JPS61212598A - インシユリン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は新規インシーリン化合物および延長化インシー
リン作用を有する新規注射液に関する。

〔従来技術〕

糖尿病の治療において、多くのインシュリン製剤が提案
され使用されてきた。これらの製剤の中には速効性を有
するものもあシ、またいくらか延長化作用を有する製剤
もある。一般には、多少の延長化作用を有する医薬用イ
ンシーリン製剤が望ましい。このような延長化作用はイ
ンシュリン結晶の懸濁液としてインシュリンを投与する
ことにより得られる。結晶性製剤は、亜鉛の存在下にイ
ンシーリンを結晶化させることにより得られる〔たとえ
ばレンチ（Ｌｅｎｔｓ）ＴＭ＊　５ｃｈｌｌｃｈｔｋｒ
ｕｌｌ参照：インシェリンクリスタルズ、ケミカルアン
ドバイオロジカルスタディーズオンインシュリンクリス
タルズアンドインシュリンジンクサスペンジ冒ンズ（Ｉ
ｎ５ｕｌｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｇ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　　５ｔｕｄｉｓｓ　　ｏｎＩｎｓｕｌｉｎ　　Ｃｒｙ
ｓｔａｌｓ　　ａｎｄ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　　Ｚｉｎｃ
Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　）　＋　Ｍｕｎｋｓｇａａｒ
ｄ　＋　１９５８　）か、または亜鉛および！ロタミン
の存在下にインシュリンを結晶化することにより得られ
る〔たとえばＮＰＨ−インシュリン、Ｒａｐ　、　Ｓｔ
ｓ、ｎｏ　Ｍｅｍ　、　Ｈｏ５ｐ　−１（１９４６）、
６０参照〕。

亜鉛インシーリン結晶または亜鉛グロタミンインシュリ
ンの公知懸濁液を使用する際の欠点の１つは、バイアル
びんを振とうして、インシュリンの正しい量を注射しバ
イアルびんにおけるインシーリンの濃度をその使用を通
じて常に一定に保つことを確実にすることが必要である
ことである。

ペンフィル（Ｐｅｎｆｉｌｌ）７Ｍカートリ、ジは空気
が存在しているといけないが、このカートリッジにおい
て延長化作用を示すインシュリン懸濁液は固体を混入し
攪拌を確実に行なう必要がある。インシーリン懸濁液お
よびインシュリン溶液を空気と振とりすることは、イン
シュリンが空気と水との界面で細繊維形成下に変性する
傾向があるので、それ自体不所望な工程である。したが
って、延長化作用を有するインシュリン溶液が望ましい
。

延長化作用を有するインシュリン誘導体の溶液は、その
アミノ基がフェニルイソンアネートと反応することによ
り変性されたインシュリンから得られる〔いわゆるイソ
−インシュリン、ハラースーメーラ−（Ｈａｌｌａｓ−
Ｍｏｅｌｌａｒ　）　：ケミカルアンドバイオロジカル
インシェリンスタディーズペースドアポンザ　リアクシ
７ン　ビトウイーン　インシュリンアンドフェニルイソ
シアネ−）　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎＳｔｕｄｉｅｓ　ｂａ
ｇｅｄ　ｕｐｏｎ　ｔｈｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔ
ｗｅｅｎＩｎｓｕｌｉｎ　ａｎｄ　Ｐｈｅｎｙｌｉｓｏ
ｃｙａｎａｔａ）＋　　コベンハーダン　１９４５］。

同様に、ＡＩ　、Ｂ２９−ノーＢｏａ置換インシュリン
（Ｂ６ｅは第三プテルオキシカルゴニルを意味する）が
皮下注射投与後に延長化インシュリン作用を示すことが
報告されている〔ガイガーとエンライマン（Ｇｅ　ｌ　
ｇｏ　ｒ　＆　Ｅｎｚｍａｎｎ）　ニゲロインシュリン
、インシュリン、ｃ−’（プチド（Ｐｒｏｉｎａｕｌｉ
ｎ　＋　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　＊　Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ）　
：プロシイーデングズオプザシンポジクムオン　！ロイ
ンシェリン、インシュリンアンド　Ｃ−ペプチド（Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　　ｔｈａ　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ　ｏｎＰｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　＋　Ｉｎ５ｕｌｉｎ
　ａｎｄ　Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ　）、トクシマ１９７８
：アムステルダムーオクスフォード１９７９．３０６−
３１０）。ＡＩ　、Ｂ２９−ジーＢｏａ置換インシ、　
ＩＪンは、臨床的に使用するにはあまシにわずかの延長
化作用を示すだけであることが見出された。

未変性インシーリンの溶液は、延長化作用を示すために
多量の亜鉛イオン（たとえば、０．４−ＩＷ／Ｕインン
エリン）を必要とする（Ｊ　、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

５５　（１９３５）、２０６参照）。このような多量の
亜鉛イオンの注射はたぶん痛みを起こし、したがってこ
のような溶液はこれまで治療に使われていなかった。

インシーリンの等電点は約５．５であシ、この等電点を
、たとえばＢ鎖のＮ末端にリシンまたはアルギニンのよ
うな塩基性アミノ酸を加えるか（たとえばドイツ特許公
開第２，０４２，２９９号）または塩基性ジペプチドア
ルイニル−アルギニンを用いて（たとえばガイが−とエ
ンライマン、前出）上側に移行させることにより、中性
−でのインシュリン誘導体の溶解度を減少させる試みが
なされてきた。しかしながら、その等電点付近での後者
化合物、Ａｒｇ”−１）−ＡｒｇＢ０インシェリンの溶
解度はもとのインシーリンのものよシ非常に大きい。

日本特許出願第５５−１４４０３２号は、Ｂ５０−アミ
ノ酸が少なくとも５つの炭素原子を有するアミノ酸およ
びそのアミドならびにエステルで置換されているヒトイ
ンシュリン類似物に関する。

これらのインシーリン類似物は哺乳動物インシーリンに
対し抗体を発現させた患者に使用される。

この日本特許出願には６つの特定化合物が記載されてい
るが、このうちいずれも延長化作用を有するとは記載さ
れていない。この日本特許出願には特定の注射製剤も記
載されていない。

ヨーロッパ特許出願第８４１０８４４２．９号は、塩基
性の有機基を８３０−アミノ酸に接続しこれＫよシ中性
声で正電荷を導入するインシュリン類似物に関する。こ
れらの類似物において、８．３０−アミノ酸は中性であ
シ、好ましくはヒトインシュリンにおけるようにトレオ
ニンである。ドイツ特許出願第３，３２７，７０９．５
号は、上述のヨーロッパ特許出願に記載された誘導体の
結晶の懸濁液ならびに芳香族ヒドロキシ化合物に関する
。ドイツ国特許出願第３，３２６，４７３．２号は、そ
のうちの少なくとも１つが上述のヨーロッパ特許出願に
記載されたインシュリン化合物の混合物を含む医薬品に
関する。

〔発明の構成および効果〕

本発明は、 ａ）　　Ｂ鎖のＣ末端カルボキシル基にアミドまたはエ
ステル残基が存在し、および ｂ）ｐＨ７でヒトインシーリンよシ少なくとも１つ多い
電荷を有し、好ましくは声７でヒトインシュリンよシ４
を越えない多数の電荷を有する、という点でヒトインシ
ュリンとは異なる新規ヒトインシュリン類似物からなる
。

電荷における変化は、Ｂ３０アミノ酸のカルボキシル基
をふさぐことにより、所望によりヒトインシュリンと比
較して１個以上のアミノ酸を置換することにより達成さ
れる。

特に、本発明の実施に対し興味のある化合物は次のよう
に特徴づけられる：Ａ４　、Ａ１７．Ｂ１３゜Ｂ２１の
４つのグルタミン酸残基の１個以上を別の天然に産生ず
る中性アミノ酸好ましくはグルタミンと置き換え；およ
び／または８２７のトレオニン残基を天然産生塩基性ア
ミノ酸残基好ましくはＬ−アルギニンまたはＬ−リシン
と置き換え；および／またはＢ３０のトレオニン残基を
塩基性アミノ酸残基１個または２個好ましくは１個と置
き換え、Ｂ鎖のＮ末端カルブキシル基が保護されている
。

本発明はまた、調節されたレベルの亜鉛イオンを有する
上記カテゴリーのヒトインシーリン類似物溶液からなる
。

篤くべきことに、一般式■： 以下余白 （式中、括弧内の数字の前のＡおよびＢは、それぞれ括
弧内の数字により示されるＡ鎖およびＢ鎖のペプチド分
画を意味し、Ｅｌ、　Ｅ２．　Ｅ３オｊ：ヒＥ４は同一
または異なって各々グルタミン酸またはヌクレオチド配
列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、Ｘ
ＩｄＬ　−）レオニン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシ
ン残基を表わし、Ｙおよび２は同一または異なって各々
、側鎖アミノ基がアシル化されてもよく側鎖とドロキシ
基がアルキル化されてもよいアミノ酸残基を表わし、ｍ
およびｎは同一または異なって各々０または１であシ、
ＲはＢ鎖のＣ末端カルボキシル基をふさぐアミドまたは
エステル残基を表わし、ただしＸがトレオニン残基であ
る場合Ｅ　１　、　Ｅ２　、　Ｅ３およびＥ４のすべて
がグルタミン酸残基であることはなく、またはＥ１、Ｂ
２１Ｂ３およびＥ４各々がグルタミン酸残基であシ、Ｘ
がトレオニン残基である場合、式−Ｙｍ−Ｚｎ−Ｒで表
わされる基は−ＮＨ２，−Ａｒ　ｇ　−ＮＩ２　＋−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２、−Ａｒｇ−Ｌｙａ−ＮＩ２　、
−Ｄａｂ−Ｄａｂ−ＮＨ２＋−Ｄａｐ−Ｄａｐ　−ＮＩ
２　＊　−Ｌｙｓ−ＮＩ２　＊　−Ｌｙｓ（Ｌａｕ）−
ＮＩ２１−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ−ＮＩ２　＋　−Ｌｙｓ　
−Ｌｙｓ　−ＮＩ２　ｅ　−０ｒｎ−ＮＩ２１−Ｏｒｎ
−Ｏｒｎ−ＮＩ２　ｒ　−Ｔｈｒ−ＮＩ２１−Ｔｈｒ−
ＯＢｕ　　または−Ｔｈｒ（Ｂｕ　）　−０Ｂｕ　　で
あシ、Ｌａｕはラワロイル基を表わし、ＤａｂとＤａｐ
はそれぞれα、γ−ジアミノ酪酸およびα、β−ジアミ
ノゾロピオン酸を表わす。）で表わされる単一のインシ
ュリン誘導体を、有効成分として用いて短期および延長
化インシーリン作用を組合わせた注射溶液が作られると
いうことが見出され丸。

式■で表わされる化合物のサブグループは、式■中、括
弧内の数字の前のＡおよびＢが、それぞれ、括弧内の数
字により示されるＡ鎖およびＢ鎖の（グチド分画を意味
し、Ｅ’　、　Ｂ２．　Ｋ’およびＢ４は同一または異
なってそれぞれグルタミン酸またはヌクレオチド配列に
よりコードされうる中。性アミノ酸残基を表わし、Ｘは
Ｌ−）レオニン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシン残基
を表わし、Ｙおよび２は同一または異なって、それぞれ
、側鎖アミノ基がアシル化されてもよく側鎖ヒドロキシ
基がアルキル化されてもよいアミノ酸残基を表わし、ｍ
およびｎは同一または異なって、それぞれＯまたは１を
表わし、ＲはＢ鎖のＣ末端カルゲキシル基をふさぐアミ
ドまたはエステル残基を表わし、ただしＸがトレオニン
残基の場合にはＥ　　、Ｅ　　。

Ｂ３およびＢ４のすべてがグルタミン酸残基であるわけ
ではなく、または、Ｅｌ　、　Ｂ２２　、　ｇ！および
Ｂ４が各々グルタミン酸残基であシ、Ｘがトレオニン残
基である場合、式：　−Ｙｍ−Ｚｎ−Ｒで表わされる基
は−ＮＨ２、−Ａｒｇ−ＮＩ２　、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
ＮＩ２　＃　−Ａｒｇ−Ｌｙｍ　−ＮＩ２　、−Ｄａｂ
−Ｄａｂ　−ＮＩ２　、−Ｄａｐ−Ｄａｐ−ＮＩ２　。

−Ｌｙ　ｍ　−ＮＩ２　ｒ　−Ｌｙ　ｓ　（Ｌａ　ｕ　
）　−ＮＩ（２＋　−Ｌ　ｙ　ｓ　−Ａｒ　ｇ　−ＮＩ
２　ｒ−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｎ’Ｈ２＊−０ｒｎ
−■２または一〇ｒｎ−Ｏｒｎ−ＮＨ２を表わす新規化
合物である。

式■の化合物において、Ｂ鎖のＣ末端カルボキシへ基は
エステル基またはアミド基によりふさがれ、これにより
カル？キシル基の負の電荷を排除する。８３０位におい
てエステル基またはアミド基により導入される電荷の変
化は、さらに、Ｂ２７位のトレオニンをアルギニンもし
くはりシンで置換するか、および／またはＡ４　、Ａ１
７，８１３゜８２１位の４つのグルタミン酸残基のいず
れかを中性アミノ酸好ましくはグルタミン残基で置換す
ることにより増加することができる。さらに、陽電荷を
８３０および／または８３１位の塩基性アミノ酸により
導入してもよい。式■で表わされる化合物は延長化作用
を有する溶液として臨床に応用できうるので、通常使用
されるツタまたはヒトインシーリンの懸濁液と比較して
免疫原性が弱くなるであろう。

延長化の程度は亜鉛イオンの添加により増強され調節さ
れうる。

インシュリン効果の延長化の程度を調節する主な要因は
亜鉛濃度と式■で表わされる化合物の選択である。たと
えばＡｒｇ！１２７．Ｔｈｒ−ＮＩ２　ヒトインシュリ
ンのような類似物を用いると、インシュリン類似物の六
量体１単位につきわずか３個の亜鉛原子で非常な延長化
作用が得られる。これは約２４０　ｎｍｏｌｅ、４？を
含む製剤における８μ？亜鉛／ｍｌに相当する。たとえ
ばＬｙｅ”’−ＮＨ２ヒトインシュリンのような他の類
似物を用いると、インシーリン類似物の六量体１個につ
き３０個の亜鉛で、中程度の延長化作用が得られる。こ
れは約２４０　ｎｍｏｌｅ／＋ｔｌを含む製剤における
８　０　ｔｔｉＰ　亜鉛／ｄに相当する。好ましい亜鉛
濃度の範囲は０〜２ｗｑ／ｌであシ、Ｂ１３および／ｉ
たけ８２７位の置換体では好ましくは亜鉛０〜２００μ
Ｍｌｌ、その他の類似物では好ましくは２０〜２００μ
ｆ、Ａｎｌである。

亜鉛イオンの存在下における式■の化合物の溶液の延長
化作用は、中性−でのこの化合物の低い溶解度に帰因す
る。Ｂ鎖のＣ末端がふさがれているインシュリン誘導体
の溶液のみが７クトラピド（Ａｃｔｒａｐｉｄ　）ＴＭ
ブタインシュリンよシ長い延長化作用を示す。

本発明の注射溶液の声は、生理学的−よシ低くそしてで
きる限シ近似していることが好ましく、上限は沈でんが
生じる−である。式Ｉで表わされる化合物約２４０　ｎ
ｍｏｌｅ／−を含む安定な溶液がｐＨ５，５で得られる
。上限は、溶液の構成、すなわち等張液、保存剤および
亜鉛濃照ならびに式■の化合物の選択による。溶液の一
下限はないが、しかしインシユリンの化学的安定性がデ
アミダーゼ反応および二量体形成のために酸溶液中で低
いので、溶液の物理的安定性に関してはできるだけ高い
声が好ましい。本発明注射液の好ましい声範囲は２．５
〜８．５、さらに好ましくはＰＨ４，５〜８である。

本発明の別の観点は、患者に対し改善された融通性をも
たらすことである。２種の水溶液、すなわち１つは式■
の化合物を含み他の一つは亜鉛塩を含む溶液を用いて、
患者は、この２つの溶液を適当に混合することにより所
望の程度の延長化作用と所望の経過を得ることができる
。すなわち、患者は、２つの貯蔵溶液を用いて、朝の注
射で１つの作用と経過を選択し夕方の注射で別の作用と
経過を選択することができる。亜鉛溶液は亜鉛約１０μ
Ｐ〜２０シ勺を含むのが好ましい。これに代わシ、貯蔵
溶液の両方ともが亜鉛を同一または異なった濃度で含有
してもよいし、および／または貯蔵溶液の両方ともが式
Ｉの化合物を同一または異なった化合物で含有してもよ
い。

本発明の注射液は式■で表わされる化合物約６０〜６０
００　ｎｍｏｌｅ／Ｍの濃度を有する。

中性アミノ酸（Ｅ１〜Ｅ４　）は、たとえばグリシン、
バリン、インロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、
チロシン、メチオニン、または好ましくはアスパラギン
、グルタミン、アラニン、セリンもしくはトレオニンで
ある。

凡の例はエステル基たとえば低級アルコキシ、好ましく
はメトキシ、エトキシ基および最も好ましくは第三ブト
キシ基であシ、このような基は、ヒトインシュリンの合
成に有効である化合物に存在する（たとえは米国特許第
４，３４３，８９８号明細書参照）。このようなエステ
ルはＴｈｒＩＩ３’−０Ｂｕｔヒトインシエリンおよび
ＴｈｒＢ３’−（Ｂｕｔ）−０Ｂｕｔヒトインシーリン
である（　Ｂｕｔは第三ブチル基を表わす）。

さらに、Ｒは−ＮＲ’Ｒ２（基中、Ｒ１と８２　は同一
または異なりてそれぞれ水素原子または低級アルキル基
を表わす。）で表わされる基を表わす。以後、１低級”
という語は、当該基が炭素原子７個未満、好ましくは５
個未満を含むことを意味する。

このような基の例は、ヒトインシュリンの合成に中間体
として知られているＴｈ　ｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシ
ュリンに見い出される〔カールスペルグ（Ｃａｒｌｓｂ
ｅｒｇ）　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　４９　（１９８
４）、４６３参照〕。本発明の好ましい実施態様におい
て、Ｒは−ＮＨ，である。さらに、Ｒは、好ましくはラ
クタム環に炭素原子８個未満を含むラクタム残基、たと
えばジアミノカルゲン酸のラクタムである。

本発明の好ましい実施態様において、Ｒは帯電されてい
ない。

中性ｐ）Ｉにおいて、−Ｘ　　−Ｐｒｏ　　−Ｌｙｓ　
　−Ｙｍ−Ｚｎ−凡の電荷は、　Ｔｈｒ　　−ＮＨ２ヒ
トインシュリン、Ｔｈｒ！１３’−０Ｂｕｔヒトインシ
ーリン、ｒｈｒ”０（Ｂｕｔ）−ＯＢｕｔヒトインシュ
リンおよびＬｙｓ　　　−ＮＨ２、ｄｏｓ（Ｒ３０）ヒ
トインシュリンにおいて＋１、Ｌ　ｙ　ｍ　”　’　−
ＮＨ２ヒトインシユリン、Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトイン
シェリン、　Ｏｒｎ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、！
Ｉ２７ Ｌｙｓ　　　、　Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシュリ
ンおよびＡｒｇ！１２’　、　Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒ
トインシュリンにおいて＋２、Ｌｙｓ　　　＋　Ｌｙｓ
　　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ　　　ｒ　Ａ
ｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、ＡｒｇＩＩ２’　
、　Ｌｙｓ　　　−ＮＨ２ヒトインシーリン、Ａｒｇ１
２’　、　Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｌｙ
ｓ　　−Ｌｙｓ　　　−ＮＨ２ヒトインシェリン、Ａｒ
ｇ　　−Ｌｙｓ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ａｒｇ
　　−Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｏｒｎ　
　　−０ｒｎ　　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｄａｂ
　　−Ｄａｂ　　−ＮＨ２ヒトインシェリンおよびＤａ
ｐ　　　−Ｄａｐ　　　−ＮＨ２ヒトインシュリンにお
いて＋３である。

本発明の好ましい実施態様の１つによれば、Ｙおよび２
で定義されるアミノ酸残基は、ヌクレオチド配列により
コード化されるＬ−アミノ酸からの残基である。

Ｙおよび２により定義されるアミノ酸残基におけるいか
なる側鎖アミン基も、炭素原子数２〜１８の酸、好まし
くは炭素原子数６〜１８の脂肪酸たとえびラウリル酸に
よジアシル化されうる。

すなわち、−Ｙｍ−Ｚ　ｎ−ＲはＬｙｓ　（Ｌ　ａ　ｕ
　）　−ＮＨ２でよい。

好ましいアルキル化ヒドロキシ基の例は、メトキシ基、
エトキン基および第三ブトキシ基である。

式■で表わされる好ましい化合物の１つの群において、
Ｙおよび／または２は塩基性アミノ酸残基であって側鎖
アミン基が場合によジアシル化されてもよい基（ｍ＝１
　）である。

式■で表わされる好ましい化合物の別の群において、ｎ
は０であシ、Ｙは塩基性アミノ酸残基である（ｍ＝１　
）。

式Ｉで表わされる好ましい化合物のさらに別の群におい
て、Ｙおよび２は両方とも塩基性アミノ酸残基（ｍ　＝
１　＋　ｎ−１）である。

式Ｉで表わされる好ましい化合物は、それぞれ次のよう
なものである： Ｇｉｎ　　　＊　Ａｒｇ　　　＊　Ｔｈｒ　　−ＮＨ２
ヒトインシェリン、Ｇｉｎ　　　、Ｇｉｎ　　　ｔ　Ｔ
ｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｇｌｎ　　　＋
　Ｌｙｅ　　　＋　Ｔｈｒ　　−ＮＨ２ヒトインシェリ
ン、Ｇ　１　ｎ　　　、Ｌｙ　ｓ　　　−ＮＨ２ヒトイ
ンシュリン、Ｇ　１　ｎ　　　、Ｔｈ　ｒ　　　−ＮＨ
２ヒトインシュリン、Ｇｉｎ”’　、　Ａｒｇ　　　、
　Ｔｈｒ　　−ＮＨ２ヒトインシェリン、引ｎ　　　＊
　Ｌｙ　ｓ　　　＋　’ｒｈ　ｒ　　−１’ＪＴ（２ヒ
トインシユリン、Ｇｉｎ　　　ｒ　Ｌｙ８−ＮＨ２ヒト
インシュリン、Ｇｉｎ　　　、Ｔｈｒ　　−ＮＨ２ヒト
インシュリン、Ａｒｇ　　　、　Ａｒｇ　　　−ＮＨ２
ヒトインシュリン、ＡｒｇＢ２’　、　Ｌｙｓ　　　−
ＮＨ２ヒトインシェリン、Ａｒ　ｇ　”　２７．Ｔｈ　
ｒ　　　−Ｎｌ（２ヒトインシエリン、ＬｙＩＩ！１２
’　、　Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ
　　　、Ｌｙｓ　　→旧２′ヒトインシュリン、Ｌｙ−
２７，Ｔｈｒ−ＮＨ２ヒトインシェリン、ＬｙｓＢ２９
−ＮＨ２＊　ｄｏｓ−（Ｂ３０）ヒトインシュリン、Ｔ
ｈ　ｒ　”　”−ＮＨ２ヒトインシェリン、Ｌｙｅ　　
　−ＮＨ２ヒトインシェリン、Ｌｙｓ　　　（Ｌａｕ）
−ＮＨ２ヒトインシェリン、Ｌｙｓ　　　−Ａｒｇ　　
−ＮＨ２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ　　−Ｌｙｓ　　−
ＮＨ２ヒトインシュリンＡｒｇ！１５゜−ＮＨ２ヒトイ
ンシュリン、Ａｒｇ　　−Ａｒｇ　　−ＮＩＮ２ヒトイ
ンシュリンまたはＡｒｇ　　−Ｌｙｓ　　−ＮＨ２ヒト
インシュリン。

以下余白 本発明の別の好ましい実施態様は、式■中のＥ１、　Ｂ
２．　Ｂ３および／ｌたはＢ４がグルタミン残基であり
、および／またはＸがＬｙｅまたはＡｒｇである化合物
を含む製剤であり、式■で表わされる化合物のサックラ
スの範囲内で、さらに好ましい実施態様は、式１中の基
−Ｙｍ−Ｚｎ−Ｒが−Ｔｈｒ−ＮＨ２またはＬｙ　ｓ　
−皿２である化合物を含む製剤である。

好ましい化合物は、Ｇｉｎ”３、Ｔｈ　ｒ　”　５０−
　Ｎ’Ｈ２ヒトインシュリン、Ｇｉｎ　　、　Ｔｈｒ　
　−皿２ヒトインシュリン、Ｌ７ｍ　　、　Ｔｈｒ　　
−ＮＨ２ヒトイア’／ニリンおよびＡｒｇ　　、　Ｔｈ
ｒ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンである。

式Ｉで表わされる好ましい化合物の１つの群は、Ｅｌ　
、　ＥＳおよびＢ４がそれぞれグルタミン酸残基を表わ
すものである。

式Ｉで表わされる好ましい化合物の他の群は、Ｂ２がグ
ルタミン残基を表わすものである。

式Ｉで表わされる好ましい化合物のさらに別の群は、Ｘ
がアｌＬ／ｊＦ″ニンまたはりシン残基を表わすもので
ある。

当該技術で良く知られているように、ヒトインシュリン
におけるアミノ酸残基のすべてがインタ、　ＩＪン作用
に必須であるというわけではない。

実際、アミノ酸残基がヒトインシーリンと異なるブタイ
ンシュリンおよびウシインシュリンが糖尿病の治療に用
いられる。インシュリン分子においてはかなシの種類の
変形種が存在する。すなわち、ヒトインシュリン分子に
おける多くのペプチド残基がインシュリン活性を不適当
に弱めることなく変化し、この中には分子の等電点に重
要な幾つかのペプチド残基が含まれる。

Ｅ’　、Ｅ２．Ｅ’　＃　Ｅ’　、ｘ、ｙ、ｚおよびａ
で定義される基は、得られる式■の化合物が医薬として
許容されうるように選択されるべきであることが明らか
である。

公知の二面性インシュリン製剤において、同じ注射液に
速効性の可溶性インシュリンと延長化作用を有する結晶
インシーリンとを組合わせることが普通である。本発明
の式■で表わされる化合物を用いれば、同じように組合
わされた短期および延長化作用が式■の化合物単独の溶
液で達成されうる。速効性と遅効性効果の比は、溶液中
の亜鉛イオンの濃度が上昇すると減少する。

式■で表わされる化合物はペプチド転移反応により調製
されうる。この反応は、ブタインシュリンまたはその他
の正しいインシュリンジスルフィド橋を有し次式■： Ｂ（１−１２）−Ｅ’−Ｂ（１４−２０）−Ｅ’−Ｂ（
２２−２６）−Ｘ−Ｂ（２８−２９）−（Ｑ、−Ｒ）ｒ
Ａ（１３）−１Ａ（５−１６）−に２−Ａ（１８−２１
）　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）（式中、括
弧内の数字の前のＡおよびＢは、それぞれ、括弧内の数
字により示されているように、Ａ鎖およびＢ鎖の適当な
ペプチド分画を示し、Ｑはアミノ酸９個を有するペグチ
ド鎖であり、ｑはθ〜３３の整数でＩｈシ、ＲはＬｙＳ
またはＡｒｇであシ、ｒは０またはｌであプ、Ｅｌ　、
　Ｅ２．　Ｅ３．　Ｅ４およびＸはそれぞれ前記定義の
ものである。）を有する生合成前駆化合物を、次式■： Ｈ−Ｙｍ−Ｚｎ−Ｒ（Ｉ［［） （式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ，ｍおよびｎはそれぞれ前記定義の
ものであり、Ｙおよび２の側鎖アミノ基およびヒドロキ
シ基はアミノおよびヒドロキシ保護基により保護されて
いる。）で表わされるアミノ化合物と、米国特許第４，
３４３，８９８号で記載されているように水と有機溶媒
の混合物中触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵
素を用いて反応させることからなる。この目的で使用さ
れる弐■の化合物の好ましいものはＴｈｒ−Ｎｌ（２、
Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−ＮＨ２、Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−０Ｂｕ
１、Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ％Ａｊ２−ＮＨ２およびＡｒｇ（
Ｂｏｅ）−ＮＨ２である。アミノ基は脂肪酸でアミル化
することにより誘導される。ヒドロキシ基はアルキル化
により保護されうる。Ｙおよび２がアミノ保護基で可逆
的にふさがれている基を含む場合には、これらの基を、
後の工程で除去することができ、所望により、アミン保
護中間体をトリプシンまたはトリプシン様酵素から分離
した後に除去することができる。トリプシン様酵素のう
ちではアクロモパクターリチカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
ｅｔａｒ　１ｙｔｌａｕａ）からのりシルエンド−ｅｆ
チダーゼが有効である。

式■で表わされる化合物は、当該アミノ酸に対する正し
いコドンを有する遺伝子を用いてヨーロッパ特許出願第
１６３，５２９号に記載と同様にして酵母のような宿主
微生物中で表現されうる。次に、新規インシュリン誘導
体をコードする遺伝子を適当な表現型ベクターへ挿入す
る。このベクターは、酵母へ転移したとき所望化合物を
表現しうるものである。次いで表現された産物を、これ
が細胞から分泌されるものか否かにより細胞から単離す
るかまたは培養液から単離する。

可逆性アミン保護基の例は、第三ブトキシカルがニル基
であシ可逆性ヒドロキシ保護基の例は、第三ブチル基で
ある。このような基は、式■で表わされる化合物に不所
望な変化を起こさない条件下で、たとえばトリフルオロ
酢酸を用いて除去される。

式ｌで表わされるインシュリン化合物は、また、カップ
リング反応によりても調製されうる。この反応において
は、次式■： 以下余白 （式中、ｇｌ、　Ｅ２．　Ｅ３．　Ｅ４　　およびＸは
それぞれ前記定義のものである。）で表わされる化合物
を、ヨーロッノ４特許第１７，９３８号明細書で記載さ
れたのと同じ条件下でトリプシンまたはトリズシン様酵
素により前記式■で表わされるアミノ化合物と結合する
。

インシュリン遺伝子工学により製造する場合、さらに１
つか２つの陽電荷をインシュリン分子内部に、すなわち
Ａ４−１Ａ１７−１Ｂ１３−１Ｂ２１−または８２７位
に導入し、アミノ酸アミドまたはアミノ酸エステルによ
るＢ鎖のＣ末端カル♂キシル基の半合成被覆をトリプシ
ンで触媒化させておくことが有利である。

哺乳動物インシュリンの３０残基以上にＢ鎖を延長化す
ることよシもインシュリン分子の５１個のアミノ酸の枠
組内でさらに陽電荷を追加導入することの有利さは調製
が容易であるということである。半合成転移ペプチド反
応においてアミノ酸アミドまたはアミノ酸エステルの大
過剰モル量が使用される。ジペプチドアミドまたはエス
テルが転移ペグチド反応に用いられる場合、値段もしく
は溶解性のいずれかまたはその両方により大過剰量の使
用が禁止され、したがりて生成物の収量が低くなる。た
とえばＬｙｅ（Ｂｏａ）−ＮＨ３とＬｙａ（Ｂｏｃ）−
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２の同じ等モル量を同様な条件
下で転移ベグチド反応に用いる場合でさえ、アミノ酸ア
ミドを用いた収量はジペプチドアミドを用いたものより
実質的に高くなる。

本発明のインシュリン製剤は、式■で表わされる化合物
を若干酸性状態下で、たとえば２４０または６００　ｎ
ｍｏム肩の濃度にて水性媒体中に溶解することによυ調
製される。水性媒体は、たとえば塩化ナトリウムまたは
グリセロールで等張化される。さらに、水性媒体はイン
シュリン活性１単位につきＺｎ”＋約２０μＩＩまでの
濃度の亜鉛イオン、酢酸塩およびクエン酸塩のような緩
衝剤およびｍ−クレゾールまたはフェノールのような保
存剤を含んでいてよい。溶液の両値は弐■で表わされる
化合物の等電点にあまり近くなりすぎることなく中性の
方向に調整され、これにより沈でんを避ける。最終的表
インシュリン製剤の両値は、式Ｉの化合物中に苛電され
た電荷数、亜鉛イオン濃度、式Ｉの化合物の濃度および
選択される式■で表わされる化合物による。このインシ
ュリン製剤は滅Ｉ濾過により滅菌される。

本発明インシュリン製剤は公知インシュリン製剤の使用
と同じようにして使用される。

ここで示されたいかなる新規特徴または特徴の組合わせ
も本発明の本質と考えられる。

ここにおいてアミノ酸に使用する略字は、Ｊ、　Ｂｌｏ
ｌ、　Ｃｈｉｎ　、　２４３　（１９６８）、　３５５
８に記載されているものである。ここで記載されている
アミノ酸はＬ形装置である。式Ｉおよびその他において
、Ａ（１−３）はＧｌｙ−１１ａ−Ｖａｔ、　Ａ（５−
６）はＱｌｎ−Ｃｙｓ等、すなわちヒトインシュリンの
アミノ酸配列である。特記しない限りここで記載したイ
ンシュリンの種はヒトである。

インシュリン化合物の合成 インシュリンの供給源は、ブタインシュリンかまたは最
後に記述したデンマーク特許出願に記載されたように酵
母に表現されたインシュリン前駆体である。

インシュリン前駆体は、同デンマーク特許出願例７に記
載のようにリクロプレプ（ＬＩＣｈｒｏｐｒ・ｐ）’ｒ
ＭＲＰ−１８へ吸着させることにより発酵培地から回収
される。前駆体は３３％（マ１０エタノール中００．２
　ＭＫＣ２，０，００１ＭＨＣｌを用イテカラムから溶
出される。インシュリン前駆体は、溜り液から、連続的
に水（溜り液１容量に対し１容童）０．０５Ｍとなる固
形クエン酸三ナトリウムそして最後に０．００６Ｍとな
る酢酸亜鉛を加えることにより結晶化される。−を６．
８に調整し、混液を４℃で一晩放置する。結晶を遠心分
離により単離し、水洗し減圧乾燥する。

酵素半合成に対し保護されたアミノ酸および保護された
ペプチドは、常法により調製されるかまたはノパパイオ
ケＡ　（Ｎｏｖａ　Ｂｌｏｃｈ＠ｍ）もしくはバケム（
Ｂａａｈｅｍ）　（両方ともスイス）から入手しうる（
慣例約合ｇ）。

名前の後の文字ＴＭは登録商標（ｔｒａｄｅ　Ｍａｒ４
ｃ）を意味する。

〔実施例〕

例１．Ｌｙｓ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンの合成７．
５ＭＭＢ２４　ｍに溶解し九ブタインシュリン１１の溶
液とＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミドで１５ＲＩ３ｔｌＣ
溶解したＬｙｅ（Ｂｏａ）−Ｎｌ２、ＣＨ，Ｃ０ＯＨＣ
Ｎ　ｘプシロン−Ｂｏｃ−Ｌ−リシンアミド、とドロ酢
酸塩）６．１ｊｌの溶液を混合し、混液を１２℃まで冷
却する。０．０５Ｍ酢酸カルシウム溶液２．０８ｍｇに
トリジシン０．１１１が溶解してい右板を加える。１２
℃で９６時間後、アセトン２００Ｍを加えることにより
タン／４り質が沈でんし、この沈でん物を遠心分離によ
り単離する。沈でん物をアセトン１００１で１度洗い、
遠心分離により単離し、減圧乾燥する。

この沈でん物を０．０１Ｎ塩酸のエタノール／水（２８
／７２容量部）溶液５０Ｍに溶かし、この溶液を、オク
タデシルジメチルシリルで置換されたシリカ粒子（平均
粒径５μ、孔径１００Ｘ）を充てんした５Ｘ３０５１調
製用高圧液体クロマトグラフィ（以後ＨＰＬＣと称す）
カラムに入れる。エタノール／硫酸でｐＨ３，５に調節
された硫酸アンモニウムの０．２Ｍ＠液（３８／６２容
量部比）でこのカラムを平衡化する。同じ緩衝液を用い
てタン・母り質をカラムから２　Ｌ　／　ｈの速度で溶
出する。

未反応ツタインシュリンの溶出後に６０分と７５分の間
にカラムから溶出するピークにおいてＬ７膳（Ｂ　ｏ　
ｅ　）　　−ＮＨ２ヒトインシ、リンが見られる。

エタノールを減圧蒸発し、容量が約１２５μに減少する
までこの蒸発を続ける。アセトン２５ａｌＪ、クエン酸
（−水和物ｐ、ａ、）１００１１１および塩化亜鉛（ｐ
−ａ−）　９１１１９を連続して添加するとＬｙｓ（Ｂ
ｏａ）”０−ＮＨ２ヒトインシュリンが単離する。−を
６．５まで調整し、室温にて１時間後、ゆり〈シ攪拌し
なから４℃で２４時間結晶化を続ける。結晶を遠心脱水
し、水冷水５Ｍで１回洗い、遠心降下させ減圧乾燥する
。収量：　Ｌｙｅ（Ｂｏａ）　　　−ＮＨ２上２ヒトシ
ュリン４５６１１Ｉｇ。

Ｌｙｅ（Ｂｏａ　）”’−ＮＨ２ヒトインシ、リン（４
５６ＩＩｇ）をトリフルオロ酢酸１５１１１１７に溶か
し、室温で３時間放置する。トリフルオロ酢酸を凍結乾
燥により除く。凍結乾燥物を水５ｏｕＶｃ溶かし、−を
２．５調整し、塩化す）　ＩＪウム１０．９を加える。

Ｌｙｓ　”　５０−■２ヒトインシュリンの塩ケーキを
遠心分離により単離する。塩ケーキを水１２５ｇに溶か
し、アセトン２５Ｍ、クエン酸（−水和物ｐ、ａ、）１
００ダおよび塩化亜鉛（ｐ、ａ−）　９＃を連続的に加
え−を７、０に調整することによＦ）　Ｌｙｓ　　−Ｎ
Ｈ２ヒトインシュリンを結晶化する。室温で１時間後、
ゆるやかに攪拌しながら２４時間４℃で結晶化を続ける
。

結晶を遠心降下させ、氷冷水５μで１回洗い、再び遠心
降下させ、乾燥する。収量：粗Ｌｙｓ　　−ＮＨ２ヒト
インシ、リン３８７ＩＩＩｇ。

結晶を０．００５Ｎ塩酸のエタノール／水゛（２０／８
０゜容量部）液５Ｑｄに溶かし、この溶液を上記の調製
用ＨＰＬＣカラムへ施こし、同時にエタノール１０．３
Ｍ塩化カリウム溶液とＯ，０ＯＩＮ塩酸（３５，５／６
４．５容量部）で平衡化する。同じ緩衝液で２ｔ／ｂの
割合で溶出すると、その結果５５分〜９０分の間にＬｙ
ｅ　　−Ｎｌ２のピークがカラムから現われる。生成物
を上述のＬｙｓ（Ｂｏａ）　　−ＮＨ２ヒトインシュリ
ンについて記載したように溜り液から単離するがただし
亜鉛含有クエン酸緩衝液中での結晶化におけるーを６．
５よシも７．０に調整する。収量゛：純粋なＬｙｅ　　
−ＮＨ２ヒトインシーリン２６２１Ｒｇ。

アミノ酸の組成は理論と一致し、すなわちアラニンは１
分子中ｌ残基でありリシンは１分子中２残基である。生
成物はｐＨ８，９でのディスクページ（ＤＩＳＣＰＡＧ
Ｅ　）　ｉ［気泳動で純粋であシ、移動割合は電荷約２
の差異に相当するブタインシュリンの５５俤であった。

ディスクページ電気泳動の詳細についてはＨｏｒｎｓ　
Ｍ＠ｔａｂ、　Ｒｏａｍ　５ｕｐｐｌａｒｎａｎｔＳ＠
ｒｉｅｓ　４５　（１９７４）、１３４を参照。

例２．Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンとＡｒｇ”
°−Ａｒ　ｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンの合成８Ｍ
酢酸３．３２ＫＪ中にブタインシーリン１ｇが溶解した
溶液と、Ａｒｇ−ＮＨ２、（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２（Ｌ　
−アルギニンアミドジヒドロ酢醸塩）３．９ｊ’ｔ−Ｎ
。

Ｎ−ジメチルホルムアミド（以後ＤＭＦとする）で溶解
して１０ｍ１ｊにしたものとを混合し、混液を１２℃ま
で冷却する。酢酸カルシウム０．０５Ｍ溶液１．２Ｍに
トリジシン０．１Ｎが溶解した溶液を加える。１２℃で
１４４時間後、アセトン２００１１ｊを加えてタンノ々
り質を沈でんさせ、この沈でん物を遠心分離により単離
する。沈でん物をアセトン１００１１ｊで一回洗い、遠
心分離で単離し、減圧乾燥する。

沈でん物をエタノール／水（２７／７３容量部）中の０
．０１Ｎ塩酸５０１１Ｊに溶かし、このタンノ４り質を
例１に記載したように調製用カラムに施こす。

最初に、エタノール１０．３Ｍ塩化カリウム溶液と０．
００１Ｎ塩醗の３５／６５　（容量部）比からなる溶出
液を４時間２１Ａの割合にてポンダで流す。

３つの未分解ピークが、約６０〜１２０分、１２０〜１
５０分および１５０−１８０分に記録される。

３つの溜シ液中のタンツク質が例１でり、、ｍ３ｏ−Ｎ
Ｈ２について記載したように単離される。収量：溜シ液
１．Ｉ［、ＩＩＩそれぞれについて４１４ダ、１４２即
および１０７ｗＬｇ。

ディスクページ電気泳動を組合わせたアミノ酸分析によ
れば、溜り液Ｉのインシュリン分子はアルギニン残基２
〜数個と結合している。溜シ液■の主な成分は、１つの
アルギニンアミド残基と結合したインシュリン、すなわ
ちＡｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンである。溜シ液
■はブタインシュリン、ｄ・−（Ｂ２Ｏ）ヒトインシュ
リン、Ａｒｇ　　　ヒトインシュリンおよびＡｒｇ　　
−ＮＨ２ヒトインシュリンの混液である。

Ａｒ　ｇ”　”−ＮＨ２上２ヒトシュリンｍｂ液■のタ
ンノ々り買をエタノール／水３／２（ｖ／ｖ　）　１０
　ｕ　Ｋ　Ｐ’　２にて溶かす。ＥＤＴＡ　１２１９添
加後、０．ＩＮ水酸化ナトリクム溶液を加えて−を１０
まで上げる。この溶液を、０．５　Ｍ　ＮＨ！、０．０
５Ｎ塩酸および６０％（Ｖ／Ｖ　）エタノール中の０．
０４Ｍ塩化ナトリウム溶液からなる緩衝液で平衡化した
ＱＡＥ−セファデックス人−２５の２．５×２５ｃＩＦ
１カラムへ施こす。０．０４Ｍ　〜０．１Ｍの直線勾配
状塩化ナトリウムを用いて溶出液総量１１となるように
して３０１ｇ／ｈの割合でカラムを溶出する。この間−
は常に約１０．０に保たれる。１０ｍＡの分画を集める
。分画４５８−７４でＡｒｇ１３０−ＮＨ２ヒトインシ
ュリンがカラムから現われる。

生成物を蒸発により溜シ液から単離し、続いて例１でＬ
ｙ　ｓ　　−ＮＨ２について記載されているように１５
チアセトン（ｖ／ｖ　）を含む亜鉛含有クエン酸緩衝液
中で−７にて結晶化する。収量：５３ｍｇ。

生成物を−８，９にてディスクページ電気泳動で均質に
し、移動度はインシュリンの５５％である。

アミノ酸組成はＡｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンの
理論と一致し、これはインシーリン１分子につきアルギ
ニン残基２個とアラニン残基１個を示す。

Ａｒｇ　　−Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリン溜υ
液Ｉのタンパク質を溶解し、溜り液■のタンノ４り質に
ついて記載したようにＱＡＥ−セファデックス”Ａ−２
５でイオン交換クロマトグラフィにかけ４Ａｒｇ　　−
Ａｒｇ　　−ＮＨ２ヒトインシュリンが分画Ａ３４−４
７にてカラムから現われる。例１でＬｙｅ”’−ＮＨ２
ヒトインシュリンについて記載したように生成物を単離
する。収量：ｌＯ■。

生成物を−８，９でディスクページ電気泳動により均質
化し、移動度はインシュリンの３５チであった。アミノ
酸の組成はインシュリン１分子につきアルギニン残基３
個とアラニン残基１個を示す。

例３．Ｔｈｒ−ＮＨ２ヒトインシュリンの合成１０Ｍ酢
酸５ｖ中にツタインシュリンＩｇが溶解した液とＴｈｒ
−ＮＨ２（Ｌ　−トレオニンアミド、遊離塩基）２．３
６５１１をＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミド１３ｍｇに懸
濁させて１３μの容量にした懸濁液とを混合する。混合
後、Ｔｈｒ−ＮＨ２を溶かす。混液を１２℃まで冷却し
、０．０５Ｍ酢酸カルシウム溶液２μにトリプシン０．
１Ｎが溶解した液を加える。１２℃で７２時間後、アセ
トン２００１１６を加えてタンノ９り質を沈でんさせ、
遠心分離によりこの沈でん物を単離する。沈でん物をア
セトン１００ｍ１１で１回洗い、遠心分離で単離し、減
圧乾燥する。

トリプシン未反応プタイ・ンシュリンからの’ｒｈ　ｒ
　”　”−ＮＨ２ヒトインシーリンの精製を、ヒトイン
シュリンのエステルについて記載したように行なう〔マ
ルクツセン（Ｍａｒｋｕａａｓｎ）　：　Ｍ＠ｔｈｏｄ
ｓｉ１１Ｄｉｍｂ＠ｔ＠ｓ　Ｒａｓ＠ｒａｈ、　ＶｏＬ
ｌ、編集者：レーナーアンドポール（Ｌａｒｎ＠ｒ　＆
　Ｐｏｕｔ　）（１９８４）、４０８〕。収量：５９９
■。

生成物を−８，９でディスクページ電気泳動にて均質で
あシ、移動度はインシュリンの７５チである。アミノ酸
組成は理論と一致し、インシュリン１分子当シトレオニ
ン残基３個とアラニン残基１個である。

例４〜例１０の出発物質において、式■の（Ｑ９−Ｒ）
、に）ｈｌｓ　−Ａｔａ　−Ｌｙ　ａが選択され、デン
マーク特許出願中５８２／８２号の例１０において酵母
グラスミドｐＭＴ　６１０について記載されているよう
に構築される。Ｇｌ’ｎ　　　ｓ　Ｇｉｎ　　　ｓｈ、
ｇ８２７およびＬｙ　ａ　”　２７をコードするヌクレ
オチドは、Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄａ、Ｒ＠ｓ、１１　　（
１９８３）、５１０３〜５】１２の手法を用いて特異的
突然変異を位置させることによりｐＭＴ　６１０にて置
換される。

以下余白 例４　：　　Ｇｉｎ　　　、Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒト
インシ、リンの合成 酢酸／　ＤＭＦ　／水（酢酸１１．４ｄ　、　ＤＭＦ　
６５．１ｄと水を加えて１００ｄにしたもの）１５ｄ中
にＧｔｎ”　１、Ｂ（１−２９）−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｌ
ｙｓ−Ａ（１−２１）インシーリン前駆体３．１２．９
が懸濁し念液へＩＭ　Ｔｈｒ−ＮＨ２のＤＭＦ液３９ｍ
を加える。混液を１２℃まで冷却し、０．０５Ｍ酢酸カ
ルシウム７．５ｄ中に溶解したブタトリジシン０．３．
９を加える。インシーリン前駆体が溶解するまで攪拌を
続ける。１２℃で４８時間後、アセトン４００１Ａｔを
加えてタン／４’り質を沈でんさせる。タン／４’り質
を遠心分離により単離し、アセトン１００ｄで一回洗ｂ
、減圧乾燥する。

沈でん物を０．０４　Ｎ　ＨＣｌ　７０ａｇｌＣ溶かし
、−を２．５に調整し、誘導体を例１に記載し友ように
してＨＰＬＣにより精製するが、念だし溶出液としてエ
タノール３５部と０．３　Ｍ　ＫＣｌ　、　０．００１
Ｎ　ＨＣＬ６５部とからなる液を用いる。誘導体が約３
カラム容量後にカラムから現われ、これを連続的に水ｌ
容量、０．０５Ｍになる量の固形クエン酸三ナトリウム
および０．００６Ｍになる量の固形酢酸亜鉛を加えて単
離する。ｐＨ６，５に調整し４℃で一晩攪拌後、遠心分
離により結晶を採取し、水で洗い、乾燥する。収量１．
６４Ｉｉ＝５３％、さらに、１？−）インシュリンエス
テルについて記載し友ように陰イオン交換クロマトグラ
フィにより精製する〔マルクッセン、同上、４１０参照
〕。最終収量＝１．１？Ｍ−３７憾。生成物をｐＨ８，
９にてディスクベージ電気泳動でほぼ均質にし、移動度
はインシュリンの５５チである。逆相ＨＰＬＣ分析（マ
ルクッセン同上、４１０参照）だおいて、生成物はプタ
インシ、リンとほぼ同じ速度で溶出する。純度は約９５
％であった。アミノ酸組成分析は提示され九式と一致し
た。

例５　：　Ｇｉｎ　　　、ＬｙＩＩ−ＮＨ２ヒトインシ
ーリンの合成 酢酸／Ｄ■゛／水（酢酸４．５７ｄ、　ＤＭＦ　７１．
９ａｊ？と水で１００＃Ｉｌにする）　１５ｍ１ＣＧＩ
ｎ”７．Ｂ（１−２９）−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｌｙｓ−Ａ
（１−２１）　　インシュリン前駆体３．１１が懸濁し
ている液へ、０．４ＭＬｙｓ（Ｂｏａ）−ＮＨ２のＤＭ
Ｆ液３９ｍｊｔ−加える。混液を１２℃まで冷却し、０
．０５Ｍ酢酸カルシウム７．５４に溶解し念トリプシン
０．３１を加える。インシーリン前駆体が溶解するまで
攪拌を続ける。１２℃で４８時間後、タンノ譬り質を例
４で記載し九ように単離する。

沈でん物を０．０４Ｎ　ＨＣｌ　７０ｄに溶かし、−を
２．５まで調整し、Ｇｉｎ”１、Ｌｙａ（Ｈｏｅ）”’
−ＮＨ２に一トインシーリン金例１に記載のようにＨＰ
ＬＣで精製する。ただし、最初にエタノール３７部と０
．３ＭＫＣ２，０，００１ＮＨＣｌ６３部からなる溶出
液２．３１で溶出を行ない、続いてエタノール３９部と
水性（１３Ｍ　ＫＣｌ　、　０．００　ＩＮ　ＨＣｌ６
１部からなる溶出液で溶出を行なう。溶出液を変えて２
５分後に誘導体が現われ、これを例４でＧｔｎ　　　。

Ｔｈ　ｒ　”　５０−？ＪＴ（２ヒトインシ、リンにつ
いて記載したように単離する。ＧＬｎ”　１、Ｌｙｓ（
Ｂｏａ）”０→■２ヒトインシーリンの収ｔｈｔ９０６
ダ＝２９１゜Ｇｔｎ”１、ＬｙＩＩ（ＢＯｅ）”０−Ｎ
Ｈ２ヒトインシーリン（１，５５１をトリプルオロ酢酸
（ＴＦＡ）　３０ａｊに溶かし、室温で２時間放置する
。ＴＦＡを凍結乾燥により除く。残渣を水１５１１１７
に溶かし、１ＮＮａＯＨで−を３に調整し、エタノール
２２ｄを加える。

溶液を、０．０１Ｍクエン酸、０．０３　Ｍ　ＮａＣｔ
からなるエタノール／水３／２（マ／マ）緩衝液で平衡
化したｓｐ−セファデックス（Ｓ＠ｐｈａｄｅｘ）７Ｍ
Ｃ−２５の２．５Ｘ２０ｍカラムへ施こし、−をＮａＯ
Ｈで４．５に調整する。同じ緩衝液で、ＮａＣＬ　０．
０３　Ｍから０．４Ｍの直線状勾配により力２ムを溶出
し、総溶出量１．６ｊとする。勾配物が０．２　Ｍ　Ｎ
ａＣｔに達すると誘導体は４４９ｄ溶出する。これを、
水１１００ｍｊ、０．０５Ｍとなるような量の固形クエ
ン酸三ナトリウムおよび０．００６Ｍとなるような量の
固形酢酸亜鉛を加えることにより結晶化する。

結局−を６．８に調整する。−晩４℃で攪拌後、結晶を
遠心分離により単離し、水で一回洗い、減圧乾燥する。

収量：１．００ｊｌであり、これは最終工場の６５％以
上とＧｔｎ　”　’　＊　Ｂ　（１−２９）−ムｔａ　
−Ａｔａ　−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）インシュリン前駆
体からの１９チに相当する。生成物をｐＨ８，９でディ
スクページ電気泳動でほぼ均質化し、移動度はインシュ
リンの３５％である。ＨＰＬ、Ｃ分析において、生成物
はブタインシーリンより前に現・われ、純度は約９７．
９６である。アミノ酸組成分析は１分子にっきりシン残
基２個を示し、その他の点ではヒトインシーリンと同じ
である。

例６．Ａｒｇ　　　、Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシ
、リンの合成 酢酸／水／　ＤＭＦ　（酢酸１１．４ｍ、水３５Ｍ。

ＤＭＦでｌＱＱｍにする）１８ｄにＡｒｇ”１、Ｂ（１
−２９）−Ａｔａ−ＡＬａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）　
インシュリン前駆体３．８ＩがＩＭしている液へ、Ｉ　
Ｍ　Ｔｈｒ−Ｎ）ｌ：２−ＤＭＦ３６１１１ｊを加える
。混液を１２℃まで冷やし、０．０５Ｍ酢酸カルシウム
５．９４部ｇ中のブタトリプシン０．３８Ｎを加える。

１２℃で４８時間後、タンパク質を例４に記載のように
アセトンで沈でんさせる。

最初にエタノール３５部と水性０．３　Ｍ　ＫＣｌ　。

０．００１ＮＨＣｌ６５部とからなる溶出液１８００ｄ
を用い、次にエタノール３７部と水溶液６３部とからな
る溶出液を用込て例１に記載のようにＨＰＬＣで誘導体
を精製する。溶出液を変えてから１０分して誘導体が現
われ、これを例４のＧｔｎＡ１７゜Ｔｈｒ１５０−ＮＨ
２インシーリンについて記載のように単離する。最後に
、例５のＧｔｎ　　ｔ　Ｌｙ　ａ　　　−ＮＨ２ヒトイ
ンシーリンに記載されているようにＳＰ−セファデック
ス”Ｃ−２５のカラムで精製する。

Ｂ２７　　　　　ｍ！Ｓ。

Ａｒｇ　　　ｅＴｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシュリン
の収量は１．６３　Ｉｉであり、これは４３僑【相当す
る。ディスクページ電気泳動ではほぼ１つのバンドが見
られ、移動度はインシーリンの５５％である。

ＨＰＬＣ分析において、ブタインシーリンよシ前に生成
物が現われ、純度は約９６９６であり几。アミノ酸組成
分析は１分子につき２個のアルギニン残基金示し、その
他の点ではヒトインシーリンと同じである。

例７．Ａｒｇ　　　、Ｌｙｅ　　　−ＮＨ２ヒトインシ
、リンの合成 化合物は、例５に記載の方法を用いてＡｒｇ　　。

Ｂ（１−２９）−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２
１）インシーリン前駆体３．６１ｇから化合物を合成す
る。Ａｒｇ　　　。

ＬｙｓＩ′５Ｏ−ＮＨ２ヒトインシ、リンの収ｔは０．
７８１／＝２２％である。ディスクページ電気泳動にお
ける１つの主バンドはインシーリン移動距離の３５係移
動する。２つの小さいバンドが見える。ＨＰＬＣ分析に
おける純度は９２ｔ６である；生成物はブタインシーリ
ン前に出現する。アミノ酸組成は１分子につき２個のア
ルギニンと２個のりシン残基を示し、それ以外はヒトイ
ンシーリンと同じである。

例８　、　Ｌｙｓ　　　、Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトイ
ンシ、リンの合成 化合物を、例６に記載の方法を用いてＬｙｓ　　　。

Ｂ（１−２９）−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｌｙｅ−Ａ（１−２
１）インシーリン前駆体７．０ｇから合成する。

Ｌｙｓ　　　、Ｔｈｒ　　　−ＮＨ２ヒトインシ、リン
の収量Ｆ１３．１５Ｎであり４５憾に相当する。ディス
クページ電気泳動け１つの主バンドと２つの副バンドを
示し、この主バンドは対照インシーリンノぐンドの距離
の５５４を移動する。ＨＰＬＣ分析による純度は９６％
である。化合物は逆相ＨＰＬＣにおいてプタインシ、リ
ンよシ早く現われる。アミノ酸組成分析は１分子当り２
個のりシン残基金示し、その他の点ではヒトインシュリ
ンと同一である。

例９　：　Ｌｙｅ！１２１、ＬｙｓＢ５’−ＮＨ２ヒト
インシーリンの合成 化合物を、例５に記載の方法を用いてＬｙｓＢ２７゜Ｂ
（１−２９）−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１
）インシュリン前駆体７．０ｇから合成する。Ｌｙ　ｍ
　”　２７　、　Ｌｙ　ｓ　”　５０−洲、ヒトインシ
ュリンの収量は１．５７１でありこれは２２チに相当す
る。ディスクページ電気泳動け１つの主バンドを示し、
これはプタインシ、リンの３５−の距離まで移動する。

１つの不純物副バンドが見える。ＨＰＬＣ分析による純
度は９４チであり、化合物はブタインシーリンよりかな
り前に出現する。アミノ酸組成分析は１分子当り３個の
りシン残基を示し、他の点ではヒトインシュリンと同一
である。

例１０　、　Ｇｉｎ　　＊Ｔｈｒ　　−ＮＨ２ヒトイン
シュリンの合成 例６に記載の方法を用いてＧＺｎ　”　”　＊　Ｂ　（
１−２９）　−Ａｔａ−んムーＬｙｓ−Ａ（１−２１）
インシュリン前躯体３．０５Ｉから化合物を合成する。

最終生成物の収量は０．８８ＩＩでありこれは２９優に
相当する。ディスクページ電気泳動け１つの主バンドを
示し、ツタインシーリン移動距離の５５俤を移動する。

）ｔＰＬｃにより純度は９５優であり、この化合物はブ
タインシーリンよりも後に溶出する。アミノ酸組成分析
はヒトインシーリンと同一であることを示す。

例１１：式■で表わされる化合物の注射液の調製延長化
作用の程度を試験するための式■で表わされる化合物の
滅菌注射液を、等張渡として０．９１（ｖ／マ）塩化ナ
トリウムと保存剤として０．１５％（ｖ／ｖ）ｍ−クレ
ゾールを用いて作る。注射液はまた、等張渡としてＬ　
６　％　（ｖ／ｖ）クレゾール、保存剤として０．３係
（ｗ／ｖ　）　ｍ−クレゾールを用い、０．０１Ｍ酢酸
ナトリウムで緩衝化することによっても作られる。亜鉛
イオンの濃度はＯ〜１６０μＩ／ｄの間を変化する。溶
液のβ値は式■の化合物の等電点と十分離れるように調
整し溶液を４℃での貯蔵で透明に保つようにする。溶液
は式Ｉで表わされる化合物２４０　ｎｍｏｌｓ　／ｌｔ
ｌを含む。２４０ｎｍｏｌ・／ｄの濃度は、これら誘導
体に対し６１００のブタインシーリンのモル吸光係数を
用い（Ｈａｎｄｂｕｃｈ　ｄｅｒ　Ｉｎｎｅｒ＠ｎ　Ｍ
ａｄｌｚｉｎ　、　Ｖｏｌ　７／Ｐａｒｔ　２Ａ　ｓ編
集者二オーバーディッセ（Ｏｂａｒｄｉｓｓｅ）　　、
　　１９７５．　１１３］および２８．５　Ｕ／１ｎ９
乾燥物質の一成分ブタインシーリンの確立された潜在能
力（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｓ、　Ｖｏｌ　６／Ｓｕ
ｐｐｌｅｍｓｕｔ１　（１９８３）　、　４参照）を用
いて、ｍ−クレゾールを含まないより濃縮し九貯蔵溶液
の２７６ｎｍの吸光率を測定することにより確立される
。ＩＵは５．９５　ｎ　ｍｏｔ・に相当する。

表１において示され九−値および亜鉛含有量を有する式
■の化合物を２４０ｎｍｏｌ・／ｄ金含有る注射液を作
る。

インク、リン効果の延長化に対する試験インシュリン注
射液によって生ずる低血糖効果の延長化を、絶食させ九
ウサギにおいて、Ｂｒ１ｔｌｓｈ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐ
ｏ＠ｉａ　１９８０ｔ　Ａ１４２にしたかって試験する
。各試験液を、体重３−４ｋｇの動物６匹ま九は１２匹
に、ウサギ１匹につき１５，５ｎｍｏ１ｅの投与量で皮
下注射し、低血糖の経過を６時間注視する。速効性製剤
との比較の友めに、アクトラピド（Ａｅｔｒａｐｉｄ）
”ブタインシーリンを試験に含ませる。試験結果を表１
および表２に示す。

ウサギにおける特定化合物の延長化効果の試験結果を下
記の表１に記載する。グルコース値は６匹のウサギから
の初期のグルコース値←）の平均である。溶液は、保存
剤として０．１５９６（マ／ｖ）ｍ−クレゾールを用い
て０．９　％　Ｎ＊Ｃ１で等張化される。

以下余白 ウサギにおける特定化合物の延長化作用に対する試験結
果を以下の表２に示す。グルコース値は、１２匹のウサ
ギからの初期のグルコース値（イ）の平均である。試験
溶液は、保存剤として０．３％（ｗ／ｖ）ｍ−クレゾー
ルを用い１．６　％　（ｗ／ｖ）グリセロールで等帰化
され、０．０１Ｍ酢酸ナトリウムで緩衝化される。

以下余白 インシュリン化合物の効力は、マウス血糖消費試験（Ｂ
ｒ１ｔｉｓｈ　Ｐｂａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　１９８０
　。

Ａ１４ｌ−Ａ１４２）で評価される。標準物との時間差
を有するインシュリンの効力を評価する問題を最少域に
するために、効力測定のためのインシュリン溶液を亜鉛
を加えることなく作る。溶液を吸収率２７６　ｎｍに基
づいて２４０　ｎｍｏｌｅ／４＋含むように作る。溶液
の亜鉛含量は８−１０μｇ〜であシ、結晶性誘導体から
起る。幾つかのイン７ｚ’）ン化合物の評価された効力
を次の表３に示す。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、括弧内の数字の前のＡおよびＢは、それぞれ括
   弧内の数字により示されるＡ鎖およびＢ鎖のペプチド分
   画を意味し、Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４は同
   一または異なって各々グルタミン酸またはヌクレオチド
   配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、
   ＸはＬ−トレオニン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシン
   残基を表わし、ＹおよびＺは同一または異なって各々、
   側鎖アミノ基がアシル化されてもよく側鎖ヒドロキシ基
   がアルキル化されてもよいアミノ酸残基を表わし、ｍお
   よびｎは同一または異なって各々０または１であり、Ｒ
   はＢ鎖のＣ末端カルボキシル基をふさぐアミドまたはエ
   ステル残基を表わし、ただしＸがトレオニン残基である
   場合Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４のすべてがグ
   ルタミン酸残基であることはなく、またはＥ＾１、Ｅ＾
   ２、Ｅ＾３およびＥ＾４各々がグルタミン酸残基であり
   、Ｘがトレオニン残基である場合、式−Ｙ＿ｍ−Ｚ＿ｎ
   −Ｒで表わされる基は−ＮＨ＿２、−Ａｒｇ−ＮＨ＿２
   、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｎ
   Ｈ＿２、−Ｄａｂ−Ｄａｂ−ＮＨ＿２、−Ｄａｐ−Ｄａ
   ｐ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ（Ｌａｕ
   ）−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ
   −Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｏｒｎ−ＮＨ＿２、または−Ｏ
   ｒｎ−Ｏｒｎ−ＮＨ＿２を表わす。）で表わされる化合
   物。 ２、Ｅ＾１、Ｅ＾３およびＥ＾４がそれぞれグルタミン
   酸残基である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、Ｅ＾２がグルタミン残基である特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の化合物。 ４、Ｙおよび／またはＺが塩基性アミノ酸残基であって
   該基中の側鎖アミノ基が場合によりアシル化されている
   基（ｍ＝１）である特許請求の範囲第１項〜第３項のい
   ずれか１に記載の化合物。 ５、ｎが０であり、Ｙが塩基性アミノ酸残基（ｍ＝１）
   である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記
   載の化合物。 ６、ＹおよびＺが両方とも塩基性アミノ酸残基（ｍ＝１
   、ｎ＝１）である特許請求の範囲第１項〜第５項のいず
   れか１に記載の化合物。 ７、Ｒが一般式：−ＮＲ＾１Ｒ＾２で表わされる基であ
   って該基中のＲ＾１およびＲ＾２は同一または異なって
   それぞれ水素原子または低級アルキル基を表わす基、好
   ましくはＲ＾は−ＮＨ＿２である特許請求の範囲第１項
   〜第６項のいずれか１に記載の化合物。 ８、Ｒが低級アルコキシ基、好ましくは第三ブチルオキ
   シ基である特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１
   に記載の化合物。 ９、Ｒがラクタム残基であって好ましくは該基中のラク
   タム環に８個未満の原子を含むものである特許請求の範
   囲１項〜第６項のいずれか１に記載の化合物。 １０、式 I で表わされる化合物がＧｌｎ＾Ａ＾１＾７
   、Ａｒｇ＾Ｂ＾２＾７、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２
   ヒトインシュリン、Ｇｌｎ＾Ａ＾１＾７、Ｇｌｎ＾Ｂ＾
   １＾３、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリ
   ン、Ｇｌｎ＾Ａ＾１＾７、Ｌｙｓ＾Ｂ＾２＾７、Ｔｈｒ
   ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｇｌｎ＾Ａ
   ＾１＾７、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュ
   リン、Ｇｌｎ＾Ａ＾１＾７、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ
   ＿２ヒトインシュリン、Ｇｌｎ＾Ｂ＾１＾３、Ａｒｇ＾
   Ｂ＾２＾７、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシ
   ュリン、Ｇｌｎ＾Ｂ＾１＾３、Ｌｙｓ＾Ｂ＾２＾７、Ｔ
   ｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｇｌｎ
   ＾Ｂ＾１＾３、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトイン
   シュリン、Ｇｌｎ＾Ｂ＾１＾３、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−
   ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ａｒｇ＾Ｂ＾２＾７、Ａｒ
   ｇ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ａｒｇ＾
   Ｂ＾２＾７、Ｌｙａ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシ
   ュリン、Ａｒｇ＾Ｂ＾２＾７、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−Ｎ
   Ｈ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾２＾７、Ａｒｇ
   ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ
   ＾２＾７、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュ
   リン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾２＾７、Ｔｈｒ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ
   ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾２＾９−ＮＨ＿２
   、ｄｅｓ−（Ｂ３０）ヒトインシュリン、Ｔｈｒ＾Ｂ＾
   ３＾０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾
   ０−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾０（
   Ｌａｕ）−ＮＨ＿２ヒトインシュリン、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３
   ＾０−Ａｒｇ＾Ｂ＾３＾１−ＮＨ＿２ヒトインシュリン
   、Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾０−Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾１−ＮＨ＿２
   ヒトインシュリン、Ａｒｇ＾Ｂ＾３＾０−ＮＨ＿２ヒト
   インシュリン、Ａｒｇ＾Ｂ＾３＾０−Ａｒｇ＾Ｂ＾３＾
   １−ＮＨ＿２ヒトインシュリンまたはＡｒｇ＾Ｂ＾３＾
   ０−Ｌｙｓ＾Ｂ＾３＾１−ＮＨ＿２ヒトインシュリンで
   ある特許請求の範囲第１項記載の化合物。 １１、次式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、括弧内の数字の前のＡおよびＢは、それぞれ括
   弧内の数字により示されるＡ鎖およびＢ鎖のペプチド分
   画を意味し、Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４は同
   一または異なって各々グルタミン酸またはヌクレオチド
   配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、
   ＸはＬ−トレオニン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシン
   残基を表わし、ＹおよびＺは同一または異なって各々、
   側鎖アミノ基がアシル化されてもよく側鎖ヒドロキシ基
   がアルキル化されてもよいアミノ酸残基を表わし、ｍお
   よびｎは同一または異なって各々０または１であり、Ｒ
   はＢ鎖のＣ末端カルボキシル基をふさぐアミドまたはエ
   ステル残基を表わし、ただしＸがトレオニン残基である
   場合Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４のすべてがグ
   ルタミン酸残基であることはなく、またはＥ＾１、Ｅ＾
   ２、Ｅ＾３およびＥ＾４各々がグルタミン酸残基であり
   、Ｘがトレオニン残基である場合、式−Ｙｍ−Ｚｎ−Ｒ
   で表わされる基は−ＮＨ＿２、−Ａｒｇ−ＮＨ＿２、−
   Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２−、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ
   ＿２、−Ｄａｂ−Ｄａｂ−ＮＨ＿２、−Ｄａｐ−Ｄａｐ
   −ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ（Ｌａｕ）
   −ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−
   Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｏｒｎ−ＮＨ＿２、−Ｏｒｎ−Ｏ
   ｒｎ−ＮＨ＿２、−Ｔｈｒ−ＮＨ＿２、−Ｔｈｒ−ＯＢ
   ｕ＾ｔまたは−Ｔｈｒ（Ｂｕ＾ｔ）−ＯＢｕ＾ｔを表わ
   す）で表わされる化合物を含有する延長化インシュリン
   作用を有する注射液。 １２、亜鉛イオンを、好ましくは約２μｇ〜約２ｍｇ亜
   鉛／ｍｌ、最も好ましくは約５μｇ〜２００μｇ亜鉛／
   ｍｌの量で含有する特許請求の範囲第１１項記載の注射
   液。 １３、特許請求の範囲第１１項記載の式 I で表わされ
   る化合物含有溶液と混合することにより特許請求の範囲
   第１１項記載のさらに延長化された活性の溶液を調製す
   るのに用いられる亜鉛溶液であって、好ましくは亜鉛約
   １０μｇ〜２０ｍｇ／ｍｌを含む亜鉛溶液。 １４、場合により亜鉛を含んでもよい特許請求の範囲第
   １１項記載の式 I で表わされる化合物含有溶液を場合
   により式 I で表わされる化合物を含んでもよい亜鉛溶
   液と混合し、混液を亜鉛濃度２ｍｇ／ｍｌまで、好まし
   くは２つの溶液のそれぞれの亜鉛含量が約４ｍｇ／ｍｌ
   未満となるようにする特許請求の範囲第１１項記載の調
   製法。 １５、次式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、括弧内の数字の前のＡおよびＢは、それぞれ括
   弧内の数字により示されるＡ鎖およびＢ鎖のペプチド分
   画を意味し、Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４は同
   一または異なってそれぞれグルタミン酸またはヌクレオ
   チド配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わ
   し、ＸはＬ−トレオニン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リ
   シン残基を表わし、ＹおよびＺは同一または異なってそ
   れぞれ側鎖アミノ基がアシル化されてもよく側鎖ヒドロ
   キシル基がアルキル化されてもよいアミノ酸残基を表わ
   し、ｍおよびｎは同一または異なってそれぞれ０または
   １であり、ＲはＢ鎖のＣ末端カルボキシル基をふさぐア
   ミドまたはエステル残基を表わし、ただしＸがトレオニ
   ン残基である場合Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４
   のすべてがグルタミン酸残基であるというわけではなく
   、またはＥ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３およびＥ＾４のそれぞ
   れがグルタミン酸残基である時はＸはトレオニン残基で
   あり、式−Ｙ＿ｍ−Ｚ＿ｎ−Ｒで表わされる基は−ＮＨ
   ＿２、−Ａｒｇ−ＮＨ＿２、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ＿
   ２、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｄａｂ−Ｄａｂ−
   ＮＨ＿２、−Ｄａｐ−Ｄａｐ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−Ｎ
   Ｈ＿２、−Ｌｙｓ（Ｌａｕ）−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−Ａ
   ｒｇ−ＮＨ＿２、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ＿２、−Ｏｒ
   ｍ−ＮＨ＿２、−Ｏｒｍ−Ｏｒｍ−ＮＨ＿２、−Ｔｈｒ
   −ＮＨ＿２、−Ｔｈｒ−ＯＢｕ＾ｔまたは−Ｔｈｒ（Ｂ
   ｕ＾ｔ）−ＯＢｕ＾ｔを表わす。）で表わされる化合物
   の調製法であって、該方法が、 ａ）次式II： Ｂ（１−１２）−Ｅ＾３−Ｂ（１４−２０）−Ｅ＾４−
   Ｂ（２２−２６）−Ｘ−Ｂ（２８−２９）−（Ｑ＿ｑ−
   Ｒ）＿ｒ−Ａ（１−３）−Ｅ＾１−Ａ（５−１６）−Ｅ
   ＾２−Ａ（１８−２１）（II） （式中、ＡおよびＢは、それぞれ、括弧内の数字により
   示されているＡ鎖およびＢ鎖のペプチド分画を示し、Ｑ
   はアミノ酸ｑ個を有するペプチド鎖であり、ｑは０〜３
   ３の整数であり、ＲはＬｙｓまたはＡｒｇであり、ｒは
   ０または１であり、Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３、Ｅ＾４お
   よびＸはそれぞれ前記定義のものである。）を有する生
   合成前駆化合物を、次式III：Ｈ−Ｙ＿ｍ−Ｚ＿ｎ−Ｒ
   （III） （式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ、ｍおよびｎはそれぞれ前記定義の
   ものであり、ＹおよびＺの側鎖アミノ基およびヒドロキ
   シ基はアミノおよびヒドロキシ保護基でふさがれている
   。）で表わされる化合物とともに、触媒としてトリプシ
   ンまたはトリプシン様酵素を用いてペプチド転移するか
   、または ｂ）次式IV： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中、Ｅ＾１、Ｅ＾２、Ｅ＾３、Ｅ＾４およびＸはそ
   れぞれ前記定義のものである。）で表わされる化合物を
   、トリプシンまたはトリプシン様酵素により式IIIで表
   わされる化合物と結合させる、 ことからなる前記式 I で表わされる化合物の調製法。