KR930007433B1

KR930007433B1 - 사람 인슈린 펩티드의 제조방법

Info

Publication number: KR930007433B1
Application number: KR1019860001737A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠쎈 얀
Original assignee: 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브; 윌리암 앤더슨
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-11
Publication date: 1993-08-10
Also published as: FI861007A0; NO860920L; DK113585D0; NO172441B; DE3685668D1; DK158677C; YU46001B; DD244345A5; GR860687B; DK158677B; CN86101489A; YU34586A; EP0194864A2; AU5449586A; IL78103A0; CS166686A2; HU201097B; DK107086A; EP0194864B1; AU612964B2

Abstract

내용 없음.

Description

사람 인슈린 펩티드의 제조방법

본 발명은 신규한 사람 인슈린 화합물의 제조방법 및 연장된 인슈린 작용을 갖는 신규한 주입가능한 용액의 제조방법에 관한 것이다.

진성 당뇨병의 치료에 있어서, 많은 다양한 인슈린 제제가 제안되어 왔고 사용되어 왔다. 어떤 제제는 속효성이며 다른 제제는 다소 연장된 작용을 갖는다. 보통, 다소 연장된 작용을 갖는 제약상의 인슈린 제제가 바람직하다. 이러한 연장된 작용은 인슈린을 결정의 현탁액으로서 투여함으로써 얻을 수 있다. 결정성 제제는 아연의 존재하에 인슈린의 결정화에 의해 얻을 수 있고 (Lente^TM과 같은 것, Schlichtkrull : 인슈린 결정, 인슈린 결정 및 인슈린 아연 현탁액에 대한 화학적 및 생물학적 연구, Munksgaard, 1958참조) 또는 아연 및 프로타민의 존재하에 인슈린의 결정화에 의해 얻을 수 있다(NPH-인슈린과 같은 것, Rep. Steno Mem. Hoap. 1(1946), 60참조).

아연 인슈린 결정 또는 아연 프로타민 인슈린의 공지의 현탁액을 사용하는 한가지 불리점은 정확한 양의 인슈린이 주입되는 것을 보증하고 바이알내의 인슈린의 농도가 사용시마다 일정하게 남아 있는 것을 보증하기 위해 바이알을 흔드는 것이 필요하다는 것이다. 공기가 없어야 하는 펜필(Penfill^TM) 카아트리지에서는 연장된 작용을 하는 인슈린 현탁액은 교반을 가능하게 하기 위해 카아트리지에 고체물의 함입이 요구된다. 인슈린 현탁액과 인슈린 용액의 공기와의 뒤흔듬은 인슈린이 물-공기 계면에서 원섬유(fibrills)의 형성하에 변성되는 경향을 갖기 때문에 그 자체가 바람직하지 못한 방법이다. 따라서, 연장된 작용을 갖는 인슈린 용액이 요망되고 있다.

연장된 작용을 갖는 인슈린 유도체 용액은 페닐이소시아네이트(소위 이소인슈린)와의 반응에 의해 그의 아미노기가 수정된 인슈린으로부터 얻었다(Hallas-Moeller : 인슈린과 페닐이소시아네이트간의 반응을 기초로한 화학적 및 생물학적 인슈린 연구, 코펜하겐 1945참조). 마찬가지로, Al, B29-di-Boc 치환된 인슈린(Boc는 tert-부틸옥시카르보닐을 가리킨다)이 피하 투여후 연장된 인슈린 작용을 나타내는 것으로 보고되었다(Geiger ＆ Enzmann : 프로인슈린, 인슈린, C-펩티드; 프로인슈린, 인슈린, C-펩티드에 대한 심포지움 회보, Tokushima 1978; 암스테르담-옥스포드 1979, 306-310 참조). AL, B29-di-Boc 치환된 인슈린은 임상적으로 사용되기에는 너무 적은 연장된 작용을 나타내는 것으로 발견되었다.

미수정된 인슈린 용액은 연장된 작용을 나타내기 위해서는 많은 양의 아연이온(예를들면, 0.4-1mg/U 인슈린)을 요한다(J. Pharmacol, 55(1935), 206참조). 이러한 많은 투여량의 아연이온 주입은 십중팔구 통증을 일으키게 되고 따라서 이러한 용액은 치료법에 결코 사용되지 못한다.

인슈린의 등전점은 약 5.5인데 등전점을 위로 이동시킴으로써 예를들면, B-사슬의 N-말단에 염기성 아미노산 유사 리신 또는 알기닌의 첨가를 통하여(예를들면, 독일 Offenlengungsschrift No. 2,042,299 참조) 또는 염기성 디펩티드 알기닐-알기닌으로 (Geiger ＆ Enzmann 상기 인용문헌 참조) 중성 pH에서 인슈린 유도체의 용해도를 감소시키도록 시도되어 왔다. 그러나, 후자 화합물 Arg^B(-1)-Arg^BO인슈린의 그의 등전점 근처에서의 용해도는 모 인슈린의 용해도 보다 훨씬 더 높다.

일본 특허출원 제55-144032호는 B30-아미노산이 적어도 다섯 탄소원자를 갖는 아미노산과 그의 아미드 및 에스테르에 의해 대치된 사람 인슈린에 대한 동족체에 관한 것이다. 이들 인슈린 동족체는 포유동물 인슈린에 대한 항체를 발육시킨 환자에 사용되는 것이었다. 일본 특허출원에는 6개의 특정한 화합물을 기술하고 있는데, 그들중 어떤 것도 연장된 작용을 갖는 것으로 언급되어 있지 않다. 특정한 주입용 제제는 일본 특허출원에 기술되어 있지 않다.

유럽 특허출원 제 84108442.9는 염기성 유기기가 B-30 아미노산에 부착되어 이로써 중성 pH에서 양의 전하를 도입하는 인슈린 동족체에 관한 것이다. 이들 동적체에는 B30-아미노산이 중성이며, 바람직하게는 사람 인슈린에서 트레오닌이 그러하다. 독일 특허출원 제 3,327,709.5는 방향족 히드록시 화합물뿐만 아니라 상기한 유럽 특허출원에 기재된 유도체의 결정 현탁액에 관계한다. 독일 특허출원 제 3,326,473.2는 인슈린 화합물의 혼합물을 포함하는 약물에 관한 것인데, 그중 적어도 한가지는 상기한 유럽 특허출원에 기술되어 있다.

본 발명을 간단히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 다음에 의하여 사람 인슈린과 다른 신규한 사람 인슈린 동족체로 이루어진다 : a) B사슬의 C-말단 카르복실기상의 아미드 또는 에스테르 잔기의 존재, b) pH7에서 사람 인슈린 보다 적어도 1전하 더 가짐, 바람직하게는 pH7에서 사람 인슈린보다 4전하 더 가짐.

전하의 변화는 B30 아미노산에서 카르복실기의 차단에 의해 달성되며, 원한다면, 사람 인슈린과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환함으로써 달성된다.

구체적으로, 본 발명의 실행에 중요한 화합물은 다음과 같이 특징지어진다 : A4, A17, B13, B21에 있는 네 글루타민산 잔기 하나 또는 그 이상은 또다른 천연발생 천연아미노산, 바람직하게는 글루타민으로 대신한다; 그리고/또는 B72의 트레오닌 잔기는 천연 분석 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 L-알기닌 또는 L-리신으로 대신한다 ; 그리고/또는 B30의 트레오닌 잔기는 하나 또는 두개, 바람직하기는 하나의 염기성 아미노산 잔기로 대신하며 B사슬의 N말단 카르복실기는 보호되어 있다.

발명은 또한 조절된 수준의 아연이온을 가진 위에 분류한 사람 인슈린 동족체의 용액으로 또한 이루어진다. 인슈린 작용의 연장정도는 이로써 향상되고 조절된다.

본 발명의 상세한 실시는 다음과 같다.

단기와 장기의 결합된 인슈린 작용을 갖는 주입가능한 용액은 유효 성분으로서 일반식 I을 갖는 단일 인슈린 유도체를 사용하여 만들수 있음이 놀랍게도 발견되었다.

여기서 괄호안에 숫자를 쓴 글자 A와 B는 각각 괄호안의 숫자로 표시한 A-및 B-사슬의 펩티드 단편을 가리키고, E¹, E², E³및 E⁴는 같거나 또는 다른데, 뉴클레오티드 서열로 코우드될 수 있는 글루타민산 또는 중성 아미노산 잔기를 각각 나타내며, X는 L-트레오닌, L-알기닌 또는 L-리신 잔기를 나타내고, Y와 Z는 같거나 또는 다른데 각각은 어떠한 측쇄 아미노기가 아실화될 수 있으며 어떠한 측쇄 히드록시기가 알킬화 될 수 있는 아미노산 잔기를 나타내며, m과 n은 같거나 또는 다르며 각각은 0 또는 1을 나타내고, R은 B사슬의 C-말단 카르복실기를 차단하는 아미도 또는 에스테르 잔기를 나타내는데, X가 트레오닌 잔기일때 모든 E¹, E², E³및 E⁴가 다 글루타민산 잔기는 아니며, 또는 E¹, E², E³및 E⁴는 각각 글루타민산 잔기이고 X는 트레오닌 잔기일때, 일반식 -Y_m-Z_n-R기는 -NH₂,-Arg-NH₂, -Arg-Arg-NH₂, -Arg-Lys-NH₂, -Dab-Dab-NH₂, -Dap-Dap-NH₂, -Lys-NH₂, Lys(Lau)-NH₂, -Lys-Arg-NH₂, -Lys-Lys-NH₂, -Orn-NH₂, -Orn-Orn-NH₂, -Thr-NH₂, -Thr-OBu^t또는 -Thr(Bu^t)-OBu^t를 나타내는 조건에서 그와 같다. Lau는 라우로일을 가리키고 Dab 및 Dap는 α, γ-디아미노부티르산 및 α, β-디아미노 프로피온산을 각각 나타낸다.

일반식(I)의 화합물의 아눅(subgroup)은 괄호안에 숫자를 쓴 글자 A와 B는 각각 괄호안의 숫자로 나타낸 A-및 B-사슬의 펩티드 단편을 가리키고, E¹, E², E³및 E⁴는 같거나 또는 다른데, 각각 뉴클레오티드 서열에 의해 코우드 될 수 있는 글루타민산 또는 중성의 아미노산 잔기를 나타내며, X는 L-트레오닌, L-알기닌 또는 L-리신 잔기를 나타내고, Y 및 Z는 같거나 또는 다르며 각각은 어떠한 측쇄 아미노산이 아실화 되며 어떠한 측쇄 히드록시가 알킬화될 수 있는 아미노산 잔기를 나타내고, m과 n은 같거나 또는 다르며 각각 0 또는 1을 나타내며 R은 B-사슬의 C-말단 카르복실기를 차단하는 아미도 또는 에스테르 잔기를 나타내는데, 모든 E¹, E², E³및 E⁴가 다 글루타민산 잔기는 아니며, X는 트레오닌 잔기일때, 또는 E¹, E², E³및 E⁴는 각각 글루타민산 잔기이고 X는 트레오닌 잔기일때, 일반식 -Y_m-Z_n-R기는 -NH₂-Arg-NH₂, -Arg-Arg-NH₂, -Arg-Lys-NH₂, -Dab-Dab-NH₂, -Dap-Dap-NH₂, -Lys-NH₂,Lys(Lau)-NH₂, -Lys-Arg-NH₂, -Lys-Lys-NH₂, -Orn-NH₂, 또는 -Orn-Orn-NH₂를 나타내는 조건에서 그와 같은 일반식 I을 갖는 신규한 화합물이다.

일반식 I의 화합물에서, B-사슬의 C-말단 카르복실기는 에스테르기 또는 아미드기에 의해 차단되어 이로써 카르복실기의 음전하를 제거한다. B30 위치에 에스테르 또는 아미드기에 의해 도입된 전하의 변화는 또한 B27-위치의 트레오닌을 알기닌 또는 리신으로 치환함으로써 및/또는 A4-, A17-, B13- 및 B21-위치의 네 글루타민산 잔기의 어떤 것을 중성 아미노산으로, 바람직하게는 글루타민 잔기로 치환함으로써 증가시킬 수 있다. 더 나아가서, 양의 전하는 B30- 및/또는 B31-위치에 염기성 아미노산에 의해 도입될 수 있다. 일반식 I의 화합물은 연장된 작용을 갖는 용액으로서 임상에 적용될 수 있기 때문에, 통상 사용된 돼지 또는 사람 인슈린 현탁액와 비교하여 면역 원성의 하락이 일어날 수 있다.

연장정도는 아연 이온의 부가에 의해 향상되고 조절될 수 있다.

인슈린 효과의 연장정도를 조절하는 주파라미터는 아연의 농도와 일반식 I의 화합물의 선택이다. 어떠한 동족체, 예를들면 Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린으로, 약 240nmol/ml를 포함하는 제제에 8㎍ 아연/ml에 해당하는 인슈린 동족체의 육합체(hexamer) 단위당 단지 세 아연 원자로 매우 연장된 작용이 얻어진다. 다른 동족체, 예를들면 Lys^B30-NH₂사람 인슈린으로 약 240nmol/ml를 포함하는 제제의 80㎍ 아연/ml에 해당하는 인슈린 동족체 육합체 당 30개의 아연으로 원만한 작용연장이 얻어진다. 바람직한 아연 농도의 범위는 0 내지 2mg/ml인데, 바람직하게는 B13 및/또는 B27 위치의 치환으로 0 내지 200㎍/ml 아연이며 다른 동족체로 20 내지 200㎍/ml에 이른다.

아연이온의 존재하에 일반식 I의 화합물 용액의 연장된 작용은 중성 pH에서 이러한 화합물의 낮은 용해도에 기인한다. B-사슬의 C-말단이 차단된 인슈린 유도체 용액만으로 악트라피드(Actrapid^TM)돼지 인슈린보다 더 연장된 작용을 나타내었다.

본 발명의 주입 가능한 용액의 pH는 바람직하게는 낮아야 하며, 침전이 발생하는 pH를 상한으로 하여 가능한한 생리학적 pH에 가까워야 한다. 약 240nmol/ml의 일반식 I의 화합물을 포함하는 안정한 용액은 pH5.5에서 얻어졌다. 상한은 용액의 구성성분 즉, 아이소토니컴(isotonikum), 방부제 및 아연농도에 의존하며 일반식 I의 화합물의 선택에 의존한다.

인슈린의 화학적 안정성은 탈아미드 반응으로 인하여 산 용액에서 나쁘며 용액의 물리적 안정도에 관하여 가능한한 높은 pH로서의 이합체(dimers)의 형성이 바람직하기 때문에 용액의 더 낮은 pH 한계는 없다. 이 발명이 주입가능한 용액에 대한 바람직한 pH 범위는 2.5 내지 8.6 더 바람직하게는 4.5 내지 8이다.

본 발명의 더 이상의 관점은 환자에 대한 향상된 굴요성(flexibility)을 제공하는 것이다. 하나는 일반식 I의 화합물을 포함하고 다른 하나는 아연염을 포함하는 두 수용액으로, 두 수용액을 적당히 혼합함으로써 환자는 원하는 정도의 연장된 작용과 원하는 프로화일을 얻을 수 있다. 따라서, 환자는 두 비축용액을 사용하여 아침 주입을 위한 한가지 작용과 프로화일 그리고 저녁 주입을 위한 또다른 작용과 프로화일에 대한 선택의 가능성을 갖는다. 바람직하게는 아연용액은 ml당 약 10㎍과 20mg 사이의 아연을 포함한다. 또 다르게는, 비축용액 둘다 같거나 아니면 다른 농도로 아연을 포함할 수 있고/또는 비축용액은 같거나 아니면 다른 화합물인 일반식 I의 화합물을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 주입가능한 용액은 약 60과 6000nmol/ml사이 농도의 일반식 I의 화합물을 갖는다.

중성의 아미노산(E¹내지 E⁴)은 예를들면, 글리신, 발린, 이소로이신, 로이신, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 바람직하게는 아스파라진, 글루타민, 알라닌, 세린 또는 트레오닌이다.

R의 예들은 에스테르 기들, 예를들면 저급알콕시, 바람직하게는 메톡시, 에톡시 및 가장 바람직한 tert-부톡시이며 이러한 기는 사람 인슈린의 합성에 유용한 화합물에 존재한다. 예로써 미국특허 명세서 제4,343,898을 참조한다. 이러한 에스테르는 Thr^B30-OBu^t사람 인슈린 및 Thr^B30(Bu^t)-OBu^t사람 인슈린이다(Bu^t는 tert 부틸을 나타낸다).

더 나아가서, R은 일반식-NR¹R²기일 수 있는데, 여기서 R¹과 R²는 같거나 또는 다르며 각각은 수소 또는 저급알킬을 나타낸다. 이후부터 "저급"이라는 용어는 문제의 기가 7개 이하의 탄소원자, 바람직하게는 5개 이하의 탄소원자를 포함함을 나타낸다. 이러한 기의 예는 사람 인슈린의 합성에서 중간체로서 공지되어 있는 Thr^B30-NH₂사람 인슈린에서 발견된다(Carlsberg Res. Commun.49(1984), 463참조). 더 나아가서, R은 락탐고리에 8개 이하의 원자를 포함하는 락탐잔기, 예를들면 디아미노 카르복실산의 락탐이 될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, R은 하전되어 있지 않다.

중성 pH에서, -X²⁷-Pro²⁸-Lys²⁹-Y_m-Z_n-R의 전하는 Thr^B30-NH₂사람 인슈린 Thr^B30-OBu^t사람 인슈린, Thr^B30(Bu^t)-OBu^t사람 인슈린 및 Lys^B29-NH₂, des-(B30)사람 인슈린에서 +1이며, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Orn^B30-NH₂사람 인슈린, Thr^B30-NH₂사람 인슈린 및 Arg^B27, Thr^B30NH₂사람 인슈린에서는 +2이고, Lys^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-Lys^B31-NH₂사람 인슈린, Arg^B31-Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린, Orn^B30-Orn^B31-NH₂사람 인슈린, Dab^B30-Dab^B31-NH₂사람 인슈린 및 Dap^B30-Dap^B31-NH₂사람 인슈린에서는 +3이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, Y 및 Z로 나타낸 아미노산 잔기는 뉴클레오티드 서열에 의해 코우드된 L-아미노산으로부터의 잔기이다.

Y 및 Z로 나타낸 아미노산 잔기의 어떠한 측쇄 아미노기도 2 내지 19 탄소원자를 포함하는 산, 바람직하게는 6 내지 18 탄소원자를 포함하는 지방산, 예를들면, 라우르산에 의해 아실화될 수 있다. 따라서 -Y_m-Z_n-R은 Lys(Lau)-NH₂일 수 있다.

바람직한 알킬화 히드록시기의 예들은 메톡시, 에톡시 및 tert-부톡시이다.

한군의 일반식 I의 바람직한 화합물에서 Y 및/또는 Z는 염기성 아미노산 잔기인데, 측쇄 아미노기는 임의적으로 아실화된다(m=1). 또 다른군의 일반식 I의 바람직한 화합물에서는 n은 0이고 Y는 염기성 아미노산 잔기(m=1)이다.

또다른 균의 일반식 I의 바람직한 화합물에서는 Y 및 Z는 둘다 염기성 아미노선 잔기이다(m=1, n=1).

일반식 I의 바람직한 화합물은 각각의 다음 화합물이다 : Gln^A17, Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Gln^B13, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Lys²⁷, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Thr³⁰-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Gln^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, The^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B29-NH₂, des-(B30) 사람 인슈린, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-NH₂사람 인슈린 Lys^B30(Lau)-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-Lys^B31-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린, 또는 Arg^B30-Lys^B31-NH₂사람 인슈린.

본 발명의 또다른 구체예는 E¹, E², E³및/또는 E⁴가 글루타민 잔기이고 그리고/또는 X는 Lys 또는 Arg인 일반식 I의 화합물을 포함하는 제제이고, 일반식 I의 화합물의 이 아군내에 더 바람직한 구체예는 -Y_m-Z_n-R기가 Thr-NH₂또는 Lys-NH₂인 일반식 I의 화합물을 포함하는 제제이다. 바람직한 화합물은 Gln^B13, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린 및 Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린이다.

한군의 일반식 I의 바람직한 화합물에서는 E¹, E³및 E⁴는 각각 글루타민산 잔기이다. 또 다른군의 일반식 I의 바람직한 화합물에서는 E₂는 글루타민 잔기이다. 여전히 또다른 군의 일반식 I의 바람직한 화합물에서는 X는 알기닌 또는 리신잔기이다.

본 분야에서 공지된 바와같이, 사람 인슈린의 아미노산 잔기 모두가 다 인슈린 작용에 필수적인 것은 아니다.

참으로, 아미노산 잔기에 있어서, 사람 인슈린과는 다른 돼지 인슈린 및 소인슈린이 당뇨병을 치료하는데에 사용되었다. 인슈린 분자에 있어서 상당한 종(鍾)에 따른 변동이 존재한다. 따라서, 사람 인슈린 분자에 있어서 많은 펩티드 잔기가 분자의 등전점에 중요한 어떠한 펩티드 잔기를 포함하면서 인슈린 활성의 지나친 감소가 없이 변화될 수 있다.

E¹, E², E³및 E⁴, X, Y, Z 및 R로 나타낸 기들은 결과되는 일반식 I의 화합물이 제약상 허용되도록 선택됨이 명백하다.

공지의 2상(相) 인슈린 제제에서는 속효성, 용해성 인슈린을 연장작용을 하는 결정성 인슈린과 같은 주사액에 조합하는 것이 보통이다. 본 발명의 일반식 I의 화합물을 사용하여, 유사한 단기 및 장기의 결합된 작용을 일반식 I의 단일 화합물 용액으로 얻을 수 있다. 속효 및 장기 효과간의 비율은 용액중의 아연이온의 농도가 증가함에 따라 감소한다.

일반식I의 화합물은 돼지 인슈린 또는 그외에 정확한 인슈린 이황화 다리를 갖는 일반식Ⅱ :

B(1-12)-E³-B(14-20)-E⁴-B(22-26)-X-B(28-29)-(Qq-R)r-A-(1-3)-E¹-A(5-16)-E²-A(18-21) (Ⅱ)

여기서 괄호안에 숫자를 쓴 글자 A 및 B는 괄호안에 가리킨대로 각각 A-및 B-사슬의 적당한 펩티드 단편을 나타내며, Q는 q 아미노산을 가진 펩티드 사슬이고 q는 0 내지 33의 정수이며, R은 Lys 또는 Arg이고 r은 0 또는 1이며 E¹, E², E³, E⁴및 X는 각각 상기한 바이다)의 생합성 전구체 화합물을 일반식(Ⅲ)의 아미노 화합물 :

H-Y_m-Z_n-R (Ⅲ)

(여기서 Y, Z, R, m 및 n은 각각 상기한 바이고, 여기서 Y 및 Z의 측쇄 아미노기 및 히드록시기는 미국특허 제4,343,898에 기술된 바와같이 물과 유기용매의 혼합물에서 촉매로서 트립신 또는 트립신 유사효소를 사용하여 아미노 및 히드록시 보호기로 임의적으로 차단시킨다)과 반응시키는 펩티드 전이 반응에 의해 제조될 수 있다. 이 방법에서 사용하기 위한 일반식Ⅲ의 바람직한 화합물은 Thr-NH₂, Lys(Boc)-NH₂, Thr(Bu^t)-OBu^t, -Thr-OBu^t, Ala-NH₂및 Arg(Boc)-NH₂이다. 아미노기는 지방산과의 아실화에 의해 유도될 수 있다. 히드록시기는 알킬화에 의해 보호될 수 있다. 만일 Y와 Z는 아미노 보호기에 의해 가역적으로 차단되는 기를 포함한다면, 이들 기는 나중 단계에서, 원한다면 아미노보호된 중간체를 트립신 또는 트립신 유사 효소로부터 분리시킨 후 제거될 수 있다. 트립신 유사효소 중에는 아크로모박테르 리티커스(Achromobacter lyticus)로부터의 리실엔토펩티다제가 유용하다.

일반식Ⅱ의 화합물은 문제의 아미노산에 대한 정확한 코돈(codons)을 갖는 유전자를 사용하여 유럽 툭허출원 제 163,529의 기술내용과 유사한 이스트와 같은 숙주 유기체에서 나타난다. 다음에 신규한 인슈린 유도체를 코우드하는 유전자를 이스트에 이동되었을때 원하는 화합물을 나타낼 수 있는 알맞는 발현 벡터에 삽입한다. 다음에 발현된 생성물을 그것이 세포로부터 분지되는지 아닌지에 따라 세포로부터 또는 배양액즙(broth)으로부터 분리시킨다.

가역적인 아미노 보호기의 예는 tert-부톡시 카르보닐이며 가역적인 히드록시 보호기는 tert-부틸이다. 이러한 기는 예를들어서, 트리플루오로 아세트산에 의해 일반식 I의 화합물에 바람직하지 못한 변경을 일으키지 않는 조건하에서 제거된다.

일반식 I의 인슈린 화합물은 또한 일반식(Ⅳ)

(여기서 E¹, E², E³, E⁴및 X는 각각 상기한 바이다)의 화합물을 유럽특허 명세서 제17,938에 기술된 것과 유사한 조건하에서 트립신 또는 트립신 유사효소에 의해 위의 일반식(Ⅲ)의 아미노화합물과 짝지음시키는 짝지음 반응에 의해 제조될 수 있다.

인슈린을 유전공학에 의해 제조할때, 아미노산 아미드 또는 아미노산 에스테르로 B-사슬의 C-말단 카르복실군의 트립신 촉매 반합성(semisynthesis) 차단을 하도록 하면서 인슈린 분자 내부에, 즉 A4-, A17-, B13-, B21- 또는 B27- 위치에 추가로 하나 또는 둘의 양의 전하가 적당히 도입될 수 있다.

포유동물 인슈린의 30잔기 이외에 B-사슬을 연장시킴으로써 보다는 신규한 일반식 I의 화합물을 형성하기 위하여 인슈린 분자의 51 아미노산의 프레임내에 추가의 양의 전하를 도입하는 것의 이점은 제조의 용이성에 관련된다. 반합성 펩티드 전이에서는 많은 몰수의 과량의 아미노산 아미드 또는 아미노산 에스테르가 사용된다. 디펩티드 아미드 또는 에스테르가 펩티드 전이 반응에 사용된다면 가격이나 용해성 또는 둘다에 있어서, 많은 과량의 사용은 금지하는 것과 다름없으며, 그 결과 생성물의 수율은 더 낮아지게 된다. 유사한 조건하에 펩티드 전이반응에 같은 동물수의 과량으로 예를들면, Lys(Boc)-NH₂및 Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH₂를 사용할 때에도 아미노산 아미드로의 수율은 디펩티드 아미드로 보다는 실질적으로 더 높아진다.

본 발명의 인슈린 제조는 약간 산성의 조건 예를들면 240 또는 600nmol/ml의 농도로 수성매제에서 일반식 I의 화합물을 용해시킴으로써 제조된다. 수성매제는 예를들어서 염화나트륨 또는 글리세롤로 등장성으로 만든다. 더 나아가서, 수성매제는 인슈린 활성 단위 당 약 20㎍까지의 Zn⁺⁺농도로 아연이온, 아세테이트 및 시트르산염과 같은 완충액 및 m^-크레졸 또는 페놀과 같은 방부제를 포함할 수 있다. 용액의 pH값은 침전을 피하기 위해서 일반식 I의 화합물의 등전점에 너무 가까워지지 않게 중성을 향하여 조절된다. 최종 인슈린 제제의 pH값은 일반식 I의 화합물에서 변화된 전하의 수, 아연이연의 농도, 일반식 I의 화합물의 농도 및 선택한 일반식 I의 화합물에 의존한다. 인슈린 제제는 살균 여과에 의해 살균이 되게 만든다.

본 발명의 인슈린 제제는 공지의 인슈린 제제의 사용과 유사하게 사용된다.

여기에 기술한 어떠한 신규한 특징 또는 특징들의 조합은 본 발명에 필수적인 것으로 생각된다.

여기에 아미노산에 대해 사용한 약호는 J. Biol. Chem. 243(1968), 3558에 언급된 것들이다. 여기에 언급된 아미노산들은 L 구조로 되어 있다. 여기서 일반식 I 및 다른 것에서 A(1-3)는 Gly-Ile-Val이고, A(5-6)는 Gln-Cys등이며, 사람 인슈린의 아미노산 서열과 비교하라. 달리 표시되어 있지 않으면, 여기에 언급된 인슈린종은 사람의 인슈린이다.

인슈린 화합물의 합성

인슈린의 공급원은 돼지인슈린이거나 아니면 후기하는 덴마아크 특허출원에 기술된 바와같이 이스트에서 발현된 인슈린 전구체이었다.

인슈린 전구체는 같은 덴마아크 특허출원의 실시예7에 기술된 바와같이 Lichroprep^TMRP-18에 흡수시킴으로써 발효액즙으로부터 회수되었다. 전구체는 0.2M KCl, 33%(v/v) 에탄올중의 0.001M HCl로 컬럼으로부터 용리되었다. 인슈린 전구체는 물(푸울 부피당 1부피), 0.05M이 되도록 고체 시트르산 3나트륨, 그리고 최종적으로 0.006M이 되도록 아세트산 아연을 계속적으로 첨가함으로써 푸울(pool)로부터 결정화시켰다. pH는 6.8로 조절하였고 혼합물은 4℃에서 하룻밤 방치해 두었다. 결정은 원심분리에 의해 분리시키고 물로 세척 및 진공건조시켰다. 요소학적 반합성을 위한 보호 아미노산 및 보호 펩티드는 표준법에 의해 제조될 수 있거나 아니면 스위스 노바 바아오켐(Nova Biochem) 아니면 바켐(Bachem)으로부터 구입(주문합성)할 수 있다.

이름 뒤의^TM이라는 글자는 등록상표임을 가리킨다.

[실시예 1]

Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

7.5M 아세트산 4ml에 용해시킨 돼지 인슈린 1g의 용액과 N, N-디메틸 아세트아미드로 용해시켜 15ml가 되도록 한 Lys(Boc)-NH₂,CH₃COOH(N-엡실론)-Boc-L-리신아미드, 히드로아세테이트염) 6.1g의 용액을 혼합하고 혼합물을 12℃로 냉각시켰다. 0.05M 칼슘 아세테이트 용액 2.08ml의 트립신 0.1g의 용액을 가하였다. 12℃에서 96시간후, 단백질은 아세톤 200ml를 가함으로써 침전되었으며 원심분리에 의해 침전을 분리시켰다. 침전을 아세톤 100ml로 1회 세척하고 원심분리에 의해 분리시키고 진공건조시켰다.

침전을 에탄올/물(부피당 28/72부)중의 0.01N염산 50ml에 용해시키고 용액을 옥타데실디메틸 실릴(평균 입자크기 15미크론, 기공크기 100옹스트롬)로 치환된 실리카 입자로 충전된 5×30cm 예비 고압액체 크로마토 그라피(이후부터 HPLC라 칭한다)에 적용시켰다. 컬럼을 비율 38/62(부/부피)인 에탄올/황산으로 pH3.5로 조절된 0.2M 황산암모늄 용액으로 평형화시켰다. 단백질을 2리터/시간의 속도로 같은 완충액으로 컬럼으로부터 용리하였다. Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린은 미반응 돼지 인슈린의 용리후 60과 75분 사이에 컬럼으로부터 용리하는 것이 피이크에서 발견되었다. 에탄올을 진공 증발시키고, 부피가 약 125ml로 감소될때까지 증발을 계속하였다. Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린을 아세톤 25ml, 시트르산(일수화물 p. a.) 100mg과 염화아연(p. a.) 9mg의 연속적인 첨가에 의해 분리시켰다. pH를 6.5로 조절하고 실온에서 1시간 후 온화한 교반으로 4℃에서 24시간동안 결정화를 계속하였다. 결정을 가라앉히고, 빙냉수 5ml로 1회 세척하고 가라앉히고 진공건조시켰다.

수율 : Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린 456mg.

Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린(456mg)을 트리플루오로 아세트산 15ml에 용해시키고 실온에서 3시간동안 두었다. 트리플루오로 아세트산을 동결건조에 의해 제거하였다. 동결건조물을 물 50ml에 용해시키고 pH를 2.5로 조절하고 염화나트륨 10g을 가하였다. Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 염케익을 원심분리에 의해 분리시켰다. 염케익을 물 125ml에 용해시키고 Lys^B30-NH₂사람 인슈린을 아세톤 25ml, 시트르산 100mg (일수화물 p. a.) 및 염화아연(p. a.) 9mg을 연속첨가하고 pH를 7.0으로 조절함으로써 결정화시켰다. 실온에서 1시간후, 온화하게 교반하면서 4℃에서 24시간동안 결정화를 계속하였다. 결정을 가라앉히고 빙냉수 5ml로 1회 세척하고 다시 가라앉히고 건조시켰다.

수율 : 미정제 Lys^B30-NH₂사람 인슈린 387mg.

결정을 에탄올/물(20/80, 부/부피)중의 0.005N 염산 50ml에 용해시키고 용액을 상기한 바와같이 예비 HPLC컬럼에 가하고 이번에는 35.5/64.5(부/부피) 비율의 에탄올/염화칼륨 0.3M 용액과 0.001N 염산으로 평형화시켰다. 2리터/시간의 속도로 같은 완충액으로의 용리는 55와 90분 사이의 컬럼으로부터 나타나는 Lys^B30-NH₂피이크를 가져왔다. 생성물을 위의 Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린에 대해 기술한 바와같이 푸울로부터 분리시키되 시트르산염 완충액을 포함하는 아연에서의 결정화에 있어서 pH를 6.5가 아닌 7.0으로 조절하였다.

수율 : 순수 Lys^B30-NH₂사람 인슈린 262mg.

아미노산 조성물은 알라닌이 1잔기/분자이고 리신이 2잔기/분자로서 이론과 일치하였다. 생성물은 pH8.9에서 디스크 페이지(DISC PAGE) 전기영동에서 이동속도가 약 2의 전하차이에 해당하는 돼지 인슈린의 이동속도의 55%로 하여 순수하였다. 디스크 페이지 전기영동의 상세한 것에 대해서는 Horm. Metab. Res. Supplement Series No. 5(1974), 134.를 참조하라.

[실시예 2]

Arg^B30-NH₂사람 인슈린과 Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린의 합성

아세트산 3.32ml중의 돼지 인슈린 1g의 용액과 N, N-디메틸포름 아미드로 용해시켜 10ml로 한Arg-NH₂, (CH₃COOH)₂(L-알기닌 아미드 디히드로 아세테이트염) 3.9g의 용액을 혼합하고 혼합물을 12℃로 냉각시켰다. 0.05M 아세트산 칼슘용액 1.2ml중의 트립신 0.1g의 용액을 가하였다. 12℃에서 144시간후, 아세톤 200ml중의 첨가에 의해 단백질을 침전시키고 침전을 원심분리에 의해 분리시켰다. 침전을 아세톤 100ml로 1회 세척하고, 원심분리에 의해 분리시키고 진공건조시켰다.

침전을 에탄올/물(27/73 부/부피)중의 0.01N 염산 50ml에 용해시키고 실시예 1에 기술된 바와같은 예비 컬럼에 단백질을 가하였다. 먼저, 에탄올/0.3M 염화칼륨 용액과 0.001N염산, 36/65(부/부피) 비율로 구성된 용리액을 2리터/시간의 속도로 4시간동안 펌프로 보내었다. 세개의 미분해 피이크가 바로 60 내지 120분, 120 내지 150분 및 150 내지 180분에 기록되었다. 세 푸울의 단백질은 바로 실시예1에 Lys(Boc)^B30-NH₂에 대해 기술된 바와같이 분리되었다.

수율 :푸울 I, Ⅱ 및 Ⅲ 각각에 대해 414mg, 142mg, 및 107mg.

디스크 페이지 전기영동과 결합된 아미노산 분석은 푸울 I의 인슈린 분자가 몇몇의 알기닌 잔기와 짝지음 되었음을 나타내었다. 푸울 Ⅱ의 주성분은 단일 알기닌 아미드 잔기, 즉 Arg^B30-NH₂사람 인슈린에 인슈린 짝지음되었다. 푸울 III은 돼지 인슈린, des(B30) 사람 인슈린, Arg^B30사람 인슈린 및 Arg^B30-NH₂사람 인슈린의 혼합물이었다.

Arg^B30-NH₂사람 인슈린

푸울 Ⅱ의 단백질은 pH2에서 에탄올/물 3/2(v/v) 10ml에 용해시켰다. EDTA 12mg의 첨가후 0.1N 수산화나트륨 용액으로 pH를 10으로 올렸다. 용액을 0.5M NH₃, 0.05N 염산 및 60%에탄올(v/v)중의 0.04M 염화나트륨 용액으로 구성된 완충액으로 평형시킨 QAE-세파덱스 A-25의 2.5×25cm컬럼에 용액을 가하였다. 컬럼을 pH는 약 10.0으로 일정하게 유지하면서 용리액 총 1리터를 사용하여 0.04M 내지 0.1M의 염화나트륨 선형구배로 30ml/시간으로 용리시켰다.

10ml 분율을 수집하였다. Arg^B30-NH₂사람 인슈린은 Nos58-74 분율에서 컬럼으로부터 나타났다. 생성물을 증발에 의해서 푸울로부터 분리시키고 이어서 실시예1의 Lys^B30-NH₂에 대해 기술한 바와같이 15% 아세톤(v/v)을 포함하는 시트르산염 완충액을 포함하는 아연중에서 pH7에서 결정화시켰다.

수율 : 53mg.

생성물은 이동속도는 인슈린 이동속도의 55%이면서 pH8.9에서 디스크 페이지 전기영동에서 균일하였다. 아미노산 조성은 Arg^B30-NH₂사람 인슈린에 대한 이론과 일치하여 인슈린 분자량 2개의 알기닌 잔기와 1개의 알라닌 잔기를 나타내었다.

Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린

푸울 I의 단백질을 용해시키고 푸울 Ⅱ의 단백질에 대해 기술한 바 대로 QAE-세타덱스^TMA-25상의 이온 교환 크로마토그래피를 시켰다. Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린은 분율 Nos 34-47의 컬럼으로 부터 나타났다. 생성물을 실시예 1의 Lys^B30-NH₂사람 인슈린에 대해 기술한 바와같이 분리하였다.

수율 10mg

생성물은 이동속도는 인슈린 이동속도의 35%이면서 pH8.9에서 디스크페이지 전기영동에서 균일하였다. 아미노산 조성은 인슈린 분자당 3개의 알기닌 잔기와 1개의 알라닌 잔기를 나타내었다.

[실시예 3]

Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

10M 아세트산 5ml중의 돼지 인슈린 1g의 용액과 N, N-디메틸 아세트아미드와 현탁시켜 13ml의 부피로 만든 Thr-NH₂(L-트레오닌 아미드, 유리염기)2.365g의 현탁액을 혼합하였다. 혼합후, Thr-NH₂를 용해시켰다. 혼합물을 12℃로 냉각시키고 0.05M 아세트산 칼슘용액 2ml 중의 트립신 0.1g의 용액을 가하였다. 12℃에서 72시간후, 아세톤 200ml의 첨가에 의해 단백질을 침전시켰고 원심분리에 의해 침전을 분리하였다. 침전을 아세톤 100ml로 1회 세척하고 원심분리에 의해 분리시키고 진공건조시켰다.

트립신 및 미반응 돼지 인슈린으로 부터 Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 정제를 사람 인슈린의 에스테르에 기술된 대로 수행하였다(Markussen : Methods in Diabetes Research, Vol. 1, Editors : Larner ＆ Pohl(1984), 408).

수율 : 599mg

생성물은 이동속도가 인슈린 이동속도의 75%이면서 PH8.9에서 디스크 페이지 전기영동에서 뉴일하였다. 아미노산 조성은 이론과 일치하여 인슈린 분자당 3개의 트레오닌 잔기와 1개의 알라닌 잔기이었다.

실시예 4에서 10의 출발물질에서 일반식Ⅱ의 (Q_q-R)_r을 Ala-Ala-Lys에 선택하고 덴마아크 특허출원 No. 582/85의 실시예 10의 이스트 플라스미드 pMT610에 대해 기술된 대로 만들었다. Gln^B13, Gin^A17, Arg^B27및 Lys^B27에 대해 코우드하는 뉴클레오티드를 Nucl. Acids. Res. 11(1983), 5103-5112의 방법을 사용하면서 부위 특이성 전이유 방법에 의해 pMT610으로 치환하였다.

[실시예 4]

Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

아세트산/DMF/물(아세트산 11.4ml, DMF 65.1ml, 물 전체합해서 100ml되게)15ml중의 Gln^A17, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)인슈린 전구체 3.12g의 현탁액에 DMF중의 1M Thr-NH₂30ml를 가하였다. 혼합물을 12℃로 냉각시키고 0.05M 아세트산칼슘 7.5ml에 용해된 돼지 트립신 0.3g을 가하였다. 인슈린 전구체가 용해될 때까지 교반을 계속하였다. 12℃에서 48시간 후 아세톤 400ml의 첨가에 의해 단백질을 침전시켰다. 단백질을 원심분리에 의해 분리시키고 아세톤 100ml로 1회 세척하고 진공 건조시켰다.

침전을 0.04N HCl 70ml에 용해시키고 pH를 2.5로 조절하고 유도체를 실시예 1에 기술된 대로 HPLC로 정제하되 에탄올 35부와 0.3M KCl 65부로 구성된 용리액을 용리에 사용하였다. 약 세컬럼 부피후에 컬럼으로 부터 유도체가 나타났고, 그것은 물 1부피, 0.05M이 되도록 고체 시트르산 삼나트륨 그리고 0.006M이 되도록 고체 아세트산 아연을 연속적으로 첨가함으로써 분리시켰다. pH를 6.5로 조절하고 4℃에서 하룻밤 교반후, 원심분리에 의해 결정을 수집하고 물로 세척, 건조시켰다.

수율 : 1.64g=53%

사람 인슈린 에스테르에 대해 기재된 대로(Markussen, ibid, 410 참조)음이온 교환 크로마토 그라피에 의해 더 정제하였다.

최종수율 : 1.15g=37% 생성물은 pH 8.9에서 디스크 페이지 전기영동에서 이동율은 인슐린 이동속도의 55%이면서 거의 균일하였다. 분석 역상(reverse-phase) HPLC(Markussen ibid, 410)에서 생성물은 돼지 인슈린과 거의 같은 이동속도로 용리한다. 순도는 약 95%로 발견되었다. 아미노산 조성분석은 제안된 식과 일치성을 나타내었다.

[실시예 5]

Gln^A17, Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

아세트산/DMF/물(아세트산 4.57ml, DMF 71.9ml, 물로 100ml로 함) 15ml중의 Gln^A17, B(1-29)-Ala-Ala- Lys-A(1-21)3.15g의 현탁액에 DMF중의 0.4M Lys(Boc)-NH₂30ml를 가하였다. 혼합물을 12℃로 냉각시키고 0.05M 아세트산칼슘 7.5ml에 용해시킨 트립신 0.3g을 가하였다. 인슈린 전구체가 용해될때까지 교반을 계속하였다. 12℃에서 48시간후 실시예 4에 기술된 대로 단백질을 분리하였다.

침전은 0.40N HCl 70ml에 용해시키고 pH를 2.5로 조절하고 Gln^A17, Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린을 실시예 1에 기술되대로 HPLC로 정제하되, 에탄올 37부, 0.03M KCl 63부로 구성된 용리액 2.3ℓ, 0.001N HCl로 용리를 수행하고, 이어서 에탄올 39부와 수성 0.3M KCl 61부로 구성된 용리액, 0.001N HCl로 용리하였다. 유도체는 용리액의 변화 25분후 나타났고 실시예 4의 Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린에 대해 기술된 대로 분리시켰다.

Gln^A17, Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린 90mg의 수율=29%

Gln^A17, Lys(Boc)^B30-NH₂사람 인슈린(1.55g)을 트리플루오로아세트산(TFA) 30ml에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 두었다. TFA는 동결건조에 의해 제거하였다. 잔유물을 물 15ml에 용해시키고 pH를 1N NaOH로 3으로 조절하고 에탄올 22ml를 가하였다. 0.01M시트르산, 0.03M NaCl, NaOH로 4.5로 조절된 pH로 이루어지는 에탄올/물 3/2(v/v) 완충액으로 평형화시킨 SP-세파덱스^TMC-25의 2.5×20cm컬럼에 용액을 적용하였다. 컬럼을 총 1.6ℓ의 용리액으로 0.03M 내지 0.4M의 NaCl의 선형 구배를 사용하여 같은 완충액으로 용리시켰다. 구배가 0.2M NaCl에 이르렀을때 440ml에서 유도체가 용리하였다. 그것을 물 1100ml, 0.05M이 되도록 고체 시트르산 삼나트륨, 그리고 0.006M이 되도록 고체 아세트산 아연을 첨가함으로써 결정화시켰다. 최후에 pH를 6.8로 조절하였다. 4℃에서 하룻밤 교반후 원심분리에 의해 결정을 분리시키고, 물로 1회 세척하고 진공건조시켰다.

수율 : 100g,

마지막 단계를 거쳐 65%에 해당하고 Gln^A17, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)인슈린 전구체로 부터 19%에 해당함, 생성물은 pH8.9에서 디스크페이지 전기영동에서 거의 균일하였으며 이 등속도는 인슈린 이동속도의 35%이었다. 분석 HPLC에서 생성물은 돼지 인슈린 이전에 나타나고 순도는 약 97%이다. 아미노산 조성 분석은 분자당 2개의 리신 잔기를 나타내었고 다른 것은 사람 인슈린과 동일하다.

[실시예 6]

Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

아세트산/물/DMF(아세트산 11.4ml, 물 35ml, 100ml가 되도록 DMF) 18ml중의 Arg^B27, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 인슈린 전구체 3.8g의 현탁액에 DMF중의 1M Thr-NH₂36ml를 가하였다. 혼합물을 12℃로 냉각시키고 0.05M 아세트산칼슘 6.84ml중의 돼지 트립신 0.38g을 가하였다. 12℃에서 48시간후 실시예 4에 기술된 대로 아세톤으로 단백질을 침전시켰다.

유도체를 먼저 에탄올 35부와 수성 0.3M KCl 65부로 구성된 용리액 1800ml, 0.001N HCl, 이어서 에탄올 37부와 수용액 63부로 구성된 용리액을 사용하여 실시예 1에 기술된 대로 HPLC에 의해 정제하였다. 유도체는 용리액의 이동 10분후 나타났고 실시예 4에서 Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린에 대해 기술한 대로 분리시켰다. 최종적으로 실시예 5에서 Gln^A17, Lys^B30-NH₂사람 인슈린에 대해 기술된 대로 SP-세파덱스^TMC-25 컬럼상에서 정제하였다.

Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 수율은 1.63g으로 43%에 해당되었다. 본질적으로 디스크 페이지 전기영동에 하나의 띠가 나타났고 이동속도는 인슈린의 이동속도의 55%이었다. 분석 HPLC에서 생성물은 돼지 인슈린 전에 나타나고 순도은 약 96%이다. 아미노산 조성분석은 분자당 2개의 알기닌 잔기를 나타내고 다른 것은 사람 인슈린과 동일하다.

[실시예 7]

Arg^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 Arg^B27, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 3.61g으로 부터 화합물을 합성하였다. Arg^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 78g의 수율=22% 인슈린 이동거리의 35%를 이동하는 디스크 페이지 전기 영동에서 하나의 주띠와 2개의 작은 띠가 보여진다. 분석 HPLC에서의 순도는 92%, 생성물은 돼지 인슈린 이전에 나타난다. 아미노산 조성분석은 분자당 2개의 알기닌과 2개의 리신잔기를 나타내고 다른 것은 사람 인슈린과 동일하다.

[실시예 8]

Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

실시예 6에 기술된 방법을 사용하여 Lys^B27, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 인슈린 전구체 7.0g으로 부터 화합물을 합성하였다. Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 수율은 3.15g으로 45%에 해당하였다. 디스크 페이지 전기 영동은 하나의 주띠와 두개의 보다 작은 띠를 나타내었고, 주띠는 인슈린 대조표준띠의 거리의 55%를 이동한다. 분석 HPLC의 순도는 96%이었고, 화합물은 돼지 인슈린에 훨씬 앞서 이동한다. 아미노산 조성 분석은 분자당 3개의 리신 잔기를 나타내었고 다른것은 사람 인슈린과 동일하다.

[실시예 9]

Lys^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

실시예 5에 기술된 방법을 사용하여 Lys^B27, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 인슈린 전구체 7.0g으로 부터 화합물을 합성하였다. Lys^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린의 수율은 1.57g으로 22%에 해당하였다. 디스크 페이지 전기영동은 하나의 주띠와 두개의 보다 작은 띠를 나타내었고, 주띠는 인슈린 대조표준띠의 거리의 35%를 이동한다. 분석 HPLC의 순도는 94%이었고 화합물은 돼지 인슈린에 훨씬 앞서 이동한다. 아미노산 조성 분석은 분자당 3개의 리신 잔기를 나타내었고 다른 것은 사람 인슈린과 동일하다.

[실시예 10]

Gln^B13, Thr^B30-NH₂사람 인슈린의 합성

실시예 6에 기술된 방법을 사용하여 Gln^B13, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) 3.05g으로 부터 화합물을 합성하였다. 최종 생성물의 수율은 88g으로서 29%에 해당하였다. 디스크 페이지 전기영동은 돼지 인슈린 이동의 55%를 이동하면서 하나의 주띠를 나타내었다. HPLC에 의한 순도는 95%이었고 화합물은 돼지 인슈린 뒤에 용리된다. 아미노산 조성분석은 사람 인슈린의 조성과 같음을 나타내었다.

[실시예 11]

일반식 I의 화합물의 주입가능한 용액의 제조

연장 작용정도의 시험을 위한 일반식 I의 화합물의 살균한 주입가능 용액을, 이소토니컴으로서 9%(w/v) 염화나트륨과 방부제로서 15%(v/v) m=크레졸을 사용하여 만들었다. 주입가능 용액을 또한 이소토니컴으로서 1.6%(w/v) 글리세롤을 사용하고 방부제로서 0.3%(w/v) 크레졸을 사용하며 0.01M 아세트산 나트륨으로 완충화하여 만들었다. 아연 이온의 농도는 0 내지 160㎍/ml로 변화시켰다. 용액의 pH값은 4℃로 저장시 깨끗하게 용액을 보존하기 위해 일반식 I의 화합물의 등전점을 충분히 조절하였다. 용액은 일반식 I의 화합물 240nmol/ml를 포함하였다. 이들 유도체에 대한 6100의 돼지 인슈린 물 흡광계수를 사용하고(Handbuch der Inneren Medizin, Vol. 7/Part 2A, Editor : Oberdisse, 1975, 113참조) 28.5U/mg 건조물질의 단일성분 돼지 인슈린을 위한 기존의 효능을 사용하여(Diabetes Care, Vo1. 6/Supplement 1(1983), 4참조), m^-크레졸이 없는 더 농축된 비축용액의 276nm에서의 흡광도의 측정에 의해 240nmole/ml의 농도가 확립되었다. 1U는 5.95nmole에 해당한다. 표 1에 언급된 일반식 I의 화합물 240nmole/ml를 포함하고 표에 언급된 pH값과 아연함량을 갖는 주입가능 용액을 만들었다.

인슈린 효과의 연장작용시험

인슈린의 주입가능 용액에 의해 생성된 저혈당 효과의 연장작용은 금식한 토끼에서 British Pharmacopoeia 1980, A142에 따라 시험하였다. 각 시험용액을 중량이 3-4kg인 6 또는 12마리의 토끼로 마리당 15.5nmole의 투여량으로 피하 투여하였고 저혈당중의 과정이 6시간동안 이어졌다. 비교용으로 속효성 제제인 Actrapid^TM돼지 인슈린을 시험에 포함시켰다. 시험결과를 표 1과 2에 나타내었다.

토끼에서 일정한 화합물의 연장효과에 대한 시험결과를 아래의 표 1에 표시하였다. 포도당 값은 초기값의 퍼센트 포도당값의 6마리 토끼에 대한 평균이다. 용액은 방부제로서 0.15%(v/v) m^-크레졸을 사용하고 0.9% NaCl로 등장성으로 만들었다.

토끼에서 일정한 화합물의 연장효과에 대한 시험결과를 아래의 표 2에 표시하였다. 포도당 값은 초기값의 퍼센트 포도당값의 12마리 토끼에 대한 평균이다. 시험용액은 방부제로서 0.3%(w/v) m^-크레졸을 사용하고 0.01M 아세트산 나트륨으로 완충화하여 1.6%(v/v)글리세롤로 등장성으로 만들었다.

[표 2]

인슈린 화합물의 효능은 쥐혈당 고갈시험(British Pharmacopoeia 1980, A 141-142)으로 평가하였다. 표준과 다른 시간을 갖는 인슈린 효능을 측정하는 문제를 줄이기 위하여 효능결정을 위한 인슈린 용액을 아연의 첨가없이 만들었다. 용액을 276nm에서의 흡광도를 기준으로 240nmole/ml를 포함하도록 만들었다. 용액의 아연 함량은 결정성 유도체를 일으키면서 8-10g/ml이었다.

몇 인슈린 화합물의 추정효능을 아래의 표 3에 나타내었다.

[표 3]

Claims

a) 돼지 인슈린 또는 일반식Ⅱ의 화합물 :

B(1-12)-E³-B(14-20)-E⁴-B(22-26)-X-B(28-29)-(Qq-R)r-A(1-3)-E¹-A(5-16)-E²-A(18-21) (Ⅱ)

(여기서 A와 B는 괄호안의 숫자로 표시한 A- 및 B-사슬의 단편을 나타내고, Q는 q 아미노산을 가진 펩티드 사슬이며, q는 0 내지 33의 정수이고, R은 Lys 또는 Arg이며, r은 0 또는 1이고, E¹, E², E³, E⁴및 X는 각각 이하의 일반식I에서 정의한 대로이다)을 일반식 Ⅲ의 화합물 :

H-Y_m-Z_n-R (Ⅲ)

(여기서 Y, Z, R, m 및 n은 각각 이하의 일반식 I에서 정의한 대로이고, 여기서 Y 및 Z에 있어서, 측쇄 아미노기와 히디록시기는 아미노 및 히드록시 보호기로 차단되어 있다)과, 촉매로서 트립신 또는 트립신 유사효소를 사용하여 펩티드 전이시키거나 또는 b) 일반식 Ⅳ의 화합물 :

(여기서 E¹, E², E³, E⁴및 X는 각각 이하의 일반식I에서 정의한 대로이다)을 트립신 또는 트립신 유사효소에 의해 일반식 Ⅲ의 화합물과 짝지음시키는 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물 :

(상기 식에서 X가 트레오닌 잔기일때, E¹, E², E³및 E⁴가 모두 글루타민산 잔기는 아니며 또는 E¹, E², E³및 E⁴는 글루타민산 잔기이고 X는 트레오닌 잔기일때, 일반식 -Y_m-Z_n-R기는 -NH₂, -Arg-NH₂, -Arg-Arg-NH₂, -Arg-Lys-NH₂, -Dab-Dab-NH₂, -Dap-Dap-NH₂, -Lys-NH₂, Lys(Lau)-NH₂, -Lys-Arg-NH₂, -Lys-Lys-NH₂, -Orn-NH₂또는 -Orn-Orn-NH₂를 나타내는 조건하에, 괄호안에 숫자를 쓴 A 및 B글자는 괄호안의 숫자로 표시한 각각 A 및 B- 사슬의 펩티드 단편을 나타내며, E¹, E², E³및 E⁴는 같거나 또는 다른데 각각 뉴클레오티드 서열로 코우드될 수 있는 글루타민산 또는 중성의 아미노산 잔기를 나타내고, X는 L-트레오닌, L-알기닌 또는 L-리신 잔기를 나타내며, Y 및 Z는 같거나 또는 다르고 어떠한 측쇄 아미노기가 아실화될 수 있고 어떠한 측쇄 히드록시기가 알킬화될 수 있는 아미노산 잔기를 각각 나타내며, m 및 n은 같거나 또는 다른데 각각 0 또는 1이며, R은 B-사슬의 C-말단 카르복실기를 차단하는 아미노 또는 에스테르 잔기를 나타낸다)을 제조하는 방법.
아연을 포함하는 제1항에 의해서 제조된 일반식 I의 화합물 용액을 2mg/ml까지의 아연농도를 가진 혼합물이 되게 하면서 상기 일반식 I의 화합물을 포함하는 아연용액과 혼합하고, 두 용액 각각에서 아연의 함량이 4mg/ml 이하인 것을 특징으로 하는 상기 일반식 I의 화합물을 포함하는 연장된 인슈린 작용을 갖는 주입가능용액의 제조방법.
제1항에 있어서, E¹, E³및 E⁴는 각각 글루타민산 잔기인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, E²는 글루타민 잔기인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, Y 및/또는 Z는 측쇄 아미노기가 임의적으로 아실화되는(m=1)염기성 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물.
제1항 또는 제3항에 있어서, n은 0이고 Y는 염기성 아미노산 잔기(m=1)인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, Y와 Z는 둘다 염기성 아미노산 잔기(m=1, n=1)인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, R은 R¹과 R²가 같거나 또는 다른데 각각 수소 또는 저급알킬을 나타내는 일반식 -NR¹R²의 기이고, 바람직하게는 R은 -NH²인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물.
제1항 또는 제3항에 있어서, R은 저급알콕시, 바람직하게는 tert-부틸옥시인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, R은 락탐고리에 바람직하게는 8원자 이하를 포함하는 락탐잔기인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 화합물은 Gln^A17, Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Gln^B13, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^A17, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Arg^B27,Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Lys^B30, -NH₂사람 인슈린, Gln^B13, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B27, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B29-NH₂, des-(B30) 사람 인슈린, Thr^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-NH₂사람 인슈린, Lys^B30(Lau)-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린, Lys^B30-Lys^B31-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-Arg^B31-NH₂사람 인슈린, Arg^B30-Lys^B31-NH₂사람 인슈린인 것을 특징으로 하는 일반식 I의 화합물을 제조하는 방법.