JPH06113878A - 新規プラスミドの製造及びそれを含む菌株を培養してｉｇｆ−１を製造する方法 - Google Patents

新規プラスミドの製造及びそれを含む菌株を培養してｉｇｆ−１を製造する方法

Info

Publication number
JPH06113878A
JPH06113878A JP3062434A JP6243491A JPH06113878A JP H06113878 A JPH06113878 A JP H06113878A JP 3062434 A JP3062434 A JP 3062434A JP 6243491 A JP6243491 A JP 6243491A JP H06113878 A JPH06113878 A JP H06113878A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
igf
fusion protein
galactosidase
cleaved
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP3062434A
Other languages
English (en)
Inventor
Young Ik Lee
ヨウン・イク，リー
Ju Won Kwak
ジュ・ウォン，クァク
Heui Dong Park
ヘウイ・ドン，パーク
Young Im Suhn
スン・ヨン，イム
Hoon Kim Young
ヨウン・フーン，キム
Sun Yoon Mi
ミ・スン，ヨーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Publication of JPH06113878A publication Critical patent/JPH06113878A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 インシュリンで治療できなかった糖尿病患者
の血糖量調節と骨疾患等の局部治療並びに先天性又は後
天性成長欠乏患者に利用できるＩＧＦ−１の新規な製造
法及びそれに用いる新規なプラスミドを提供する。 【構成】 ヒトの肝細胞から抽出、単離したｍＲＮＡか
らＩＧＦ−１をコードするｃＤＮＡを製造し、このｃＤ
ＮＡを他の遺伝子との融合遺伝子の形で挿入した発現ベ
クターで大腸菌を形質転換した後、得られた形質転換体
を、適切な培地で培養してＩＧＦ−１を製造する方法で
あって、（ａ）該発現ベクターがＩＧＦ−１遺伝子と上
記他の遺伝子の間にエンテロキナーゼ認識部位を有する
プラスミドであり、生成する融合蛋白質をエンテロキナ
ーゼによって切断し、次いで精製するＩＧＦ−１の製造
法、また（ｂ）該発現ベクターがヒドロキシルアミンで
切断しうる、ＡＡＣ ＧＧＡコドンを含むリンカーＤＮ
Ａを有するベクターであり、生成する融合蛋白質をヒド
ロキシルアミンで切断し、次いで精製するＩＧＦ−１の
製造法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の目的】ヒト成長ホルモン（human growth hormo
ne）により肝において形成され、血液に放出されるＩＧ
Ｆ−１（insulin like growth factor 1）は、分子量が
７，６４９で、７０余個のアミノ酸により構成されてい
る。
【０００２】ＩＧＦ−１のアミノ酸組成は、インシュリ
ンのＡ−鎖と約４３％の類似性を有し、自身の受容体は
勿論、インシュリン受容体とも結合する能力をもってお
り、生体内にてインシュリンと同様な作用をすると同時
に、細胞の成長を促進させる役割をすることが知られて
いる。
【０００３】このようなＩＧＦ−１はソマトメジン(Som
atomedin) の一種として知られ、生体内には３種類のソ
マトメジン（Ａ、Ｂ、Ｃ）が存在するが、この内ソマト
メジンＣはＩＧＦ−１と命名された。
【０００４】かかるＩＧＦ−１の受容体は、肝細胞の他
にも脂肪組織、リンパ球、骨、胎盤の膜等にも存在し、
実験の結果インシュリン受容体とは全く異なる受容体で
あることが明らかになった。
【０００５】かかる受容体が、ソマトメジンＣと結合す
ると、今まで明かでなかった２次メセンジャーを刺戟し
て体細胞分裂を促進させる結果をもたらすのである。実
際において肝から血液に分泌されたＩＧＦ−１は、血液
中で運搬蛋白質（carrier protein)と結合して不活性状
態で循環しているうちに、人体の栄養状態または生理的
変化により運搬蛋白質から分離した後、体細胞の受容体
と結合することにより、細胞分裂（mitogenic)効果を表
わすのである。
【０００６】ＩＧＦ−１による生物学的活性は、短期的
な効果と長期的な効果に分けることができる。
【０００７】短期的な効果は、主にインシュリン作用組
織的な脂肪組織もしくは心臓筋細胞からインシュリンの
受容体に結合するとき現われる効果のような現象であ
り、ＩＧＦ−１もインシュリンと同様に血液中でブドウ
糖の輸送及び吸収したブドウ糖を酸化させてブドウ糖か
らの脂肪合成を促進する。
【０００８】このような効果が、ＩＧＦ−１とインシュ
リン受容体とが結合して生じるとの証拠は、脂肪組織内
でインシュリン受容体をトリプシンで処理して除去した
場合、ＩＧＦ−１の活性が無くなる実験により確認した
（King et al., J. ClinicalInvest. 66:130 (1980))
。
【０００９】ＩＧＦ−１による短期的な効果が、インシ
ュリンのような作用を表わすのに比べて、長期的な効果
は、インシュリン作用とは異なる人体内の多くの組織細
胞の増殖成長及び分化を促進する現象として表われる。
鶏またはラットにて軟骨組織細胞にＩＧＦ−１を処理す
ると、軟骨組織の成長に関与する硫酸基の吸収とリボ核
酸（ＲＮＡ）の合成が急速に増加することが明らかにな
った（Steiner, Th etal. Calcified Tissue Internati
onal 35:578 (1983))。また鶏の胃において体細胞壁、
細胞においては筋肉細胞に存在するアセチルコリンエス
テラーゼとクレアチンキナーゼが増加する現状を示すた
め、これらの未分化細胞が筋肉細胞に分化するときＩＧ
Ｆ−１が作用することが分っている。
【００１０】これ以外にも、１９８２年Kurzz とBarner
はラットの肝から由来した赤血球細胞と骨髄細胞に、イ
ンシュリン及びＩＧＦ−１を処理してその結果を比較し
た結果、インシュリン処理に比べてＩＧＦ−１処理のと
き細胞増殖率が顕著に増加したと報告している。
【００１１】ＩＧＦ−１の長期的効果は、体外実験に比
べて生体実験結果により更に確実に立証された。即ち、
脳下垂体が除去されたマウスに成長ホルモン、ＩＧＦ−
１及びインシュリンをそれぞれ注射した後、その効果を
調査した結果、成長ホルモン無しでＩＧＦ−１のみ注射
したマウスが、他のラットに比べ硬骨組織の直径が大き
くなり、軟骨組織の硫黄及びチミジンの吸収増加と体重
の増加が著しく現われた（Sconhoenle et al, Nature 2
96:252 (1982))。
【００１２】このような強力な細胞分裂効果（mitogeni
c effect）を示すＩＧＦ−１は、成長促進剤としての利
用度を更に増加させることができる。
【００１３】
【発明の構成】本発明は、ＩＧＦ−１の遺伝子をヒトの
肝細胞から分離して、独特な発現ベクターに加えた後、
微生物を増殖させて多量生産を行う発明であり、かつ発
現精製したＩＧＦ−１を利用して、インシュリンで治療
できなかった糖尿病患者の血糖量調節と骨疾患者等の局
部治療並びに先天性または後天性成長欠乏患者に利用で
きうる発明である。
【００１４】本研究により明らかになったＩＧＦ−１遺
伝子の発現及び精製方法は、先行の多くの技術的な問題
点を避けた、新たな方法により開発されたものである。
【００１５】従来公知の発現方法は、遺伝子を直接発現
することが困難である場合、他の種類の蛋白質と融合蛋
白質状態で発現させた後、化学物質（ＣＮＢｒ）により
融合蛋白質を切り除く方法が用いられているが、この方
法により得られた物はＣＮＢｒ自体の毒性により、精製
した後でも人体に用いるのは困難である。
【００１６】本発明においては、従来用いられたＣＮＢ
ｒ以外の酵素的な方法及びヒドロキシルアミンを用いて
正確に融合蛋白質を切断した後、目的の蛋白質を精製す
るより正確な方法を選んだのである。
【００１７】この方法において選んだ酵素はエンテロキ
ナーゼ（enterokinase）であり、このエンテロキナーゼ
が作用する５個のアミノ酸（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−）を認識するヌクレオチドを形成させ
て（ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＣＡＴ−ＡＡＡ−）遺伝
子の切断部位に加えた後、この遺伝子を発現させ、次い
でエンテロキナーゼを利用して切断する方法を用いた。
この方法は従前使用されていなかった新規な方法であ
る。
【００１８】かかる新規な方法を利用して発現された融
合蛋白質のインクルージョンボデイ（inclusion bodie
s）から望む部位を切断するために用いた蛋白質Ｒ−基
の置換法もまた、従前には用いられていなかった新しい
方法である。
【００１９】即ち、大腸菌から発現された融合蛋白質は
インクルージョンボデイとして存在し、融合蛋白質内で
多数のシステイン残基等と無作為的に結合してジスルフ
ィド結合を維持している状態であり、これらをデナチュ
レーション（denaturation）して溶解させるためには、
ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールのような強い還
元剤が必要である。しかし、融合蛋白質を切断するとき
強い還元剤を用いると、融合蛋白質を切断するエンテロ
キナーゼの活性が消失するのみならず、特にβ−メルカ
プトエタノールのような還元剤を用いてシステインのス
ルフヒドリル（−ＳＨ）基を還元すると、非常に不安定
になる。この際酸素存在下で結合されないβ−メルカプ
トエタノールを除去すると、容易に再酸化が起り、更に
ジスルフィド結合を形成しながらインクルージョンボデ
イ形態で再び沈澱を生じる。
【００２０】前述した種々な問題点により、今までＩＧ
Ｆ−１の生成は大腸菌内にて生成効率が非常に低い溶解
形態で生成させるしかなかったが、本発明においてはか
かる問題点を克服することができる次のような新規な方
法を利用した。
【００２１】先ず、融合蛋白質中に存在するシステイン
のスルフヒドリル基と結合するが、常温では容易に酸化
されないジスルフィド化合物（ジエタノールジスルフィ
ド、ジチオビスニトロ安息香酸）と融合蛋白質とをβ−
メルカプトエタノール触媒の存在下で反応させて、融合
蛋白質中の−ＳＨ基間のジスルフィド結合形成を防止す
る。この場合酵素により切断される部位が十分露出する
ように溶解形態を維持した後、酵素エンテロキナーゼで
処理する。このようにエンテロキナーゼで融合蛋白質を
切断した後ＩＧＦ−１を分離する。
【００２２】システインのスルフヒドリル基にジスルフ
ィド化合物が結合されたＩＧＦ−１からジスルフィド化
合物の除去は、結合条件より低い濃度のβ−メルカプト
エタノールを触媒として徐々に透析反応させると、ジス
ルフィド化合物が除去されると同時にＩＧＦ−１の再活
性が起り、ＩＧＦ−１を分離することができる。
【００２３】このように本発明においては、融合遺伝子
を発現させるとき、特定酵素により切断できる新たな方
法を利用したものであり、多量発現後Ｒ−基置換法を利
用して溶解させ、次いで酵素で取り除く方法を利用した
のである。
【００２４】前記のようにＲ−基を置換した後、酵素エ
ンテロキナーゼを利用した切断方法以外に、本発明にお
いては、ヒドロキシルアミンを利用して純粋なＩＧＦ−
１を生産する方法を利用した。ヒドロキシルアミンはpH
９にて蛋白質内のＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の結合を特異的
に切断することができる。この原理を利用してＡＴＧＴ
ＴＡＡＣＧとＴＡＣＡＡＴＴＧＣＣＴＧを合成した後、
リンカーに用いると、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−
１との間にＡｓｎ−ＧｌｙをコードするＡＡＣＧＧＡコ
ドンを持つようになる。そこでβ−ガラクトシダーゼと
ＩＧＦ−１融合蛋白質を得た後、ヒドロキシルアミンに
より切断するとＡｓｎ−Ｇｌｙ間が切断されて、初めの
アミノ酸はグリシンであるＩＧＦ−１を純粋に得ること
ができる。
【００２５】本発明のかかる新たな方法によるＩＧＦ−
１の精製は従来の方法に比べて簡単な方法であり、かつ
非常に高収率で実施できる長所がある。
【００２６】ある蛋白質を造るためには、先ず目的の蛋
白質を生産する細胞よりｍＲＮＡを得なければならな
い。このようにして得たｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて
ｃＤＮＡに転写させるか、造られたｃＤＡＮに（ｄＣ）
ｎテール（tail）を付けた後、（ｄＧ）ｎテ−ルが付い
たベクター（ｐＢＲ３２２）とアニーリングさせて適当
な菌株に加え、形質転換させるのである。
【００２７】このように形質転換された菌株は多様なｍ
ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを持っているが、このように
して造られた菌株の群をｃＤＮＡライブラリーと言う。
ここで形質転換して得た菌株の中から望みの遺伝子を保
有する菌株を選別するためにコロニー・ハイブリダイゼ
ーション（colony hybridizaiton）方法（Maniatis,T.,
et al. 1982, "Molecular Cloning", pp. 312-319)を
利用する。このときプローブ（probe)は既に公知のアミ
ノ酸配列で５個のアミノ酸に対応する塩基配列をＤＮＡ
合成機で合成した後、32Ｐで標識して使用する。このよ
うにして得たＩＧＦ−１をコーディングする遺伝子を発
現させるためには、効率的な発現ベクターを利用する。
大腸菌から高等生物の遺伝子を発現するベクターには種
々な種類があるが、本発明においては、ｔａｃプロモー
ターを有するベクターを使用した（図６参照）。
【００２８】コロニー・ハイブリダイゼーションを行っ
て探し出したＩＧＦ−１ ｃＤＮＡ遺伝子を種々な制限
酵素で処理して、その遺伝子を確認した（図３参照）。
図５に示されている通り、ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡにはｐ
ＢＲ３２２誘導体ベクターのＰｓｔＩ制限酵素位置間に
６８０bpの塩基対が入っており、括弧内に示された制限
酵素ＡｖａIIとＡｌｕＩとの間の部分を蛋白質翻訳後プ
ロセシング（Processing）過程を経て生成するＩＧＦ−
１の発現に利用した。
【００２９】ＩＧＦ−１と大腸菌にて発現する発現ベク
ターｐＹＪＭ−Ｉ４を組み合せるために、次のような遺
伝子操作を行った（図６参照）。ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡ
をＡｖａII制限酵素で処理した後、ＡｌｕＩ酵素で弱く
処理して２０６bpのＡｖａII−ＡｌｕＩ ＤＮＡの断片
を電気泳動ゲルにて分離した。ここで四つの合成オリゴ
ヌクレオチド即ち、ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡ
ＴＧＧ（ＭＧ６）、ＧＴＣＣＣＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣ
ＣＴＣＣＡＡＴＧ（ＭＧ−７）、ＣＴＴＡＧＡＧ（ＭＧ
−８）、ＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＧ（ＭＧ−９）を交
ぜて接合（ligation）した後、これをｐＵＣ８プラスミ
ドのＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉ認識部位との間に挿入
し、ｐＹＪＭ−Ｉ１プラスミド（図６（Ａ）参照、Kore
an Collection for Type Cultures に寄託された国際寄
託番号ＫＣＴＣ０００４ＢＰ）を製造した。このように
組み合されたｐＹＪＭ−Ｉ１プラスミドには、蛋白質翻
訳過程後プロセシングされて生じるＩＧＦ−１の７０ア
ミノ酸をコードする遺伝子が、二つの制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＥｃｏＲ Ｉ認識部位との間に存在する。従っ
て、これをβ−ガラクトシダーゼとの融合により発現さ
せるために、β−ガラクトシダーゼとの融合ベクターで
あるｐＣＴ１０（図６（Ｂ）参照）に挿入する次のよう
な過程を経て、ＩＧＦ−１を大腸菌にて発現させる発現
ベクターｐＹＪＭ−Ｉ４を組み合せた。ｐＹＪＭ−Ｉ１
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで
二重処理してＩＧＦ−１ ＤＮＡを分離した後、大腸菌
のＤＡＮポリメラーゼクレノ−断片酵素を用いて両端を
埋めて、ＡｖａII制限酵素で処理し、図６にて示されて
いる通り２２０bpのＩＧＦ−１ ＤＡＮ断片を電気泳動
ゲルの中で分離した。ここで二つの合成オリゴヌクレオ
チドＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧ（ＭＧ−２４）と
ＧＴＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（ＭＧ−２５）
とを交ぜて接合した後、接合された２３５bpＤＮＡ断片
をｐＣＴ１０のクレノー酵素で処理したＣｌａＩ位置に
挿入して、ｐＹＪＭ−Ｉ４プラスミド（図６（Ｂ）参
照、Korean Collection for Type Cultures に寄託され
た国際寄託番号ＫＣＴＣ０００５ＢＰ）を製造した。
【００３０】図６にて示す通り、ｐＹＪＭ−Ｉ４プラス
ミドには抗生剤アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐr)、Ｃｏ
ｌＥＩ複製点（ｏｒｉ．）ラックリプレッサー（lac re
pressor)を生成するｌａｃＩ遺伝子（ｌａｃＩ）が含ま
れており、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１との融合
蛋白質を生成する遺伝子が、大腸菌の強力なプロモータ
ーであるｔａｃプロモーターに連結されているため、多
量のβーガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質を生
成することができる。このβーガラクトシダーゼとＩＧ
Ｆ−１融合蛋白質との連結部位には酵素エンテロキナー
ゼが認識して作用するアミノ酸配列（Ａｓｐ）4 −Ｌｙ
ｓに相応するＤＮＡ塩基配列が存在し、ＩＧＦ−１がβ
−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質からエンテ
ロキナーゼ処理により遊離されて、ＩＧＦ−１蛋白質の
みを分離することができるのである。
【００３１】発現ベクターであるｐＹＪＭ−Ｉ４を有す
る大腸菌細胞ＪＭ１０９を、ＬＢ＋Ａｐ（１００μg ／
ml）培地にて一夜培養した種培養液５mlを１００μg ／
mlのアンピシリンが含まれているＭ９＋ＣＡ最小培地１
００mlに接種して、３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴ
Ｇ（イソ−プロ−ポリ−β−Ｄ−チオガラクトシド）を
２mM加えて、大腸菌のｔａｃプロモーターによりβ−ガ
ラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質の生産を誘発し
た。このようにして得た培養液１．５mlづつを取り、そ
の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。その結果、
誘発前に比べて誘発後、１時間、４時間、５時間経過す
ることにより、分子量約５０，０００ダルトンの位置に
濃い蛋白質バンドが観察され、これより大腸菌のｔａｃ
プロモーター支配下にβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−
１融合蛋白質が発現されていることが分った（図９）。
【００３２】また、このとき生成された蛋白質の量も大
腸菌の総蛋白質の２０〜３０％以上で効率的であること
が分った。生成されたＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダー
ゼ融合蛋白質は、大腸菌細胞内にインクルージョンボデ
イーとして蓄積されていることが電子顕微鏡写真により
分った（図８）。
【００３３】ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼ融合蛋
白質を分離して、エンテロキナーゼで加水分解した後、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した電気泳動写真は図１１
の通りである。この結果、分子量８，０００ダルトンの
分離されたＩＧＦ−１を得た。
【００３４】二番目の方法ではヒドロキシルアミンを利
用する方法を用いた。ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダー
ゼとの融合蛋白質をヒドロキシルアミンにより切断し
て、ＩＧＦ−１を分離することができる発現ベクターｐ
ＹＰＭ−Ｉ１（Korean Cllection for Type Culturesに
寄託された国際寄託番号ＫＣＴＣ０００６ＢＰ）を次の
通り製造した。
【００３５】ｐＹＰＭ−Ｉ１をＢａｍＨ Ｉ及びＥｃｏ
Ｒ Ｉで処理した後、ＩＧＦ−１ＤＮＡ断片を分離し
て、大腸菌クレノー断片酵素で処理した後、ＡｖａIIで
処理して図１２で示すような２２０bpのＩＧＦ−１ Ｄ
ＮＡ断片を分離した。これに合成オリゴヌクレオチドＡ
ＴＧＴＴＡＡＣＧとＧＴＣＣＧＴＴＡＡＣＡＴとを交ぜ
て連結した後、これをｐＣＴ１０のクレノー酵素で処理
したＣｌａＩ位置に挿入して、ｐＹＰＭ−Ｉ１プラスミ
ドを製造した。このプラスミドにより生産される融合蛋
白質は、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１との間にＡ
ｓｎ−Ｇｌｙ残基を有するため、ヒドロキシルアミン処
理によりＩＧＦ−１のみを分離することができる。
【００３６】発現ベクターであるｐＹＰＭ−Ｉ１を有す
る大腸菌細胞ＪＭ１０９にＩＰＴＧを加えてβ−ガラク
トシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質の生産を誘発させた
後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１３）。その
結果、誘発する前に比べて誘発後約４５，０００ダルト
ンの位置に融合蛋白質が生産されていることを確認し
た。
【００３７】この融合蛋白質を精製するために、前記の
培養液を遠心集菌したものを、リゾチーム処理と超音波
処理した後、遠心分離して得たインクルージョンボデイ
ーを８M 酵素−２０mMβ−メルカプトエタノール溶液に
溶解させた。これをセパクリルＳ２００カラムに通過さ
せた後、蛋白質ピーク部分の分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より確認した結果、主に約４５，０００ダルトン附近の
融合蛋白質を含んでいることが分った（図１４）。
【００３８】水酸化リチウムでpHを９．０に調節した２
M ヒドロキシルアミン−６M 塩酸グアニジンに、前記の
融合蛋白質を最終濃度が１ml当り５mg以下になるように
添加してよく溶解させた。この溶液を４５℃にて４時間
反応させてβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１の切断を
誘発した後、ギ酸をpHが２〜３になるように添加して反
応を中止させた。切断されたＩＧＦ−１を尿素−ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより確認した結果、図１５に示す通り約
７，０００ダルトンのＩＧＦ−１が生成されていること
がわかった。
【００３９】ヒドロキシルアミンで加水分解した融合蛋
白質からＩＧＦ−１の分離は、ＩＧＦ−１が強酸中に安
定に溶解する性質を利用して、ヒドロキシルアミンで切
断したＩＧＦ−１溶液に濃ギ酸を少量添加してpHを２〜
３程度に維持した後、０．５M の酢酸（pH２．８８）−
０．０７５M ＮａＣｌに対して透析し、ＳＰ−セファデ
ックスＣ−２５イオン交換樹脂カラムに満たした後透析
緩衝溶液で洗浄し、次いでイオン交換樹脂に完全に吸着
させる。このとき大部分のβ−ガラクトシダーゼ断片は
透析のとき沈澱、除去されて、一部の断片のみこのイオ
ン交換樹脂と結合反応されるが、０．２M 酢酸アンモニ
ウムと０．２M ＮａＣｌを含む抽出溶液（pH５．０）で
イオン交換樹脂を洗浄すると、ＩＧＦ−１及びβ−ガラ
クトシダーゼの断片が等電点の差によりpH４．０にてイ
オン交換樹脂より分離され、ＩＧＦ−１のみ抽出される
（図１６）。
【００４０】図１７にて示されたピーク分画を取り、三
次蒸溜水で透析してＨＰＬＣにより確認し（図１８）、
電気泳動した結果分離されたＩＧＦ−１の純度は９５％
以上であり、その分子量は尿素−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り約７，０００ダルトン程度であることが確認された
（図１７）。
【００４１】実施例１ ＩＧＦ−１を生産する遺伝子を得るために、先ず肝組織
からｃ−ＤＮＡライブラリーを製造した（図２）、ｃＤ
ＮＡライブラリーを製造するために先ず肝組織から全体
ＲＮＡを分離した。全体ＲＮＡを分離するためにはグア
ニジンイソチオシアネート方法を利用した（Maniatis e
t al. "Molecular cloning" pp. 194)。
【００４２】このように得た全体ＲＮＡはオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルローズカラムを利用して、ポリＡ+ ＲＮＡの
み分離した（Maniatis et al. "Molecular cloning" p
p. 197)。
【００４３】このとき得た全体ＲＮＡとポリＡ+ ＲＮＡ
の精製効率を知るために、ホルムアルデヒドアガロース
ゲルを利用して全てのサイズのポリＡ+ ＲＮＡが残って
いるかを確認した。このようにして得たポリＡ+ ＲＮＡ
を利用してｃＤＮＡライブラリーを製造する。
【００４４】分離したポリＡ+ ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）
ｎプライマーと逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡを造
る。ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、Ｒ
Ｎａｓｅ Ｈにより加水分解させる。このように形成さ
れたＳＳ−ＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断
片を用いてｄｓ−ｃＤＮＡを造り、ヘアーピン構造はＳ
１ヌクレアーゼを利用して切断した。形成されたｄｓ−
ｃＤＮＡはｄＣＴＰ及び末端転位酵素を用いて各ストラ
ンド（strand）の３′側にシチジンを付けるのである
（tailing)
【００４５】両ストランドの３′側にシチジンが結合さ
れたｄｓ−ｃＤＮＡはｐｓｔＩ制限酵素で切断した後、
末端転位酵素及びｄＧＴＰを用いてポリ（ｄＧ）ｎを造
ったｐＢＲ３２２に結合させる（Maniatis, Molecular
Cloning, pp. 215）。
【００４６】前記の通り結合させた後、E. Coli ＨＢ１
０１に形質転換させて多数の他のｄｓ−ｃＤＮＡを有す
る形質転換菌株を得ることができた。このようにして得
たｃ−ＤＮＡ群をｃ−ＤＮＡライブラリーと言う（図２
参照）。
【００４７】実施例２ テトラサイクリンに抵抗性を示す約２００，０００個の
形質転換菌株中にて８０，０００個のコロニーを合成オ
リゴヌクレオチドを利用してＩＧＦ−１のｃＤＮＡが含
まれているかを調査した。ＩＧＦ−１のアミノ酸配列中
でアミノ酸５７〜６１番目（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）の５個のアミノ酸に対応するヌクレオ
チドの配列を合成した（５′−ＣＴＧ−ＧＡＧ−ＡＴＧ
−ＴＡＴ−ＴＧＣ−３′）。
【００４８】このように合成された１５−ｍｅｒオリゴ
ヌクレオチドを32Ｐ−ＡＴＰ及びＴ4 ポリヌクレオチド
キナーゼを利用して５′側に標識させた標識に続いて１
５−ｍｅｒを１８％ポリアクリルアミドゲルを利用して
純粋に精製した後、プローブとして用いた。
【００４９】このように５′側に32Ｐで標識させたプロ
ーブにより、ｃＤＮＡライブラリーにおいてＩＧＦ−１
を含むｃＤＮＡが含有されているかの調査を行った。
【００５０】コロニー・ハイブリダイゼーション方法に
より調査した８０，０００個のコロニーの中で、６個の
コロニーが強く結合（hybridize)されていることが分
り、図３はこの中２個のコロニーを示している。この結
合したコロニーを更にスクリーニングして合成オリゴヌ
クレオチドを結合しているかを確認した。
【００５１】前記のコロニー中、一つのコロニーは６８
０bpのＤＮＡ配列を含んでいた。このＤＮＡ配列が正に
ＩＧＦ−１を含有しているか否かを確認するために、種
々の制限酵素で切り取って制限酵素地図を作成した（図
４）。
【００５２】図４に示す通り、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ
切断部位に６８０bpのＤＮＡが含まれていることがわか
る。これを更に細分するために６８０bp全体のＤＮＡ配
列を決定した。
【００５３】図５はＰｓｔ１切断部位内にある６８０bp
の配列を示したものである。下線が引かれた部分が成熟
したＩＧＦ−１をコードする配列であり、５′側に１４
個のアミノ酸と３′側に１００個のアミノ酸をコードす
る配列並びに２４０塩基対の３′−ノンコーディング部
位が存在する。３′−ノンコーディング部位に続いてポ
リ（Ａ）配列が存在していることがわかる。
【００５４】実施例３ このように分離されたｃＤＮＡ配列を利用してＩＧＦ−
１の発現を試みた。
【００５５】前述した通りグリシンよりアラニンまでの
７０個のアミノ酸を発現させた（図６参照）。
【００５６】ＩＧＦ−１を大腸菌にて発現させる発現ベ
クターｐＹＪＭ−Ｉ４を組み合せるために次のような遺
伝子操作を行った。
【００５７】ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡをＡｖａII制限酵素
で処理し、次いでＡｌｕＩ酵素で弱く処理して２０６bp
のＡｖａII−ＡｌｕＩＤＮＡ断片を電気泳動ゲルにて分
離した。これに４種の合成オリゴヌクレオチド即ち、Ｇ
ＡＴＣＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＧ
（ＭＧ−６）、ＧＴＣＣＣＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＴ
ＣＣＡＡＴＧ（ＭＧ−７）、ＣＴＴＡＧＴＧＡＧ（ＭＧ
−８）、ＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＧ（ＭＧ−９）を交
ぜて接合（ligation）した後、これをｐＵＣ８プラスミ
ドのＢａｍ ＨＩとＥｃｏ ＲＩ認識部位との間に挿入
して、ｐＹＪＭ−Ｉ１プラスミドを製造した。このよう
に組み合されたｐＹＪＭ−Ｉ１プラスミドには、ＩＧＦ
−１の７０アミノ酸をコードする遺伝子は二つの制限酵
素ＢａｍＨＩとＥｃｏ ＲＩ認識部位との間に存在して
いる。従って、これをβ−ガラクトシダーゼとの融合に
より発現させるために、β−ガラクトシダーゼ発現ベク
ターであるｐＣＴ１０に挿入する次のような過程を経
て、ＩＧＦ−１を大腸菌にて発現させるベクターｐＹＪ
Ｍ−Ｉ４に組み合せた。
【００５８】ｐＹＪＭ−Ｉ１プラスミドを制限酵素Ｂａ
ｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩにより二重処理してＩＧＦ−
１ ＤＮＡを分離した後、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
のクレノー断片酵素で両端を埋め、ＡｖａII制限酵素で
処理して図６に示すような２２０bpのＩＧＦ−１ ＤＮ
Ａ断片を電気泳動ゲルにて分離した。これに二つの合成
オリゴヌクレオチドＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧ（ＭＧ−
２４）、ＧＴＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（ＭＧ
−２５）を交ぜて接合した後、接合された２３５bpＤＮ
Ａ断片をｐＣＴ１０のクレノー酵素で処理したＣｌａＩ
位置に挿入して、ｐＹＪＭ−Ｉ４プラスミドを製造した
（図６参照）。このｐＹＪＭ−Ｉ４をＤＮＡ配列決定に
より確認した（図７）。
【００５９】図６に示す通り、ｐＹＪＭ−Ｉ４プラスミ
ドには抗生剤アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐr)、Ｃｏｌ
ＥＩ複製点（ｏｒｉ）、ラックリプレッサーを生成する
ｌａｃＩ遺伝子（ｌａｃＩ）を含み、β−ガラクトシダ
ーゼとＩＧＦ−１との融合蛋白質を生成する遺伝子が、
大腸菌の強力なプロモーターであるｔａｃプロモーター
に連結されているため、多量のβ−ガラクトシダーゼと
ＩＧＦ−１融合蛋白質を生成することができる。このβ
−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質との連結部
位には、酵素エンテロキナーゼが認識して作用するアミ
ノ酸配列即ち、（Ａｓｐ)4−Ｌｙｓに相応するＤＮＡ塩
基配列が存在し、融合蛋白質からエンテロキナーゼ処理
によりＩＧＦ−１のみ分離することができるのである
（図６参照）。
【００６０】実施例４ 発現ベクターであるｐＹＪＭ−Ｉ４を含む大腸菌細胞Ｊ
Ｍ１０９をＬＢ+ Ａｐ（１００μg ／ml）培地にて一夜
培養した種培養液５mlを、１００μg ／mlのアンピシリ
ンが含まれているＭ９+ ＣＡ培地１００mlに接種して、
３７℃で３時間培養した後、ＩＰＴＧを２mM加えて大腸
菌のｔａｃプロモーターに連結されたβガラクトシダー
ゼ−ＩＧＦ−１遺伝子を誘発した。このようにして得た
サンプル１．５mlずつを取って、その一部をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで確認した。その結果、誘発前に比べて誘発後１
時間、４時間、５時間経ることにより、分子量約５０，
０００ダルトンの位置（図９矢印参照）に濃いバンドが
観察された。これより大腸菌のｔａｃプロモーター支配
下にβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１との融合蛋白質
が発現されていることが分った（図９参照）。
【００６１】又、このとき生成する蛋白質の量も大腸菌
全体の蛋白質の２０〜３０％以上で効率的であった。生
成したＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白
質が、大腸菌細胞内にインクルージョンボデイで蓄積さ
れていることが電子顕微鏡撮影結果より分った（図８参
照）。
【００６２】実施例５ ＩＰＴＧにより大腸菌内にてその発現が誘発されたＩＧ
Ｆ−１の分離は、大腸菌内に形成されたβ−ガラクトシ
ダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質結晶体（inclusion bod
y）の分離から始まる。
【００６３】融合蛋白質の分離は２mMのＩＰＴＧが添加
された培地に培養された大腸菌を遠心分離して得た後、
リゾチームが含まれているトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH
８．０）に懸濁させて３７℃で１０分間培養した後、超
音波磨砕機により１５分間磨砕し、次いで１，０００g
で１５分間遠心分離して沈澱物を得た。
【００６４】分離したβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−
１融合蛋白質結晶体より純粋な融合蛋白質の分離につい
ては、結晶体が水溶液に溶解しないため、８M の尿素と
２０mMβ−メルカプトエタノールとが含まれているトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液に溶解させた後、超遠心分離器を利用
して１００，０００G で９０分間遠心分離し、上澄液を
セファクリル−Ｓ２００カラムに通過させて分画する方
法を２回繰り返して分離した後、各分画をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにて電気泳動して確認した（図１０参照）。
【００６５】確認されたβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ
−１融合蛋白質分画を透析膜に入れて２４時間透析を行
い、尿素とβ−メルカプトエタノールを除去した後、凍
結乾燥した。β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋
白質をエンテロキナーゼで処理し、ＩＧＦ−１のみを分
離するためには、エンテロキナーゼ活性緩衝溶液（０．
１M トリス−酢酸緩衝液pH５．６）中に溶解しなければ
ならない。
【００６６】しかし、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−
１融合蛋白質は蛋白質ペプチド間のジスルフィド結合に
より、低いpHにて容易に結晶化するため、この結合を切
るためにはシステイン基置換過程が必要であり、融合蛋
白質の置換は０．１M ジエタノールジスルフィドを７mM
のβ−メルカプトエタノール存在下で凍結乾燥させた融
合蛋白質と３７℃で３時間反応させ、その結果システイ
ンが置換された融合蛋白質はエンテロキナーゼ活性緩衝
溶液中に容易に溶解した。
【００６７】溶解された融合蛋白質にエンテロキナーゼ
を加えて２０℃で１時間反応させて、β−ガラクトシダ
ーゼとＩＧＦ−１を切断した結果、分子量３８，０００
のβ−ガラクトシダーゼ蛋白質と分子量７，０００のＩ
ＧＦ−１蛋白質に分離されているのをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により確認した（図１１参照）。
【００６８】再生は図１４に示す通り４mMのβ−メルカ
プトエタノールにて２時間反応させた後、透析でβ−メ
ルカプトエタノールの濃度を低下させる方法により、Ｓ
Ｈ基を置換したジエタノールジスルフィド基の除去と同
時に蛋白質内ペプチド間のジスルフィド結合を誘発し
た。
【００６９】
【化１】
【００７０】実施例６ ＩＧＦ−１をヒドロキシルアミンで切断できうる形態の
融合蛋白質を生産するために、図１２に示す通りｐＹＪ
Ｍ−Ｉ１からＩＧＦ−１ ＤＮＡを含むＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ断片を分離してクレノー酵素で処理した後、Ａ
ｖａIIで処理して分離された２２０bpの断片に合成オリ
ゴヌクレオチド即ち、ＡＴＧＴＴＡＡＣＧとＧＴＣＣＧ
ＴＴＡＡＣＡＴを交ぜて連結した後、ｐＣＴ１０のクレ
ノー酵素で処理したＣｌａＩ位置に挿入して、発現ベク
ターｐＹＰＭ−Ｉ１プラスミドを製造した。このプラス
ミドにより生産されるβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−
１との融合蛋白質は、その間に合成オリゴヌクレオチド
由来のアスパラギン−グリシン残基があるため、ヒドロ
キシルアミンで切断する場合、アスパラギンとグリシン
の部位が切断されてＩＧＦ−１のみ分離することができ
る。
【００７１】このｐＹＰＭ−Ｉ１に含まれている大腸菌
細胞ＪＭ１０９を実施例４と同様に培養し、ＩＰＴＧに
より誘発した後、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融
合蛋白質の生産の可否をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した
（図１３参照）。生産された融合蛋白質の分子量は約４
５，０００ダルトンであった。
【００７２】実施例７ ｐＹＰＭ−Ｉ１プラスミドにより生産されるＩＧＦ−１
の分離は、実施例４と同様な方法で培養した後、実施例
５の方法により先ずβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１
融合蛋白質を部分精製した（図１４参照）。
【００７３】この融合蛋白質分画を透析し、尿素とβ−
メルカプトエタノールを除去した後凍結乾燥した。この
乾燥された融合蛋白質をヒドロキシルアミンと共に４５
℃で４時間反応させて、β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ
−１を切断した。切断された融合蛋白質の電気泳動像は
図１５に示す通り、約７，０００ダルトンＩＧＦ−１バ
ンドを有していた。
【００７４】ヒドロキシルアミンにより切断されたＩＧ
Ｆ−１とβ−ガラクトシダーゼの分離は、ＩＧＦ−１と
β−ガラクトシダーゼが混合した溶液に、ギ酸を加えて
pH２〜３程度に調整した後、０．５M の酢酸（pH２．８
８）−０．０７５M 塩化ナトリウムに透析させて、ＩＧ
Ｆ−１が溶解している状態でβ−ガラクトシダーゼ断片
の沈澱を誘導した。次いでこれを遠心分離して、図１６
に示すようにＩＧＦ−１を含む上澄液をＳＰ−セファデ
ックスＣ−２５イオン交換樹脂カラムに透析溶液を吸着
させ洗浄した後、０．２M の酢酸アンモニウムと０．２
M 塩化ナトリウムとを含む抽出溶液（pH５．０）でイオ
ン交換樹脂から抽出された溶液の２８０nm紫外線吸光度
を調査した後、そのピークを尿素−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
確認し、ＩＧＦ−１分画を決定、採取する。このときＩ
ＧＦ−１の分画ピークはpH４．０にて図１７に示す通り
である。
【００７５】図１７においてのピーク分画を採集して凍
結乾燥させた後、尿素−ＳＤＳ−ＰＡＧＡにより確認し
た結果、約７，０００ダルトンの位置にてＩＧＦ−１単
一バンドが現われた（図１７）。
【００７６】分離されたＩＧＦ−１を蒸溜水に溶解して
ＨＰＬＣにより確認した結果、純粋な状態で精製されて
いることを確認した（図１８）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の塩基配列及び
それを解釈したアミノ酸配列
【図２】肝細胞からポリＡ+ −ＲＮＡを利用したｃ−Ｄ
ＮＡライブラリーの製造
【図３】放射線同位元素で処理した１５−ｍｅｒプロー
ブを利用し、ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡを分離するためのコ
ロニー・ハイブリダイゼーションの写真
【図４】ＩＧＦ−１遺伝子の制限酵素地図作成
【図５】ＩＧＦ−１遺伝子及び周辺配列のＤＮＡ配列決
定
【図６】ＩＧＦ−１の発現ベクターであるｐＹＪＭ−Ｉ
４の製造過程を表わす系統図
【図７】ＩＧＦ−１の発現ベクターであるｐＹＪＭ−Ｉ
１のＩＧＦ−１遺伝子の５′側と３′側のＤＮＡ配列検
定
【図８】大腸菌から発現され、インクルージョンボデイ
に蓄積されたＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼ融合蛋
白質の電子顕微鏡写真
【図９】発現ベクターであるｐＹＪＭ−Ｉ４を利用し
て、ＩＧＦ−１を生産させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り確認した電気泳動写真
【図１０】インクルージョンボディーの精製 （Ａ）初めのセファクリルＳ２００を通したカラムのプ
ロフィールと電気泳動 （Ｂ）二番目のセファクリルＳ２００を通したカラムの
プロフィールと電気泳動
【図１１】ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白
質をエンテロキナーゼで加水分解した後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより確認した電気泳動写真
【図１２】ＩＧＦ−１の発現ベクターであるｐＹＰＭ−
Ｉ１の製造過程を表わす系統図
【図１３】ｐＹＰＭ−Ｉ１を利用してＩＧＦ−１を生産
した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した電気泳動写真
【図１４】セファクリルＳ２００を通してインクルージ
ョンボディーを精製した結果と電気泳動
【図１５】ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼとの融合
蛋白質をヒドロキシルアミンで切断した後、尿素−ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより確認した写真
【図１６】ＳＰ−セファデックスＣ−２５イオン交換樹
脂カラムを利用したＩＧＦ−１の精製過程
【図１７】ＩＧＦ−１の精製結果を示す電気泳動
【図１８】分離したＩＧＦ−１をＨＰＬＣにより純度を
測定した結果得たグラフ
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】放射性同位元素で処理した１５−ｍｅｒプロー
ブを利用し、ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡを分離するためのコ
ロニー・ハイブリダイゼーションのＸ線写真
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質
を発現し、インクルージョンボディに蓄積している大腸
菌の形態を示す電子顕微鏡写真
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】ＩＧＦ−１とβ−ガラクトシダーゼとの融合
蛋白質をヒドロキシルアミンで切断した後、尿素−ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより確認した電気泳動写真
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 (72)発明者 ヘウイ・ドン，パーク 大韓民国、ダエク−シティ、ブク−ク、ブ クヒョン−ドン、360−11 (72)発明者 スン・ヨン，イム 大韓民国、ソウル、トボン−ク、サンムン −ドン、102・ドン・サミク・セラミッ ク・アパート、ナンバー・509 (72)発明者 ヨウン・フーン，キム 大韓民国、ソウル、クァナク−ク、ボンチ ェオン・６−ドン、148−９、マ・ドン、 ジャンミウォン・アパート、ナンバー・ 103 (72)発明者 ミ・スン，ヨーン 大韓民国、ソウル、ノウォン−ク、ハガエ −ドン、６・ドン、チェオンク・アパー ト、ナンバー・1407

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトの肝細胞から抽出、単離したｍＲＮ
    ＡからＩＧＦ−１をコードするｃＤＮＡを製造し、この
    ｃＤＮＡを他の遺伝子との融合遺伝子の形で挿入した発
    現ベクターで大腸菌を形質転換した後、得られた形質転
    換体を適切な培地で培養してＩＧＦ−１を製造する方法
    であって、該発現ベクターが、ＩＧＦ−１遺伝子と上記
    他の遺伝子の間にエンテロキナーゼ認識部位を有するプ
    ラスミドであり、生成する融合蛋白質をエンテロキナー
    ゼによって切断し、次いで精製することを特徴とするＩ
    ＧＦ−１の製造法。
  2. 【請求項２】 他の遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ
    遺伝子を有し、エンテロキナーゼ認識部位として（Ａｓ
    ｐ)4−ＬｙｓをコードするＤＮＡ断片を有するベクター
    を発現ベクターとして用いる請求項１記載の製法。
  3. 【請求項３】 該発現ベクターがプラスミドｐＹＪＭ−
    Ｉ４である請求項１記載の製法。
  4. 【請求項４】 融合蛋白質中に存在するシステインのス
    ルフヒドリル基と結合するが、常温では容易に酸化され
    ないジスルフィド化合物と融合蛋白質とを、β−メルカ
    プトエタノール触媒の存在下で反応させて、融合蛋白質
    中のスルフヒドリル基間のジスルフィド結合形成を防止
    し、それによって酵素認識部位を酵素に対して露出する
    ことを特徴とする所望の蛋白質を酵素で分離する製法。
  5. 【請求項５】 ジスルフィド化合物がジエタノールジス
    ルフィド又はジチオビスニトロ安息香酸である請求項４
    記載の製法。
  6. 【請求項６】 請求項４の方法でＩＧＦ−１を分離する
    請求項１記載の製法。
  7. 【請求項７】 エンテロキナーゼでβ−ガラクトシダー
    ゼとＩＧＦ−１融合蛋白質を切断することにより分離さ
    れた、分子量が７，０００のＩＧＦ−１を、１０mMトリ
    ス−ＨＣｌ緩衝液に溶解して生成したＩＧＦ−１溶液を
    透析膜に入れ、４mMβ−メルカプトエタノールを含む１
    ０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．２）緩衝液に対して徐々に
    透析させ、システインのスルフヒドリル基に結合したジ
    エタノールジスルフィド基を除去し、それによってＩＧ
    Ｆ−１の再生を誘発し、かくして蛋白質を活性化する請
    求項６記載の製法。
  8. 【請求項８】 ヒトの肝細胞から抽出、単離したｍＲＮ
    ＡからＩＧＦ−１をコードするｃＤＮＡを製造し、この
    ｃＤＮＡを他の遺伝子との融合遺伝子の形で挿入した発
    現ベクターで大腸菌を形質転換した後、得られた形質転
    換体を適切な培地で培養してＩＧＦ−１を製造する方法
    であって、該発現ベクターがヒドロキシルアミンで切断
    しうる、ＡＡＣ ＧＧＡコドンを含むリンカーＤＮＡを
    有するベクターであり、生成する融合蛋白質をヒドロキ
    シルアミンで切断し、次いで精製することを特徴とする
    ＩＧＦ−１の製法。
  9. 【請求項９】 該発現ベクターがプラスミドｐＹＰＭ−
    Ｉ１である請求項８記載の製法。
  10. 【請求項１０】 ヒドロキシルアミンで切断しうるＡｓ
    ｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙをコードする合成リンカー
    を、ＡＡＣ ＧＧＡコドンを含むリンカーＤＮＡとして
    用いてβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合蛋白質を
    製造した後、Ａｓｎ−Ｇｌｙ残基間の部位を切断して、
    分子量７，０００を有し、グリシンをその最初のアミノ
    酸として有する成熟したＩＧＦ−１を得る請求項８記載
    の製法。
  11. 【請求項１１】 β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１の
    間でヒドロキシルアミンで切断されうる、Ａｓｎ−Ｇｌ
    ｙ残基を有するβ−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融合
    蛋白質を部分精製し、得られる蛋白質を、ＬｉＯＨを用
    いてpH９．０に調整した２M ヒドロキシルアミン−６M
    塩酸グアニジン溶液と反応させ、β−ガラクトシダーゼ
    とＩＧＦ−１の間に存在するＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間部位
    を切断する請求項８記載の製法。
  12. 【請求項１２】 β−ガラクトシダーゼとＩＧＦ−１融
    合蛋白質をヒドロキシルアミンで切断し、該溶液のpHを
    ギ酸を添加することにより２〜３に調整してＩＧＦを安
    定化し、得られた溶液を０．５M 酢酸（pH２．８８）−
    ０．０７５MＮａＣｌに対して透析して、β−ガラクト
    シダーゼ断片を析出せしめるようにし、次いで遠心分離
    して除去し、ＩＧＦ−１を含む上清液をＳＰ−セファデ
    ックスＣ−２５カラムを通過させてＩＧＦ−１をそれに
    吸着させた後、０．５M 酢酸（pH２．８８）−０．０７
    ５M ＮａＣｌでカラムを洗浄し、次いで、０．２M 酢酸
    アンモニウム−０．２M ＮａＣｌ（pH５．０）により溶
    出液から抽出してＩＧＦ−１を精製する請求項８記載の
    製法。
  13. 【請求項１３】 精製したＩＧＦ−１をさらに蒸溜水に
    対し透析した後、得られたＩＧＦ−１を０．１％トリフ
    ルオロアセテートを含むアセトニトリル／再蒸溜水０〜
    ６０％直線濃度勾配法により、ＬＫＢウルトラパックＴ
    ＳＫ ＯＰＳ−１２０Ｔの５μm カラムを用いて高速液
    体クロマトグラフィーにかける請求項１２記載の製法。
  14. 【請求項１４】 プラスミドｐＹＪＭ−Ｉ１（ＫＣＴＣ
    ０００４ＢＰ）。
  15. 【請求項１５】 プラスミドｐＹＪＭ−Ｉ４（ＫＣＴＣ
    ０００５ＢＰ）。
  16. 【請求項１６】 プラスミドｐＹＰＭ−Ｉ１（ＫＣＴＣ
    ０００６ＢＰ）。
JP3062434A 1990-03-05 1991-03-05 新規プラスミドの製造及びそれを含む菌株を培養してｉｇｆ−１を製造する方法 Pending JPH06113878A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019900002811A KR920003787B1 (ko) 1990-03-05 1990-03-05 신규 플라스미드 제조 및 그를 함유한 균주를 배양하여 아이 지 에프-1(igf-1)을 생산하는 방법
KR2811/1990 1990-03-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH06113878A true JPH06113878A (ja) 1994-04-26

Family

ID=19296650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3062434A Pending JPH06113878A (ja) 1990-03-05 1991-03-05 新規プラスミドの製造及びそれを含む菌株を培養してｉｇｆ−１を製造する方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPH06113878A (ja)
KR (1) KR920003787B1 (ja)
GB (1) GB2241703A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004503219A (ja) * 2000-06-19 2004-02-05 ダイアックス　コーポレーション 新規エンテロキナーゼ開裂配列

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
KR100755727B1 (ko) * 2006-03-06 2007-09-06 (주)케어젠 β-갈락토시다제 유래의 융합 단편 펩타이드 및 이를 융합파트너로 이용하는 재조합 단백질의 제조방법
US8481297B2 (en) 2009-01-08 2013-07-09 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus
US20120171246A1 (en) 2009-09-10 2012-07-05 Yale University Immunization to reduce neurotoxicity during treatment with cytolytic viruses
CA2876209A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
SG11201506991VA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
US10874621B2 (en) 2013-10-17 2020-12-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cationic nanoparticles for co-delivery of nucleic acids and therapeutic agents
EP3721875B1 (en) 2014-05-09 2023-11-08 Yale University Particles coated with hyperbranched polyglycerol and methods for their preparation
US20180126014A1 (en) 2015-04-15 2018-05-10 Yale University Compositions for enhancing delivery of agents across the blood brain barrier and methods of use thereof
WO2017095751A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Partikula Llc Compositions and methods for modulating cancer cell metabolism
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2018053434A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 The Johns Hopkins University Protein nanocages with enhanced mucus penetration for targeted tissue and intracellular delivery
US20200085758A1 (en) 2016-12-16 2020-03-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
WO2018196782A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 The University Of Hong Kong Use of hcn inhibitors for treatment of cancer
US11478433B2 (en) 2017-06-23 2022-10-25 Yale University Nanomaterials with enhanced drug delivery efficiency
US20230172870A1 (en) 2021-12-08 2023-06-08 Yale University Surface conjugation to poly(amine-co-ester) nanoparticles for targeting to cells and tissues
WO2023147552A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Radiosensitizing compositions and methods of use thereof
WO2024112867A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for increasing immune responses

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL71991A (en) * 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
SE8303626D0 (sv) * 1983-06-23 1983-06-23 Kabigen Ab A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced
DK108685A (da) * 1984-03-19 1985-09-20 Fujisawa Pharmaceutical Co Vaekstfaktor i
EP0196056B1 (en) * 1985-03-28 1991-05-22 Chiron Corporation Improved expression using fused genes providing for protein product
EP0207044A1 (en) * 1985-06-20 1986-12-30 Monsanto Company Release of peptides from polypeptides
EP0212532A1 (en) * 1985-08-12 1987-03-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for producing fusion proteins
DE3681398D1 (de) * 1985-10-21 1991-10-17 Fujisawa Pharmaceutical Co Verfahren zur herstellung von insulinaehnlichem wachstumsfaktor i (igf-i) und plasmid zu dessen herstellung.
US4828988A (en) * 1986-05-15 1989-05-09 Smith Kline - Rit Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine
EP0264074B1 (en) * 1986-10-09 1992-12-30 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Expression vector for insulin-like growth factor i

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004503219A (ja) * 2000-06-19 2004-02-05 ダイアックス　コーポレーション 新規エンテロキナーゼ開裂配列

Also Published As

Publication number Publication date
KR920003787B1 (ko) 1992-05-14
GB9104524D0 (en) 1991-04-17
KR910016924A (ko) 1991-11-05
GB2241703A (en) 1991-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH06113878A (ja) 新規プラスミドの製造及びそれを含む菌株を培養してｉｇｆ−１を製造する方法
WO1985000831A1 (en) Microbial expression of insulin-like growth factor
JPH02500876A (ja) 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法
JPH06507304A (ja) 合成生物接着性ポリペプチド
JPS62502538A (ja) 新規インシユリン誘導体およびこれら誘導体を含有する医薬製剤
JPH02460A (ja) ポリペプチドおよびその製造法
JP2003511018A (ja) インスリンおよびインスリン類似体の製造を改善するｃペプチド
JPS6131090A (ja) 新規なポリペプチドの発現方法
JP2565666B2 (ja) ヒト酸性繊維芽細胞成長因子をコードする人工ｄｎａそれを含むプラスミド及び宿主を用いて生産される組換えヒト酸性繊維芽細胞成長因子
JPS62174026A (ja) 白血球減少症治療剤
US7282481B2 (en) Heparin-binding proteins modified with sugar chains, method of producing the same and pharmaceutical compositions containing same
KR20010052635A (ko) 아연 결합이 향상된 신규한 인슐린 동족체
JPH07138295A (ja) 新規なヒトタンパク質およびそれをコードする遺伝子
CA2000309A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
CN113735960A (zh) 一种fgf重组蛋白治疗nash的应用
EP1071718A1 (en) Matrix binding factor
US5045471A (en) Cloned DNA for P450scc and expression thereof
AU2020256316B2 (en) Molecular design of recombinant protein drug
JP2864152B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2002526074A (ja) 新規のヒト肝臓癌誘導生長因子のコード配列、そのコードされるポリペプチド、およびこれらの製造方法。
JPS6314694A (ja) トロポエラスチンのｃＤＮＡ
JPH03240800A (ja) 成長ホルモン様糖タンパク質
JP3352713B2 (ja) ペプチドの製造法
FI75185B (fi) Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens.
JPS60137292A (ja) 新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸、該ポリデオキシリボ核酸を含む複製可能な組換ｄνａ、該複製可能な組換ｄνａで形質転換された微生物または細胞、新規生理活性ポリペプチド及びその製造方法