CN114133435B - 一种类弹性蛋白多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类弹性蛋白多肽及应用，属于生物医药领域。所述的类弹性蛋白多肽包括[(VPGXG)m‑(Z)n]k，其中，V为缬氨酸，P为脯氨酸，G为甘氨酸，X为除脯氨酸之外的任意一种氨基酸，Z为酸性、碱性或带巯基的一种或多种氨基酸，m、n和k均为大于或者等于1的整数。与传统的类弹性蛋白多肽相比，该类弹性蛋白多肽含有更多的可用于交联的位点；其序列中含有的酸性、碱性或带巯基的氨基酸带有活性基团，能与化学交联剂结合。所述的类弹性蛋白多肽能与传统类弹性蛋白多肽一样形成纳米颗粒并应用于细胞培养；也能与交联剂结合制成水凝胶后应用于细胞培养。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种类弾性蛋白多肽以及应用。
背景技术
类弹性蛋白多肽(elastin-like polypetides，ELPs)是根据弹性蛋白相关序列合成的五肽(VPGXG，即缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-除脯氨酸外的任意一种氨基酸-甘氨酸)聚合物。它具有温度敏感的可逆相变特性。在低温时，ELPs分散在水溶液中，溶液澄清；而当温度高于一个临界温度时，溶液变浑浊，ELPs聚集析出。这个临界温度称为ELPs的相变温度，这个过程是可逆的。根据该性质，利用ITC(Inverse transition cycling，可逆相变循环)策略(Meyer et al.Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.Nature Biotechnology.)可对类弹性蛋白多肽进行分离纯化。此外，ELPs具有优良的物化特性和生物相容性，在生物医药领域具有广泛的应用，包括蛋白纯化试剂、生物医学材料、给药载体等，但传统的ELPs的多肽骨架上缺乏交联位点，不能进行有效的化学交联以形成网状结构，其本身的生物学活性也有待进一步加强。
水凝胶是一类具有能与水结合的亲水基团，可以被水显著溶胀且不溶于水的交联高分子聚合物。它具有三维网状结构，使其在水中可以吸收大量的水分发生溶胀的同时，维持原有的结构。其特殊结构使水凝胶具有生物相容性、生物降解性和纳米复合性等优良性能，在医学领域得到广泛的应用与研究。目前，以ELPs水凝胶为主体的材料已在科学实验上用于处理骨损伤、软骨损伤、脱髓鞘等损伤再生模型。
细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要表型的一种方法。尽管培养技术不断发展，体外培养细胞时仍往往会存在细胞表型丢失、低血清条件下活性下降的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种类弹性蛋白多肽，该类弹性蛋白多肽结构包括[(VPGXG)m-(Z)n]k，X为除了脯氨酸之外的任意一种或者几种氨基酸。Z为酸性氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸；碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸；带巯基的氨基酸，例如甲硫氨酸；中的任意一种或多种。
氨基酸英文简写所对应的中文名称：A(丙氨酸)；R(精氨酸)；N(天冬酰胺)；D(天冬氨酸)；C(半胱氨酸)；R(谷氨酰胺)；E(谷氨酸)；G(甘氨酸)；H(组氨酸)；I(异亮氨酸)；L(亮氨酸)；K(赖氨酸)；M(甲硫氨酸)；F(苯丙氨酸)；P(脯氨酸)；S(丝氨酸)；T(苏氨酸)；W(色氨酸)；Y(酪氨酸)；V(缬氨酸)。
小写字母m、n、k代表重复次数，均为大于等于1的整数。例如m、n和k分别为16、1和4；16、3和4；64、5和1；4、1和24；或4、1和12。
所述类弹性蛋白多肽具有与传统ELPs相同的温度敏感的可逆相变特性。根据该特性，当温度高于相变温度时，类弹性蛋白多肽在溶液中聚集形成纳米颗粒；当温度低于相变温度时，类弹性蛋白多肽分散于溶液中，溶液澄清。该过程可以反复进行10次及以上。根据该特性，利用ITC策略可进行类弹性蛋白多肽的分离纯化。
所述的类弹性蛋白多肽重复片段(VPGXG)-(Z)的N端、C端和(VPGXG)和(Z)之间的区域，能拼接多肽。例如：通过基因工程技术，可以在多肽重复片段(VPGXG)-(Z)的N端、C端或(VPGXG)和(Z)片段之间区域对应的DNA序列上插入生长因子、胞外基质结合肽或含蛋白酶识别位点多肽对应的DNA片段，再转录表达，得到所述类弹性蛋白多肽与生长因子、胞外基质结合肽或含蛋白酶识别位点多肽的结合物。
所述的生长因子包括IGF-1、IGF-2、PDGF-BB、EGF、FGF-2、FGF-7、TGF-b3、VEGF和TGF-a中的一种或者多种。所述的胞外基质结合肽包括透明质酸结合肽，例如RYPISRPRKR；硫酸软骨素结合肽，例如YKTNFRRYYRF；肝素结合肽，例如GRPGKRGKQGQK；胶原结合肽，例如TKKTLRT；中的一种或者多种。所述的蛋白酶识别位点包括MMP7切割位点，例如PLELRA；胃蛋白酶切割位点，例如LVPRGSP；弹性蛋白酶切位点，例如VGVAPG；ADAM9切割位点，例如SSAASA；中的一种或者多种。
所述的类弹性蛋白多肽和传统的ELPs能用于制备细胞培养试剂，将其添加至细胞培养基中，会形成纳米颗粒，能促进细胞增殖。
所述的类弹性蛋白多肽或传统的ELPs与生长因子或胞外基质结合肽的结合物添加至细胞培养试剂中，能促进细胞增殖或表达胞外基质。
所述的类弹性蛋白多肽的Z上含有活性基团(羧基、氨基或巯基)，该活性基团能与化学交联剂结合。传统的ELPs结合位点较少，不能进行有效的化学交联以形成网状结构，难以制成水凝胶。本发明的类弹性蛋白多肽结合位点较多，能与化学交联剂有效结合，更易形成水凝胶。
进一步地，用所述的类弹性蛋白多肽制成的水凝胶用于制备细胞培养试剂，能促进细胞表达胞外基质。
所述的细胞包括软骨细胞和成纤维细胞。
所述的细胞培养试剂包括基础培养基。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种含有新的重复序列的新型类弹性蛋白多肽，为类弹性蛋白多肽的研究提供了一个新的结构。本发明将类弹性蛋白多肽及其与功能性多肽的结合物应用于制备细胞培养试剂，均能有效提高细胞活性，显著促进细胞的增殖或胞外基质表达。本发明的类弹性蛋白多肽含有更多的交联位点，更易与化学交联剂结合，易于水凝胶的制备，且其制备的水凝胶也能用于培养细胞，可显著促进细胞胞外基质的表达。
附图说明
图1：40℃下(左图)和4℃下(右图)的[(VPGVG)16-K]4溶液状态图
图2：[(VPGVG)16-K]4的MALDI质谱图
图3：[(VPGVG)16-K3]4在细胞培养基中分散成纳米颗粒状的电镜图；左图为100μg/ml的[(VPGVG)16-K3]4在25℃下的照片，右图为100μg/ml的[(VPGVG)16-K3]4在37℃下的照片，在该温度下形成颗粒；大图的比例尺为40μm，右下角的小图的比例尺为4μm
图4：[(VPGVG)16-K3]4作用于软骨细胞后测得的CCK8实验结果，****表明P<0.0001
图5：[(VPGVG)16-K3]4-FGF2作用于成纤维细胞后测得的CCK8实验结果，****表明P<0.0001
图6：(VPGVG)64-K5冻干后外观
图7：人软骨细胞分别培养在GelMA水凝胶和GelMA与(VPGVG)64-K5-NB制成的水凝胶上3天后，Ⅱ型胶原相对表达水平，*表明P<0.1
图8：[(VPGVG)4-K]24-NB光照前(左图)和光照后(右图，成胶)对比图
图9：人软骨细胞铺在[(VPGVG)4-K]24-NB制备的水凝胶表面3天后的Ⅱ型胶原相对表达水平，**表明P<0.01
图10：软骨细胞细胞培养在[(VPGVG)4-K]12-YKTNFRRYYRF-[(VPGVG)4-K]12处理的培养皿3天后，Ⅱ型胶原相对表达水平，**表明P<0.01
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明的技术思想及特点，而不是为了限制本发明的保护范围。凡是按本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做出的任何改动，均在本发明的保护范围之内。本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
实施例1
[(VPGVG)16-K]4及其制备
合成VPGVG的DNA片段，再以pET28a为载体，利用PRe-RDL方法(McDaniel etal.Recursive Directional Ligation by Plasmid Reconstruction AllowsRapid andSeamless Cloning of Oligomeric Genes，Biomacromolecules)依次获得(VPGVG)16、(VPGVG)16-K和[(VPGVG)16-K]4的DNA片段。
将[(VPGVG)16-K]4的DNA片段进行连接，之后再转入DH5α大肠杆菌中、涂平板，过夜后挑取单个大肠杆菌克隆进行培养，提取质粒测序确认DNA片段。
获得目标序列后，将质粒转入含有T7聚合酶的大肠杆菌中，挑取单克隆到20ml的LB培养基中培养14小时，再将这20ml培养基倒入1L培养基中，待OD600的值到0.8左右，再加入1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)摇菌表达4小时，之后进行蛋白纯化。
在上述细菌培养过程中，所用抗生素是根据载体pET28a的抗性决定的，选用卡那霉素，浓度为50μg/ml；所用细菌培养温度均为37℃。
该类弹性蛋白多肽具有温度敏感的可逆相变特性，相变温度在100μM时约为32.4℃，利用ITC策略进行分离纯化。将细菌离心沉淀后，用PBS对细菌进行重悬，利用超声仪对细菌进行破碎，超声的总时间需大于4分钟。超声结束后，将细菌裂解碎片离心除去。将所得的上清液加热到40℃，该类弹性蛋白多肽发生相分离，溶液会变浑浊。马上在40℃下12000g离心10分钟，多肽颗粒会沉在管底，去除上清；用4℃预冷的PBS重悬，再在4℃下12000g离心10分钟，分散的多肽会继续在上清液中，而杂质被离心至管底，取上清。重复该过程2-3次。
在40℃下(左图)和4℃下(右图)的[(VPGVG)16-K]4的溶液状态如图1所示。透析后冻干即可获得[(VPGVG)16-K]4，其MALDI质谱图如图2所示。
实施例2
[(VPGVG)16-K3]4及其用于细胞培养
本实施例中，m、n和k值分别为16、3和4，多肽序列为[(VPGVG)16-K3]4。该多肽同样具有温度敏感的可逆相变特性，相变温度在100μM时约为33.1℃。
[(VPGVG)16-K3]4制备方式同实施例1，将冻干后[(VPGVG)16-K3]4粉末用PBS溶解得20mg/ml的溶液。将人的原代软骨细胞养在10％FBS+DMEM/F12培养基中，传至P2，再以15000个/cm2的密度铺到孔板中。1天后，将其中一组细胞换成1％FBS+DMEM/F12的培养基；而另几组细胞的1％FBS+DMEM/F12培养基中，添加[(VPGVG)16-K3]4的PBS溶液使[(VPGVG)16-K3]4终浓度约为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，[(VPGVG)16-K3]4在培养基中分散成纳米颗粒状，如图3所示，或者添加PBS作为对照。培养3天后进行CCK8检测。
CCK8检测时，将所有细胞的培养基都换成含有CCK8试剂的DMEM/F12，37℃孵育4小时，再使用酶标仪检测405nm处的吸光值。该实验中，设3个不加细胞的孔(其他操作都进行)作为空白孔，计算各个孔的最终吸光值时需减去空白孔。
实验结果如图4所示，由结果可知50μg/ml和100μg/ml[(VPGVG)16-K3]4对软骨细胞增殖无显著影响，200μg/ml[(VPGVG)16-K3]4可显著促进软骨细胞增殖(P<0.0001)。
实施例3
[(VPGVG)16-D3]4及其用于细胞培养
[(VPGVG)16-D3]4结构中除Z为D外，其他均同实施例2。实验结果发现[(VPGVG)16-D3]4同[(VPGVG)16-K3]4一样，能显著促进软骨细胞增殖，具体数据略。
实施例4
[(VPGVG)16-K3]4-FGF2(生长因子)的制备及其用于细胞培养
构建出[(VPGVG)16-K3]4的DNA片段，将FGF2对应的DNA序列接在[(VPGVG)16-K3]4的DNA片段的3’端，这样表达出来的多肽中，FGF2会共价连接在实施例2中序列的C端。对构建的DNA片段进行表达。利用ITC策略进行分离纯化，透析后冻干可简单快速地获得[(VPGVG)16-K3]4-FGF2。
将成纤维细胞用10％FBS+L-DMEM传代培养，以5000个/cm2的密度种在孔板中。1天后，将其中一组细胞换成1％FBS+L-DMEM的培养基；而另几组细胞的1％FBS+L-DMEM培养基中，添加[(VPGVG)16-K3]4-FGF2的PBS溶液使终浓度为40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml，或者添加PBS作为对照。培养3天后进行CCK8检测。
CCK8实验结果如图5所示，结果显示：10ng/ml[(VPGVG)16-K3]4-FGF2对成纤维细胞增殖没有显著影响，而20ng/ml和40ng/ml[(VPGVG)16-K3]4-FGF2均可显著促进成纤维细胞增殖。
实施例5
(VPGVG)64-K5-NB及其水凝胶的制备和应用于细胞培养
本实施例中，m的值为64，n的值为5，k值为1。多肽序列为(VPGVG)64-K5。(VPGVG)64-K5制备方式同实施例1，(VPGVG)64-K5冻干后状态如图6所示。在本实施例中，先将羧基化的Methyl 4-(4-(hydroxymethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butanoate(NB)接枝在(VPGVG)64-K5上，具体步骤为：在室温下将50mg的(VPGVG)64-K5溶解在5ml去离子水中，并添加20mg的NB、加入13mg的1-羟基苯并三唑(HOBt)；将混合溶液的pH调节至4.5、将20mg的1-(3-二甲基氨基丙基)–3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入混合物中，在室温下搅拌48小时。将该溶液装入可以让分子量小于3500Da的分子透过的透析袋中，并用含有0.1M NaCl的稀盐酸(pH3.5)透析2天，再用去离子水透析2天，将溶液冻干即可获得(VPGVG)64-K5-NB粉末。
利用酰胺键将甲基丙烯酸酐(MA)接枝到明胶(Gelatin)上，合成GelMA。具体操作如下：首先，将Gelatin在50℃水浴条件下溶于1×PBS中，制备成10％(w/v)均相溶液。然后在剧烈搅拌的条件下，将MA按照0.1ml/g Gelatin的浓度加入，再使该混合物在50℃下反应3小时，反应结束后得GelMA溶液。使用8000-14000Da的透析袋在50℃加热条件下用去离子水透析GelMA溶液一周左右，以去除未反应的甲基丙烯酸酐和其他副产物。将透析好的GelMA溶液用冷冻干燥机冻干即得。
将冻干的GelMA和ELP-K5-NB冻干粉溶解在PBS溶液中，然后加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)。其浓度分别为：5％GelMA，1％(VPGVG)64-K5-NB和0.1％LAP。用405nm紫外光照射溶液，即可形成水凝胶。
将P2的人软骨细胞分别培养在GelMA水凝胶(GelMA)和GelMA与(VPGVG)64-K5-NB制成的水凝胶(GelMA+polypeptide)上，3天后收集细胞、提取RNA。
结果发现：GelMA+polypeptide组人软骨细胞的Ⅱ型胶原mRNA的表达量显著上升(图7)。II型胶原是软骨细胞基因表达的特异性产物，是软骨基质的主要有机成分。软骨细胞的II型胶原mRNA表达显著上升，说明软骨细胞更好的维持了其表型，(VPGVG)64-K5-NB制成的水凝胶更有利于软骨细胞表型的维持。
实施例6
(VPGVG)64-E5-NB及其水凝胶的制备和应用于细胞培养
本实施例中多肽的m、n和k值都同实施例5，仅将Z位点的赖氨酸(K)替换成谷氨酸(E)，其序列为(VPGVG)64-E5。将实施例5中羧基化的NB换成氨基化的NB，其他操作和实施例5均相同。结果发现(VPGVG)64-E5-NB水凝胶组II型胶原mRNA表达显著上升。
实施例7
[(VPGVG)4-K]24-NB及其水凝胶的制备和应用于细胞培养
本实施例中，m、n和k值分别为4、1和24，多肽序列为[(VPGVG)4-K]24。
先将羧基化的NB接枝在[(VPGVG)4-K]24多肽上，具体步骤为：在室温下将50mg的[(VPGVG)4-K]24溶解在5mL去离子水中，并添加30mg的NB，然后加入15mg的HOBt。将混合溶液的pH调节至4.5，然后将20mg的1-(3-二甲基氨基丙基)–3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入混合物中，并在室温下搅拌48小时。将该溶液装入可以让分子量小于3500Da的分子透过的透析袋中，先用含有0.1M氯化钠的稀盐酸溶液(pH 3.5)透析2天，再用去离子水透析2天，将溶液冻干即获得了粉末形式的接枝了NB的[(VPGVG)4-K]24-NB。
溶解3％(w/v)的[(VPGVG)4-K]24-NB在PBS中，用405nm紫外光照射溶液，即可成胶(图8)。
将人软骨细胞养到P2代后，再次传代时，分别种到细胞培养皿里和该胶表面，将两组细胞的RNA提取出来进行逆转录，比较两组细胞Ⅱ型胶原的表达水平。
结果发现：与在细胞培养皿(Control)表面培养的细胞相比，该胶(Gel)表面培养的人软骨细胞的Ⅱ型胶原表达量显著上升(图9)。
实施例8
[(VPGVG)4-K]12-SSAASA-[(VPGVG)4-K]12及其水凝胶的制备和应用于细胞培养
将实施例7中序列改为[(VPGVG)4-K]12-SSAASA-[(VPGVG)4-K]12，在两段主要的结构域之间接上了ADAM9切割位点，其他操作同实施例7。结果发现用[(VPGVG)4-K]12-SSAASA-[(VPGVG)4-K]12水凝胶培养人软骨细胞组，人软骨细胞的Ⅱ型胶原表达量显著上升。
实施例9
[(VPGVG)4-K]12-YKTNFRRYYRF-[(VPGVG)4-K]12及其应用于细胞培养
将实施例7中序列改为[(VPGVG)4-K]12-YKTNFRRYYRF-[(VPGVG)4-K]12，在两段主要的结构域间接上了硫酸软骨素结合位点。
在培养软骨细胞之前，将该多肽以250μg/ml的浓度溶解在PBS中，再加入到细胞培养皿上。平行设置不含多肽的PBS作为对照。在4℃下放置过夜，第二天吸去多余的溶液，用PBS洗两遍，用该培养皿来培养软骨细胞。3天后进行细胞内Ⅱ型胶原的mRNA含量检测。
结果显示：与对照组(Control)相比，用250μg/ml该多肽(Polypeptide)处理的培养皿上软骨细胞Ⅱ型胶原的mRNA表达量显著增加(图10)。
Claims (9)
1.一种类弹性蛋白多肽，其特征在于，所述的类弹性蛋白多肽结构选自如下六种多肽中的任意一种：[(VPGVG)16-K]4、[(VPGVG)16-K3]4、[(VPGVG)16-D3]4、(VPGVG)64-K5、(VPGVG)64-E5、[(VPGVG)4-K]24。
2.一种多肽，其特征在于，所述多肽的结构为在如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽的N端或C端，通过基因工程的方式拼接生长因子、胞外基质结合肽或含蛋白酶识别位点的多肽，或在如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽[(VPGVG)4-K]24的两段主要的结构域[(VPGVG)4-K]12之间，通过基因工程的方式拼接生长因子、胞外基质结合肽或含蛋白酶识别位点的多肽。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述[(VPGVG)4-K]24两段主要的结构域[(VPGVG)4-K]12间，拼接ADAM9切割位点或硫酸软骨素结合位点。
4.一种如权利要求1所述的类弹性蛋白多肽或如权利要求2~3中任一项所述的多肽在用于制备细胞培养试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的类弹性蛋白多肽或多肽能与交联剂结合制成水凝胶。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的细胞选自软骨细胞或成纤维细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的试剂为基础培养基。
8.一种多肽在体外促进软骨细胞或成纤维细胞增殖中的应用，其特征在于，所述多肽如权利要求2~3中任一项所述。
9.一种多肽在非治疗目的的提高人软骨细胞的II型胶原mRNA的表达量中的应用，其特征在于，所述多肽如权利要求2~3中任一项所述。
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