JPH03240800A - 成長ホルモン様糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な魚類の脳下垂体由来の成長ホルモン様
タンパク質、より詳細にはカレイ目ヒラメ科魚類の脳下
垂体由来の成長ホルモン様糖タンパク質、そのアミノ酸
配列をコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ組換え
ベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換
体、該形質転換体を利用して産生された新規な魚類の脳
下垂体由来の成長ホルモン様タンパク質及びその製造法
に関する。

本発明は、また上記新規な成長ホルモン様タンパク質を
用いた魚類をはじめとする動物の成長促進方法にも関す
る。

（従来技術及び発明が解決しようとする課題）現在、魚
類から哺乳動物類に濁るまで数多くの成長ホルモンが単
離されるとともに、その多くのものについてはそれらの
遺伝子の構造までもが明らかにされてきている。これは
これら成長ホルモンが成長促進効果を有するので、魚類
養殖業及び畜産業にあっては魚類、家畜の成長促進ある
いは可食部位の増加などの応用が期待しうるからである
。更にまた、ヒトにおいては、小人症などの治療に有用
であるなどの効果が示されてもきている。このようなこ
とからその成長ホルモンを大量に取得する目的での研究
開発がなされてきている。

しかしながら、Ｔ、Ｂ１５ｔｒｉｚｅｒらの報告（Ｔｈ
ｅ　　Ｌａｎｃｅｔ、１３，３２１−３２３　（１９８
８））などでは、成長ホルモン欠如の状態で正常な生育
を示す個体が存在することから、成長ホルモン以外の成
長因子の存在が主張されてきている。

そこで本発明者らは、従来の成長ホルモンよりも更に大
きな作用効果を持つ成長因子あるいは新しい生理作用を
持つホルモンが存在するのではないかと考え、もしこの
ような物質が得られ更にそれを大量に取得しえるならば
、科学発展の上からのみでな〈産業上の有用性も大きい
と考えて鋭意研究を進めた結果、ヒラメの脳下垂体より
新規な成長ホルモン様糖タンパク質を発見し、更にはそ
の成長ホルモン様タンパク質のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子のクローニングに成功すると共に、それを大量
に生産する方法を開発したのである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、カレイ目ヒラメ科魚類の、特にヒラメの脳下
垂体に、新しい成長ホルモン様糖タンパク質が存在する
ことを見出すと共に、それを単離精製し、更にはその成
長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列及び糖鎖付加
位置をコードする遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝
子組換え技術を用いてクローニングし、その遺伝子を発
現させることに成功し、容易且つ大量に高純度の目的成
長ホルモン様タンパク質を製造することを可能にしたの
である。　本発明は、更に上記のようにして脳下垂体か
ら得られた成長ホルモン様糖タンパク質及び上記のよう
にして遺伝子組換え技術を利用して得られた成長ホルモ
ン様タンパク質が、共に良好な動物、特に魚類の成長促
進活性を示すことを確認してなされたものである。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質は、以下に示す各
種の方法により分離精製することができる。

該方法としては、例えば上記成長ホルモン様糖タンパク
質を含有する組織あるいは細胞、例えばカレイ目ヒラメ
科魚類であるヒラメの脳下垂体を出発原料として、各種
のタンパク質の分離精製法として知られた方法を適用し
て行うことができる。

これらタンパク質の分離精製法としては、ホモジュナイ
ザー、超音波細胞破砕等による可溶化処理、各種塩類を
含んだ緩衝液による抽出処理、酸またはアルカリによる
可溶化あるいは沈澱処理、更には有機溶媒による抽出あ
るいは沈澱処理、硫安等による塩析、透析、メンブレン
フィルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー、向流分配り、ロマトグラフィー、裏速液
体クロマトグラフィー、等電点あるいはゲル電気泳動な
どがあげられ、それらは単独であるいは適宜組み合わせ
てもちいられる。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質の分離精製法をよ
り詳しく説明すると、ヒラメから通常の方法で得られた
脳下垂体は、液体窒素あるいはドライアイス・アセトン
ただちに凍結して使用時まで約−８０９Ｃ程度で保存す
る。次にこの脳下垂体冷却下破砕し、アセトン等の有機
溶媒を眉いて脱脂した後遠心する。こうして得られた沈
澱をタンパク質分解酵素阻害剤存在下緩衝液に懸濁し水
酸化ナトリウム等を用いてアルカリ抽出処理を行なう。

抽出液は必要により遠心分離処理等を行い、透析処理し
た後、凍結乾燥処理する。

次にこの生成物を適当な緩衝液に溶解したのち、ゲル濾
過クロマトグラフィー、例えばセファデックスＧ−１０
０カラムのクロマトグラフィーにかける。溶出分画は２
８０ｎｍにおける吸光度をモニターすることにより、測
定して分取しえる。次にこのようにして得られた画分の
うち、目的の成長ホルモン様糖タンパク質を含有する画
分を凍結乾燥処理する。

次にこの生成物を適当な緩衝液に溶解したのち、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　、例えばＯＤＳ　
１２０Ｔ等の化学修飾シリカゲルを充填剤として使用し
た高速液体クロマトグラフィーにかける。溶出液を２２
０ｎｍにおける吸光度でモニターすることにより、目的
とする成長ホルモン様糖タンパク質を含有する画分を集
める。

このようにして得られた成長ホルモン様糖タンパク質は
、各種の物理化学的分析にかけることにより、その性質
を測定することができる。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質は、ＳＤＳボリア
クリルアミドゲル電気泳動の結果、約２８．０００ダル
トンの分子量を持つものであると推定される。また、上
記高速液体クロマトグラフィーによって得られたタンパ
ク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一
バンドを与える。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質は、また等電点ゲ
ル電気泳動によってその等電点が６．５であるとか推定
される。

上記のようにして精製分離して得られた成長ホルモン様
糖タンパク質は、それを塩酸等の酸、ペプシン、トリプ
シン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ等のタ
ンパク質分解酵素等で加水分解したのち、得られたペプ
チド断片をイオン交換クロマトグラフィー等のクロマト
グラブイ−にかけて分離したのち、各得られたペプチド
断片についてアミノ酸自動分析機などにかけて、そのア
ミノ酸組成を分析すると共にそのアミノ酸配列を決定す
ることができる。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸組成の
分析法をより詳しく説明すると、先ず精製された該成長
ホルモン様糖タンパク質を塩酸でもって加水分解したの
ち、フェニルイソチオシアネート（Ｐ　Ｉ　ＴＣ）を反
応させて、アミノ酸をそれぞれ対応するフェニルチオカ
ルバミル誘導体に変換し、それを逆相高速液体クロマト
グラフィーにかけて定量する方法（ＰＩＴＣ法）があげ
られる。

このようにして得られた本発明の成長ホルモン様糖タン
パク質のアミノ酸組成は第１表に示すとおりのものであ
る。

第１表 この表かられかるように、本発明の成長ホルモン様糖タ
ンパク質は、７個のシスティンを持ち、更にグルタミン
酸、ロイシン、セリンに富むと（１う成長ホルモン様の
特性を有している。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列を
決定するには、通常のベプチドシークエンサ〜を使用す
ることによって行うことができるが、特に気相ベプチド
シークエンサーが好適に使用できる。

このようなベブチドシークエンサーによれば、タンパク
会のＮ末端からのアミノ酸配列を決定することができる
。

次にこのような手法で決定された本発明の成長ホルモン
様糖タンパク質のＮ末端側の２３個のアミノ酸残基の配
列は、次のとうりのものである。

Ｉ　ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−３
ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ本発明の成長ホ
ルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝
子は、以下に示す各種の方法により製造することができ
る。

該方法としては、例えば上記成長ホルモン様糖タンパク
質の産生細胞であるカレイ目ヒラメ科魚類であるヒラメ
の脳下垂体からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型
としてｃＤＮＡを合成し、次ぎにこれを適当なベクター
に接続して宿主細胞内で増殖させ、目的の成長ホルモン
様−タンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを
含有するクローンを選別し、該クローンの有するベクタ
ーより単一する方法、本発明の単離精製法により魚類よ
り得られた成長ホルモン糖様タンパ、り質のアミノ酸配
列分析の結果得られたちけんより、適当なりＮλプロー
ブを合成し、そのプローブを用いて遺伝子今イブラリ−
を検索し、目的の成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ
酸配列をコードするｃＤＮＡを含有するクローンを選別
し、該クローンより当該遺伝子を単離する方法、本発明
の成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列をコード
する遼−子のＤＮＡに基づいて、例えばリン酸トリエス
テル法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３４．３１４３’（
１９７８）、Ａｄｖ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　３６．　１３５　　（１９７９）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１
０，２５９７．６５５３（１９８２））、ホスホアミダ
イト法（Ｎａｔｕｒｅ、３１０，１０５　（１９８４）
）等の常法に従って、核酸の化学合成を行う方法、これ
らの方法を組合せた方法等があげられる。

以下に、上記ヒラメの脳下垂体から該遺伝子を調製する
方法について詳述する。

本発明の遺伝子を入手するためには、ヒラメの脳下垂体
からＲＮＡを抽出する必要があるが、そのヒラメとして
は養殖のものでも天然のものでもいずれのものも好適に
使用することができる。ヒラメから脳下垂体を摘出する
にあたっては、常法に従って行うことができ、こうして
摘出された脳下垂体は、直ちに液体窒素、ドライアイス
・アセトン等を用いて凍結させたのち、必要に応じ約−
８００Ｃ程度で使用時まで保存することができる。

上記のようにして得られた脳下垂体からＲＮＡを抽出す
るにあたっては、通常の方法によって行うことができる
が、このような方法としては、ポリソームの分離、ショ
糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげら
れる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出法としては、グ
アニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣ１密度勾配遠心
を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、１８．５２９４　（１９７９））、バナジウ
ム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤で処理したのちフェノール処理を行う方法
（Ｂｅｒｇｅｒ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒＬ　　１８，５１４３　（１９７９））、グアニジ
ン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジ
ン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・
チオシアネート−フェノール・クロロホム法、グアニジ
ン・チオシアネートで処理した後塩化リチウムで処理し
てＲＮＡを沈澱させる方法などをあげることができる。

上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法をより詳しく説明
すると、先ず凍結脳乍垂体をグアニジン・チオシアネー
ト溶液中で機械的に破砕して可溶化し、次に塩化リチウ
ムを加え、必要に応じて遠心して細胞質ＲＮＡを沈澱と
して得る。　次にこのようにして得られた沈澱物を必要
に応じてフェノール抽出処理した後にエタノール沈澱に
かけて、ＲＮＡを沈澱物として得る。

このようにして得られたＲＮＡから、更にはポリＡ鎖を
有するＲＮＡを、通常の方法にしたがって精製する。

このような方法としては、オリゴｄＴセルロース等を用
いるアフィニティカラムクロマトグラフィー法が有利に
使用できる。

次にこのようにして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡは、これ
を鋳型として逆転写酵素（リバーストランスクリブター
ゼ）をもちいて二本鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の合成に用
いられる。このｃＤＮＡの合成方法としては、通常の方
法にしたがって行うことができ、先ずオリゴ（ｄＴ）あ
るいはベクターブライマーをブライマーとして、例えば
ＡＭＶ、ＭＭＬＶあるいはＲ３Ｖ等に由来する逆転写酵
素を用いて第−鎖のＤＮＡを合成し、次にフレノウフラ
グメントで処理して、二本鎖ＤＮＡとした後Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで処理した後Ｓ１ヌクレアーゼ処理するか、あ
るいはＳ１ヌクレアーゼで処理した後ターミナルトラン
スフェラーゼで処理するか、あるいは上記逆転写酵素を
用いて得られた第−鎖のＤＮＡ含有物にＤＮＡポリメラ
ーゼ■、リボヌクレアーゼＨ及びＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮ
Ａリガーゼを作用させる等の方法によって行うことがで
きる。このような方法としては、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｇｙ、Ｖｏｌ、１５２，３０７〜３３
５、Ｅｄ、ｂｙ　　５ｈｅｌｂｙ　　Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒ
　　ｅｔａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎ
ｃ、１９８７年　に記載された方法があげられるが、実
用上はこのｃＤＮＡの合成は、例えばアマジャム・ジャ
パン社等から市販されているｃＤＮＡ合成キットを利用
することが便利である。

次に上記のようにして得られたｃＤＮＡは、これを適当
なベクターに挿入、次にこのようにして得られたベクタ
ーを適当な宿主に導入してクローニングすることにより
増幅し、ついでスクリーニングを行って目的の成長ホル
モン様着タンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮ
Ａを含有する組換え宿主を選択し、次にその組換え宿主
のプラークあるいはコロニーから当該成長ホルモン様糖
タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離す
ることができる。

上記ｃＤＮＡを挿入するのに用いられるベクターとして
は、通常使用せられる各種プラスミドベクター等があげ
られ、例えばｐＢＲ３２２，λバクテリオファージベク
ター　λｇｔｌＯ，λｇｔｌ１等が好適に使用できるま
た、ここで使用される宿主としては、特に限定されず、
上記組換えベクターが自律複製できるものであればよく
、このような宿主としては例えば、大腸菌が好適に使用
できる。

特に上記ベクターとしてλｇｔｌＯＤＮＡを用いた場合
には、宿主として大腸菌ＮＭ５１４株が好適に使用でき
る。

上記ｃＤＮＡをベクターに挿入するにあたっては、同一
制限酵素を用いて生ずるところの接着末端を利用するか
、必要に応じて合成のリンカ一部あるいはアダプター部
を付加したり、ホモポリマーを加えたりする等の通常の
方法を用いて行うことができる。

例えば、より詳しくはｃＤＮＡの両末端にＴ４リガーゼ
を用いてＥｃｏＲＩリンカ−を付加した後、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化処理し、これに同じく制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１で切断されたベクター断片をライゲーションして、
目的組換えベクターとすることができる。

こうして得られた組換えベクターを宿主に導入するには
、通常使用せられる各種の方法が使用できる。

このような方法としては、例えば　Ｈａｎａｈａｎｅｔ
　　ａｌ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６．５５７　（
１９８３）に従ったＣａＣ１ｇ又はＲｂＣｌを共存させ
て調製されたコンピテント細胞に、これらベクターを取
り込ませる方法、適当な増殖期にある宿主をＭｇ５Ｏ。

等で処理して後、組換えファージベクターを感染させる
方法等があげられる。

次に当該成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを含有する組換え体をスクリーニング
して選択する。この選択にあたっては、公知の各種の方
法を適用することにより行うことができ、例えば化学合
成したオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーま
たはプラーク　ハイブリダイゼーション法、ハイブリダ
イゼーション・トランスレーションアッセイ法、プラス
・マイナス法等によって有利に実施することができるよ
り詳しくは、組換え体のプラークのＤＮＡを、ナイロン
メンブレン等のフィルター上に固定し、次にこれを標識
したプローブと反応させ、このプローブと選択的に結合
するＤＮＡ配列を有する組換え体を選択すや。

上記ここで使用されるプローブとしては、目的のＤＮＡ
配列に対して相補的な配列を有する核酸配列のことを指
し、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また化学合成したもの
でも天然のものでも、あるいは組換えＤＮＡの手法で得
られたものでもよいが、公知の方法を適用して化学的に
合成されたＤＮＡ配列を用いるのが一般的であり好まし
い。

ここで化学的にプローブのＤＮＡ配列を合成するにあた
っては、目的とする前記成長ホルモン様糖タンパク質の
アミノ酸配列、特にヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質
のアミノ酸配列に基づいてその配列を決めることができ
る。

以上のようにして選別された組換え体から得られた本発
明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバー
ト法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌクレオチド・
チエインターミネーシタン法（Ｓａｎｇｅｒ、５ｃｉｅ
ｎｃｅ、２１４．１２０５　（１９８１）、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ａｓ、５６
０〜５８０　（１９８０）、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、ｅｔ
　　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、９，３０
９　（１９８１）等によって決定することができる。

かくして決定された本発明の成長ホルモン様糖タンパク
質、特にヒラメ由来の成長ホルモン様糖タンパク質の遺
伝子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、第４図に示
される通りである。その配列は、ヒラメ由来の成長ホル
モン様糖タンパク質の前駆体のＤＮＡ配列及びアミノ酸
を包含している。このＤＮＡ配列中塩基第１番目から第
７２番目に相当するアミノ酸配列部分がシグナルペプチ
ドであり、その塩基第７３番目から１１ｊ６９３番目に
相当するアミノ酸配列部分が成熟タンパク質である。上
記ヒラメ由来の成長ホルモン様糖タンパク質は、先ず上
記前駆体として生合成され、その後シグナルペプチド部
分が除去されて、分泌性のタンパク質となることが明か
となっている。

このＤＮＡ配列から決定されるアミノ酸配列は、既に天
然物から決定された該成長ホルモン様糖タンパク質のア
ミノ酸配列と完全に一致し、こうして組換え体より得ら
れた該ｃＤＮＡは、ヒラメ由来の成長ホルモン様糖タン
パク質のアミノ酸配列をコードしていることが確認され
た。

また、このＤＮＡ塩基配列は、過去に発見されている成
長ホルモン、プロラクチンなどと有意の相同性を待ち、
特に哺乳類であるラットの成長ホルモンとは有意な相同
性が認められた。

ところで、遺伝子組換え技術によれば、ＤＮＡ鎖の切断
、削除、付加及び結合、更にはＤＮＡ鎖中の塩基の置換
は、通常の手法にしたがって行うことができるので、本
発明の遺伝子は、第４図に示された塩基配列を有する遺
伝子に関するのみでなく、本発明の目的を逸脱しない範
囲で上記したような改変・修飾を加えたものにも関する
。

本発明の遺伝子に含まれ、第４図に示された塩基配列を
有する遺伝子の改変・修飾として特に好ましいのは、目
的とするタンパク質の安定性、生物学的活性を高めるよ
うなものが挙げられる。

本発明の成長ホルモン様タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子は、上記組換えベクターより制限酵素を
用いて、通常の方法にしたがって処理することにより大
量に得ることができ、こうして得られた遺伝子は、遺伝
子組換え技術によって利用されて、高純度で且つ大量の
成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質を製造することができる。

このように本発明の遺伝子を利用するに当たっては、通
常の遺伝子組換え技術において用いられている各種の方
法を使用することができる。

本発明の遺伝子は、適当な発現用ベクターに組換えられ
、次に適当な発現用宿主にその組換えベクターを導入し
て形質転換し、得られた組換え体を培養し、適当に発現
誘導することにより、目的のタンパク質を取得すること
ができる。

本発明の遺伝子を用いて目的のタンパク質を宿主中で産
生させるにあたっては、成熟タンパク質として、即ちシ
グナルペプチドを取り去った形で生産させることもでき
るし、上記シグナルペプチドをそのまま利用したりある
いは適当な宿主細胞等に適合したシグナルペプチドを付
加して宿主細胞等から分泌産生させることもできる。

このような場合において、それに用いる遺伝子のＤＮＡ
配列人には、開始コドン及び終止コドンが必要で、必要
に応じてそれらは公知の方法を用いて付与される。

上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドとして好適
に使用されるものとしては、細胞の分泌タンパク質前駆
体のものがあげられ、・例えば大腸菌β−ラクタマーゼ
、リン酸結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、バ
チルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陽性細菌及びグ
ラム陽性細菌に関連したものが挙げられる。

更にまた、例えばインターフェロン、インターロイキン
２、プロインシュリン、各種ホルモンと一緒に宿主細胞
中で当該遺伝子を発現させることもできる。

本発明の遺伝子を発現用ベクターに組換えるにあたって
は、公知の遺伝子組換え技術で用いられる通常の方法に
従って行うことができ、例えば各種制限酵素によるライ
ゲーション処理等があげられる。

ここで利用される発現用ベクターとしては、宿主中で自
律複製できるものであれば特に制限なく使用できるが、
そのベクター中に複製起源、選択マーカー、プロモータ
、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナルなど
を有するものが好ましく使用できる。

またこれらベクターとしては、各種バクテリア出来のも
の、バクテリオファージ由来のもの、動物ウィルス由来
のものがあげられ、各種ウィルスベクター、各種プラス
ミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター等
があげられる。

またこれらベクターとしては、大腸菌、特にＥＫ型プラ
スミドベクター、λｇｔタイプファージベクター、緑膿
菌由来のベクター、枯草菌由来のベクター、酵母由来の
ベクター、ＳＶ４０由来のベクター等があげられる。

上記ベクターで利用できるプロモーターとしては、トリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（１ａ
Ｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａ
Ｃ）プロモーター、バクテリオファージ由来のラムダ（
λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に良く知られた
ものが挙げられる。

これらの遺伝制御配列は、適宜それらを組み合わせたり
、あるいは化学的に修飾したりして適当なベクターに組
み込んで、本発明の遺伝子発現用のベクターを構築する
ことができる。

本発明の遺伝子発現用のベクターには、さらに複数個の
本発明の遺伝子を組み込んでその発現を行うこともでき
る。

本発明の成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列を
コードする遺伝子発現ベクターは、これを適当な宿主、
特に宿主細胞に通常知られた方法に従って導入して、そ
の宿主細胞を形質転換させ、次にそのようにして形質転
換された宿主細胞を培養等の方法により増殖させること
等により、大量に形質転換体と呼ばれる該成長ホルモン
様タンパク質のアミノ酸配列を有するペプチド産生能を
有する細胞を得ることができる。

ここで使用される宿主、特に宿主細胞としては、大腸菌
あるいは大腸菌以外のダラム陰性細菌、枯草菌、放線菌
等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等の真核細胞の
いずれでもよいが、大腸菌が好適に使用できる。

上記宿主への本発明の遺伝子発現ベクターの及びこれに
よる形質転換方法としては、通常遺伝子組換え技術の分
野で使用せられている方法を用いることができ、例えば
コンピテント細胞と上記ベクターとを混合したり、細胞
をプロトプラスト化したのち、上記ベクターを担体に結
合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシウム共
沈法等を用いて行うことができる。

このようにして得られた形質転換体は、その外来遺伝子
の発現を抑制した状態で増殖したのち、該遺伝子の発現
を誘導することもできる。

この形質転換体の増殖あるいは培養は、通常の各種の細
胞培養用培地を眉いて行うことができ、そのようなもの
としては、例えば炭素源、窒素源、ビタミン、アミノ酸
、核酸塩基、無機塩などを含有し、適宜肉汁、ペプトン
、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エキス、バレイショ、
麦芽汁、牛乳、血液、血清、ホルモン、抗生物質などを
加えたものがあげられるが、好適な培地は一般に広く市
販されているものを使用してそれをそのままあるいは適
当に改変して用いることができる。

上記形質転換体の増殖又は培養にあたっては、該形質転
換体の生育に適したｐＨ１温度、通気、攪拌、培地交換
の頻度等の条件は、実験等により適宜決定することがで
きる。

上記形質転換体を増殖又は培養することにより、あるい
は該遺伝子の発現を誘導することにより産生された本発
明の遺伝子発現に基づくタンパク質は、通常の操作によ
り分離採取することができる。

この分離採取法としては、例えば細胞の超音波破砕、機
械的破砕、凍結及び融解による方法、浸透圧ショック等
による方法のほか、培養上清から、例えばタンパク質沈
澱剤を用いて沈澱処理する等して分離する方法などがあ
げられる。

上記の分離方法に加えて一更に目的とするタンパク質は
、その物理学的性質や化学的性質を利用して、一般に広
く採用されている各種分離精製方法を適用して精製をす
ることができる。

このような分離精製方法としては、上記した硫安等の蛋
白沈澱剤を用いる沈澱処理のほか、限外濾過処理、ゲル
濾過処理、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー、電気泳動等あるいはそれらの
組合せを用いることができる。

本発明の成長ホルモン様タンパク質、特にカレイ目ヒラ
メ科魚類の脳下垂体由来の成長ホルモン様タンパク質は
、その生物活性を次ぎに示すような方法で容易に確認す
ることができる。これは、ヒラメ幼魚を個体識別しうる
ようになしてから、その幼魚の腹腔内あるいは筋肉内に
投与した後、その体重増加及び体長増加を測定すること
により行うことができる。

この場合の投与量としては、適宜選択して決めることが
できるが、例えばヒラメ脳下垂体から抽出分離精製され
た成長ホルモン様糖タンパク質の場合、魚体重１ｇ当た
り約０．０１μｇを、遺伝子組換え手法によって得られ
た成長ホルモン様タンパク質の場合、魚体重１ｇ当たり
約０．１μｇを４日毎に与えることができる。

実施例 以下に具体的に実施例を記載し、本発明の詳細な説明す
る。

実施例１ ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質の抽出１年齢のヒラ
メ４６０尾より脳下垂体３．３ｇを摘出し、ただちに液
体窒素で凍結後、使用時まで一８０°Ｃで保存した。こ
の脳下垂体３．３ｇを水冷中で磨砕後、１００ｍ１の水
冷アセトンで脱脂し、日立製作所製遠心分離機　ｈｉｍ
ａｃｓｃＲ２ＯＢ　　で１５．００Ｏｒｐｍ、１０分間
、０°Ｃで遠心分離する。　得られた沈澱を５ｍＭＥＤ
ＴＡ液５０ｍ１に液温０、懸濁液を水酸化ナトリウムで
ｐＨ９〜ＩＯに調整し、４°Ｃで１時間アルカリ抽出を
行った。抽出液５５ｍ１を上記製遠心分離機で１５．０
０Ｏｒｐｍ、２０分間遠心分離し、その上清４５ｍ１を
蒸留水３１で２４時間４°Ｃにおいて透析した。透析物
を凍結乾燥し、４８３ｍｇの粉末を得た。

実施例２ ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質の精製実施例１で得
た粉末４８３ｍｇを１０ｍ１の０．０５Ｍ酢酸アンモニ
ウム水溶液（ｐＨ９，０）に溶解し、００５Ｍ酢酸アン
モニウム水溶液（ｐＨ９，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−１００（ファルマシア社製）カラム（２，４６
Ｘ６３ｃｍ）にかけ分画した。溶出条件は前流２０　Ｇ
ｍ　ｌ流速１８ｍ１／時とし、試験管１本当たりの分取
量を４ｍｌとし、２８０ｎｍの吸光度でタンパク質含量
を測定し、５つの画分を得た。（第１図） 第１図に示す画分３を凍結乾燥し、２２２ｍｇの白色粉
末をえた。次にこれを０ＤＳ１２０Ｔ（東ソー社製）カ
ラム（０，４６Ｘ２５ｃｍ）の高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）にかけ精製した。ＨＰＬＣの溶出条件
は、０．　１％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル　２
０〜８０％　直線勾配、カラム温度４０°Ｃ１流速１ｍ
１Ｚ分とし、２２０　ｎｍの吸光度でタンパク質含量を
測定し、ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質　８ｍｇを
分取した。（第２図） 第２図に示す画分Ａは、下記に、示すような物理化学的
性質を示した。

実施例３ 分子量と等電点の測定 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で実施例２で得
られた画分Ａを展開し、ヒラメ成長ホルモン様糖タンパ
ク質は約２８，０００ダルトン（２８Ｋ）の分子量を持
つことが分かった。なお、漂準分子量マーカーとしては
、ファルマシア社製着色済み分子量７１−カーＬＭＷｋ
ｉｔＥ、分子量９４，０００．６７．０００；４３゜０
００；３０＝　０００；２Ｇ、０００；１４．ｏｏｏを
用いた。

また同時に、実施例２で得られた画分ＡはＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを与えた。

該ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質は等電点ゲル電気
泳動により等電点が６．５であることが分かった。

実施例４ アミノ酸組成の分析 該ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質０．１ｇｇを０、
　６％フェノールを含む６Ｎ塩酸２０ｎ１により１１０
°Ｃで１８時間加水分解したのち、フェニルイソチオシ
アネート（ＰＩＴＣ）でアミノ酸をフェニルチオカルバ
ミル誘導体に変換後、逆相ＨＰＬＣで定量するＰＩＴＣ
法に従った。ＨＰＬＣの条件はカラムＴＳＫ　　０ＤＳ
８０Ｔ（東ソー社製、０．４Ｘ２５ｃｍ）、溶出条件は
Ａ液０．１４Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，４，アセトニト
リル＝９０　：　１０　（０，０５％トリエチルアミン
を含む）Ｂ［６０％アセトニトリルを用い、イニシャル
　Ａ液１００％　−Ｂ液８０％とし、２０分、直線グラ
ジェントで行い、カラム温度４５°Ｃ９流速　１ｍ１／
分とし、２５４　ｎｍにおける吸光度でアミノ酸の含量
を測定した。　結果を次表に示した。

表 アミノ酸組成 津製作所製気相ベブチドシークエンサーにかけて、Ｎ末
端側アミノ酸配列を決定した。

決定されたＮ末端側２３個のアミノ酸配列は、次のとう
りである。

１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｉ　Ｉｅ−３ｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ該ヒラメ成長ホル
モンモジタンパク質は７個のシスティンを持ち、グルタ
ミン酸、ロイシン、セリンに富むという成長ホル、セン
様の性質を示した。

実施例５ Ｎ末端アミノ酸配列の決定 該ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質　ＩＯμｇを島実
施例６ ヒラメ脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーの作製ヒラメ脳下
垂体よりＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＲＮＡ抽出キットを用い
全ＲＮＡを抽出した。

ヒラメ脳下垂体１．０ｇを２０ｍ１のグアニジン・チオ
シアネート溶液（グアニジン・チオシアネート、８％β
−メルカプトエタノールからなる溶液）中水浴上で破砕
し、０．３容量のエタノールを加え日立製作所製遠心分
離機　ｈｉｍａｃｓｃＲ２０Ｂで１０．００Ｏｒｐｍ、
５分間、０°Ｃで遠心し沈澱させたのち、上清を除きさ
らに上記グアニジン・チオシアネート溶液に懸濁し、塩
化リチウム溶液３０ｍ１を加え、Ｏ’Ｃｌ６１？間静置
してＲＮＡを選択的に沈澱させた後、日立製作所製遠心
分離機　ｈｊｍａｃｓｃＲ２０Ｂで１０．ｏｏｏｒｐｍ
、９０分間遠心分離する。次に得られた沈澱を、尿素を
含む塩化リチウム溶液３５ｍ１に溶解し、上記遠心分離
機で１０．００Ｏｒｐｍ、６０分間、４°Ｃで遠心分離
し、上清を除いた後ＲＮＡバッファ　　５ｍｌに溶解し
、フェノール抽出（フェノール５ｍｌ、室温で６０分間
抽出２回）、クロロホルム抽出（クロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：　１）５ｍｌ、５秒間混合）つ
いでエタノール沈澱（エタノール２０ｍ１，２Ｍ酢酸ナ
トリウムｐＨ５，０，０，５ｍｌ、−２０’　Ｃで１６
時間沈澱させた後上記遠心分離機で９．００Ｏｒｐｍ、
４°Ｃで、３０分間遠心分離する。）により全ＲＮＡを
精製した。得られた全ＲＮＡは、３．６ｍｇであった。

次にこれをバッフｙ　−（０，５Ｍ　　ＮａＣ１，２０
ｎＭ　　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤ
Ｓ、　　Ｉ）Ｈ７，６）１ｍｌに溶解し、ＳＤＳ溶液中
で、オリゴｄＴセルロースカラム（５−３ｐｒｊｍｅ社
製、カラム容ｗ１ｍｌ）に通すことによりポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡを精製した。全ＲＮＡＩｍｇより得られたポリ（Ａ
）ＲＮＡは、合計２０μｇであった。

次にこのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて相補的ＤＮＡの合成
を行った。ｃＤＮＡの合成はｃＤＮＡ合成システムプラ
ス（アマジャム社製）を用いて行った。

ヒラメ下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ５μｇを１ｓｔ　　５ｔ
ｒａｎｄ合成用バッファー溶液２５μｍに溶解し、デオ
キシヌクレオシド三リン酸混液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰをそれぞれ含有）５μｍ、０．
１７　０Ｄ　　Ｕｎｉｔｓ　　オリゴ（ｄＴ＋ｚ−＋ｓ
　）ブライ７−２．５μｍ及び１００　　Ｕｎｉｔｓ　
　の逆転写酵素を加えて、全量を５０μｍとし、４２°
Ｃで６０分間反応させて、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合
成した。

次に、得られた反応液５０μｍに、２ｎｄ　　５ｔｒａ
ｎｄ合成用バッファー溶液９３．５μｌ、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ　１１５単位、大腸菌リボヌクレアーゼ４
単位を加えて、全量を　２５０ｎｌとし、１２６Ｃで６
０分間、次いで２２°Ｃ１６０分間反応させ、さらに７
０°Ｃ５１０分間加熱して反応を停止させ、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼｌＯ単位を加え３７°Ｃ１１０分間反応さ
せ平滑末端のｃＤＮＡを合成した。

上記反応液に、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ（１）Ｈ８，０
）２０μｍを加えて、反応を停止させ、該反応液を、フ
ェノール−クロロホルム抽出（フェノール１２５ｎｌ、
クロロホルム１２５ｎｌ、室温で数分間２回抽出）、つ
いでエタノール沈澱（エタノール５００ｍ１、ドライア
イス上で１０分間沈澱させた後ＴＯＭＹ社製ＭＣｌ−１
５０で１２．ｏｏｏｒｐｍ、２０分間遠心分離する。）
により、３μｇのｃＤＮＡを得た。

次に得られたヒラメ脳下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡに相補的
なＤＮＡをλｇｔｌＯに組み込み、ヒラメ脳下垂体ＣＤ
ＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーの構築にあ
たってはアマジャム社のｃＤＮＡクローニングシステム
λｇｔｌＯを用いた。

ヒラメ下垂体ｃＤＮＡ　　ｌμｇを含むＥｃｏＲＩ部位
メチル化反応用バッファー溶液１０μｍに、２０単位の
ＥｃｏＲＩメチラーゼ、アデノシルメチオニン液　２μ
ｍを加えて、全量を　２０μ】とし、３７°Ｃで６０分
間反応させ、次に得られた反応液を７０°Ｃで１０分間
加熱し、反応を停止させた。

次に、得られた反応液２０μｍに、ライゲージコンバッ
ファー溶液　３μｍ、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ
ｃｏｌリンカ−２μｍ　（２μｇ）を加えて、全量を３
０μｍとし、１５°Ｃで１６〜２０時間反応させて、ｃ
ＤＮＡにＥｃｏｌリンカ−を付加した。

更に次に、得られた反応液３０μｍに、ＥｃｏＲＩ消化
バッファー溶液１０μｍ、１００単位の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩを加えて、全量を１００μｍとし、３７°Ｃで５時
間反応させて、ｃＤＮＡの末端にＥｃｏ　夏リンカー由
来のＥｃｏｌ粘着末端を形成させた。

該得られた反応液を、キット添付のゲル濾過カラムに通
すことにより得られた溶出液を、エタノール沈澱（エタ
ノール８００ｍ１、−２０°Ｃで２時間沈澱させた後Ｔ
ＯＭＹ社製ＭＣｌ−１５０で１２．００Ｏｒｐｍ、３０
分間遠心分離する。）することにより、Ｅｃｏｌリンカ
−由来のＥｃｏｌ粘着末端を有するｃＤＮＡを得た。

次に、得られたＥｃｏｌリンカ−由来のＥｃｏｌ粘着末
端を有するｃＤＮＡ３００ｎｇを有する液５μｍに、ラ
イゲーションバッファー溶液１μｌ、２．５単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ、λｇｔ　１０Ｅｃｏ　Ｉ断片２ｎ１　
（１μｇ）を加えて、全量を１０μｍとし、１５６Ｃで
！６〜２０時間反応させて、該ヒラメ脳下垂体ｃ　ＤＮ
Ａを組み込んだλｇｔｌＯＤＮＡコニカテマーを合成し
たこの組換えλｇｔｌＯＤＮＡコニカテマーをキットに
添付の　ｉｎ　　ｖｆｔｒｏ　　パッケージングエクス
トラクトによりパッケージング処理し、大腸菌ＮＭ５１
４において３．３Ｘ１０’　リコビナント／μｇｃＤＮ
Ａの効率をもつヒラメ脳下垂体ＣＤＮＡライブラリーを
得た。

実施Ｎ７ ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質ｃＤＮＡの選択ヒラ
メ脳下垂体ＣＤＮＡライブラリーからのヒラメ成長ホル
モン様糖タンパク質ｃＤＮＡの選択には、該ヒラメ成長
ホルモン様糖タンパク質のＮ末端側アミノ酸配列の第５
番目から第２２番目までのアミノ酸の配列に対応する合
成ＤＮＡ　（ＤＮＡ合成装置、モデル３８１Ａシンセサ
イザー、アブライドバイオシステムズ社製を用いて製造
）をプローブとして用いた。それは次のような塩基配列
を有する。

該プローブは〔γ−”Ｐ）ｄＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレ
オチチドキナーゼによって標識して用いた。

実施例６で得られたライブラリー２Ｘ］０’ｐｔｕをＬ
Ｂ培地で１６時間培養した大腸菌ＮＭ５１４　５０ｎｌ
に感染させ、９ｃｍのＬＢプレートに重層し、生じたプ
ラークのＤＮＡをナイロンフィルター上に固定し、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ（１９８２））にしたがって、プラークハイブ
リダイゼーションを行った。

プローブの洗浄はｌＸ５ＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１
０，０１５Ｍ　　クエン酸ナトリウム）０．１％ＳＤＳ
液で５５９Ｃ，４回１０分間ずつ、さらに６０６Ｃ１２
回１０分間ずつ行い、上記標識プローブに強く結合した
ものに対応するプラークを選択し、該ヒラメ成長ホルモ
ン様糖タンパク質のｃＤＮＡをもつクローンを２９個得
た。

実施例８ 成長ホルモン様糖タンパク質のｃＤＮＡの塩基配列の決
定 実施Ｎ７で得られた組換えファージ２９個から、該ヒラ
メ成長ホルモン様糖タンパク質のｃＤＮＡをもつ組換え
λｇｔｌＯＤＮＡを単離し、ＥＣ０ＲＩ処理により該ヒ
ラメ成長ホルモン様糖タンパク質のｃＤＮＡを単離し、
その長さを調べたところ９つのクローンは、１．ＯＫｂ
、残り２０個のクローンは、１．６Ｋｂであった。

得られた成長ホルモン様糖タンパク質のｃＤＮＡを、種
々の制限酵素（Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＶ、Ｐｓｔｌ、Ｓｔ
ｕ　Ｉ、　Ｂｇ　Ｉ　Ｉｌ、　Ｓｍａ　Ｉ）で消化し、
制限酵素地図を作製した。（第３図） その結果得られた１、６Ｋｂのクローン２０個及び１、
ＯＫｂのクローン２０個は、それぞれ同一の制限酵素地
図を持つことが判明した。次に１．ＯＫｂ及び】。

６Ｋｂのクローンより１つずつクローンを選び（ｃｆＳ
Ｌ３　（１，０Ｋｂ）、　ｃｆＳＬ７　（１，６Ｋｂ）
）、サンガー法に（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、　　ら（亘９７
７）　　Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
　　７４．５４６３−５４６７）よって全塩基配列を決
定した。

塩基配列決定のストラテジーを第３図に示す。

塩基配列決定は制限酵素による消化で　ｄｅｌｅｔｉ。

ｎ　　ｍｕｔａｎｔ　　を作成して行い、適当な制限酵
素部位がない場合は　ｐ　ｒ　ｉｍｅ　ｒ　　を合成し
て行った。

決定されたヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質の塩基配
列を第４図に示す。

上記で得られたｃｆｓＬ３とｃｆＳＬ７の該糖タンパク
質ｃＤＮＡはその５　末端側が同一で、ＣｆＳＬ７はｃ
ｆＳＬ３にくらべ５７７ｂｌ）の配列がその３　末端に
付加されたものであった。

第４図に示された塩基配列のうち塩基数１−７２が、シ
グナルペプチドを、７３−６９３が該成長ホルモン様糖
タンパク質の成熟タンパク質をコードする。

また、該成熟タンパク質はアミノ酸残基数１２１゜１２
２．１２３に　Ａｓｎ、ＬＶｓ、Ｔｈｒの糖鎖付加配列
を持つことが判明したシ成熟タンパク質はアミノ酸残基
数が２０７であり、その分子量は２３．９９６ダルトン
（２４Ｋ）である。実施例３（こおける分子量は２８に
であるので前記糖鎖付加位置には分子量約４００ダルト
ンの糖鎖が結合することが分かる。

このｃＤＮＡの塩基配列は、既に決定された該成長ホル
モン様糖タンパク質のアミノ酸配列から予測される塩基
配列と完全に一致し、該ｃＤＮＡは、ヒラメ成長ホルモ
ン様糖タンパク質から既に決定された該成長ホルモン様
糖タンパク質のアミノ酸配列及び糖鎖付加位置をコード
することが確認された。

なお、ｃｆｓＬ７を含むプラスミドｐｆＳＬ７を導入し
た大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｊｆｓ
Ｌ７　（微工研菌寄第１１２５６　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
１１２５６））として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

このｃＤＮＡの塩基配列は、過去に発見された成長ホル
モン、プロラクチンなどと有意な相同性を持ち、特に哺
乳類であるラットにおいてはその成長ホルモンと有意な
相同性が認められた。このこ七からも該成長ホルモン様
糖タンパク質は、成長ホルモンと同様の作用を持つこと
が分かる。

実施例９ ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質をコードする組換体
プラスミドの作製 ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質をコードするＤＮＡ
を含むプラスミドｐｆｓＬ７　５ｔｔｇを、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩ　（１）Ｈ７，５）、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣ１ｘ５０ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノール、１００μｇ／ｍｌ　　ウシ血清アルブ
ミンの反応液（以下　Ｈバアファー　という）２０ｎｌ
に溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｄｒａｌ　（東洋紡績
社製）それぞれ３０単位を加え、３７°Ｃ１２時間反応
を行った。反応液をフェノール抽出後、アガロースゲル
電気泳動により約７００ｂのヒラメ成長ホルモン様糖タ
ンパク質のアミノ酸配列をコードする部分を切り出し、
ＤＮＡ精製用キッ）Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　（フナコシ薬
品製）によりＤＮＡを回収し、エタノール沈澱後２０ｎ
１の７０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩ　　（１）Ｈ７，
５）、１０ｍＭ　　ＫＣＩ、７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ　、
７ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、］Ｏｎｇ／ウシ
血清アルブ血清アルブレ、制限酵素Ｍｂｏ１１（東洋紡
績社製）５単位を加え、３７６Ｃ，１０分間反応を行い
、反応液をアガロースゲル電気泳動により約６５０ｂｐ
のＭｂｏＩ［部分消化断片を切り出し、上記ＤＮＡ精製
用キットによりｃｆｓＬ７ＤＮＡにコードされる成熟ヒ
ラメ成長ホルモン様糖タンパク質翻訳領域、３′非翻訳
領域を含む約６５０ｂｐの断片的０．１ｎｇを得た。

別に原核細胞発現用ベクター（ファルマシア社製）をＨ
バアフア−に溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績社
製）２０単位を加え、３７°Ｃ１１時間反応を行い、反
応液をエタノール沈澱後５０ｎｌの６７ｍＭ　　ＫＰＯ
（１）Ｈ７，４）　、６．７ｍＭ　　ＭｇＣ］ｔ、１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、３３μＭ　　ｄＮＴＰ（
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）に溶解し、
２０単位の　Ｋｌｅｎｏｗ　　ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋
紡績社製）を加え、室温、３０分間反応させ、アルカリ
ホスファターゼ（ＢＡＰ）（東洋紡績社製）１単位を加
え、６０°Ｃ１３０分間反応させた。反応液をフェノー
ル・クロロホルム抽出した後、エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。

次に開始コドン（ＡＴＧ）と成熟ヒラメ成長ホルモン様
糖タンパク質の５　末端ＡＴＣ（Ｉｌｅ）からＭｂ。

■切断部位までを含む２種のオリゴヌクレオチド（３４
，３３量体）を合成した。合成はモデル、３８１Ａシン
セサイザー（アブライドバイオシステムズ社製）を用い
て行った。

３４量体のオリゴヌクレオチド２μｇを５０ｎＪの一！
。

５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩ　（１）Ｈ７，６）、
１（ｊｍＭＭｇＣＬ、ｌ０ｍＭ　　２−メルカプトエタ
ノール、１１００ｎ　　ＡＴＰ溶液に溶解し、１０　単
位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）を
加え、３７６Ｃ１３０分間反応させた。フェノール処理
後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラ
ム（容量０゜９ｍ１）により未反応のＡＴＰを除いた。

リン酸化された３４量体とすでに合成した３３量体のオ
リゴヌクレオチドをＴＥバー７７７−（１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ　　ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ）に溶解し、７５゜Ｃ１５分間加熱後、室温まで徐
冷し、下記の配列を持つＤＮＡリンカ−を作製した。

灼梧８ｃ　ＣＡ　ＣＴ　Ａ　ａ　Ａ　ＣＴ　ｃ　ＣＡ　
Ａ　ｃ；　ａ　Ａ　Ａ　ｃ上記のようにして得たｃｆＳ
Ｌ７のＭｂｏ１１−Ｄｒａ■断片　０．１ｎｇ、脱リン
酸化されたｐＫＫ２２３−３　　ＥｃｏＲＩ断片　０．
７ｎｇ、ＤＮＡリンカ−０，５ｎｇをｌ０ｎｌのＴＥバ
ッファーに溶解し、ライゲーションキット（宝酒造社製
）を用いてライゲージ３ン反応を行った。該反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造社製
）を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で
良く生育するコロニーを選び成熟ヒラメ成長ホルモン様
糖タンパク質のアミノ酸配列をコードするプラスミドｐ
ＫｓＬ１を得た。

実施例」０ ｐＫＳＬＩを含む大腸菌によるヒラメ成長ホルモン様タ
ンパク質の生産 実施例９で得た組換え体プラスミドｐＫｓＬ１を用い常
法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた
アンピシリン耐性コロニーを１０ｍ１のＭＣ（４地（０
，６％　Ｎａ、ＨＰＯ，，０，３％　Ｋ　Ｈ！　Ｐ　Ｏ
ａ、０．５％　ＮａＣ１，０，１％　ＮＨ４Ｃｌ、０．
５％グルコース、０．５％カザミノ酸、１　ｍ　Ｍ　　
Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，４ｎｇ／ｍｌビタミンＢ＋　、Ｉ）
Ｈ７，２）に接種し、３７°Ｃで１６時間培養した。得
られた培養液を１１のＭＣＧ培地に接種し、１６時間３
７°Ｃで培養後、得られた培養液を日立製作所製遠心分
離機　ｈｉｍａｃＳＣＲ２ＯＢで８．０００ｒｐｍＳ　
１０分間遠心し、菌体を回収した。

この菌体をレムリサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ
、Ｕ、に、　　（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）２２７，６８０−６８５）に懸濁し、直接ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ヒラメ下垂体
から抽出したヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質に対す
るつサギ抗体を用いウェスタンブロッティング（Ｔｏｗ
ｂｉｎ、ｅｔ　　ａｌ、、　　（１９７９）　　Ｐｒｏ
、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７６．４３５０　　）を
行った。その結果分子量的２４，０００ダルトンのとこ
ろにヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質抗体と交差する
バンドが見られた。これらのことからｐＫｓＬｌを保有
する大腸菌は確かにヒラメ成長ホルモン様タンパク質を
大量に生産していることがわかる。

実施例１１ 組換えヒラメ成長ホルモン様タンパク質の調製実施例１
０に従いヒラメ成長ホルモン様タンパク質生産菌を培養
集菌し、Ｍａｒｓｔｏｎ（ＤＮＡ　　ｃｏｏｎｉｎｇ；
Ａ　　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ
、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８７）３，５９ＩＲＬ
、Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ）の方法に従いヒラメ成長
ホルモン様タンパク質封入体を得、さらに５ｃｈｏｎｅ
ｒらの方法（Ｂｉｏ　　／　　］’ｅｃｈ　　（１９８
５）３．１５１）に従いヒラメ成長ホルモン様タンパク
質を抽出し、再生、ＨＰＬＣによる精製後、組換えヒラ
メ成長ホルモン様タンパク質２０ｍｇを得た。

実施例１２ 生理活性の測定 ４化後４か月齢（１０−１５ｇ）のヒラメ１群１０尾を
、個体識別し、それぞれの腹腔内に実施例２で得られた
画分Ａの該ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質及び実施
例１１で得られた組換え該ヒラメ成長ホルモン様タンパ
ク質、更に比較として生理食塩水を、それぞれ４日おき
に魚体重１ｇ当たり０．０１ｇｇ、０．　１μｇ投与し
た。

飼育は２０°Ｃで行い、ヒラメ幼魚の体重の１．　５％
量の飼料（日本配合飼料）を朝夕２回に分けて与えた。

第１回の投与から３５日目の体重増加率を第２表に示し
た。　第２表から明らかなように、本発明の成長ホルモ
ン様タンパク質はヒラメ等魚類の成長促進に有効である
ことが判明した。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は、セファデックス　Ｇ−１００カラムクロマト
グラフイーによる成長ホルモン様糖タンパク質の溶出パ
ターンを示す。 第２図は、高速液体クロマトグラフィーによる成長ホル
モン様糖タンパク質の溶出パターンを示す。 第３図は、成長ホルモン様糖タンパク質のアミノ酸配列
をコードする遺伝子の制限酵素地図及びシーケンススト
ラテジーを示す。 （）内の数字は５　端からの塩基数を示す。 第４図は、本発明の成長ホルモン様糖タンパク質の遺伝
子のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸配列を示す。 口＝コ　は、糖鎖付加位置を示す。 第５図は、組換え体プラスミドｐＫＳＬ］の作製過程を
示す。 第２図 製出時間（８） 第３図 ロロコｌ　ＣＩ　ＩＪ　（ｌ　　ロＱ−ψｌ＋４１　　
へω−ω〇− １−−１−ｕＬ　　−（Ｊ＜ Ｑ　り ←　Ｖ 口（−ロΦｇ の＜−ｆｉｃＪロ ロ　ａＯ 啼Ｑへ １０口 Ｏ＜り マ（− −〇　〇 １−１− ６　　（Ｔｈｔ の　←　← 口０り り　←　　電 ψＱ− ←　Ｑ 　　− Ｑ　ぶ （ト υ　　ａ　　　　　　　　（ｈ （−ロー ロく　　ロＱ ロ　− ←　勧 （＝ 口・ （ｈ く− り　＜　畳 ・　＜　蕾 や　←　φ （り く− ロ０ ０　　α 　　− ←　ド ロー ←υ （＝ ロー トー ロ〉 ＜Ｉ− （つ　Ｑ ０コ ト旬 ←　− ←　Ｑ 口＋！ ←　・　〜 −＜２１ トｌ 一 ←　ψ ロ　− ←− ２ ｅ く− Ｕ口 手 続 補 正 書 平成２年４月２６日 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホル
   モン様タンパク質。 （２）次なる物理化学的性質を有する成長ホルモン様糖
   タンパク質である請求項１に記載の成長ホルモン様タン
   パク質； （１）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ約２８，０００ダルト
   ン （２）等電点：等電点−ＰＡＧＥ６．５ （３）アミノ酸組成 アミノ酸残基数アミノ酸残基数 Ｃｙｓ７．０Ｐｒｏ９．６ Ａｓｐ２１．８Ｔｙｒ６．９ Ｇｌｕ３０．１Ｖａｌ１０．３ Ｓｅｒ１７．３Ｍｅｔ７．６ Ｈｉｓ６．４Ｉｌｅ１２．０ Ｇｌｙ２．９Ｌｅｕ２９．３ Ａｒｇ８．９Ｐｈｅ６．２ Ｔｈｒ８．８ＴｒＰ Ａｌａ９．６Ｌｙｓ１２．８ （４）Ｎ末端側に２３個の次なる配列のアミノ酸残基を
   有する： ▲数式、化学式、表等があります▼ （３）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体より、抽出精製
   して得られた成長ホルモン様糖タンパク質である請求項
   １に記載の成長ホルモン様タンパク質。 （４）遺伝子組換え手法によって得られ、分子中に次な
   るアミノ酸配列を含む成長ホルモン様活性を有するポリ
   ペプチドである請求項１に記載の成長ホルモン様タンパ
   ク質； 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （５）第４図に示されたアミノ酸配列を有するポリペプ
   チドである請求項１に記載の成長ホルモン様タンパク質
   （６）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホル
   モン様タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子。 （７）分子中に次なるアミノ酸配列を含む成長ホルモン
   様活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである
   請求項６に記載の遺伝子； ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （８）第４図に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
   ドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項６に
   記載の遺伝子。 （９）第４図に示された塩基配列を有するＤＮＡである
   請求項６に記載の遺伝子。 （１０）遺伝子が、カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由
   来の成長ホルモン様タンパク質のアミノ酸配列のうち、
   Ｎ末端側から第５番目から第２２番目までのアミノ酸配
   列に対応する合成ＤＮＡである請求項６に記載の遺伝子
   （１１）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホ
   ルモン様タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   を組み込んだ組換えベクター。 （１２）請求項７〜１０のうちのいずれか一つに記載の
   遺伝子を組み込んだ請求項１１に記載の組換えベクター
   （１３）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホ
   ルモン様タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   を組み込んだ組換えベクターを含む形質転換体。 （１４）該形質転換体が請求項１２に記載の組換えベク
   ターを含むものである請求項１３に記載の形質転換体。 （１５）該形質転換体が微生物である請求項１３に記載
   の形質転換体。 （１６）該形質転換体が大腸菌に属するものである請求
   項１５に記載の形質転換体。 （１７）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホ
   ルモン様タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子
   を組み込んだ組換えベクターで形質転換された形質転換
   体を培養増殖せしめて、生成するカレイ目ヒラメ科魚類
   の脳下垂体由来の成長ホルモン様タンパク質を採取する
   ことを特徴とするカレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来
   の成長ホルモン様タンパク質の製造法。 （１８）カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来の成長ホ
   ルモン様タンパク質を魚類に投与して魚類の成長を促進
   させることを特徴とする魚類の成長促進法。 （１９）該タンパク質が請求項２〜５のうちのいずれか
   一つに記載のものである請求項１８に記載の方法。