JPS62502538A - 新規インシユリン誘導体およびこれら誘導体を含有する医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規インシュリン誘導体およびこ れら誘導体を含有する医薬製剤 技術分野 本発明は新規インシュリン誘導体および持続性作用を示し少なくとも１種の新規 インシュリン誘導体および所望によって速効性インシュリンを含有するインシュ リン製剤に関する。

背景技術 重いまたは慢性の場合、糖尿病は通常インシュリン、例えばブタインシュリン、 ウシインシュリンまたはヒトインシュリンを含有する注射製剤で処置される。

可溶性インシュリン製剤は通常速効性である、しかしこの作用は数時間で停止す る。従ってしばしば、通常は１口側回も注射を与える必要かある。

この欠点を克服するため、作用が何時間か、或いは２４時間以上も維持されるよ うに持続作用を有するインシュリン製造が調合されている。かかる持続性にされ た製剤を用いると、ある糖尿病患者は少ない回数の注射、例えば２４時間で１回 または２回の注射を受けるだけである。

かかる持続作用はインシュリンを僅かに可溶性の塩、例えば亜鉛インシュリンま たはプロタミンインシュリンに変換することによって達成できる。僅かに可溶性 のインシュリン塩は懸濁液の形で使用され、そこから例えば皮下注射後インシュ リンが徐々に放出される。

最近持続作用を達成するため別の方法が提案された。そ（７）　例１ｃ　ｆｆｉ 合血清アルブミン中にインシュリン結晶を内包させることがある。別の例に連続 的に作用するインシュリン装置、いわゆるインシュリンポンプがある、しかしな がらこれは患者にとって不快でかつ危険を伴うことがある。

タンマーク特許出願第３５８２／８４号、第３５８３／８４号および第３７５７ ／８４号には、Ｂ鎖のＣ末端を少なくとも一つの正電荷を有する有機基、好まし くはＡｒｇ　−ＯＨまたはＡｒｇ　−Ａｒｇ　−ＯＢで延長したインシュリン誘 導体の製剤および使用が記載されている。かかるインシュリン誘導体の懸濁液を 含有する製剤は持続作用を示す。

工業的規模でデンマーク特許出願第３５８２／８４号明細書に記載されたインシ ュリン誘導体を製造するための好ましい方法は、トリプシン様酵素の使用を含み 、これは酵素活性か最終製剤を汚染することがある、これについてはデンマーク 特許出願第３７５７／８４号明細書の実施例を参照され度い。Ｂ鎖のＣ末端が少 なくとも一つの正電荷を担持する有機基で延長されている上述したインシュリン 誘導体の持続作用は、Ｂ鎖の延長から専ら形成される。しかしながら延長された Ｂ鎖は、Ｂ鎖を特にＢ　２９−　ＩＪリジンの開裂する酵素に敏感である、従っ て持続作用は低下し、駄目になることすらある。この酵素開裂はまた皮下注射後 も生起できる、例えばデンマーク特許出願第３５８３／８４号第１５頁第１８行 を参照され度い。酵素作用の結果として、Ｂ鎖のＣ末端が少なくとも一つの正電 荷を担持する有機基で延長されている上述したインシュリン誘導体を含有する製 剤の持続作用は著しく変動することがある。

インシュリン製剤、特に注射製剤において、Ａ４．Ａ１７゜Ｂ１３およびＢ２１ の位置での４個のアミノ酸残基の一つ以上が電荷を有しない（ｕｎｃｈａｒｇｅ ｄ　）側鎖を含有するインシュリン誘導体の使用によって、従来知られていない 望ましい長い間継続する持続性作用が達成されることをここに驚いたことに見出 した。

従って本発明はＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基 の一つ以上が電荷を有しない側鎖を含有するインシュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の 一つまたは二つが電荷を有しない側鎖を含有するインシュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の 一つが電荷を有しない側鎖を含有するインシュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有するインシ ュリンポンプに関する。

不発明は特にＡｌ１の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有するイン シュリン誘導体に関する。

本発明は特にＡ４の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基であるインシュリン誘 導体に関する。

本発明は特にＡ１７の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基であるインシュリン 誘導体に関する。

不発明はまたＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の 一つ以上が電荷を有しない側鎖を含有する少なくとも１種のインシュリン誘導体 を含有し、所望によって速効性インシュリンも含有するインシュリン製剤に関す る。

不発明のインシュリン製剤の特に有利な具体例は、持続されたインシュリン作用 を示し、中性を有し所望によってバッファーおよび／または保存在を含有する等 張水性媒体中に本発明のインシュリン誘導体の少なくとも１種の懸濁液を含有し 、所望によって速効性インシュリンを含有する注射製剤に関する。

糖尿病の処置のため通常使用されるインシュリン、例えばブタ、ウシ、ヒツジお よびヒトインシュリンは全て６個の遊離カルボキシル基、即ちＡ４．Ａ１７．Ａ ２１．Ｂ１３゜Ｂ２１およびＢ３０アミノ酸残基中に遊離カルボキシル基を含有 する。上記番号はＮ末端から出発してそれぞれインシュＩＪ　７　Ａ鎖およびＢ 鎖中の位置を示す。インシュリンの生物学的活性は通常増大する誘導体化の程度 によって低下する。しかしながら生物学的活性は、遊離カルボン酸基の誘導体化 の高度のときでさえも驚いたことに殆ど影響を受けず、全ての６個の遊離カルボ ン酸基が誘導体化されたとき完全にだめになる（ディー・レヴイのＢｉｏｃｈｅ ＋＋＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、第３１０巻、１９７３年第４０６頁〜第４１５頁参照）。

不発明のインシュリン製剤によれば、インシュリン活性を維持でき、同時に驚い たことに持続作用を達成できる。

この持続効果は特別の誘導体の性質、例えば電荷を有しない側鎖を含有するアミ ノ酸残基の数および電荷を有しない側鎖の化学構造によって決る。従って持続作 用を意のままに変えることができる。本発明のインシュリン誘導体の著しく有利 でかつ新規な特長は持続作用がトリプシン活性の起源に関係なくトリプシン（ｔ ｒｉｐｔｉｃ　）活性に比較的に不感性であることである。

インシュリン依存糖尿病の場合、しばしば使用される治療は、基本的インシュリ ンレベルを作るため、持続性インシュリン製剤の毎日２回の注射、−回は朝にそ して１回は就床直前の夕方における注射にある。更に速効性製剤の３回の注射を 主たる食事の前に与える。この治療の欠点は、持続性製剤の夜遅くの注射が、夜 中に危険な低面グルコースレベルを生ぜしめることにある。この立場は夕方前の 持続作用インシュリンおよび速効作用インシュリンの混合製剤を注射することに よって避けることができる、これによって低血糖症はあったとしても夕方中に起 り、これは軽食によって防ぐことができる。しかしながらこの種の治療は、最も 使用されている持続性インシュリン製剤インスレイタート（Ｉｎ５ｕｌａｔａｒ ｄ　：登録商標）およびモノタート（Ｍｏｎｏ　ｔａｒｄ　：登録商標）が充分 に長く作用しないので、しばしば過血糖症を朝の間に生ぜしめる。従って普通に 使用するに当っての製剤よりも長く作用する、特にかかる製剤の１回の注射が１ 日または数日間さえにも充分であるインシュリン製剤を糖尿病の患者に与えるこ とが望まれている。本発明により製造したインシュリン製剤は普通に使用される 持続性インシュリン製剤「インスレイタート（登録商標〕の作用と同じかそれよ り長い持続したインシュリン作用を示す。

本発明は特に下記の特定化合物に関する。

ヒトインシュリン−Ａ１７〜ｇｌｎ ヒトインシュリン−Ａ　４−　ｇｉｎ ブタインシュリン−８２１−ｇｌｎ ヒトインシュリン−Ｂ１３〜ｇｌｎ ヒトインシュリン−（Ａ　１７　、　Ｂ　２１　）　−ｇｌｎヒトインシュリン −Ａ　−ａｌａ ヒトインシュリン−８２１−ｔｈｒ ヒトインシュリン−”　１３−　ｖａｌヒトインシュリン−Ｂ　２１−　ｔｈｒ 　−Ａ　ｌ　７−　ｇｌｎヒトインシュリン−Ｂ２３−メチルエステルヒトイン シュリン−Ａ１７−メチルエステル本発明のインシュリン製剤が速効性インシュ リンを含有するとき、このインシュリンは例えばヒトまたはブタインシュリンで あることができる。

ブタ、ウシ、ヒツジ、ラビットまたは特にヒトインシュリンの使用によって、本 発明のインシュリン誘導体は、カルボン酸基の電荷、を有しない基への変換のた めそれ自体知られている方法、例えばエステル化またはアミド化によって作るこ とができる。例えばＡ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置のカルボン酸基の 一つ以上をメチル化したようなインシュリン誘導体は、適当な時間三弗化硼素／ メタノール中でヒトインシュリン−Ｂ３０−メチルエステルを反応させ、続いて 僅かに塩基性のｐＨ値でアニオン交換カラム上で変性したインシュリン誘導体の 分別することによって作られる。生成物を分取ＨＰＬＣによって分別し、分離し 、その後Ｂ３０メチルエステル基を、Ｑ、ＩＮ水酸化ナトリウムの水冷溶液中で ゆるやかに加水分解することによって除去する。

Ａ４．Ａ１７．Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基の一つ以上が電荷を有 しない側鎖を含有する本発明のインシュリン誘導体の製造は生物工学法の使用に よって行なうことができる。例えばこれらの位置にあるグルタミン酸の幾つかま たは全部を、グルタミンの如き電荷を有しない側鎖を担持する天然産アミノ酸に よって置換できる。

これらの変性インシュリンを製造する好ましい方法は生合成、例えばグルタミン 酸に対しコーディングｔ　ルＤＮＡ　鎖中のコドン中の一つの塩基を変えること によるものである、このコドンはグルタミンに対してコードを作ることができる 。インシュリン（またはプロインシュリン）に対しコーディングするＤＮＡ鎖中 の塩基を変えることによって、分離についての限界により化学的に作ることが困 難または不可能である変性をすることができる。

生合成でヒトインシュリンを作るための多くの異なる方法か存在する。全プロイ ンシュリン、その変性された変換物またはそれぞれ人鎖およびＢ鎖に対しコーデ ィングするＤＮＡ鎖を好適なプロモーターを含有する複製可能なプラスミド中に 挿入されていることはこれらの全てに共通である。

この系を一定のホスト微生物中にトランスフォーメーションすることにより、そ れ自体知られている方法で真正ヒトインシュリンに変換できる生成物を作ること ができる。

プロインシュリンまたはＡ鎖およびＢ鎖の生合成およびそれらの変換に対する幾 つかの既知の方法を以下に説明する。

よく知られているジェネンテク（０ｅｎｅｎｔｅｃｈ　）法においては、ポリペ プチドのＥユリ中の分子内製造がなされる、この場合これらのポリペプチドは、 インシュリンのそれぞれのＡ鎖およびＢ鎖とβ−ガラクトシダーゼの間の融合で ある。醗酵後二つの生成物を分離し、臭化シアンによってＡ鎖およびＢ鎖をβ− ガラクトシダーゼから分離し、その後亜硫酸化鎖をｐＨ１０，５でジチオスレイ トールの存在還元条件の下に組合せる。最後にヒトインシュリンをこの反応混合 物を分離する。

ＥＰＯ第５５９４５号に記載された方法においては、分割された位置で分離され た別の蛋白質と融合蛋白質として生成物は合成される。これはプロテアーゼ分割 位置または化学的に分割されつる位置（例えばメチオニン）であることができる 。プロインシュリンに対する遺伝子は組換えＤＮＡ法により別の蛋白質との遺伝 子融合としてクローニングされる。分離キメリック（ｃｈｉｍａｒｉｃ　）蛋白 質を好適な酵素またはＣＮＢｒを用いて分割し、その後変性プロインシュリンを 亜硫酸分解した形で分離する。この生成物はフランクによって発表されている如 （ｐＨ１０，５でβ−メルカプトエタノールを用い還元条件下で再結合し、続い てケンムラ−（Ｋｅｍｍｌｏｒ　）によって１９７１年に発表されている如くト リプシン／ＣＰＢ分割をする。形成されたインシュリンヲ既知の方法で分離する 。

最後に、ＥＰＯ第１１６２０１号に記載された方法を使用して生合成的にプロイ ンシュリンを作ることができる。この方法においては、蛋白質はサツカロミセス 　セルビジアエからのα−因子系を用いて培地中に分泌される。この系中にプロ インシュリンに対する遺伝子コーディングを挿入することによって、デンマーク 特許出願第３０９１／８４号に記載された系を用いて培地からプロインシュリン を分離できる。その後プロインシュリンは上述した既知の方法によりインシュリ ンに変換できる。

上述したことは、生成物がプロインシュリン或いはそれぞれ人鎖およびＢ鎖であ る方法を説明しである。更にこれらの生成物はシグナル配列と共に合成され、そ の目的は生成物をそれが開裂される細胞表面にもたらすことにある、或いは蛋白 質との融合として合成でき、その目的は生成物を安定化することにある。

更に生合成的に変性プロインシュリンを作ることができる。ヨーロッパ特許出願 第８２３０３０７１．３号には、Ｃ鎖が組換ＤＮＡ法により変性されたプロイン シュリンが記載されている。

上述したインシュリンの変性は好適な表現系で変性ＤＮＡ配列を表現することに よって作ることができる。ＤＮＡ配列の変化は、トーツス・ニー・クンケルによ りＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ｋａａｄ、、　Ｓｃｉ、米国第８２巻、第４４８頁〜第４９２頁（１９８５年） に発表された方法によってインシュリン遺伝子のインビトロでの突然変異生成に よって作ることができる。この方法によればインシュリン遺伝子は一重鎖ＤＮＡ バクテリオファージＭ１３中にクローンされる。このファージからのＤＮＡを精 製し、これに一定の突然変異（一つのミス対合）のみならずこの突然変異の各側 での相同を含有するプライマー代表的には１５〜２５７−をアニーリングする。

次いでプライマーをＤＮＡポリメラーゼの使用によりファージゲノムの全長に延 長させ、かくして一つの鎖が突然変異を含有し、他の鎖が野生遺伝子を含有する 完全な二重鎖分子を提供する。Ｅコリ細胞中にこの分子を導入することによって 、ファージブロジエニーは一部野生遺伝子を含有するファージとなり、一部は突 然変異を含有するファージとなるであろう。これらのファージの中、突然変異形 成プライマーでバイブリッド形成することにより、ファージプロジエニーの一重 鎖ＤＮＡに所望の種類のためスクリーニングすることができる。プライマーは突 然変異した鎖に完全相同を有するが、単一ヌクレオチドで野生種とは異なる。ス クリーニング後、二重鎖ＤＮＡをＥコリ細胞から分離でき、ファージを複製でき 、変性インシュリン遺伝子はそれから分離できる。その後この遺伝子は元の表現 系に挿入される。

注射製剤は本発明のインシュリン誘導体を無定形および／または結晶懸濁液とし て別々に、または他のかかるインシュリン誘導体および／または天然産インシュ リンと組合せて含有できる。これらの誘導体の大部分は、結晶化媒体がフェノー ルを含有するとき、約等電点ｐＨ値或いは等電点よりも高いｐＨ値で亜鉛で結晶 化できることが判った。本発明のインシュリン誘導体をプロタミンまたは過剰の 亜鉛の存在下に結晶化することもできる、これらは更に持続された活性を生せし める。

発明を実施する形態 本発明を更に下記実施例によって説明する。

実施例　１ ヒトインシュリン−Ｂ２１−メチルエステルの製造５００■のヒトインシュリン −Ｂ３０−メチルエステルを５０ｍＪの乾燥メタノール中に懸濁した。撹拌しな がら２０％ｗ／ｖ三弗化硼素／メタノール２０ゴを加えた。常温で２時間放置後 、懸濁液を４００ｍ１のエーテル中に注入し、４℃で２５００　ｘｇで２０分間 遠心分離した。沈澱を２回エーテルで洗浄し、１・５０ｍ／のエーテル中に再葱 濁し、減圧上蒸発させ、ｐＨｓ、　２５の６０容量％エタノール２Ｆ７７Ｍトリ ス／ＨＣ１１５０ｍＪ中に溶解した。次に試料を同じバッファーで平衡化した１ 、６Ｘ２１αのＱ−セファロース（登録商標〕ＣＬ　−５Ｂファスト・フロー・ カラムに付与した。２４ｍ／ｈｒの流速でイソクラチック溶離１時間後に、次の １６時間にわたってＯ〜０．１Ｍに増大する塩化す）　ＩＪウム勾配でカラムを 溶離した。インシュリンジメチルエステル極大値は３つの化プールに分割された 。

最初に溶出したプールを０．１２５　Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ４，０）および ３８容量％アーｔｒトニトリルで４５℃で平衡化した４Ｘ２５０だリクロソープ （ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ：登録商標）ＲＰ　１８カラム（メルク５０３３３　） 上で更に分別した。１〜２■のインシュリンジメチルエステルを付与し、蛋白質 主画分は１２−７分の流速で２０〜２５分で溶出した。

かくして得られたインシュリンジメチルエステル１ｏｍｇを氷冷した０、ＩＮ水 酸化ナトリウム溶液ｌ　ｒａｔ中に溶解した。

反応混合物を０℃で５分間放置させ、その後ｐＨ値を塩酸で９に調整した。混合 物を（１５Ｘ　５　ｃｒｎモノＱ（ＭｏｎｏＱ：登録商標）アニオン交換剤カラ ムに付与し、流速５．１ｏｎ／分で０．１Ｍまで増大する線状塩化す）　ＩＪウ ム勾配を用い、ｐＨ８，２５，６０容量％エタノール、２０　ｍＭトリス／ＨＣ Ｉで３０分間分別した。ヒトインシュリン−Ｂ２１−メチルエステルを含有する 画分から減圧でエタノールを除去した後、蛋白質をｐＨ６，３で沈澱させた。収 量＝７■。

ヒトインシュリン−８２１−メチルエステルは正しい分子量を示すプラズマ脱着 質量分析により、そしてニス・アウレウスプロテアーゼで分解して特性決定した 。これによってＢ２１エステル位置を確認した。

実施例　２ ヒトインシュリン−Ａ１４−メチルエステルノ製造ヒトインシュリン−Ａ１７− メチルエステルヲ実施例１に記載した如くして分離し、同定した、しかしながら アニオン交換クロマトグラフ工程から分離した第２の溶離インシュリンジメチル エステルプールを以後の分別に使用した。

これによって６．５　ｍｇのヒトインシュリン−Ａ１７＝メチルエステルが得ら れた。

実施例　３ ヒトインシュリン−Ｂ２１−ジメチルエステルを含有する製剤の配合および生物 学的効果 １、６ｗ／ｖ％のグリセロール、０．３３　ｗ／ｖ％のｍ−クレゾール、ｌ／７ ５Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ値７．５を含有する媒体２５ｍ１を作った。溶液を 一過によって滅菌した。実施例１に記載した如く作ったヒトインシュリン−Ｂ２ １−メチルエステル１．５　ｍｆｌを１、Ｏｎｔｌの媒体中に懸濁した。

この亜鉛不含製剤をギニアブタに皮下注射した後持続性低血糖症が観察された。

得られた持続性インシュリン作用は、標準プロタミンインシュリンＦＩＪ剤イン スレイタート（登録商標）の注射後観察された低血糖症に匹敵した。

実施例　４ ヒトインシュリン−Ａ１７−メチルエステルを含有する結晶インシュリン数剤の 配合および生物学的効果４、５　ｍｇのヒトインシュリン−Ａ１７−メチルエス テルを、２、７　ｍｌの０．０１５Ｍリン酸に溶解した。２１■の塩化ナトリウ ムおよび１５２ｒｙ＋Ｍの塩化亜鉛の水溶液４１μｌを加えた。溶液を一過によ って滅菌した。水酸化す）　ＩＪウムの滅菌水溶液で無菌灸件下溶液のｐＨを８ ．０に調整した。溶液のｐＨ値を次いで滅菌塩酸で７．３に再調整し、２１℃で ゆるやかに撹拌して、平均粒度１０μｍを有する菱面体結晶を形成した。容量を 滅菌水で３＊ｌに調整した。

更に２１〜の塩化ナトリウムおよび９μｌのｍ−クレゾールとの混合物の形で１ ３．５　ｍＭ　ＩＪン酸３　ｍｌの滅菌溶液を作り、ｐＨ値を水酸化す）　ＩＪ ウムの滅菌水溶液で７，３に調整した。

二つの溶液を一緒にした。

かかる溶液は、１８μｇ／Ｋｇの投与量で、ギニアブタにおける強力に持続した 低血糖症を誘起した。得られた持続性インシュリン作用は、既知の注射製剤イン スレイタート（登録商標）の持続作用よりも長い。血グルコース曲線下の面積は 、インシュリン誘導体がヒトインシュリンと殆んど同じ生物学的活性を示すこと を示している。

実施例　５ ヒトインシュリン−Ａ４−　ｇ”　ノＨ’ｌｌＸ前述した生合成法の一つによっ て作ったヒトプロインシュリン−Ａ４−ｇｌｎ１５Ｑｙｙを、３　ｍｇのマトリ ックス結合トリフシン〔トリプシン−セファローズ（登録商標）ファスト・フロ ー〕を含有するトリス／塩酸（ｐＨ７，５）　３０ｍｌ中に溶解した。混合物を 室温で１時間放置させた後、樹脂を一過によって除去した。得られたデス−３０ −インシュリン−Ａ　４−　ｇｌｎをＰＨ６，３で沈澱させて分離し、凍結乾燥 した。蛋白質粉末を２００　ｍ９のスレオニンメチルエステル１０００μｅのエ タノールおよび４００μｌの蒸溜水を含有する混合物中に溶解した。ｐＨを酢酸 で６．３に調整し、１■のマトリックス結合トリプシンを混合した。ゆるやかに 撹拌しつつ室温で２時間放置後、一過しだ後１０容量の２−プロパツールを加え て蛋白質を沈澱させた。乾燥した沈澱を２０　ｍＭ　トリス／塩酸、６０容量％ エタノール、ｐＨｓ、　２５中に再溶解し、上記バッファーで平衡化した１、６ Ｘ２０ｏｎＱ−セファロース（登録商標）ＣＬ−５Ｂフアストフローカラムに付 与し、２４　ｃｍ／　ｈｒの流速で、１５時間にわたり、０から０．１Ｍへ増大 する線状塩化す）　ＩＪウム勾配で溶離した。

Ａ　４−　ｇＩｎ−ヒトインシュリン−８３０−メチルエステルを含有する画分 からエタノールを減圧下除去し、ｐＨを６．８に調整して蛋白質を沈澱させた。

Ｂ５０−メチルエステルは、１０１へｅの蛋白質濃度で０．１Ｍの冷水酸化す） 　ＩＪウム中で１０分間加水分解し、続いてＰＨ８，２５に調整した。

蛋白質溶液を、２ｍＭトリス／塩酸の２容量、ＰＨ８，２５で稀釈後、１．．６ Ｘ２０ｔＭＱ−セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂフアストフローカラムに付 与し、上述した如く溶離した。

エタノールを除去した後、蛋白質をｐＨ６，３で沈澱させた。

凍結乾燥後、３０ｍｇのヒトインシュリン−Ａ　４−　ｇｉｎ　ヲｐ４だ。

生成物の純度は逆相高圧液体クロマトグラフィで確認し、生成物の同定はアミノ 酸分析、多段ニドマン分解およびプラズマ脱着質量分析で確認した。

実施例　６ 実施例５に記載した如くして得られたヒトインシュリン−Ａ４−ｇｌｎ１５ｙｙ を、１３．５　ｒｇＭリン酸、０．３％ｍ−クレゾールおよび１．６％グリセロ ールを含有する溶液１０ｇ／中に溶解した。溶液を一過によって滅菌し、ｐＨを 水酸イはトリウムの滅菌水溶液で９０に調整した。ｐＨを塩酸の滅菌溶液で８２ に再調整し、ゆるやかに撹拌して菱面体結晶としてヒトインシュリン−Ａ　４− 　ｇｌｎを結晶化した。

この結晶懸濁液のギニャブタへの０．５ＩＵ／Ｋｇの皮下注射によって、得られ た持続性低血糖症効果は、０．５　ＩＵ／Ｋｇでインスレイタート（登録商標） の注射によって生ぜしめら手続補正書（う拘つ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の一つ以上 が電荷を有しない側鎖を含有することを特徴とするインシユリン誘導体。
2. ２．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の一つまた は二つが電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第１項記載のインシユリン誘 導体。
3. ３．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の一つが電 荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第１項記載のインシユリン誘導体。
4. ４．Ａ４の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第１ 項記載のインシユリン誘導体。
5. ５．Ａ１７の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第 １項記載のインシユリン誘導体。
6. ６．Ａ４の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基である請求の範囲第１項記載の インシユリン誘導体。
7. ７．Ａ１７の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基である請求の範囲第１項記載 のインシユリン誘導体。
8. ８．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸残基の一つ以上 が電荷を有しない側鎖を含有する少なくとも１種のインシユリン誘導体を含有し 、所望によつて速効性インシユリンも含有することを特徴とするインシユリン製 剤。
9. ９．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミノ酸の一つ以上が電 荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第８項記載のインシユリン製剤。
10. １０．Ａ４，Ａ１７，Ｂ１３およびＢ２１の位置の４個のアミン酸残基の一つが 電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第８項記載のインシユリン製剤。
11. １１．Ａ４の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲第 ８項記載のインシユリン製剤。
12. １２．Ａ１７の位置のアミノ酸残基が電荷を有しない側鎖を含有する請求の範囲 第８項記載のインシユリン製剤。
13. １３．Ａ４の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基である請求の範囲第８項記載 のインシユリン製剤。
14. １４．Ａ１７の位置のアミノ酸残基がグルタミン残基である請求の範囲第８項記 載のインシユリン製剤。
15. １５．持続性インシユリン作用を示し、中性ｐＨを有する等張性水性媒体中の少 なくとも１種のインシユリン誘導体を含有し、所望によつてバツフアーおよび／ または保存剤を含有し、また所望によつて速効性インシユリンを含有する注射製 剤である請求の範囲第８項記載の製剤。