DK158677B

DK158677B - Insulinderivater og anvendelsen deraf, injicerbar oploesning indeholdende insulinderivaterne samt fremgangsmaade til fremstilling af oploesningen.

Info

Publication number: DK158677B
Application number: DK107086A
Authority: DK
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-10
Publication date: 1990-07-02
Also published as: ZA861432B; EP0194864B1; NZ215445A; ES8800276A1; DE3685668D1; JPS61212598A; NO860920L; EP0194864A2; ES552879A0; FI861007A; PT82173A; EP0194864A3; DK113585D0; CS259536B2; CN86101489A; GR860687B; ATE77391T1; FI861007A0; IL78103A0; CS166686A2

Description

1 DK 158677 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte in-5 sulinderivater af den i krav 1 angivne art, anvendelsen af sådanne derivater som antidiabetikum, injicerbare opløsninger med forlænget insulinvirkning samt en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne opløsninger.

Til behandling af diabetes mellitus er der foreslået 10 og anvendt mange forskellige insulinpræparater. Nogle af præparaterne er hurtigtvirkende og andre præparater har mere eller mindre retarderet virkning. Sædvanligvis ønskes farmaceutiske insulinpræparater med mere eller mindre retarderet virkning. En sådan retarderet virkning kan fås ved administration af insuli-15 net som en suspension af insulinkrystaller. De krystallinske præparater kan fås ved krystallisation af insulin i nærværelse af zink (såsom Lente^, se Schlichtkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) eller ved krystallisation 20 af insulin i nærværelse af zink og protamin (såsom NPH-insulin, se Rep.Steno Mem.Hosp. 1 (1946), 60).

En ulempe ved anvendelsen af de kendte suspensioner af zinkinsulinkrystaller eller af zinkprotamininsulin er nødvendigheden af at ryste hætteglasset for at sikre, at der inji-25 ceres den rigtige mængde insulin, og for at sikre, at insulinkoncentrationen i hætteglasset forbliver konstant under anvendelsen deraf. I Penf ill^-ampuller, hvor der ikke må være luft til stede, kræver insulinsuspensioner med retarderet virkning inkorporering af et fast legeme for at muliggøre omrystning.

30 Omrystningen af insulinsuspensioner og insulinopløsninger med luft er i sig selv en uønsket aktion, idet insulin har tendens

2 DK 158677 B

til at denaturere under dannelse af fibriller ved vand-luft-grænseflader. Insulinopløsninger med retarderet virkning er derfor ønskelige.

Opløsninger af insulinderivater med retarderet virk-5 ning kunne fås fra insulin, som var modificeret i aminogrupper-ne ved omsætning med phenylisocyanat (såkaldt Isoinsulin, se Hallas-Møller: Chemical and Biological Insulin Studies based upon The Reaction between Insulin and Phenylisocyanate, København 1945). På tilsvarende måde er det angivet, at Al,B29-di-10 Boc-substitueret insulin (Boc betegner tertiær butyloxycarbo-nyl) viser retarderet insulinvirkning efter subkutan administration (se Geiger & Enzmann: Proinsulin, Insulin, C-petide; Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima 1978: Amsterdam-Oxford 1979, 306 - 310).

15 Al,B29-di-Boc-substitueret insulin viste sig at udvise for ringe retarderet virkning til at være klinisk anvendelig.

Opløsninger af umodificerede insuliner kræver store mængder zinkioner (f.eks. 0,4 - 1 mg/U insulin) for at udvise retarderet virkning (se J.Pharmacol. 5J5 (1935), 206 ). Injektion 20 af så store doser af zinkioner vil sandsynligvis være smertefuldt, og derfor har sådanne opløsninger aldrig været anvendt i terapien.

Insulins isoelektriske punkt er ca. 5,5, og der er gjort forsøg på at formindske opløseligheden af insulinderiva-25 ter ved neutralt pH ved at ændre det isoelektriske punkt opad, f.eks. ved i den N-terminale B-kæde at tilsætte basiske aminosyrer såsom lysin eller arginin (se f.eks. tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.042.299) eller med det basiske dipeptid, arginyl-arginin (se Geiger & Enzmann, som er anført ovenfor).

30 Opløseligheden af den sidstnævnte forbindelse, Arg v -Arg insulin, nær dens isoelektriske punkt var imidlertid meget højere end opløseligheden af insulin.

Japansk patentansøgning nr. 55-144032 angår humanin-sulinanaloger, hvori B30-aminosyren er udskiftet med en amino-35 syre med mindst fem kulstofatomer, og amider og estere deraf.

3 DK 158677 B

Disse insulinanaloger skulle anvendes til patienter, der havde dannet antistoffer mod pattedyrinsuliner. I den japanske patentansøgning er der angivet seks specifikke forbindelser, hvoraf ingen er angivet at have retarderet virkning. Der er 5 ikke angivet nogen som helst specifikke, injicerbare præparater i den japanske patentansøgning.

Europæisk patentansøgning nr. 84108442.9 (svarende til dansk patentansøging nr. 3582/84) angår insulinanaloger, hvori der er knyttet en basisk, organisk gruppe til B30-amino-10 syren, hvorved der indføres en positiv ladning ved neutral pH.

I disse analoger er B30-aminosyren neutral og fortrinsvis threonin som i humaninsulin. De pågældende insulinanaloger har ikke særlig udprægede retarderede virkninger, jfr. nedenstående eksempel 12. Tysk patentansøgning nr. 3.327.709,5 angår en 15 suspension af krystaller af de i ovennævnte europæiske patentansøgning angivne derivater samt en aromatisk hydroxyforbindel-se. Tysk patentansøgning nr. 3.326.473,2 (svarende til dansk patentansøgning nr. 3583/84) angår et lægemiddel indeholdende en blanding af insulinforbindelser, blandt hvilke mindst en er 20 beskrevet i ovennævnte europæiske patentansøgning.

Det har nu overraskende vist sig, at insulinderivater med den i krav 1 angivne almene formel I har fordelagtige virkninger, nemlig en kombineret kort og retarderet virkning, som kan forøges og reguleres ved tilsætning af zinkioner.

25 ' Insulinderivater ifølge den foreliggende opfindelse er forskellige fra humaninsulin ved: a) tilstedeværelsen af en amidgruppe i B-kædens C-terminale carboxylgruppe, og ved b) at den har mindst én ladning mere end humaninsulin 30 ved pH 7, fortrinsvis ikke mere end 4 ladninger mere end humaninsulin ved pH 7.

Forandringen i ladningen opnås ved at blokere B30-aminosyrens carboxylgruppe og om ønsket ved at substituere én eller flere af aminosyrerne sammenlignet med humaninsulin.

4 DK 158677 B

Specifikt kan insulinderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse karakteriseres som følger: En eller flere af de fire glutaminsyrerester ved A4, A17, B13 og B21 er i stedet for en anden naturligt forekommende neutral aminosyre, for-5 trinsvis glutamin, og/eller threoninresten ved B27 er i stedet for en naturligt forekommende basisk aminosyrerest, fortrinsvis L-arginin eller L-lysin, og/eller threoninresten ved B30 er i stedet for én eller to basiske aminosyrerester, idet én foretrækkes, og den C-terminale carboxylgruppe i B-kæden er beskyt-10 tet.

De injicerbare opløsninger ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge krav 1. Fremgangsmåden til fremstilling deraf er ejendommelig ved det i krav 11's kendetegnende del angiv-15 ne.

I forbindelser med formel I er den C-terminale car-boxylgruppe i B-kæden blokeret af en amidgruppe, hvorved carboxylgruppens negative ladning elimineres. Forandringen i ladning, der introduceres ved amidgruppen i B3O-stillingen, kan 20 yderligere forøges ved at erstatte threonin i B27-stillingen med arginin eller lysin og/eller ved at erstatte en hvilken som helst af de fire glutaminsyrerester i A4-, A17-, B13- og B21-stillingen med en neutral aminosyre, fortrinsvis med en gluta-minrest. Endvidere kan en positiv ladning introduceres med en 25 basisk aminosyre i B30- og/eller B31-stillingen. Idet forbindelser med formel I kan anvendes i klinikken som opløsninger med retarderet virkning, kan der ske et fald i immunogenicite-ten sammenlignet med de sædvanligvis anvendte svine- eller humaninsulinsuspensioner.

30 Retarderingsgraden kan forøges og reguleres ved til sætning af zinkioner.

Væsentlige parametere til regulering af graden af retardering af insulinvirkningen er koncentrationen af zink og valget af forbindelsen med formel I. Med nogle analoger, f.eks.

B 2 7 B 3 0 o 35 Arg ,Thr -NI^-humaninsulin, opnås der meget retarderet 5

DK 158677 B

virkning med blot 3 zinkatomer pr. hexamerenhed af insulinanalog svarende til 8 μg zink/ml i et præparat indeholdende ca.

B30 240 nmol/ml. Med andre analoger, f.eks. Lys -NE^-humaninsulin, opnås der moderat retardering af virkningen med 30 zink 5 pr. hexamer insulinanalog svarende til 80 μg zink/ml i et præparat indeholdende ca. 240 nmol/ml. Området for foretrukne zinkkoncentrationer er fra 0 til 2 mg/ml, fortrinsvis fra 0 til 200 μg/ml zink med substitution i B13- og/eller B27-stillingen og fortrinsvis fra 20 til 200 μg/ml med andre analoger.

10 Den retarderede virkning af opløsninger af forbindel ser med formel I i nærværelse af zinkioner tilskrives den lave opløselighed af sådanne forbindelser ved neutralt pH. Kun opløsninger af insulinderivater, i hvilke B-kædens C-terminal var blokeret, viste en mere retarderet virkning end porcint 15 Actrapid -insulin.

pH-værdien af den injicerbare opløsning ifølge denne opfindelse skal fortrinsvis være under og så tæt på den fysiologiske pH-værdi som muligt, idet den øvre grænse er den pH-værdi, ved hvilken der sker udfældning. Der er opnået stabile 20 opløsninger indeholdende ca. 240 nmol/ml af forbindelser med formel I ved pH-værdi 5,5. Den øvre grænse afhænger af opløsningens bestanddele, dvs. isotonikum, konserveringsmiddel og zinkkoncentration og på valget af forbindelse med formel I. Der er ingen laveste grænse for pH-værdi af opløsningerne, men da 25 insulins kemiske stabilitet er ringe i sure opløsninger på grund af deamideringsreaktioner og dannelse af dimere, foretrækkes en så høj pH-værdi som muligt med hensyn til opløsningens fysiske stabilitet. Det foretrukne område for de injicerbare opløsninger ifølge denne opfindelse er fra 2,5 til 8,5, 30 hensigtsmæssigt fra 4,5 til 8.

Det er et yderligere aspekt ved denne opfindelse, at den muliggør forøget fleksibilitet for patienterne. Patienten kan med to vandige opløsninger, én indeholdende en forbindelse med formel I og den anden indeholdende et zinksalt, få en øn-35 sket grad af retarderet virkning og en ønsket profil ved at 6 DK Ί58677Β blande de to opløsninger på passende måde. Under anvendelse af to stamopløsninger har patienten følgelig mulighed for at vælge én virkning og profil til morgeninjektionen og en anden virkning og profil til afteninjektionen. Zinkopløsningen indeholder 5 fortrinsvis mellem ca. 20 μg og 20 mg zink pr. ml. Alternativt kan begge stamopløsninger indeholde zink, enten i samme eller forskellige koncentrationer, og/eller begge stamopløsninger kan indeholde en forbindelse med formel I - enten den samme eller forskellige forbindelser.

10 De injicerbare opløsninger ifølge denne opfindelse har fortrinsvis en styrke på mellem ca. 60 og 6000 nmol/ml af forbindelsen med formel I.

1 4

Den neutrale aminosyre (E til og med E ) er fortrinsvis asparagin, glutamin, alanin, serin eller threonin.

15 Ved neutral pH er ladningen af 27 28 29 B90 -X -Pro -Lys -Y -Z -R +1 i Thr -NH„-humaninsulin, m, B30 OTt , .m “ B30 . t, nZ t ,

Thr -OBu -humaninsulin, Thr (Bu )-OBu -humamnsulin og 332 9 33o

Lys -NH„,des-(B30)-humaninsulin, +2 i Lys -NH^-humaninsu- ^33o 33 g ^ lin, Arg -ΝΗ~-humaninsulin, Orn -NH„-humaninsulin, r B27 nvu B30 * . . . Λ B27 :L B30 m .

20 Lys ,Thr -ΝΗ~-humaninsulin og Arg ,Thr -NH„-humaninsu- ^327 330 ^ lin, og +3 i Lys ,Lys -NH^-humaninsulin, 327" 330 ^ b27 B30

Lys ,Arg -N^-humaninsulin, Arg ,Lys -N^-humaninsulin,

ArgB^,ArgB^®-NH2-humaninsulin, LysB3®~LysB3^-NH2-humaninsulin,

ArgB3°-LysB31-NH2~humaninsulin, ArgB30-ArgB3 -humaninsulin, 25 OrnB30-OrnB31-NH7-humaninsulin, DabB30-DabB31-NH9-humaninsulin 330 331^ ^ og Dap -Dap -N^-humaninsulin.

I en anden gruppe af foretrukne forbindelser med formel I er n nul, m er 1, og Y er en arginin- eller lysinrest.

I en yderligere gruppe af foretrukne forbindelser med 30 formel I er m og n begge 1, og Y og Z er begge arginin- eller lysinrester.

Foretrukne forbindelser med formel I er hver af de følgende: Gin ,Arg ,Thr -NH„-humaninsulin, _η A17 Bl3 B30 „TT . 1Λ . _Ί A17 τ B30 „TT .

Gin ,Gln ,Thr -NH„-humaninsulin, Gin ,Lys -NH9-human- A17 B30 ^ 2 35 insulin, Gin ,Thr -NH2“humaninsulin,

DK 158677B

7

GlnBl3, ArgB27, Thr B3 0-NH„ -humaninsulin, GlnB13, ThrB3 °-NH„ -human- B27 B30 ^ ^ insulin, Arg ,Lys -NH„-humaninsulin, B27 B30 ^ B27 B30

Arg ,Thr -NH„-humaninsulin, Lys ,Lys -NEL·-humaninsulin, B27 B30 ^ B30 *

Lys ,Thr -NH9-humaninsulin, Lys -NHL·-humaninsulin, 330 B3i ^ βίο ~ 5 Lys -Lys -NH9-humaninsulin, Arg -NHL·-humaninsulin eller 330 B3i ^ *

Arg -Arg -NI^-humaninsulin.

I en gruppe af foretrukne forbindelser med formel I er R amino.

I en anden gruppe af foretrukne forbindelser med for-10 mel I er E1, E3 og E4 hver en glutaminsyrerest.

I en tredie gruppe af foretrukne forbindelser med 2 formel I er E en glutaminrest.

Som det er fagmanden bekendt, er ikke alle aminosyre-resterne i humaninsulin af væsentlig betydning for insulinvirk-15 ningen.

Svine- og okseinsulin, der er forskellig fra humaninsulin i aminosyrerester, er da også blevet brugt til behandling af diabetikere. Der forekommer betydelige variationer i insu-linmolekulet fra art til art. Således kan mange peptidrester i 20 humaninsulinmolekylet ændres, uden at der sker en utilladelig formindskelse af insulinvirkningen, herunder nogle peptidrester, der er vigtige med hensyn til molekylets isoelektriske punkt.

12 3

Det er indlysende, at grupperne betegnet E , E , E , 25 E4, X, Y, Z og R skal vælges således, at den resulterende forbindelse med formel I er farmaceutisk acceptabel.

I de kendte, bifasiske insulinpræparater er det almindeligt at kombinere hurtigtvirkende, opløst insulin med krystallinsk insulin med retarderet virkning i samme injektion.

30 Med opløsninger af forbindelser med formel I ifølge denne opfindelse kan der opnås en tilsvarende kombineret hurtig og retarderet virkning med en enkelt forbindelse med formel I i opløsning. Forholdet mellem hurtig virkning og retarderet virkning aftager, når opløsningens zinkionkoncentration forøges.

DK 158677 B

8

Forbindelser med formel I kan fremstilles ved en transpeptidering, i hvilken svineinsulin eller en biosyntetisk precurserforbindelse, som har de korrekte insulindisulfidbroer, og som har den almene formel II: 5 B(l-12)-E3-B(14-20)-E4-B(22-26)-X-B(28-29)-(Qg-R)r-A(l-3)-E1-A(5-16)-E2-aIi8-21) (II) hvori bogstaverne A og B efterfulgt af cifre i parenteser betegner de ved cifrene i parentes indicerede peptidfragmenter af henholdsvis A- og B-kæden fra humaninsulin, Q er en peptid- 10 kæde med q aminosyrer, q er et hel-t tal fra 0 til 33, R er Lys 12 3 4 eller Arg, r er nul eller én, og E , E , E , E og X er hver som beskrevet ovenfor, omsættes med en aminoforbindelse med den almene formel III: H-Y -Z -R (III) m n 15 hvor Y, Z, R, m og n hver er som angivet ovenfor, og hvori sidekædeaminogrupper og -hydroxygrupper i Y og Z eventuelt er beskyttede med amino- og hydroxybeskyttelsesgrupper, under anvendelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator i en blanding af vand og organiske opløsningsmidler som 20 beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.343.898. Foretrukne forbindelser med formel III til brug ved denne metode er Thr-NH2, Lys(Boc)-NH2,_Thr(But)-0But, Thr-OBuS Ala-NH2 og Arg(Boc)-NH2. Aminogrupper kan være derivatiseret ved acylering med en fedtsyre. Hydroxygrupper kan være beskyttede ved alkylering. Hvis Y 25 og Z indeholder grupper, der er reversibelt beskyttede af ami-nobeskyttelsesgrupper, kan disse grupper om ønsket fjernes på et senere stadium, efter at det aminobeskyttede mellemprodukt er fjernet fra trypsinet eller det trypsinlignende enzym.

Blandt de trypsinlignende enzymer er lysylendopeptidase fra 30 Achromobacter lyticus anvendelig.

„ DK 158677 B

Forbindelsen med formel II kan udtrykkes i en værtsorganisme såsom gær i lighed med beskrivelsen i europæisk patentansøgning med publikationsnr. 163.529 under anvendelse af et gen med de korrekte codoner til de pågældende aminosyrer.

5 Det gen, der koder for det hidtil ukendte insulinderivat, indsættes så i en egnet udtryksvektor, der, når den overføres til gær, er i stand til at udtrykke den ønskede forbindelse. Det udtrykte produkt isoleres derefter fra cellerne eller kulturvæsken, afhængigt af om det er udskilt fra cellerne eller ikke.

10 Et eksempel på en reversibel aminobeskyttelsesgruppe er tertiært butoxycarbonyl, og en reversibel hydroxybeskyttel-sesgruppe er tertiært butyl. Sådanne grupper kan fjernes under betingelser, der ikke giver uønskede omdannelser i forbindelsen med formel I, f.eks med trifluoreddikesyre.

15 Insulinderivater med formel I kan også fremstilles

ved en koblingsreaktion, ved hvilken en forbindelse med den almene formel IV

A(1-3)-E1-A(5-6)-Cys-A(8-16)-E2-A(18-19)-Cys-Asn (A-kæde)

I I

20 S S

I I

S S (IV)

I I

B(1-6)-Cys-B(8-12)-E3-B(14-18)-Cys 25 I (B-kæde)

Lys-Pro-X-B(26-22)-E4-Gly 12 3 4 hvor E , E , E , E og X hver er som beskrevet ovenfor, kobles med en aminoforbindelse med ovennævnte formel III med trypsin eller et trypsinlignende enzym under betingelser, der er analo-30 ge med de, som er beskrevet i europæisk patentskrift nr.

17.938.

10 DK 158677 B

Når insulin fremstilles ved gensplejsning, kan den ene eller de to yderligere, positive ladninger passende indføres internt i insulinmolekylet, dvs. i A4-, A17-, B13-, B21-eller B27-stillingen, hvorhos B-kædens C-terminale carboxyl-5 gruppe blokeres semisyntetisk ved hjælp af trypsin med et aminosyreamid eller en aminosyreester.

Fordelen ved at indføre de yderligere, positive ladninger inden for rammerne af insulinmolekylets 51 aminosyrer fremfor at lave de hidtil ukendte forbindelser med formel I i 10 stedet for at forlænge B-kæden ud over pattedyrinsulins 30 rester er, at fremstillingen bliver lettere. Ved den semisyn-tetiske transpeptidering bruges der et stort molært overskud af aminosyreamidet eller aminosyreesteren. Hvis der ved transpeti-deringsreaktionen skulle bruges et dipeptidamid eller en ester, 15 ville enten prisen eller opløseligheden eller begge dele forhindre anvendelsen af et stort overskud, og udbyttet af produktet bliver følgelig lavere. Selv når der i transpeptide-ringsreaktionen anvendes det samme ækvimolære overskud af f„eks. Lys(Boc)-NH2 og Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 under tilsvarende 20 betingelser, bliver udbyttet med aminosyreamidet væsentligt højere end med dipeptidamidet.

Insulinpræparater ifølge denne opfindelse kan fremstilles ved at opløse en forbindelse med formel I i et vandigt medium under svagt sure betingelser, f.eks. i en koncentration 25 på 240 eller 600 nmol/ml. Det vandige medium gøres isotonisk, f.eks. med natriumchlorid eller glycerol. Endvidere kan det vandige medium indeholde zinkioner i en koncentration på indtil ++ ca. 20 μg Zn pr. enhed insulinaktivitet, puffere såsom acetat eller citrat og konserveringsmidler såsom m-cresol eller 30 phenol. Opløsningens pH-værdi justeres mod neutralitet uden at komme for tæt til det isoelektriske punkt af forbindelsen med formel I, således at udfældning undgås. Det endelige insulinpræparats pH-værdi afhænger af antallet af ladninger, der er ændret i forbindelsen med formel I, koncentrationen af zink-

11 DK 158677 B

ioner, koncentrationen af forbindelsen med formel I og af, hvilken forbindelse med formel I, der er valgt. Insulinpræparatet steriliseres ved sterilfiltrering.

Insulinpræparaterne ifølge denne opfindelse anvendes 5 analogt med anvendelsen af de kendte insulinpræparater.

Den heri anvendte forkortelse for aminosyrerne er den, som er angivet i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrerne, der er beskrevet i denne beskrivelse, er i L-konfigura-tion. I formel I og andre steder heri er A(1-3) Gly-Ile-Val, 10 A(5-6) er Gln-Cys osv., jfr. aminosyresekvensen for humaninsulin. Med mindre andet er angivet, er insulinarten i denne beskrivelse humaninsulin.

Syntese af insulinforbindelser

Insulinudgangsmaterialet var enten svineinsulin eller 15 en insulinprecurser, som var udtrykt i gær som beskrevet i den europæiske patentansøgning med publikationsnummer 163.529.

Insulinprecursorene blev udvundet fra fermentations-væskerne ved adsorption til LiChroprep^ RP-18 som beskrevet i eksempel 7 i europæisk patentansøgning med publikationsnr.

20 163.529. Precursorerne elueredes fra søjlen med 0,2 M KC1, 0,001 M HC1 i 33% (rumfang/rumfang) ethanol. Insulinprecurso-rerne blev krystalliseret fra den opsamlede fraktion ved successivt at tilsætte vand (1 rumfang pr. rumfang af det opsamlede), fast trinatriumcitrat til opnåelse af 0,05 M og til 25 sidst zinkacetat til opnåelse af 0,006 M. pH-værdien blev justeret til 6,8, og blandingen henstod natten over ved 4°C. Krystallerne blev isoleret ved centrifugering, vasket med vand og tørret i vakuum.

Beskyttede aminosyrer og beskyttede peptider til 30 enzymatisk semisyntese var enten fremstillet ved standardmetoder eller indkøbt (almindelige synteser) fra enten Novo Biochem eller Bachem, begge. Schweiz.

12 DK 158677 B

Bogstaverne VM efter et navn angiver, at det er et varemærke.

Eksempel 1 B3 0

Syntese af Lys ^.-NH^humaninsulin

5 Opløsninger af 1 g svineinsulin opløst i 4 ml 7,5 M

eddikesyre og 6,1 g Lys(Boc)-Νί^,ΟΗ^ΟΟΟΗ (N-epsilon-Boc-L-lysinamidhydroacetatsalt) opløst til 15 ml med N,N-dimethyl-acetamid blandes, og blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes en opløsning af 0,1 g trypsin i 2,08 ml af en 0,05 M calcium-10 acetatopløsning. Efter 96 timer ved 12°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 200 ml acetone, og bundfaldet isoleres ved centrifugering. Bundfaldet vaskes én gang med 100 ml acetone, isoleres ved centrifugering og tørres i vacuum.

Bundfaldet opløses i 50 ml 0,01 N saltsyre i etha-15 nol/vand (28/72 rumfangsdele), og opløsningen sættes på en 5 x 30 cm's præparativ højtryksvæskekromatografisøjle (i det følgende betegnet HPLC-søjle), som er pakket med octadecyldi-methylsilylsubstituerede kieselgelpartikler (gennemsnitlig partikelstørrelse: 15 micron, porestørrelse: 100 Ångstrøm). Søjlen 20 bringes i ligevægt med ethanol/0,2 M ammoniumsulfatopløsning justeret til pH 3,5 med svovlsyre, i et forhold på 38/62 (rumfangsdele) . Proteinerne elueres fra søjlen med den samme puffer B30 med en hastighed på 2 liter/time. Lys (Boc) -N^-kumaninsulin findes i en top, som eluerer fra søjlen mellem 60 og 75 minut-25 ter efter eluering af uomdannet svineinsulin. Ethanolet afdampes i vacuum, og inddampningen fortsættes, indtil rumfanget er B3 0 formindsket til ca. 125 ml. Lys(Boc) -N^-humaninsulin isoleres ved successive tilsætninger af 25 ml acetone, 100 mg citronsyre (monohydrat p.a.) og 9 mg zinkchlorid (p.a.). pH 30 indstilles til 6,5, og efter 1 time ved stuetemperatur fortsættes krystalliseringen ved 4°C i 24 timer under svag omrøring.

13 DK 158677 B

Krystallerne centrifugeres ned, vaskes én gang med 5 ml iskoldt vand, centrifugeres ned og tørres i vacuum. Udbytte: 456 mg B3 0

Lys(Boc) -HN--humaninsulin.

^ B30 456 mg Lys(Boc) -NH2-humaninsulin opløses i 15 ml 5 trifluoreddikesyre og henstilles i 3 timer ved stuetemperatur.

Trifluoreddikesyren fjernes ved frysetørring. Frysetørrings- resten opløses i 50 ml vand, pH-værdien indstilles til 2,5, og B3 0 der tilsættes 10 g natriumchlorid. Lys -NH2-humaninsulinsalt- kagen isoleres ved centrifugering. Saltkagen opløses i 125 ml B3 0 10 vand, og Lys -NH2-humaninsulinet krystalliseres ved successive tilsætninger af 25 ml acetone, 100 mg citronsyre (monohydrat p.a.) og 9 mg zinkchlorid (p.a.) og indstilling af pH til 7,0. Efter 1 time ved stuetemperatur fortsættes krystalliseringen ved 4°C i 24 timer under svag omrøring. Krystallerne centrifu- 15 geres ned, vaskes én gang med 5 ml iskoldt vand, centrifugeres B3 0 ned og tørres. Udbytte: 387 mg råt Lys -NH2-humaninsulin.

Krystallerne opløses i 50 ml 0,005 N saltsyre i etha-nol/vand (20/80 rumfangsdele), og opløsningen sættes som beskrevet ovenfor på en præparativ HPLC-kolonne, der er bragt i 20 ligevægt med ethanol/0,3 M kaliumchloridopløsning og 0,001 N saltsyre i forholdet 35,5/64,5 (rumfangsdele). Ved eluering med den samme puffer med en hastighed på 2 liter/time fås B3 0

Lys -NH2-humaninsulin, i en fraktion som eluerer fra søjlen mellem 55 og 90 minutter. Produktet isoleres fra den opsamlede B3 q 25 fraktion som beskrevet for Lys(Boc) -NH2-humaninsulin ovenfor, med den undtagelse, at pH i krystallisationen i den zink- holdige citratpuffer er indstillet til 7,0 i stedet for 6,5.

B3 0

Udbytte: 262 mg rent Lys -NH2-humaninsulin.

Aminosyresammensætningen var i overensstemmelse med 30 teorien, dvs. 1 alaninrest og 2 lysinrester pr. molekyle. Produktet var rent ved DISC PAGE-electrophorese ved pH 8,9, vandringshastigheden var 55% af svineinsulins vandringshastighed svarende til en forskel i ladninger på ca. 2. Detaljer for DISC PAGE-elektrophorese fremgår af Horm.Metab.Res.Supplement Series 35 No. 5 (1974), 134. .

Eksempel 2

14 DK 158677B

Syntese af ArgB^^-NH^-h\mianinsulin og Arg6^-Ar-humaninsulin

Opløsninger af 1 g svineinsulin i 3,32 ml 8 M eddike-5 syre og 3,9 g Arg-NH^,(CH^COOH)2 (L-argininamiddihydroacetat-salt) opløst ad 10 ml med N,N-dimethylformamid (i det følgende betegnet DMF) blandes, og blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes en opløsning af 0,1 g trypsin i 1,2 ml 0,05 M calcium-acetatopløsning. Efter 144 timer ved 12°C udfældes proteinerne 10 ved tilsætning af 200 ml acetone, og bundfaldet isoleres ved centrifugering. Bundfaldet vaskes én gang med 100 ml acetone, isoleres ved centrifugering og tørres i vacuum.

Bundfaldet opløses i 50 ml 0,01 N saltsyre i etha-nol/vand (27/73 rumfangsdele), og proteinerne sættes på en præ-15 parativ søjle som beskrevet i eksempel 1. Der pumpes først en eluent bestående af ethanol/0,3 M kaliumchloridopløsning og 0. 001 N saltsyre i et forhold på 35/65 (rumfangsdele) gennem ved en hastighed på 2 liter/time i 4 timer. Der iagttages tre overlappende toppe henholdsvis fra ca. 60 til 120 minutter, fra 20 120 til 150 og fra 150 til 180 minutter. Proteinerne i de tre B3 0 fraktioner isoleres som beskrevet for Lys -NH2 ^ e^semPel 1· Udbytter: 414 mg, 142 mg og 107 mg fra henholdsvis fraktionerne 1, II og III.

Aminosyreanalyser kombineret med DISC PAGE-elektro-25 phorese viste, at insulinmolekylerne i fraktion I var koblet med fra 2 til adskillige argininrester. Den overvejende bestanddel i fraktion II var insulin koblet til en enkelt argi- B3 0 ninamidrest, dvs. Arg -NH--humaninsulin. Fraktion III var en ^ B30 blanding af svineinsulin, des(B30)-humaninsulin, Arg -human-B30 30 insulin og Arg J -NH2-humaninsulin.

15 DK 158677 B

pon

Arg -NH^-humaninsulin

Proteinerne i fraktion II opløses i 10 ml etha-nol/vand 3/2 (rumfang/rumfang) ved pH 2. Efter tilsætning af 12 mg EDTA justeres pH op til 10 ved tilsætning af en 0,1 N natri-5 umhydroxidopløsning. Opløsningen sættes på en 2,5 x 25 cm's søjle af QAE-Sephadex A-25, som er bragt i ligevægt med en puffer bestående af 0,5 M ammoniak, 0,05 N saltsyre og 0,04 M natriumchloridopløsning i 60% ethanol (rumfang/rumfang). Søjlen elueres med en hastighed af 30 ml eluent/timen, med en liniær 10 gradient i natriumchlorid fra 0,04 M til 0,1 M under anvendelse af i alt 1 liter eluent, idet pH holdes konstant på ca. 10,0.

Der opsamles fraktioner på 10 ml. Arg -NH2-humaninsulin kom mer ud fra kolonnen i fraktionerne nr. 58-74. Produktet isoleres fra de samlede fraktioner ved inddampning efterfulgt af 15 krystallisation ved pH 7 i en zinkholdig citratpuffer indehol-dende 15% acetone (rumfang/rumfang) som beskrevet for Lys -NH2-humaninsulin i eksempel 1. Udbytte: 53 mg. Produktet var homogent ved DISC PAGE-analyse ved pH 8,9, og vandringshastigheden var 55% af insulins vandringshastighed. Aminosyresammen- 20 sætningen var i overensstemmelse med det teoretiske for B3 0

Arg -NH2-humaninsulin, idet der var 2 argininrester og 1 ala-ninrest pr. insulinmolekyle.

, B30 , B31 ____ , , .

Arg -Arg -ΜΗη-humaninsulin

Proteinerne fra fraktion I opløses og underkastes 25 ionbytterkromatografi på QAE-Sephadex^ A-25 præcis som beskre- B3 0 B31 vet for proteinerne i fraktion II. Arg -Arg -NH2“humaninsu- lin kommer ud fra kolonnen i fraktionerne nr. 34 - 47. Produk- B3 0 tet isoleres som beskrevet for Lys -NH2-humaninsulin i eksempel 1. Udbytte: 10 mg.

30 Produktet var homogent ved DISC PAGE-elektrophorese ved pH 8,9, og vandringshastigheden var 35% af insulins vandringshastighed. Aminosyresammensætningen viste 3 argininrester og 1 alaninrest pr. insulinmolekyle.

Eksempel 3

„ DK 158677 B

16

Syntese af GlnA~^/ThrB^^-NH^-htimaninsulin

Al 7

Til en opslemning af 3,12 g Gin ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinprecursor i 15 ml eddikesyre/DMF/vand (11,4 5 ml eddikesyre, 65,1 ml DMF, vand ad 100 ml) tilsættes 30 ml 1 M Thr-NH^ i DMF. Blandingen afkøles til 12°C, og der tilsættes 0,3 g svinetrypsin opløst i 7,5 ml 0,05 M calciumacetat. Omrøringen fortsættes, indtil insulinprecursoren opløses. Efter 48 timer ved 12°C blev proteinerne udfældet ved tilsætning af 400 10 ml acetone. Proteinerne blev isoleret ved centrifugering, vasket én gang med 100 ml acetone og tørret i vacuum.

Bundfaldet blev opløst i 70 ml 0,04 N HCl, pH-værdien justeret til 2,5, og derivatet renset ved HPLC som beskrevet i eksempel 1, med den undtagelse at der til elueringen blev an-15 vendt en eluent bestående af 35 dele ethanol og 65 dele 0,3 M KC1, 0,001 N HCl. Derivatet kom ud fra søjlen efter ca. 3 søjlerumfang, og det blev isoleret ved successivt at tilsætte 1 rumfang vand, fast trinatriumcitrat til 0,05 M og fast zinkacetat til 0,006 M. Efter justering af pH til 6,5 og omrøring nat-20 ten over ved 4°C blev krystallerne isoleret ved centrifugering, vasket med vand og tørret. Udbytte 1,64 g = 53%. Yderligere rensninger ved anionbytterchromatografering som beskrevet for humaninsulinestere (se Markussen, ibid, 410). Slutudbytte: 1,15 g = 37%. Produktet var næsten homogent ved DISC PAGE-electro-25 phorese ved pH 8,9, og vandringshastigheden var 55% af insulins vandringshastighed. Ved analytisk "reverse-phase" HPLC (se Markussen, ibid, 410) eluerer produktet med ca. den samme hastighed som svineinsulin. Renheden blev målt til ca. 95%.

Analyse af aminosyresammensætningen viste overensstemmelse med 30 den foreslåede formel.

Eksempel 4

17 DK 158677B

Al7 B30

Syntese af Gin /Lys -NH^-humaninsulin Til en opslemning af 3,15 g A17

Gin ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insulinprecursor i 15 ml 5 eddikesyre/DMF/vand (4,57 ml eddikesyre, 71,9 ml DMF, vand ad 100 ml) sættes 30 ml 0,4 M Lys(Boc)*-NH2 i DMF. Blandingen afkøles til 12°C, og 0,3 g trypsin opløst i 7,5 ml 0,05 M calciumacetat tilsættes. Blandingen omrøres indtil insulinprecurso-ren er opløst. Efter 48 timer ved 12°C isoleres proteinerne som 10 beskrevet i eksempel 3.

Bundfaldet opløses i 70 ml 0,04 N HC1, pH justeres

Al 7 -doa

til 2,5, og Gin ,Lys(Boc) -NH2-humaninsulin. renses ved HPLC

som beskrevet i eksempel 1, med den undtagelse at der først elueres med 2,3 1 af en eluent bestående af 37 dele ethanol og 15 63 dele 0,3 M KC1, 0,001 N HCl, efterfulgt af en eluent bestående af 39 dele ethanol og 61 dele vandig 0,3 M KC1, 0,001 N HCl. Derivatet kom ud 25 minutter efter skift af eluent, og det blev isoleret som beskrevet for GlnA"^, ThrB^-NH--humaninsulin A17 R30 ^ i eksempel 3. Udbytte af Gin ,Lys(Boc) -NH2-humaninsulin 20 906 mg = 29%.

GlnA^,Lys(Boc)B^°-NH2-humaninsulin (1,55 g) opløses i 30 ml trifluoreddikesyre (TFA) og hensættes ved stuetemperatur i 2 timer. TFA blev fjernet ved frysetørring. Remanensen blev opløst i 15 ml vand, pH justeres til 3 med 1 N NaOH, og 22 25 ml ethanol blev tilsat. Opløsningen blev sat på en 2,5 x 20 cm søjle af SP-Sephadex^ C-25, der var bragt i ligevægt med en puffer af ethanol/vand 3/2 (rumfang/rumfang) indeholdende 0,01 M citronsyre, 0,03 M NaCl, pH justeret til 4,5 med NaOH. Søjlen elueres med den samme puffer under anvendelse af en liniær gra-30 dient i NaCl fra 0,03 M til 0,4 M i en samlet mængde på 1,6 1 eluent. Derivatet eluerede i 440 ml, da gradienten nåede 0,2 M NaCl. Det blev krystalliseret ved tilsætning af 1100 ml vand, fast trinatriumcitrat til en koncentration på 0,05 M og fast

18 DK 158677 B

zinkacetat til 0,006 M. Til sidst blev pH justeret til 6,8.

Efter omrøring natten over ved 4°C blev krystallerne isoleret ved centrifugering, vasket én gang med vand og tørret i vacuum.

Udbytte: 1,00 g svarende til 65% over sidste trin og 19% fra A17 5 Gin ,B(1-29 )-Ala-Ala-Lys-A( 1-21)-msulmprecursoren. Produk tet var næsten homogent ved DISC PAGE-electrophorese ved pH 8,9, og vandringshastigheden var 35% af insulins vandringshastighed. Ved HPLC-analysen eluerer produktet før svineinsu-lin; renheden var ca. 97%. Analyse af aminosyresammensætningen 10 viste 2 lysinrester pr. molekyle og ellers identitet med humaninsulin.

Eksempel 5 B27 B30

Syntese af Arg ,Thr -NH^-humaninsulm Til en opslemning af 3,8 g t>27 15 Arg -B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insulinprecursor i 18 ml eddikesyre/vand/DMF (11,4 ml eddikesyre, 35 ml vand, DMF ad 100 ml) tilsættes 36 ml 1 M Thr-N^ i DMF. Blandingen afkøles til 12°C, og 0,38 g svinetrypsin i 6,84 ml 0,05 M calciumacetat blev tilsat. Efter 48 timer ved 12°C blev proteinerne udfældet 20 med acetone som beskrevet i eksempel 3.

Derivatet blev renset ved HPLC som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af først 1800 ml eluent bestående af 35 dele ethanol og 65 dele vandigt 0,3 M KCl, 0,001 N HCl, efterfulgt af en eluent bestående af 37 dele ethanol og 63 dele af 25 den vandige opløsning. Derivatet viste sig 10 minutter efter skiftet i elueringsmiddel, og det blev isoleret som beskrevet for GlnA17,ThrB^^-NH2_insulin i eksempel 3. Til sidst blev det renset på en SP-Sephadex^11 C-25-søjle som beskrevet for GlnA^7 ,LysB^-NH2“humaninsulin i eksempel 4.

19 DK 158677 B

B27 B30

Udbyttet af Arg ,Thr -NH2-humaninsulin var 1,63 g svarende til 43%. Der ses hovedsageligt ét hovedbånd ved DISC PAGE-electrophorese, og vandringshastigheden var 55% af insulins vandringshastighed. Ved HPLC-analyse eluerede produktet 5 før svineinsulin, og renheden var ca. 96%. Analyse af aminosyresammensætningen viste 2 argininrester pr. molekyle og ellers identitet med humaninsulin.

Eksempel 6

Syntese af ArgB^ ,LysB^^-NH^-humaninsulin 10 Forbindelsen blev syntetiseret fra 3,61 g B2 7

Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insulinprecursor under anvendelse af de metoder, der er beskrevet i eksempel 4. Udbytte R2 7 ο o λ af Arg ,Lys -NH2-humaninsulin 0,78. g = 22%. Et hovedbånd ved DISC PAGE-electrophorese, der vandrede 35% af længden af 15 insulins vandring. To mindre bånd var synlige. Renhed i HPLC analysen var 92%; produktet eluerer før svineinsulin. Analyse af aminosyresammensætningen viser 2 arginin- og 2 lysinrester pr. molekyle og ellers identitet med humaninsulin.

Eksempel 7 R27 B30 20 Syntese af Lys ,Thr -NH2-humaninsulin

Forbindelsen blev syntetiseret fra 7,0 g B2 7

Lys ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insulinprecursor under an vendelse af de samme metoder som i eksempel 5. Udbyttet af B27 B30

Lys ,Thr -NH2-humaninsulin var 3,15 g svarende til 45%.

25 DISC PAGE-electrophorese viste et større og to mindre bånd, og hovedbåndet vandrede 55% af vejen af insulinreferencen. Renheden blev ved HPLC-analyse bestemt til 96%. Forbindelsen viste

20 DK 158677B

sig tidligere end svineinsulin i omvendt fase HPLC. Analyse af aminosyresammensætningen viste 2 lysinrester pr. molekyle og ellers identitet med humaninsulin.

Eksempel 8 B27 B30 5 Syntese af Lys ,Lys -NH^-humaninsulin

Forbindelsen blev syntetiseret fra 7,0 g B2 7

Lys ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinprecursor under an vendelse af de metoder, der er beskrevet i eksempel 4. Udbytte B27 B30 af Lys ,Lys -l·^-humaninsulin var 1,57 svarende til 22%.

10 DISC PAGE-electrophorese viste ét større bånd, der vandrede en afstand, der var 35% af svineinsulins vandring. En mindre urenhed var synlig. Ved HPLC-analyse viste renheden sig at være 94%, og forbindelsen eluerede væsentligt før svineinsulin. Analyse af aminosyresammensætningen viste 3 lysinrester pr. mole-15 kyle og ellers identitet med humaninsulin.

Eksempel 9 B13 B30

Syntese af Gin ,Thr -NH^-humaninsulin

Forbindelsen blev syntetiseret fra 3,05 g Gin ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-insulinprecursor under an-20 vendelse af de metoder, der er beskrevet i eksempel 5. Udbyttet af slutproduktet var 0,88 g svarende til 29%. DISC PAGE-elec-trophorese viste ét større bånd, der vandrede 55% af vejen sammenlignet med svineinsulin. HPLC viste en renhed på 95%, og forbindelsen eluerede senere end svineinsulin. Analyse af 25 aminosyresammensætningen viste identitet med humaninsulin.

Eksempel 10

21 DK 158677B

Fremstilling af injicerbare opløsninger af forbindelser med formel I

Til undersøgelse af graden af retarderet virkning 5 fremstilledes sterile, injicerbare opløsninger af forbindelser med formel I under anvendelse af 0,9% (vægt/rumfang) natrium-chlorid som isotonikum og 0,15 % (rumfang/rumfang) m-cresol som konserveringsmiddel. Der fremstilledes også injicerbare opløsninger under anvendelse af 1,6 (vægt/rumfang) glycerol som iso-10 tomicum, idet der blev brugt 0,3% (vægt/rumfang) m-cresol som konserveringsmiddel, som blev pufret med 0,01 M natriumacetat. Zinkionkoncentrationen blev varieret fra 0 til 160 μg/ml. Opløsningernes pH-værdier blev indstillet, så de var tilstrækkeligt langt fra det isoelektriske punkt af forbindelser med for-15 mel I til at holde opløsningen klar ved opbevaring ved 4°C. Opløsningerne indeholdt 240 nmol/ml af forbindelserne med formel I. Koncentrationen på 240 nmol/ml blev opnået ved at bestemme absorptionen ved 276 nm af en mere koncentreret stamopløsning, som ikke indeholdt m-cresol, under anvendelse af svineinsulins 20 molære extinctionskoefficient på 6100 for disse derivater (se Handbuch der Inneren Medizin, Vol. 7/Part 2A, Editor:

Oberdisse, 1975, 113) og under anvendelse af den konstaterede aktivitet for monokomponent svineinsulin på 28,5 U/mg tørstof (se Diabetes Care, Vol. 6/Supplement 1 (1983), 4). 1 U svarer 25 til 5,95 nmol.

Der blev fremstillet injicerbare opløsninger indeholdende 240 nmol/ml af de i tabel 1 angivne forbindelser med formel I med de i tabellen angiven pH-værdier og zinkindhold.

22

DK 158677B

Test for prolongering af insulinvirkningen

Forlængelsen af den hypoglykæmiske virkning af inji-cerbare insulinopløsninger blev testet i fastende kaniner som beskrevet i Britisk Farmakope 1980, A 142. Hver prøveopløsning 5 blev administreret subkutant i en dosis på 15,5 nmol pr. kanin til 6 eller 12 dyr vejende 3 - 4 kg, og hypoglykæmiforløbet blev fulgt i 6 timer. Til sammenligning blev det hurtigtvirkende svineinsulinpræparat, Actrapid , medtaget i testen. Analyseresultaterne fremgår af tabel 1 og 2.

10 Analyseresultaterne for retarderet virkning i kaniner af nogle af forbindelserne fremgår af tabel 1, nedenfor. Gluco-seværdien er gennemsnittet af glucoseværdien i procent af den oprindelige værdi for 6 kaniner. Opløsninger var isotoniske med 0,9% NaCl og indeholdt 0.15% (rumfang/rumfang) m-cresol som 15 konserveringsmiddel.

Tabel 1 - - - |_

Forbindelser med Zn , pH Glucose i procent af startværdi formel I_μg/ml_1/2 h lh 2 h 4 h 6 h

LysB30-NH2-insulin 0 4,5 53 54 49 79 100 20 LysB3°-NH2-insulin 80 4,5 63 62 63 73 80

LysB30-NH9-insulin 160 4,5 87 80 68 90 93

Arg -NH2-insulin 0 4,5 57 53 51 65 81

ArgB3^-NH2-insulin 80 4,5 76 68 63 73 78

ThrB3(^-t®2-insulin 0 4,2 46 46 39 64 91 25 ThrB30-NH2-insulin 160 4,2 64 58 50 70 69

ThrB3 °-OBut-insulin 0 4,0 59 65 59 79 100

ThrB30-OBut-insulin 160 4,0 81 75 62 66 88

ThrB30(But)-OBut-insulin 0 4,0 64 60 54 71 82

ArgB30-ArgB31-NH2-insulin 0 4,5 72 70 68 67 68 30 ArgB30-ArgB31-NH„-insulin 160 4,5 91 87 78 73 68

Lys°JU(Lau)-NH2-insulin 0 94 95 94 93 95

Actrapid^ svineinsulin 15 7_53_48 42 70 98

23 DK 158677 B

Analyseresultaterne for retarderet virkning af nogle af forbindelserne hos kaniner fremgår af nedenstående tabel 2. Glucoseværdien er den gennemsnitlige glucoseværdi i procent af den oprindelige værdi for 12 kaniner. Prøveopløsningerne var 5 isotoniske med 1,6% (vægt/rumfang) glycerol, indeholdt 0,3% (vægt/rumfang) m-cresol som konserveringsmiddel og 0,01 M natriumacetat som buffer.

Tabel 2

Forbindelse med Zn , pH Glucose i procent af startværdi 10 formel I _μg/ml_Ih 2 h 4 h 6 h

Gln^,Thf^ ^-M^-insulin 80 4,5 65 63 68 83

GlnA17 ,LysB3°-NH2-insulin 80 4,5 60 56 73 86

GlnBl3,ThrB30-NH2-insulin 6,7 4,5 91 92 92 90

ArgB27,ThrB30-NH2-insulin 80 4,5 88 86 85 81 15 ArgB27,ThrB3^-NH2-insulin 8,5 4,5 62 64 66 67

ArgB27,LysB30-NH2-insulin 80 4,5 85 83 81 79

ArgB27,LysB3°-NH2-insulin 10,9 4,5 78 73 69 67

LysB27,ThrB3^-NH2-insulin 7,4 4,5 56 55 62 61

LysB27,LysB3^-NH -insulin 9,5 4,5 72 65 65 60 con ^ 20 LysD -NH2~insulin 80 4,5 74 83 80 82

Referenceinsulin

Actrapid^1 svineinsulin 15 7 58 56 87 100

Insulinforbindelsernes styrke blev målt ved sænkningen af blodsukkeret i mus (British Pharmacopoeia 1980, A 141 -25 A 142). For at formindske problemet med at bestemme styrken af insuliner med en retarderingsgrad, der er forskellig fra Stan-

24 DK 158677 B

darden, blev der til bestemmelse af styrken fremstillet insulinopløsninger uden tilsætning af zink. Der blev fremstillet opløsninger indeholdende 240 nmol/ml baseret på absorption ved 276 nm. Zinkindholdet af opløsningerne var 8-10 μg/ml, stam-5 mende fra de krystallinske derivater. De beregnede styrker af nogle insulinforbindelser er vist i nedenstående tabel 3.

Tabel 3__

Styrke i Konfidens- forhold til grænser 10 insulin, %_(P = 0,05), %

GlnÅ^7 ,ThrB3^-NH2-insulin 67 58 - 75

GlnA^7,LysB3(^-NH2-insulin 62 51 - 72

ArgB27,ThrB30-NH2-insulin 122 102 - 145

ArgB27,LysB3^-NH2-insulin 84 74 - 94 15 LysB3° (Lau)-NH2-insulin_18_15 - 23

Eksempel 11

Til belysning af den fremragende virkning af forbindelserne ifølge denne opfindelse i sammenligning med de fra europæisk patentansøgning nr. 84108442.9 kendte forbindelser 20 blev forbindelsernes protraherede virkning bestemt. Resultatet er angivet i nedenstående tabel 4, hvor indexet for protraheret virkning er beregnet som angivet i Protein Engineering 1 (1987), side 211, øverst, venstre spalte. I tabel 4 er de 3 første forbindelser forud kendte forbindelser.

Tabel 4

25 DK 158677 B

Index for protraheret virkning, Forbindelse_3 Zn++/hexamer_

LysB27,ThrB30-NH2-insulin 53 5 LysB27,LysB30-NH2-insulin 70

ArgB27,ThrB30-NH2-insulin 53

ArgB27,LysB3°-NH2-insulin 71

GlnBl3,ThrB3°-NH2-insulin 45

GlnB13,Arg627,ThrB3°-NH2-insulin 60 10 GlnAl7,ArgB27,ThrB2°-NH2-insulin 39

GlnAl7,GlnBl3,ThrB30-NH9-insulin 42 no Λ td *5 "I ^

Lys -Lys -NH^-insulin 31 B3 0 ^

Arg -NH^-insulin 28

Arg -Arg -NH2-insulin 59 15 Actrapid® 0

Tabel 5

Index for protraheret virkning, ++

Forbindelse_31 Zn /hexamer_

GlnÅ"*"7 ,LysB3<^-NH2-insulin 24 20 GlnAl7,ThrB3^-NHp-insulin 33

Lys -NH2-insulin 28

Monotard® 42

Ultralente® 100

Claims

26 DK 158677 B

1. Insulinderivater med den almene formel I A(1-3)-E1-A(5-6)-Cys-A(8-16)-E2-A(18-19)-Cys-Asn (A-kæde) I I

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at E1, 3 4 E og E hver er en glutammsyrerest.

3. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de 2 foregående krav, kendetegnet ved, at E er en glutaminrest.

4. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de 10 foregående krav, kendetegnet ved, at n er nul, m er 1, og Y er en arginin- eller lysinrest.

5. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at m og n begge er 1, og Y og Z begge er arginin- eller lysinrester.

5. S I I S S (I) I I B(1-6)-Cys-B(8-12)-E3-B(14-18)-Cys

6. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at R er -NH2·

7. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er GlnAl^,ArgB^^,ThrB^^-NH2~humaninsulin, GlnAl7 , GlnBl^, ThrB^0-NH2-humaninsulin, GlnAl7,Lys6'* ^-NH2-human- 20 insulin, Gln^7 ,ThrB^-NH2-humaninsulin, Gin6’*"'*, ArgB^7 ,ThrB^- B13 ^ B30 NH„-humaninsulin, Gin , Thr -NH~-humaninsulin, ^e>27 R30 R30 Arg ,Lys -NH2-humaninsulin, Arg , Thr -NH2-humaninsulin, LysB^7 ,LysB'*®-NH„-humaninsulin, LysB^7, ThrB'*^-NH9-humaninsulin, Lys -NH2-humaninsulin, Lys -Lys -ΝΗ„-humaninsulin, B30 ^ R30 ^R31

25 Arg -NH2-humaninsulin eller Arg -Arg -NH2-humaninsulin·

8. Anvendelse af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 som antidiabetikum.

9. Injicerbare opløsninger med forlænget insulinvirkning, kendetegnet ved, at de som aktiv bestanddel indeholder en 30 forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

10. Præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det indeholder zinkioner, fortrinsvis fra ca. 2 μg til ca. 2 mg zink pr. ml, mere foretrukket fra ca. 5 μg til 200 μg zink pr. ml.

28 DK 158677 B

10 I (B-kæde) R-Z -Y -Lys-Pro-X-B(26-22)-E4-Gly n m hvori bogstaverne A og B efterfulgt af cifre i parentes betegner de ved cifrene i parentes indicerede peptidfragmenter af 12 3 4 henholdsvis A- og B-kæden fra humaninsulm, E , E , E og E er 15 ens eller forskellige og hver betegner en glutaminsyre-, glycin-, valin-, isoleucin-, leucin-, phenylalanin-, tyrosin-, methionin-, asparagin-, glutamin-, alanin-, serin- eller threo-ninrest, X betegner en L-threonin-, L-arginin- eller L-lysin-rest, Y og Z er ens eller forskellige og hver betegner en 20 arginin-, lysin-, glycin-, valin-, isoleucin-, leucin-, phenylalanin-, tyrosin-, methionin-, asparagin-, glutamin-, alanin-, serin-, α,γ-diaminosmørsyre-, a,β-diaminopropionsyre- eller threoninrest, og m og n er ens eller forskellige og hver betegner 0 eller 1, og R betegner en gruppe med den almene formel 12 12

25 -NR R , hvor R og R er ens eller forskellige og hver betegner hydrogen eller lavere alkyl med mindre end 7 kulstofatomer, med det forbehold, at når E"1, E , EJ og E4 hver er en glutaminsyre-rest, og X er en threoninrest, da betegner gruppen med formlen -Ym-Zn~R amino, -Arg-NH2, -Arg-Arg-NH2, -Arg-Lys-NH2,

30 -Dab-Dab-NH2, -Dap-Dap-NH2, -Lys-NH2, -Lys-Arg-Nl·^ eller

27 DK 158677 B -Lys-Lys-NH^, hvor Dab betyder α,γ-diaminosmørsyre, Dap betegner a, (3-diaminopropionsyre, samt det forbehold, at forbindelsen med formel I har mindst en ladning mere end humaninsulin ved en pH-værdi på 7.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af en opløsning ifølge krav 10, kendetegnet ved, at en opløsning af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, eventuelt indeholdende zink, blandes med en zinkopløsning, eventuelt 5 indeholdende en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1 - 7, i sådanne mængder, at der opnås en blanding med en zinkkoncentration på indtil 2 mg/ml, idet indholdet at zink i hver af de to opløsninger fortrinsvis er under ca. 4 mg/ml.