NO172441B

NO172441B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive insulinforbindelser

Info

Publication number: NO172441B
Application number: NO860920A
Authority: NO
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-11
Publication date: 1993-04-13
Also published as: GR860687B; CS166686A2; MY102102A; DE3685668T2; HUT41052A; HU201097B; JPS61212598A; DK113585D0; YU46001B; DK107086D0; IL78103A0; KR860007288A; NZ215445A; DK107086A; AU612964B2; AU5449586A; DD244345A5; YU34586A; ATE77391T1; DE3685668D1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte

for fremstilling av terapeutisk aktive insulinforbindelser.

Disse forbindelser kan anvendes i injiserbare løsninger som har forlenget insulinvirkning.

Ved behandling av diabetes mellitus er mange varieteter av insulinpreparater blitt foreslått og anvendt. Noen av prepara-tene er hurtigvirkende, og andre preparater har mer eller mindre forlenget virkning. Vanligvis er det ønskelig med farmasøytis-

ke insulinpreparater med mer eller mindre forlenget virkning.

En slik forlenget virkning kan oppnås ved at insulinet admini-streres som en suspensjon av insulinkrystaller. De krystallins-

ke preparater kan oppnås ved krystallisering av insulin i nærvær av sink (for eksempel Lente ®, se Schlichtkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals

and Insulin Zinc Suspensions, Munkegaard, 1958) eller ved krystallisering av insulin i nærvær av sink og protamin (for eksem-

pel NPH-insulin, se Rep.Steno Mem.Hosp. 1, (1946), 60).

Én ulempe ved anvendelsen av de kjente suspensjoner av sink-insulinkrystaller eller av sink-protamin-insulin er nød-vendigheten av å ryste glassbeholderen for å sikre at den korrekte mengde insulin blir injisert og for å sikre at konsentrasjon-

en av insulin i glassbeholderen forblir konstant under hele bru-ken. I Penfill ®-patroner hvor luft rna være fraværende, krever insulinsuspensjoner med forlenget virkning inkorporering av et fast legeme i patronen for å muliggjøre agitering. Rystingen av insulinsuspensjoner og insulinløsninger med luft er i seg selv en uønsket prosess, da insulin har tendens til å denaturere under dannelse av fibriller ved vann/luft-grenseflåtene. Følge-lig er det ønskelig med løsninger av insuliner med forlenget virkning.

Løsninger av insulinderivater med forlenget virkning ble oppnådd fra insulin som var blitt modifisert i sine aminogrupper ved omsetning med fenylisocyanat (såkalt iso-insulin, se Hallan-Moeller: Chemical and Biological Insulin Studies based

upon the Reaction between Insulin and Phenylisocyanate,

København 1945). Likeledes ble Al,B29-di-Boc substituert insu-

lin (Boe betegner tertiært butyloksykarbonyl) rapportert å vise forlenget insulinvirkning etter subkutan administrering (se Geiger&Enzmann i: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceedings

of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide,

Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979, 306-310). Det Al,B29-di-Boc-substituerte insulin ble funnet å oppvise en for lite forlenget virkning til å være klinisk anvendelig.

Løsninger.av umodifiserte insuliner krever store mengder

av sinkioner (for eksempel 0,4 - 1 mg/U insulin) for å oppvise forlenget virkning (se J. Pharmacol. 55, (1935), 206). Injeksjon av så store doser av sinkioner vil sannsynligvis gi smerte, og slike løsninger er derfor aldri blitt brukt i terapi.

Det isoelektriske punkt for insulin er ca. 5,5, og det er gjort forsøk med å nedsette løseligheten av insulinderivater ved nøytral pH-verdi ved å skifte det isoelektriske punkt oppad, f. eks. ved tilsetninger, i N-terminusen til B-kjeden, av basiske aminosyrer som for eksempel lysin eller arginin (se for eksempel BRD-off.skrift 2 042 299) eller med det basiske dipeptid argi-nyl-arginin (se Geiger&Enzmann sitert ovenfor). Løseligheten av sistnevnte forbindelse Arg B ( v —1) -Arg BO-insulin, nær dets isoelektriske punkt, var imidlertid meget høyere enn for mor-insulinet.

Japansk patentsøknad 55-144032 vedrører analoger til human-insulin hvor B30-aminosyren er erstatteb med en aminosyre som har minst 5 karbonatomer, samt amider og estere derav. Disse insulinanaloger skulle anvendes på pasienter som hadde utviklet anti-stoffer mot pattedyr-insuliner. I nevnte japanske patentsøknad er det beskrevet seks spesifikke-forbindelser, hvorav ingen.ble angitt å ha forlenget virkning. Ingen spesifikke injiserbare preparater er beskrevet i nevnte japanske søknad.

Europeisk patentsøknad 84108442.9 vedrører insulinanaloger hvor en basisk, organisk gruppe er knyttet til B30-aminosyren og derved innfører en positiv ladning ved nøytral pH-verdi. I disse analoger er B30-aminosyren nøytral og fortrinnsvis threonin som i human-insulin. BRD-off.skrift 3 327 709.5 vedrører en suspensjon av krystaller av de derivater som er beskrevet i ovennevnte europeiske patentsøknad, så vel som en aromatisk hydrok-sylforbindelse. BRD-søknad 3 326 473.2 vedrører et medikament som inneholder en blanding av insulinforbindelser, av hvilke minst én er beskrevet i ovennevnte europeiske patentsøknad.

Foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å fremstille nye analoger av human-insulin som avviker fra human-insulin ved: a) nærvær av en amid- eller esterrest på C-terminal-karboksylgruppen i B-kjeden og

b) som har minst én ladning mer enn human-insulin ved

pH 7, fortrinnsvis ikke mer enn 4 ladninger mer enn human-insulin ved pH 7.

Endringen i ladning oppnås ved blokkering av karboksylgruppen i B30-aminosyren og, om ønsket, ved substituering av en eller flere av aminosyrene sammenlignet med human-insulin.

Spesifikt kan forbindelsene av interesse for utførelse av foreliggende oppfinnelse karakteriseres som følger: En eller flere av de fire glutaminsyrerester ved A4 , Kil, B13, B21 er i stedet en annen naturlig forekommende nøytral aminosyre, fortrinnsvis glutamin;og/eller threoninresten ved B27 er i stedet en naturlig forekommende basisk aminosyrerest, fortrinnsvis L-arginin eller L-lysin; og/eller threoninresten ved B30 er i stedet en eller to basiske aminosyrerester, hvorav én foretrekkes, og N-terminal-karboksylsyregruppen i B-kjeden er beskyttet.

Det kan fremstilles løsninger av de ovennevnte kategoriserte human-insulin-analoger med et kontrollert av sinkioner i seg. Graden av forlengelse av insulinvirkning forsterkes og styres derved.

Det er overraskende blitt funnet at injiserbare løsninger med kombinert kort og forlenget insulinvirkning kan lages ved som aktiv ingrediens å anvende et enkelt insulinderivat med føl-gende formel I:

hvor bokstavene A og B fulgt av tall i parentes betegner peptidfragmentene i henholdsvis A- og B-kjedene, indikert ved tallene i parentes, El, E2, E3 og E4 er L-glutaminsyre, eller E2 og E3 kan være L-glutamin, X representerer en L-threonin-, L-arginin- eller L-lysin-rest, Y er en L-lysin-, L-arginin-eller

L-threoninrest, Z er en L-argininrest og n er 0 eller 1, og

R representerer en amidorest som blokkerer C-terminal-karboksylgruppen i B-kjeden, med det forbehold at ikke alle av E<1>, E<2>,

E 3 og E 4 er glutammsyre-rester, når X er en threoninrest, eller, når E<1>, E<2>, E<3>og R<4>hver er en glutaminsyrerest, og X er en threoninrest, så vil gruppen av formel -Y-Zn~R representere -Arg-NH2, Arg-Arg-NH2, -Lys-NH2, -Thr-NH2.

Forbindelsene kan fremstilles ved to alternativer som er angitt i karakteristikken til krav 1, nemlig: a) ved å transpeptidere porcin-insulin eller en forbindelse av den i krav 1 angitte generelle formel II, med en

forbindelse av den angitte generelle formel III, under

anvendelse av porcin-trypsin som katalysator; eller

b) å koble en forbindelse av den angitte formel IV med en forbindelse av formel III, ved hjelp av trypsin.

I forbindelser av formel I er C-terminalkarboksylgruppen i B-kjeden som nevnt blokkert av en amidgruppe, og eliminerer derved den negative ladning på karboksylgruppen. Endringen i ladning som innføres av amidgruppen i posisjon B30 kan økes ytterligere ved å erstatte threonin i B27-posisjon med arginin eller lysin og/eller ved å erstatte hvilken som helst av de fire glutaminsyrerester i A4-, A17-, B13- og B21-posisjon-en med en nøytral aminosyre, fortrinnsvis med en glutaminrest. Videre kan en positiv ladning bli innført av en basisk aminosyre i B30- og/eller B31-posisjonen. Siden forbindelser av formel I kan anvendes klinisk som løsninger med forlenget virkning, kan et fall i immunogenisitet sammenlignet med de vanlig brukte suspensjoner av porcin- eller human-insuliner inntreffe.

Graden av forlengelse kan forsterkes og styres ved tilsetning av sinkioner.

Hovedparametere som styrer graden av forlengelse av insulin-effekten er konsentrasjonen av sink og valget av forbindelsen av

27 formel I. Når det gjelder noen analoger, for eksempel Arg ,

B30

Thr ~NH2 human-insulin, oppnås svært forlenget virkning med bare 3 sinkatomer pr. heksamer-enhet av insulinanalog tilsvarende 8 ug sink/ml i et preparat som inneholder ca. 240 nmol/ml. For andre analogers vedkommende, for eksempel Lys B30~NH2 human-insulin, oppnås moderat forlengelse av virkningen med 30 sink pr. heksamer av insulinanalog tilsvarende 80 ug sink/ml i et preparat inneholdende ca. 240 nmol/ml. Området for foretrukne sink-konsentrasjoner går fra 0 til 2 mg/ml, fortrinnsvis fra 0 til 200 ug/ml, sink med substitusjon .i B13- og/eller B27-posisjon og fortrinnsvis fra 20 til 200 ug/ml for andre analogers vedkommende .

Den forlengede virkning av løsninger av forbindelser av formel I i nærvær av sinkioner tilskrives den lave løselighet for slike forbindelser ved nøytral pH-verdi. Bare løsninger av insulinderivater i hvilke C-terminalen av B-kjeden var blokkert, viste en mer forlenget virkning enn Actrapid ®-porcin-insulin.

pH-verdien til den beskrevne injiserbare løsning bør fortrinnsvis være under og så nær den fysiologiske pH-

verdi som mulig, idet den øvre grense er den pH-verdi hvor utfelling inntreffer. Stabile løsninger som inneholder ca.

240 nmol/ml av forbindelser av formel I er oppnådd ved pH 5,5. Den øvre grense avhenger av bestanddelene i løsningen, dvs. isotonikum, konserveringsmiddel og sink-konsentrasjon, og av valget av forbindelser av formel I. Det er ingen nedre pH-grense for løsningene, men siden den kjemiske stabilitet for insuliner er dårlig i sure løsninger på grunn av deamideringsreaksjoner og dannelse av dimerer, foretrekkes en så høy pH-verdi som mulig med hensyn til den fysikalske stabilitet for løsningen. Det foretrukne pH-område for slike injiserbare løsninger er fra 2,5 til 8,5, mer foretrukket fra 4,5 til 8.

En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at den til-veiebringer forbedret fleksibilitet for pasientene. Med to vandige løsninger, en som inneholder en forbindelse av formel I og den annen som inneholder et sinksalt, kan pasienten oppnå en ønsket grad av forlenget virkning og en ønsket profil ved å blande de to løsninger på passende måte. Derfor har pasienten, som anvender to forrådsløsninger, muligheten av å velge én virkning og profil for morgeninjeksjon og en annen virkning og profil for afteninjeksjon. Fortrinnsvis inneholder sinkløsningen mellom ca. 10^g og 20 mg sink pr. ml. Alternativt kan begge forrådsløsninger inneholde sink, enten i de samme eller forskjellige konsentrasjoner, og/eller begge forråds-løsninger kan inneholde en forbindelse av formel I, enten de samme eller forskjellige forbindelser.

Fortrinnsvis har de injiserbare løsninger av forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen en styrke av mellom ca. 6 0 og 6000 nmol/ml av forbindelsen av formel I.

R kan være en gruppe med den generelle formel -NRiR2 hvor R<1>og R<2>er like eller forskjellige og hver representerer hydrogen eller lavere alkyl. I det følgende betyr betegnelsen "lavere" at gruppen det er tale om inneholder mindre enn 7 karbonatomer, fortrinnsvis mindre enn 5 karbonatomer. Et eksempel på en slik gruppe finnes i Thr B30-NH2 human-insulin som er kjent som et mellomprodukt i en syntese av human-insulin (se Carlsberg Res.Commun. 49, (1984), 463). I en foretrukken ut-førelsesform av denne oppfinnelse er R lik -NH2. Videre kan R være en laktam-rest som fortrinnsvis inneholdér mindre enn 8 atomer i laktamringen, for eksempel et laktam av en diamino-karboksylsyre.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er R uladet.

27 28 29

Ved nøytral pH er ladningen av -X -Pro -Lys -Ym-Zn~R

+ 1 i ThrB30-NH2 human-insulin, Thr<B*>^°-0but human-insulin, ThrB30(But)-0But human-insulin og Lys<B29->NH_,des-(B30) human-B30 B30

insulin, +2 i Lys -NH» human-insulin, Arg -NH_ human-

B30 B27 B30

insulin, Orn -NH~ human-insulin, Lys ,Thr -NH_ human-

B27 B30

insulin og Arg ,Thr _NH2 human-insulin, og +3 i LysB27,LysB30-NH;, human-insulin, Lys<B27>,Arg30-NH human-

B27iB30 „TT , , . B27zB30 „„ insulin, Arg ,Lys -NH2human-insulin, Arg ,Arg -NH9

B30 B31

human-insulin, Lys -Lys _NH2 human-insulin,

ArgB30-LysB31-NH2 human-insulin, ArgB30-ArgB31-NH2 human insulin, OrnB30-OrnB3''"-NH9 human-insulin, Dab30-Dab31-NH-

B30 B31

human-insulin og Dap -Dap ~NH2 human-insulin.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er aminosyrerestene med betegnelsene Y og Z rester fra L-aminosyrer som kodes av nukleotidsekvenser.

Enhver sidekjede-aminogruppe i aminosyrerestene med betegnelsene Y og Z kan være acylert av en syre som inneholder 2-18 karbonatomer, fortrinnsvis en fettsyre som...inneholder 6-18 karbonatomer, for eksempel laurinsyre, Således kan

-Y -Zn~R være -Lys(Lau)-NH2.

Eksempler på foretrukne alkylerte hydroksylgrupper er met-oksy, etoksy og tert.-butoksy.

I én gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er Y og/eller Z en basisk aminosyrerest hvor sidekjede-aminogruppen eventuelt er acylert.

I en annen gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er n null og Y en basisk aminosyrerest.

I en ytterligere gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er Y og Z begge basiske aminosyrerester (n = 1).

Foretrukne forbindelser av formel I er hver av de følgende: GlnAl7,ArgB27, ThrB30-NH2 human-insulin,

GlnAl7,GlnB13,ThrB30-NH2 human-insulin,

Gln<Al7>,Lys<B27>,Thr<B30->NH:)human-insulin, GlnA17 ,Lys<B30->NH- human-insulin, Gin , Thr ~NH2 human-insulin,

Gln<B13>,Arg<B27>,Thr<B30->NH2human-insulin

GlnB13,LysB27,ThrB30-NH human-insulin, GlnBl3,LysB30-NH human-insulin, Gin Ri T ,Thr -NH2 human-insulin, Arg<R>?7 ,& rqDO -NH2~

human-insulin, Arg ,Lys -NH2human-insulin,

ArgB27,ThrB30-NH human-insulin, Lys<B27>,Arg30-NH2human-insulin, Lys ,Lys J -NH2 human-insulin, Lys ,Thr -NH2

R29 B30 human-insulin, Lys -NH2,des-(B30) human-insulin, Thr -NH2 human-insulin, Lys30-NH2human-insulin, Lys<B3>°(Lau)-NH2-human-insulin, LysB30-ArgB31-NH2 human-insulin, Lys<B30->Lys31-NH2human-insulin, Arg<B30->NH2human-insulin, Arg<B30->Arg<B31->NH2human-insulin eller Arg B30 -Lys<B31>"NH2human-insulin.

En annen foretrukken utnyttelse av oppfinnelse er å lage preparater som inneholder en forbindelse av formel I hvor El,E2, E og/eller E er en glutaminrest, og/eller X er Lys eller Arg, og innen denne underklasse av forbindelser av formel I er en ytterligere foretrukken utførelsesform preparater som inneholder en forbindelse av formel I hvor gruppen -Y -Z -R er -Thr-NH„

^ ^ B13 B30

eller -Lys-NH2. Foretrukne forbindelser er Gin ,Thr -NH2 human-insulin, Gln<Al7>,Thr<B30->NH2human-insulin, Lys<B27>,Thr<B3>°-B27 B30 NH2 human-insulin og Arg ,Thr~NH2human-insulin.

I en gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er E ,

3 4

E og E hver en glutaminsyrerest.

I en annen gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er 2

E en glutaminrest.

I enda en gruppe av foretrukne forbindelser av formel I er X en arginin- eller lysinrest.

Som velkjent på området er ikke alle aminosyrerestene i human-insulin essensielle for insulinvirkningen.

Faktisk er porcin-insulin og bovin-insulin som avviker fra human-insulin i aminosyrerester, blitt anvendt for å behandle diabetikere. Betydelige variasjoner fra art til art i insulinmolekylet eksisterer. Således kan mange peptidrester i human-insulinmolekylet bli endret uten urimelig nedsettelse av insulin-aktiviteten, inklusive noen peptidrester som er av betydning for det isoelektriske punkt for molekylet.

Det er innlysende at de grupper som er betegnet E<1>, E<2>, E<3>, E 4, X, Y, z og R skal velges slik at den resulterende forbindelse av formel I er farmasøytisk akseptabel.

I de kjente bifasiske insulinpreparater er det

vanlig å kombinere hurtig-virkende, løselig insulin med forlenget-virkende, krystallinsk insulin i samme injeksjon. Anvendelse av forbindelser av formel I gjør at en

lignende kombinert kort og forlenget virkning kan oppnås med

en løsning av en enkelt forbindelse av formel I. Forholdet mellom hurtig og langvarig effekt avtar etter hvert som konsentrasjonen av sinkioner i løsningen økes.

Forbindelser av formel I kan fremstilles ved en transpepti-deringsreaksjon i hvilken porcininsulin eller ellers en biosyn-tetisk forløper-forbindelse som har de korrekte insulin-disulfid-broer og med den generelle formel II:

hvor bokstavene A og B fulgt av tall i parentes betegner de passende peptidfragmenter i henholdsvis A- og B-kjedene, indikert ved tallene i parentes, Q er en peptidkjede med g aminosyrer, q er et helt tall fra 0 til 33, R er Lys eller Arg, og r er null eller 1, og E<1>, E<2>, E<3>, E<4>og X er hver som definert ovenfor, omsettes med en aminoforbindelse av den generelle formel

III:

hvor Y, Z, R og n hver er som definert ovenfor, og hvor sidekjede-aminogruppene og hydroksylgruppene i Y og Z eventuelt er blokkert med amino- og hydroksylbeskyttende grupper, ved anvendelse av porcin-trypsin som katalysator i en blanding av vann og organiske løsningsmidler, slik det er beskrevet i US-patentskrift 4 343 898. Foretrukne forbindelser av formel III for anvendelse i denne prosess er Thr-NH2, Lys (Boc)-NH2, Thr (Bufc) - OBu^, Thr-ObuS Ala-NH2og Arg (Boe) -NH2.Aminogrupper kan derivatiseres ved acylering med en fettsyre. Hydroksylgrupper kan være beskyttet ved alkylering. Hvis Y og

Z inneholder grupper som er reversibelt blokkert av aminobeskyttende grupper, kan disse grupper bli fjernet i et senere stadi-um, hvis dette er ønskelig, etter at det aminobeskyttede mellomprodukt er separert fra porcin-trypsinet.

Forbindelsen av formel II kan uttrykkes i en vertsorganisme som for eksempel gjær, i likhet med beskrivelsen i europeisk patentsøknad 163 529 under anvendelse av et gen som har de korrekte kodoner for de aktuelle aminosyrer. Det gen som koder for det nye insulin-derivat innsettes deretter i en passende ekspre-sjonsvektor som, når den overføres til gjær, har evne til å uttrykke den ønskede forbindelse. Det uttrykte produkt isoleres deretter fra cellene eller dyrkningsbuljongen avhengig av om det sekreteres fra cellene eller ikke.

Et eksempel på en reversibel aminobeskyttende gruppe er tert.-butoksykarbonyl, og en reversibel hydroksylbeskyttende gruppe er tert.-butyl. Slike grupper fjernes under betingelser som ikke forårsaker uønsket endring i forbindelsen av formel I, for eksempel av trifluoreddiksyre.

Insulinforbindelser av formel I kan også fremstilles ved en koblingsreaksjon i hvilken en forbindelse av den generelle formel IV

12 3 4

hvor E , E , E , E og X hver er som definert ovenfor, kobles til en aminoforbindelse av ovennevnte formel III ved trypsin eller et trypsin-lignende enzym under betingelser lik dem som er beskrevet i europeisk patentskrift 17 9 38.

Når insulin produseres ved genetisk engineering, kan de ytterligere 1 eller 2 positive ladninger passende innføres internt i insulinmolekylet, dvs. i A4-, A17-, B13-, B21- eller B27-posi-sjonen, slik at det vil skje trypsin-katalysert semisynteseblok-kering av C-terminal-karboksylgruppen i B-kjeden med et aminosy-reamid eller en aminosyreester.

Fordelen ved å innføre de ytterligere positive ladninger innen rammen av de 51 aminosyrer i insulinmolekylet for å danne de nye forbindelser av formel I fremfor ved- forlengelse av B-kjeden utover de 30 rester av pattedyr-insulinene har å gjøre med enkelhet i fremstillingen. I den semisyntetiske transpeptider-ing anvendes et stort molart overskudd av aminosyreamidet eller aminosyreesteren. Hvis et dipeptid-amid eller en ester skulle anvendes i transpeptideringsreaksjonen, er enten pris eller lø-selighet eller begge deler prohibitive for anvendelse i stort overskudd, og følgelig blir utbyttet av produktet lavere. Selv hvis det samme ekvimolare overskudd av for eksempel Lys(Boc)-NH2og Lys(Boe)-Lys(Boe)-NH2anvendes i transpeptiderings-reaksjon-en under lignende betingelser, blir utbyttet med aminosyreamidet vesentlig høyere enn med dipeptidamidet.

Insulinpreparater fremstilles

Insulinpreparåtene av forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen anvendes på samme måte som de kjente insulinpreparater.

Ethvert nytt trekk eller kombinasjon av trekk som her er beskrevet, menes å være essensielt for oppfinnelsen.

forløper uttrykt i gjær som beskrevet i sistnevnte danske patentsøknad.

ved å oppløse en forbindelse av formel I i et vandig medium ved svakt sure betingelser, for eksempel i en konsentrasjon av 240 eller 600 nmol/ml. Det vandige medium gjøres isotonisk, for eksempel med natriumklorid eller glycerol. Videre kan det vandige medium inneholde sinkioner i en konsentrasjon av opp til ca.

20 Mg av Zn<++>pr. enhet av insulinaktivitet, puffere som for eksempel acetat og citrat og konserveringsmidler som for eksempel m-kresol eller fenol. pH-verdien til løsningen justeres mot nøytralitet uten å komme for nær det isoelektriske punkt for forbindelsen av formel I slik at utfelling unngås. pH-verdien til det endelige insulinpreparat avhenger av det antall ladning-

er som er blitt endret i forbindelsen av formel I, konsentrasjonen av sinkioner, konsentrasjonen av forbindelsen av formel I og den forbindelse av formel I som er valgt. Insulinpreparatet gjø-res sterilt ved sterilfiltrering.

Insulinpreparatene av forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen anvendes på samme måte som de kjente insulinpreparater.

Forkortelser som anvendes for aminosyrene i denne beskri-velse, er de som er angitt i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. De aminosyrer som her er angitt, er i L-konfigurasjon. I formel I

og ellers vil her A(1-3) bety Gly-Ile-Val, A(5-6) er Gln-Cys osv., kfr. aminosyresekvensen i human-insulin. Med mindre annet er angitt, er de insulin-arter som her er angitt, fra mennesker.

Syntese av insulinforbindelsene

Kilden for insulin var enten porcin-insulin eller en insulin-forløper uttrykt i gjær som beskrevet i sistnevnte danske patentsøknad.

Insulinforløperne ble utvunnet fra fermenteringsbuljonger ved adsorpsjon til LiChroprep som beskrevet i eksempel 7 i nevnte danske patentsøknad. Forløperne ble eluert fra kolonnen med 0,2 M KC1, 0,001 M HCl i 33%ig (v/v) etanol. Insulinforlø-perne ble krystallisert ut fra væskeoppsamlingen ved suksessive tilsetninger av vann (1 volum pr. volum (v/v) av væskeoppsamling), fast trinatriumcitrat slik at det blir 0,05 M og endelig sinkacetat slik at det blir 0,006 M. pH-verdien ble justert til 6,8, og blandingen ble hensatt natten over ved 4°C. Krystallene ble isolert ved sentrifugering, vasket med vann og tørket i vakuum.

Beskyttede aminosyrer og beskyttede peptider for enzyma-tisk semisyntese ble enten fremstilt ved standardmetoder eller innkjøpt (vanlig syntese) fra enten Nova Biochem eller Bachem, begge i Sveits.

Eksempel 1

B30

Syntese av Lys -NH2 human-insulin

Løsninger av 1 g porcin-insulin oppløst i 4 ml av 7,5 M eddiksyre og 6,1 g av Lys(Boe)-NH2^H^COOH (N-epsilon-Boc-L-lysin-amid, hydroacetatsalt) oppløst til 15 ml med N,N-dimetyl-acetamid ble blandet, og blandingen ble avkjølt til 12°C. En løsning av 0,1 g trypsin i 2,08 ml av en 0,05 M løsning av kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 96 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved tilsetning av 200 ml aceton, og utfellingen ble isolert ved sentrifugering. Utfellingen ble vasket én gang med 100 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum.

Utfellingen ble oppløst i 50 ml av 0,01 N saltsyre i etanol/vann (28/72 deler pr. volum) og løsningen ble påført en 5 x 30 cm preparativ høytrykks-væskekromatografi (heretter betegnet HPLC)-kolonne pakket med silisiumdioksydpartikler substituert med oktadecyldimetylsilyl (middelpartikkelstørrelse 15 nm,

porestørrelse 100 Ångstrøm). Kolonnen ble likevektsinnstilt med etanol/0,2 M løsning av ammoniumsulfat justert til pH 3,5 med

svovelsyre, i et forhold av 38/62 (deler i volum). Proteinene ble eluert fra kolonnen med samme puffer i en hastighet av 2 liter/h. Lys(Boe) B30-NH2 human-insulin ble funnet i en topp som eluerte fra kolonnen mellom 60 og 75 minutter, etter eluering

med uomsatt porcin-insulin. Etanolen ble fordampet i vakuum,

og inndampingen ble fortsatt inntil volumet var redusert til

B3 O

ca. 125 ml. Lys(Boe) ~NH2 human-insulinet ble isolert ved suksessive tilsetninger av 25 ml aceton, 100 mg sitronsyre (mono-hydrat p.a.) og 9 mg sinkklorid (p.a.). pH-verdien ble justert til 6,5, og etter 1 h ved romtemperatur ble krystallisasjonen fortsatt ved 4°C i 24 timer under forsiktig røring. Krystallene ble slynget ned, vasket én gang med 5 ml iskaldt vann, slynget og

B30

tørket i vakuum. Utbyttet: 456 mg Lys(Boe) -NH~ human-insulin.

B30

Lys(Boe) -NH2 human-insulinet (456 mg) ble oppløst i

15 ml trifluoreddiksyre og hensatt i 3 timer ved romtemperatur. Trifluoreddiksyren ble fjernet ved lyofilisering. Lyofilisatet ble oppløst i 50 ml vann, pH-verdien justert til 2,5, og 10 g natriumklorid ble tilsatt. Saltkaken av Lys B30~NH2 human-insulin ble isolert ved sentrifugering. Saltkaken ble oppløst i 125 ml vann, og Lys _NH2 human-insulinet ble krystallisert ved suksessive tilsetninger av 25 ml aceton, 100 mg sitronsyre (mono-hydrat p.a.) og 9 mg =sinkklorid(p.a.) og justering av pH-verdien til 7,0. Etter 1 time ved romtemperatur ble krystallisasjonen fortsatt ved 4°C i 24 timer under forsiktig røring. Krystallene ble slynget, vasket én gang med 5 ml iskaldt vann, slynget

B30

igjen og tørket. Utbytte: 387 mg av rått Lys ~NH2 human-insulin.

Krystallene ble oppløst i 50 ml av 0,005 N saltsyre i etanol/vann (20/80, deler i volum), og løsningen ble påført en preparativ HPLC-kolonne som beskrevet ovenfor, denne gang likevektsinnstilt med etanol/0,3 M løsning av kaliumklorid og 0,001 N saltsyre, i et forhold av 35,5/64,5 (deler pr. volum). Eluering med samme puffer ved en hastighet av 2 liter/h resulterte i en

B30

topp av Lys ~NH2 som kom ut fra kolonnen mellom 55 og 90 min. Produktene ble isolert fra væskeoppsamlingen som beskrevet for

B30

Lys(Boe) ~NH2 human-insulin ovenfor, med unntagelse av at pH-verdien i krystallisasjonen i den sinkholdige citratpuffer ble

B30 justert til 7,0 fremfor 6,5. Utbytte: 262 mg av ren Lys NH2human-insulin.

Aminosyrematerialet var i overensstemmelse med teorien,

idet alanin var 1 rest/molekyl og lysin 2 rester/molekyl. Produktet var rent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 55 % av verdien for porcin-insulin til-

svarende en forskjell i ladninger på ca. 2. Med hensyn til de-taljer vedrørende DISC PAGE elektroforese, se Horm.Metab.Res. Supplement Series nr. 5 (1974), 134.

Eksempel 2

B30 B30 B31 Syntese av Arg -NH^ human - insulin og Arg - Arg - NH? human-insulin

Løsninger av 1 g av..porcin-insulin i 3,32 ml av 8 M eddiksyre og 3,9 g av Arg-NI^,(CH^COOH)2(L-argininamid-di-hydroacetatsalt) oppløst til 10 ml med N,N-dimetylformamid (i det følgende betegnet DMP) ble blandet, og blandingen ble av-kjølt til 12°C. En løsning av 0,1 g trypsin i 1,2 ml av en 0,05 M løsning av kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 144 timer ved 12°C, ble proteinene utfelt ved tilsetning av 200 ml aceton, og utfellingen ble isolert ved sentrifugering. Utfellingen ble vasket én gang med 100 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum.

Utfellingen ble oppløst i 50 ml av 0,01 N saltsyre i etanol/vann (27/73 deler i volum), og proteinene ble fylt i en preparativ kolonne som beskrevet i eksempel 1. Først ble en eluent som er sammensatt av etanol/0,3 M løsning av kaliumklorid og 0,001 N saltsyre i et forhold av 35/65 (deler pr- volum), pumpet gjennom ved en hastighet av 2 liter/h i 4 timer. Tre

. uoppløste topper ble registrert, fra ca. 60 til 120 minutter, fra 120 til 150 og fra 150 til 180 minutter. Proteinene i de

B30

tre vaeskeoppsaml inger ble isolert som beskrevet for Lys ~NH2

i eksempel 1. Utbytter: 414 mg, 14 2 mg og 107 mg for henholdsvis oppsamlinger I, II og III.

Aminosyreanalyse kombinert med DISC PAGE elektroforese viste at insulinmolekylene fra vaeskeoppsaml ing I var blitt koblet med fra 2 til flere argininrester. Hovedkomponenten i væskeoppsamling II var insulin-koblet til en enkelt argininamidrest, dvs. Arg B30-NH„ human-insulin. Vaeskeoppsaml ing III var en blanding av porcin-insulin, des(B30) human-insulin, Arg B30-human-insu-B30

lin og Arg -NH2 human-insulin.

B30

Arg ~ NH2 human- insulin

Proteinene fra vaeskeoppsaml ing II ble oppløst i 10 ml av etanol/vann 3/2 (v/v) ved pH 2. Etter tilsetning av 12 mg av

EDTA ble pH-verdien hevet til 10 ved hjelp av 0,1 N løsning av natriumhydroksyd. Løsningen ble påført en 2,5 x 25 cm kolonne av QAE-Sephadex A-25 likevektsinnstilt med en puffer sammensatt av 0,5 M NH^, 0,05 N saltsyre og 0,04 M løsning av matriumklo-rid i 60 % etanol (v/v). Kolonnen ble eluert med 30 ml/h med en lineærgradient i natriumklorid fra 0,04 M til 0,1 M

ved anvendelse av i alt 1 liter eluent, mens pH-verdien ble holdt konstant ved ca. 10,0. Fraksjoner av 10 ml ble oppsamlet, Arg B30-NH2 human-insulin strømmet ut fra kolonnene i fraksjonene nr. 58 - 74. Produktet ble isolert fra væskeoppsamlingen ved inndampning fulgt av krystallisasjon ved pH 7 i en sinkholdig citratpuffer inneholdende 15 % aceton (v/v) som beskrevet for

B30

Lys ~NH2 1 eksempel 1. Utbytte: 53 mg. Produktet var homogent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 55 % av verdien for insulin. Aminosyrematerialet var

B30

i overensstemmelse med teorien for Arg ~NH2 human-insulin, hvilket viser 2 argininrester og 1 rest av alanin pr. molekyl av insulin.

B30 B31

Arg - Arg -NH^ human- insulin

Proteinene fra væskeoppsamling I.ble oppløst og utsatt for ionebyttekromatografi pa QAE-Sephadex A-25 som beskrevet for

B30 B31

proteinene i væskeoppsamling II. Arg -Arg ~NH2 human-insulin strømmet ut fra kolonnen i fraksjoner nr. 34 - 47. Produktet ble isolert som beskrevet for Lys B30~NH2 human-insulin i eksempel 1. Utbytte: 10 mg.

Produktet var homogent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 35 % av verdien for insulin. Aminosyrematerialet viste 3 argininrester og 1 rest av alanin pr. molekyl av insulin.

Eksempel 3

B30

Syntese av Thr - NH 2 human - insulin

En løsning av 1 g porcin-insulin i 5 ml av 10 M eddiksyre og en suspensjon av 2,365 g av Thr-NH^ (L-threoninamid, fri base) suspendert slik at det ble et volum på 13 ml med N,N-di-metylacetamid, ble blandet. Etter blandingen var Thr-NH2opp-løst. Blandingen ble avkjølt til 12°C, og en løsning av 0,1 g trypsin i 2 ml av en 0,05 M løsning av kalsiumacetat ble tilsatt.

Etter 72 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved tilsetning

av 200 ml aceton, og utfellingen ble isolert ved sentrifugering. Utfellingen ble vasket én gang med 100 ml aceton, isolert ved sentrifugering og tørket i vakuum.

B30

Rensning av Thr ~NH2 human-insulin fra trypsin og uomsatt porcin-insulin ble utført som beskrevet for estere av human-insulin (se Markussen: Methods in Diabetes Research, vol. 1, Utgivere: Larner&Pohl (1984),408). Utbytte: 599 mg.

Produktet var homogent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 75 % av verdien for insulin. Aminosyrematerialet var i overensstemmelse med teorien, dvs. 3 rester av threonin og 1 rest av alanin pr. molekyl av insulin.

I utgangsmaterialene i eksemplene 4 til 10 ble (Q -R) i formel II valgt til Ala-Ala-Lys og konstruert som beskrevet for<g>jærplasmid pMT610 i eksempel 10 i dansk patentsøknad 582/85. Nukleotider som koder for Gln13, GlnA17, ArgB27 og Lys<B27>ble substituert i pMT6l0 ved punktspesifikk mutagenese med hjelp av fremgangsmåten fra Nucl.Acids.Res., 11 (1983), 5103-5112).

Eksempel 4

Syntese av Gln^ 7 , ThrB30- NH2 human- insulin

Al 7

Til en suspensjon av 3,12 g av Gin ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulin-forløper i 15 ml eddiksyre/DMF/vann (11,4 ml eddiksyre, 65,1 ml DMF, vann slik at det ble 100 ml) ble tilsatt 30 ml av 1 M Thr-NH2i DMF. Blandingen ble avkjølt til 12°C

og 0,3 g porcin-trypsin oppløst i 7,5 ml av 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Røringen ble fortsatt inntil insulinforløperen var oppløst. Etter 48 timer ved 12°C ble proteinene utfelt ved tilsetning av 400 ml aceton. Proteinene ble isolert ved sentrifugering, vasket én gang med 100 ml aceton og tørket i vakuum.

Utfellingen ble oppløst i 70 ml av 0,04 N HCl, pH justert til 2,5 og derivatet renset ved HPLC som beskrevet i eksempel 1, med unntagelse av at en eluent som var sammensatt av 35 deler etanol og 65 deler av 0,3 M KCl, 0,001 N HCl ble anvendt for eluering. Derivatet strømmet ut fra kolonnen etter ca. 3 kolon-nevolumer, og det ble isolert ved suksessive tilsetninger av 1 volum vann, fast trinatriumcitrat slik at det ble 0,05 M og fast sinkacetat slik at det ble 0,006 M. Etter justering av pH-verdien til 6,5 og røring natten over ved 4°C ble krystaller innhøstet ved sentrifugering, vasket med vann og tørket. Utbytte: 1,64 g = 33 %. Videre rensninger ved hjelp av anione-byttekromatografi som beskrevet for human-insulin-estere (se Markussen, ibid, 410). Endelig utbytte: 1,15 g = 37 %. Produktet var så å si homogent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 55 % av verdien for insulin. I analytisk revers-fase-HPLC (se Markussen, ibid, 410) elue-

rer produktet ved omtrent samme hastighet som for procin-insulin. Renheten ble funnet å være ca. 9 5 %. Analyse av aminosyrematerialet viste identitet med den foreslåtte formel.

Eksempel 5

Syntese av GlnA17, LysB30- NH2 human- insulin

Al 7

Til en suspensjon av 3,15 g av Gin ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulin-forløper i 15 ml eddiksyre/DMF/vann (4,57 mol eddiksyre,7,19 ml DMF, vann slik at det ble 100 ml) ble 30 ml av 0,4 M Lys(Boc)-NH2i DMF tilsatt. Blandingen ble avkjølt til 12°C, og 0,3 g trypsin ble oppløst i 7,5 ml av 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Røringen ble fortsatt inntil insulin-forløperen var oppløst. Etter 48 timer ved 12°C ble proteinene isolert som beskrevet i eksempel 4.

Utfellingen ble oppløst i 70 ml av 0,04 N HCl, pH-verdien justert til 2,5, og GlnA17,Lys(Boe)B30-NH2 human-insulin ble renset ved HPLC som beskrevet i é&sempel 1, med unntagelse av at elueringen først ble utført med 2,3 1 av en eluent sammensatt av 37 deler etanol og 63 deler av 0,3 M KCl, 0,001 N HCl,

fulgt av en eluent. sammensatt av 39 deler etanol og 61 deler av vandig 0,3 M KCl, 0,001 N HCl. Derivatet strømmet ut 25 minutter etter endringen av eluent, og det ble isolert som beskrevet for Gln<A17>,Thr<B30->NH„ human-insulin i eksempel 4.

ai 7 ^ R^n

Utbytte av Gin ,Lys(Boe) -NH2 human-insulin: 906 mg = 29%.

GlnA17,Lys(Boe)B30-NH2 human-insulin (1,55 g) ble oppløst i 30 ml trifluoreddiksyre (TFA) og hensatt ved romtemperatur i 2 timer. TFA ble fjernet ved lyofilisering. Resten ble oppløst i

15 ml vann, pH justert til 3 med 1 N NaOH:.,. og 22. ml etanol ble tilsatt. Løsningen ble påført en 2,5 x 20 cm kolonne av SP-Sephadex C-25 likevektsinnstilt med en etanol/vann 3/2 (v/v) puffer omfattende 0,01 M sitronsyre, 0,03 M NaCl, pH justert til 4,5 med NaOH. Kolonnen ble eluert med den samme puffer, ved anvendelse av en lineær gradient i NaCl fra 0,03 M til 0,4 M i ialt 1,6 1 eluent. Derivatet eluerte i 440 ml da gra-dienten nådde 0,2 M NaCl. Det ble krystallisert ved tilsetning av 1100 ml vann, fast trinatriumcitrat til 0,05 M og fast sinkacetat til 0,006 M. Til slutt ble pH-verdien justert til 6,8. Etter røring natten over ved 4°C ble krystallene isolert ved sentrifugering, vasket én gang med vann og tørket i vakuu. Utbytte: 1,00 g tilsvarende 65 % over siste trinn og 19 % fra Gin Al 7, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) insulin-forløperen. Produktet var så å si homogent i DISC PAGE elektroforese ved pH 8,9, idet migreringshastigheten var 35 % av verdien for insulin. I analytisk HPLC strømmet produktet ut før porcin-insulin, idet renheten er ca. 97 %. Analyse av aminosyremateriale viste 2 lysinrester pr. molekyl og ellers identitet med human-insulin.

Eksempel 6

B27 B30

Syntese av Arg , Thr -NH^ human - insulin

B2 7

Til en suspensjon av 3,8 g av Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulin-forløper i 18 ml eddiksyre/vann/DMF (11,4 ml eddiksyre, 35 ml vann, DMF opp til 100 ml) ble det tilsatt 36 ml av 1 MThr-NH2i DMF. Blandingen ble avkjølt til 12°C, og 0,38 g porcin-trypsin i 6,84 ml av 0,05 M kalsiumacetat ble tilsatt. Etter 48 timer ved 12°C ble proteinene utfelt med aceton som beskrevet i eksempel 4.

Derivatet ble renset ved HPLC som beskrevet i eksempel 1 ved først å anvende 1800 ml eluent sammensatt av 35 deler etanol og 65 deler vandig 0,3 M KCl, 0,001 N HCl, fulgt av en eluent sammensatt av 37 deler etanol og 63 deler av den vandige løsning. Derivatet strømmet ut 10 minutter etter skifte av eluent, og det ble isolert som beskrevet for GlnA^"7 ,ThrB30-NH_ insulin i eksempel 4. Endelig ble det renset på en kolonne av SP-Sephadex C-25 som beskrevet for Gln<A>^<7>,Lys<B30->NH_ human-insulin i eksempel 5.

R27 B30

Utbyttet av Arg ,Thr -NH2 human-insulin var 1,63 g tilsvarende 43 %. I det vesentlige ett bånd ble sett i DISC PAGE elektroforese, idet migreringshastigheten var 55 % av verdien

for insulin.. I analytisk HPLC strømmet produktet ut før porcin-insulin, idet renheten er ca. 96 %. Analyse av aminosyrematerialet viser 2 argininrester pr. molekyl, og ellers identitet med human-insulin.

Eksempel 7

B27 B30

Syntese av Arg , Lys -NH^ human- insulin

Forbindelsen ble syntetisert ut fra 3,61 g av

227

Arg ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulin-forløper ved anvendelse av de metoder som er beskrevet i eksempel 5. Utbytte av ArgB27,LysB30-NH2 human-insulin: 0,78 g = 22 %. Ett hovedbånd i DISC PAGE elektroforese som migrerer 35 % av distansen for insulin-migrering. To mindre bånd synlige. Renhet i analytisk HPLC 92 %; produktet strømmer ut før porcin-insulin. Analyse av aminosyrematerialet viser 2 arginin og 2 lysinrester pr. molekyl og ellers identitet med human-insulin.

Eksempel 8

B27 B30

Syntese av Lys , Thr -NH^ human- insulin

Forbindelsen ble syntetisert ut fra 7,0 g av

B2 7

Lys ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) insulin-forløper ved anvendelse av de metoder som er beskrevet i eksempel 6. Utbytte av

B2 7

Lys ,ThrB30-NH2 human-insulin var 3,15 g tilsvarende 45 %. DISC PAGE elektroforese viste ett hovedbånd og to mindre bånd,

idet hovedbåndet migrerte 55 % av distansen til insulinreferanse-båndet. Renheten i analytisk HPLC var 96 %. Forbindelsen strøm-mer ut tidligere enn porcin-insulin i revers fase-HPLC. Analyse av aminosyrematerialet viser 2 lysinrester pr. molekyl og ellers identitet med human-insulin.

Eksempel 9

B27 B30

Syntese av Lys , Lys -NH^ human- insulin

Forbindelsen ble syntetisert ut fra 7,0 g av Lys B2 7,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) insulin-forløper under anvendelse av de metoder som er beskrevet i eksempel 5. Utbytte av

B27 B30

Lys ,Lys -NH2 human-insulin var 1,57 g tilsvarende 22 %. DISC PAGE elektroforese viste ett hovedbånd som migrerte til

en distanse av 35 % av distansen for porcin-insulin. Én mindre forurensning er synlig. Renhet i analytisk HPLC var 94 %, idet forbindelsen eluerte godt foran porcin-insulin. Analyse av aminosyrematerialet viste 3 lysinrester pr. molekyl og ellers identitet med human-insulin.

Eksempel 10

B13 B30

Syntese av Gin , Thr -NH^ human- insulin

Forbindelsen ble syntetisert ut fra 3,05 g av

B13

Gin ,B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) insuiiin-f orløper ved anvendelse av de metoder som er beskrevet i eksempel 6. Utbytte av sluttproduktet var 0,88 g tilsvarende 29 %. DISC PAGE elektroforese viste ett hovedbånd, som migrerte 55 % av den distanse porcin-insulin migrerer. Renhet ved HPLC var 95 %, idet forbindelsen eluerer senere enn porcin-insulin. Analyse av aminosyrematerialet viste identitet med human-insulin.

Fremstilling av injiserbare løsninger av forbindelser av formel I

Sterile injiserbare løsninger av forbindelsene av formel I for testing av graden av forlenget virkning ble laget under anvendelse av 0,9 % (vekt/vol.) natriumklorid som isotonikum og 0,15 % (v/v) m-kresol som konserveringsmiddel. Injiserbare løsninger ble også laget under anvendelse av 1,6 % (vekt/vol.) glycerol som isotonikum, under anvendelse av 0,3 % (vekt/vol.) m-kresol som konserveringsmiddel, og som ble pufret med 0,01 M natriumacetat. Konsentrasjonen av sinkioner ble variert fra 0 til 160 ug/ml. pH-verdiene til løsningene ble justert til-strekkelig unna det isoelektriske punkt for forbindelsene av formel I for å holde løsningene klare under lagring ved 4°C. Løsningene inneholdt 240 nmol/ml av forbindelsene av formel I. Konsentrasjonen 240 nmol/ml ble etablert ved måling av absorpsjonsevnen ved 276 nm av en mer konsentrert forrådsløsning som manglet m-kresol, under anvendelse av den molare ekstinksjons-koeffisient for porcin-insulin på 6100 for disse derivater (se Handbuch der Inneren Medizin, vol. 7/del 2A, utgiver: Ober-disse, 1975, 113) og ved å anvende den etablerte potens for mono-komponent-porcin-insulin på 28,5 U/mg tørrstoff (se Diabetes Care, vol. 6/supplement 1 (1983), 4). 1 U tilsvarer 5,95 nmol.

Injiserbare løsninger inneholdende 240 nmol/ml av forbindelsene av formel I angitt i tabell 1 og med de pH-verdier og innhold av sink som angitt i tabellen, ble laget.

Test angående forlengelse av insulin- effekt

Forlengelsen av den hypoglykemiske effekt produsert av de injiserbare løsninger av insulin ble testet i henhold til British Pharmacopoeia 1980, A 142, på fastende kaniner. Hver testløsning ble administrert subkutant i en dose av 15,5 nmol pr. kanin til 6 eller 12 dyr som veide 3-4 kg, og forløpet av hypoglykemi ble fulgt i 6 timer...For sammenligning ble det hurtigvirkende preparat Actrapid porcin-insulin inkludert i testene. Resultatene av testene er vist i tabellene 1 og 2.

Resultatet av tester med hensyn på forlenget effekt av visse forbindelser i kaniner er angitt i tabell 1 nedenunder. Glu-kose-verdien er gjennomsnittet, fra 6 kaniner, av glukoseverdien i prosent av den opprinnelige verdi. Løsninger ble gjort iso-toniske med 0,9 % NaCl, med 0,15 % (v/v) m-kresol som konserveringsmiddel .

Resultatet av tester med hensyn på forlenget effekt av visse forbindelser i kaniner er angitt i tabell 2 nedenfor. Glukoseverdien er gjennomsnitt, fra 12 kaniner, av glukoseverdien i prosent av den opprinnelige verdi. Testløsninger ble gjort iso-toniske med 1,6 % (vekt/vol.) glycerol, med 0,3 % (vekt/vol.) m-kresol som konserveringsmiddel, og de ble pufret med 0,01 M natriumacetat.

Potensene til insulinforbindelser ble fastslått i museblod-sukker-deplesjonstest (British Pharmacopoeia 1980, A 141-A142). For å redusere til et minimum problemet med å vurdere potensen til insuliner som har en timing som er forskjellig fra standard-en, ble insulinløsninger for potensbestemmelser laget uten tilsetning av sink. Det ble laget løsninger som inneholdt 240 nmol/ml basert på absorpsjonsevnen ved 276 nm. Sinkinnholdet i løsningene var 8-10Mg/ml, som stammet fra de krystallinske derivater. De anslåtte potenser for noen insulinforbindelser er vist i tabell 3 nedenunder.

Claims

1. Analogi-fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive insulinforbindelser av den generelle formel I

hvor bokstavene A og B fulgt av tallene i parenteser betegner peptidfragmentene i henholdsvis A- og B-kjedene i human-insulin, 12 3 4 indikert med tallene i parenteser, E , E , E og E er L-glutamin-2 3 syre eller E og E kan være L-glutamin, X representerer en L-threonin-, L-arginin- eller L-lysinrest, Y er en L-lysin-, L-arginin-eller L-threoninrest, Z er en L-argininrest og n er 0 eller 1, og R representerer en amidorest som blokkerer C-terminal-karboksylgruppen i B-kjeden, med det forbehold at ikke alle av E , E 2 , E 3 og E 4er glutaminsyre-rester, når X er en threoninrest, eller, når E1, E2, E<3>og R<4>hver er en glutaminsyrerest, og X er en threoninrest, så vil gruppen av formel -Y-Z -R representere -Arg-NH2, Arg-Arg-NH2, -Lys-NH2, -Thr-NH2, karakterisert veda) å transpeptidere porcin-insulin eller en forbindelse av den generelle formel II:

hvor A og B betegner fragmentene i A- og B-kjedene indikert ved tall i parentes, Q er en peptidkjede med q aminosyrer, q er et helt tall fra 0 til 33, R er Lys eller Arg, og r er 12 3 4 null eller 1 og E , E , E , E og X er hver som definert ovenfor, med en forbindelse av den generelle formel III:

hvor Y, Z, R og n hver er som definert ovenfor, og hvor sidekjede-aminogrupper og hydroksylgrupper i Y og Z eventuelt er blokkert med amino- og hydroksylbeskyttende grupper, under anvendelse av porcin-trypsin som katalysator, eller b) å koble en forbindelse av formel IV: 12 3 4 hvor E , E , E , E og X hver er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel III ved hjelp av trypsin.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for fremstilling av Gln<A17>, Lys<B30->NH2-humaninsulin, Gln<A17>, Thr<B30->NH2.humaninsulin/ Gln<B13>, Thr<B30->NH2-humaninsulin, ArgB27, LysB30-NH2-humaninsulin, ArgB27, ThrB30-NH2-humaninsulin, Lys B2V , Lys<B30->NH2~humaninsulin, LysB2V, ThrB30-NH2-humaninsulin, Thr B3 0-NH2-humaninsulin, Lys B3 0-NH2~humaninsulin, B3 0 Arg -NH2-humaninsulin, eller B3 0 B3 T Arg -Arg -NH2-humaninsulin, karakterisert vedat tilsvarende utgangsstoffer anvendes.