CS259536B2

CS259536B2 - Method of insulin's new derivatives production

Info

Publication number: CS259536B2
Application number: CS861666A
Authority: CS
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1985-03-12
Filing date: 1986-03-11
Publication date: 1988-10-14
Also published as: NO860920L; AU5449586A; DK107086D0; NZ215445A; DE3685668T2; FI861007A0; DE3685668D1; DK158677B; ES552879A0; EP0194864B1; ZA861432B; YU34586A; ES8800276A1; KR930007433B1; CN86101489A; NO172441C; AU612964B2; PH24260A; DD244345A5; PT82173A

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových insulinových derivátů, které je možno zpracovat na. farmaceutické prostředky pro injekční podání s prodlouženým účinkem.

Při léčbě cukrovky již byla navrhována a užívána celá rada prostředků s obsahem insulinu. Některé z těchto prostředků mají rychlý účinek, jiné mají více nebo měně prodloužený účinek. Obvykle se požadují prostředky, jejichž působení je více nebo méně dlouhodobé. Prodloužený účinek je možno získat například tak, že se insulin podává ve formě krystalické suspenze. Krystalické prostředky je možno získat tak, že se insulin nechá krystalizovat za přítomnosti zinku (tímto způsobem se získá například prostředek Leňte™, popsaný v publikaci Schlicktkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biclogical Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) nebo krystalizací insulinu za přítomnosti zinku a protaminu [NPH-insulin, popsaný v publikaci Rep. Stěno Mem. Hosp. 1 (1946), 60].

Jednou nevýhodou při použití známých suspenzí krystalů zinkinsulinu nebo zinkprotamininsulinu je potřeba protřepat lahvičku s lékem, aby bylo jisté, že se vstříkne správné množství insulinu a že koncentrace insulinu v lahvičce zůstane stejná v průbě2 hu jeho použití. V Penvill™-lahvičkách, které musí být uchovávány za nepřístupu vzduchu je zapotřebí vložit do lahvičky tělísko, aby bylo možno zajistit promíchávání suspenze insulinu. Protřepávání suspenzí insulinu a roztoku insulinu se vzduchem je nežádoucí již z toho důvodu, že insulin má tendenci ke svému znehodnocení tvorbou vláken na rozhraní mezi vodou a vzduchem. Z uvedených důvodů by bylo žádoucí získat prostředky s prodlouženým účinkem insulinu ve formě roztoků.

Roztoky insulinových derivátů s prodlouženým účinkem byly získány z insulinu, který byl modifikován na svých aminoskupinách reakcí s fenylisokyanátem (tzv. isoinsulin, který byl popsán v publikaci „Hallas-Moeller“ Chemical and Biological Insulin Studies based upon the Reaction between Insulin and Phenylisocyanate, Copenhagen 1945). Podobně Al,B29-di-Boc- substituovaný insulin (Boc znamená terciární butyloxykarbonylovou skupinu) má prodloužený účinek po podkožním podání, jak bylo popsáno v publikaci Geiger a Enzmann: v: Proinsulin, Insulin, C-peptide Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima 1978; Amsterdam—Oxford 1979, 306—310). Al,B29-di-Boc-insulin má příliš málo prodloužený účinek, aby mohl být užit klinicky.

Roztoky nemodifikovaný typů insulinů vyžadují velké množství iontů zinku, například 0,4 až 1 mg na jednotku insulinu к získání prodlouženého účinku, jak bylo popsáno, v J. Pharmacol. 55, (1935), 206. Injekční podání tak velkého množství iontů zinku je bolestivé a z tohoto důvodu nebyly roztoky tohoto typu nikdy užívány к léčebným účelům.

Isoelektrický bod insulinu je přibližně 5,5 a byly proto, prováděny pokusy snížit rozpustnost insulinových derivátů při neutrálním pH 7 posunutím isoelektrického bodu směrem vzhůru, například tak, že se na N-terminální zakončení řetězce В přidá bazická aminokyselina, například lysin nebo arginin, jak bylo· popsáno například v NSR vykládacím spisu č. 2 042 299 nebo se užije к témuž účelu bazického dipeptidu arginylargininu, jak bylo< popsáno ve svrchu uvedené publikaci Gaigera a Enzmanna.

Rozpustnost této sloučeniny, které se označuje jako Arg^B(’ⁿ—Arg^B0-insulin v blízkosti jeho isoelektrického bodu bylo však mnohem vyšší než u původního insulinu.

Japonská zveřejněná patentová přihláška č. 55-144 032 se týká analogů lidského insulinu, v nichž byla aminokyselina v poloze B30 nahrazena aminokyselinou s alespoň pěti atomy uhlíku, popsány jsou rovněž amidy a estery tohoto insulinového derivátu. Uvedené látky jsou určeny pro použití u nemocných, kteří si vytvořili protilátky proti insulinovým derivátům savců. Ve svrchu uvedené japonské přihlášce je popsáno šest specifických sloučenin, žádná z nich však nemá prodloužený účinek. V přihlášce není rovněž popsán žádný specifický farmaceuticky prostředek, určený pro injekční podání.

Dále jsou popsány analogy insulinu, v nichž je na aminokyselinu v poloze B30 navázána bazická organická skupina, čímž se molekule uděluje kladný náboj při neutrálním pH. V těchto sloučeninách je aminokyselina v poloze B30 neutrální a jde s výhodou o threonin stejně jako v lidském in sulinu. NSR zveřejněná patentová přihláška č. 3 327 709 se týká suspenze krystalů derivátů, uvedených výše a aromatického hydroxyderivátu této látky.

V NSR zveřejněné patentové přihlášce č. 3 326 473 je popsán farmaceutický prostředek, který obsahuje směs insulinových sloučenin.

Vynález se týká způsobu výroby nových analogů lidského insulinu, které se od lidského insulinu liší tak, že

a) obsahují zbytek amidu nebo zbytek esteru na C-terminální karboxylové skupině řetězce В a

b) mají alespoň o jeden náboj víc než lidský insulin, při pH 7, s výhodou nejvýše o čtyři náboje více než lidský insulin při pH 7.

Změna náboje se dosahuje blokováním karboxylové skupiny aminokyseliny v poloze B30 a v případě potřeby substitucí jedné nebo většího^ počtu aminokyselin lidského insulinu.

Sloučeniny, které je možno získat způsobem podle vynálezu je možno charakterizovat následujícím způsobem: na jednom nebo větším počtu čtyř zbytků kyseliny glutamové v poloze A4, A17, B13, B21 se nachází jiná v přírodě se vyskytující neutrální aminokyselina, s výhodou glutamin a/nebo je na threoninovém zbytku v poloze B27 zařazena v přírodě se vyskytující bazická aminokyselina, s výhodou L-arginin nebo L-lysin a/nebo je threoninový zbytek v poloze B30 nahrazen jedním nebo dvěma zbytky bazických aminokyselin, s výhodou jedním tímto zbytkem a N-terminální karhoxylová skupina v řetězci В je chráněna.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu je možno zpracovávat na roztoky s řízenou hladinou iontů zinku. Tímto způsobem je také možno řídit prodloužený účinek insulinu.

Předmětem vynálezu je způsob výroby nových derivátů insulinu obecného vz-rce I

A (1-3) —E¹—A (5—6) — Cys—A (8—16) —E²—A (18—19) —Cys- - Asn

II ss

II

B(l—6)—Cys—B(8 —12)— E³—B(14—18)—Cys

I

R—Z„—Y_m—Lys—Pro—X—B(26—22)-E^z‘-Gly (A-řetězec) (I) (B-retězec)

259538 kde n a m nezávisle na sobě mají hodnotu U nebo 1,

А а В následované čísly v závorkách znamenají peptidové fragmenty, řetězců A a D, s délkou uvedenou čísly v závorkách,

E’, E², E³ a E⁴, stejné nebo· různé, znamenají zbytek kyseliny glutamové nebo zbytek neutrální aminokyseliny ze skupiny glycin, valin, isoleucm, leucin, fenylalanin, tyrosin, methiomn, asparagin, glutamin, alanin, šeřin nebo threonin, pro niž může být kódem nukleotidový sled,

X znamená zbytek L-threoninu, L-argininu nebo L-lysinu,

Y a Z, stejné nebo různé znamenají zbytek aminokyseliny glycinu, valinu, isslem cinu, ieucinu, fenylalaninu, tyrosinu, methioninu, asparaginu, glutaminu, alaninu, šeřinu, threoninu, argininu, ornithinu, lysinu, kyseliny alfa,gamma-diammomáselné nebo kyseliny alfa,beta-diaminopropionové, přičemž kterákoliv aminoskupina postranního řetězce může být acylována kyselinou o 2 až 18 atomech uhlíku a kterákoliv hydroxyskupina postranního řetězce může být alkylována alkylovým zbytkem o 1 až 4 atomech uhlíku, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci insulin vepře nebo sloučenina obecného vzorce JI

B(l—12)— E³—B(14—20) — E'--B(22—26) — —X—B—(28—29) — (Q_q—R)-A(l—3) — —E^J—A(5—16)—E²—A(18—21) (II) kde

А а В znamenají fragmenty řetězců A a B, jejichž délka je uvedena čísly v závorkách.

E^}, E², E³ a E⁴ mají svrchu uvedený význam,

Q znamená peptídový řetězec s q-aminokyselinami, q znamená celé číslo· 0 až 33.

R znamená skupinu —NR’R², v níž R¹ a R², stejné nebo různé znamenají atm vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 6 atomech uhlíku nebo zbytek laktamu o nejvýš 7 atomech v kruhu.

r znamená celé číslo 0 nebo 1, působením sloučeniny obecného vzorce III

Η -Υ., -Ζη- -R (III) kde

Y. Z, R, m a n mají svrchu uvedený význam, přičemž kterákoliv aminokyselina a hydroxylová skupina postranního řetězce v substituentech X a Z je popřípadě chráněná příslušnými ochrannými skupinami, při použití trypsinu nebo· trypsinu podobného enzymu s výhodou proteázy z Achromobac ter lyticus jako katalyzátoru, při teplotě nejvýše 50 °C.

Podskupinou sloučenin obecného vzorce I jsou nové sloučeniny vzorce I, v nichž písmena A a B, následované čísly v závorkách znamenají peptidové fragmenty řetězců A а В, o délce, znázorněné čísly v závorkách, E¹, E², E³ a E⁴, stejné nebo různé znamenají zbytek kyseliny glutamové nebo zbytek výše uvedené neutrální aminokyseliny, pro níž může být kódem nukleotidový sled, X znamená L-threonin, I-arginin nebo L-lysin. Y a Z, stejné nebo různé, znamenají zbytek aminokyseliny, přičemž jakákoliv aminokyselina postranního řetězce může být acylována a jakákoliv hydroxyskupina postranního řetězce může být alkylována a m a n, stejné nebo různé znamenají celé číslo 0 nebo 1 a R znamená amidoskupinu nebo zbytek esteru, který obklopuje C-terminální karboxylovou skupinu řetězce В za předpokladu, že všechny zbytky E^J, E², E³ a E⁴neznamenají zbytky kyseliny glutamové v případě, že X znamená threoninový zbytek a v případě, že E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové а X znamená threoninový zbytek, znamená skupina vzorce —Y_in—Z_n—R skupiny

-NH₂, —Arg—NH₃, —Arg—Arg—NH₂, —Arg—Lys—NH₉,

Dab—Dab—NH₂, Dap—Dap—NH₂, —Lys—NH₉, —Lys(Leu)—NH₂, —Lys—Arg—NH₉, —Lys—Lys—NH₂, —Orn—NH₂ nebo —Orn— Orn—NH₂.

Ve sloučeninách obecného vzorce I je C-terminální karboxylová skupina řetězce В blokována esterovou skupinou nebo amidovou skupinou, čímž se vyloučí negativní náboj karboxylové skupiny. Změna náboje, způsobená zavedením esterové nebo amidové skupiny v poloze B30 může být dále zvýšena tak, že se threoinin v poloze B27 nahradí argininem nebo lysinem a/nebo se nahradí kterýkoliv ze čtyř zbytků kyseliny glutamové v polohách A4, A17, B13 а B21 neutrální aminokyselinou, s výhodou glutaminovým zbytkem. Mimoto je možno zavést kladný náboj bazickou aminokyselinou v poloze B30 a/nebo B31. Protože sloučeniny obecného vzorce I mohou být užívány к léčebným účelům ve formě roztoků s prodlouženým účinkem, dochází ke snížení imunogenity ve srovnání s běžně užívanými suspenzemi vepřového nebo lidského insulinu.

Stupeň prodloužení účinku, může být řízen a podporován přidáním zinečnatých iontů. '

Hlavními parametry, které řídí stupeň prodloužení účinku insulinu jsou koncentrace zinku a volba sloučeniny obecného vzorce I. V případě některých analogů, například Arg^B27,Thr^u3°—NH-j-lidského insulinu je možno dosáhnou velmi prodlouženého účinku při použití pouze tří atomů zinku na hexamerní jednotku insulinového analogu, což odpovídá 8 gg zinku v ml prostředku, který obsahuje 240 nmolů/ml. V případě jiných í;nalogů, například Lys^B3°—NH₂-Jidského insulinu se dosáhne mírnějšího prodloužení účinku při použití 30 atomů zinku na hexamer insulinu, což odpovídá 80 /zg/ml zinku v prostředku s obsahem 240 nmol/ml. Výhodné rozmezí koncentrace zinku je 0 až 2 mg/ml, s výhodou 0 až 200 ^g/ml při substituci v polohách B13 a/nebo B27, při použití jiných analogů je výhodné rozmezí 20 až .200 gg/ml.

Prodloužený účinek roztoků sloučenin obecného vzorce I za přítomnosti iontů zinku se připisuje nízké rozpustnosti těchto látek při neutrálním pH. Pouze roztoky insulinových derivátů, v nichž C-terminální zakončení řetězce В bylo blokováno, mají prodlouženější účinek než vepřový insulin Actrapid™.

Injekční roztoky podle vynálezu mají mít pH co nejblíže fyziologickému pH, horní hranicí je pH, při němž dochází к vysrážení. Stálé roztoky s obsahem přibližně 240 nmolů/ml sloučeniny obecného vzorce I byly získány při pH 5,5. Horní hranice závisí na složkách roztoku, tj. na látce, zajišťující isotonicitu roztoku, na konzervačním prostředku, na koncentraci zinku a na zvolené sloučenině obecného vzorce I. Neexistuje spodní hranice pH, avšak chemická stálost insulinových derivátů se při svém prostředí snižuje vzhledem к deamidační reakci a к tvorbě dimerů, takže je výhodné, co nejvyšší pH s^ohledem na fyzikální stálost roztoku. Ze všeho·, co bylo uvedeno vyplývá, že výhodné pH pro injekční roztoky s obsahem analogů insulinu, získaných způsobem podle vynálezu je 2,5 až 8,5, zvláště 4.5 až 8.

Analogy insulinu, získané způsobem podle vynálezu poskytují nemocným velké výhody. Při použití dvou vodných roztoků, z nichž jeden obsahuje sloučeninu obecného vzorce I a druhý sůl zinku může nemocný sám řídit požadovanou délku účinku příslušným smísením uvedených roztoků. Má tedy možnost zvolit celkový profil účinku ranní a večerní injekcí insulinu.

Roztok zinku s výhodou obsahuje 10 μν až 20 mg zinku v 1 ml. Je také možno postupovat tak, že oba zásobní roztoky obsahují zinek ve stejné nebo různé koncentraci a/nebo mohou oba zásobní roztoky obsahovat sloučeninu obecného vzorce I, při čemž může jít o stejné nebo různé analogy insulinu.

Injekční roztoky s obsahem sloučeniny, vyrobených způsobem podle vynálezu s výhodou obsahují 60 až 6 000 nmclů/ml sloučenin obecného vzorce I.

Neutrální aminokyselinou ve významu E’ až E'¹ je například glycin, valin, isoleucin, Jeucin, fenylalanin, tyrosin, methionin nebo s výhodou asparagin, glutamin, alanin, serin nebo threonin.

Příkladem substituentu R .mohou být esterové skupiny, napři!· lad nižší alkoxyskupina, s výhodou methoxyskupina, ethoxyskupina a zvláště terc.butoxyskupina, tyto skupiny jsou obvykle přítomny ve sloučeninách, které se užívají při výrobě lidského insulinu, jak bylo popsáno například v US patentovém spisu č. 4 343 898. Jde o ester typu Thr^B3°—OBu¹ -lidský insulin a Thr^B3°—OBu’lidský insulin, v nichž Bu^ť znamená terc.butyl.

R může znamenat skupinu -obecného vzorce —NR’R² kde

R^l a R² stejné nebo různé znamenají atomy vodíku nebo nižší alkylové zbytky, tj. zbytky o méně než 7 atomech uhlíku, s výhodou méně než 5 atomech uhlíku.

Příklad této skupin yje možno nalézt v analogu Thr^B3°—NH₂-lidský insulin, který je známým meziproduktem pro výrobu lidského- insulinu, popsaným v Carlsberg Res. Commun. 49 (1984), 463. Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu znamená R skupinu —NH₂. Mimo to může R znamenat zbytek laktamu, který s výhodou obsahuje v laktamovém kruhu méně než 8 uhlíkových atomů, jde například o laktam diaminokarboxylové kyseliny.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu nemá skupina R žádný náboj.

Při neutrálním pH je náboj skupiny —X²⁷—Pro²⁵—Lys²⁹—Y_[tl—Z_n—R roven ч-l ve sloučeninách Thr^B3°—NH-2-lidský insulin, Thr^B30—OBuMidský insulin, ТЬг^в30(Ви^г)—OBu^T-lidský insulin a Lys^B29—NH2, des-(B30)-lidský insulin, dále +2 ve sloučeninách Lys^B3°—ΝΗυ-lidský insulin, Arg^B3°—NH^-lidský insulin, Orn^B3°—NH)-lidský insulin, Lys^B27,Thr^B39— NHo-lidský insulin a Arg^B27,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, a +3 ve sloučeninách

Lys^B27,Lys^B3ft—NH2-lidský insulin, Lys^B27,Arg^B3°—NH2-lidský insulin, Arg^B27,Lys^B3í)—NH-2-lídský insulin, Arg^B27 Arg^B3°—NH₂-lidský insulin,

Lys^B3°— Lys^B31—NH2-lidský insulin, Arg^B3í)—LysB³¹—NH2-lidský insulin, Arg^B3°—Arg^B3i—NH2-lidský insulin, Orn^B3°—Orn^B3J—NH2,-lidský insulin, Dab^B3°— Dab^B31—NH₂-lidský insulin, a Dap^B30— Dap³³¹—NFL-lidský insulin.

Pcdle jednoho z výhodných provedení způsobu podle vynálezu jsou zbytky aminokyselin, označené Y a Z zbytky L-aminokyselin, pro něž jsou kódem nukleotidové sledy.

Jakákoliv aminoskupina postranního řetězce ve zbytcích aminokyselin, označených Y a Z může být acylována. kyselinou, která obsahuje 2 až 18 atomů uhlíku, s výhodou alifatickou kyselinou, obsahující 6 až 18 atomů uhlíku, například kyselinou laurovou. Zbytek — Y_m—Z_n—R tedy může mít například význam —Lys(Lau)—NH₂.

Příkladem výhodné alkylcvané hydroxyskupiny může být methoxyskupina, ethoxyskupina, a terc.butoxyskupina.

V jedné ze skupin výhodných sloučenin obecného vzorce I znamenají Y a/nebo Z zbytky bazických aminokyselin, v nichž je aminoskupina postranního řetězce popřípadě acylována (m = 1).

V další skupině výhodných sloučenin obecného vzorce I n = 0 a Y znamená zbytek bazické aminokyseliny (m — 1).

V další skupině výhodných sloučenin obecného vzorce I znamenají Y a Z zbytky bazických aminokyselin (m = 1), n = 1).

Z výhodných sloučenin obecného vzorce I je možno uvést náslⁿdující látky:

Gln^M7,Arg^B27,Thr^D3°—NH2-lidský insulin, Gln^A17,Gln^B13,Thr³³⁰—NH2-lidský insulin, Gln^Al7,Lys^B27,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Gln^A,7,Lys^R3°—NH2~lidský insulin,

Gln^A17 Thr^B3°—NH2-lidšký insulin, Gln^Bj3,Arg^B27,Thr^B33—NH2-lidský insulin, Gln³¹³,Lys^B27,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Gln^BJ3,Lys^R3°—NH2-lidský insulin, Gln^B|3,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Arg^B27,Arg^B3°—NH2-lidský insulin, Arg^R27,Lys^u30~NH2-lidský insulin, Arg^B27,Thr^B3°— NH2-lidský insulin, Lys³²⁷,Arg^B3í)—NH₂-lidský insulin,

Lys³²⁷,Lys³³⁰— NH2-lidský insulin, Lys^B27, Thr³³⁰—NH2-lidský insulin,

Lys^B29—NH2,des- (B30)-lidský insulin, Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Lys³³⁰— NH₂-lidský insulin,

Lys^D30(Lau) — NH2-lidský insulin, Lys^B3°—Arg^B31—NH2-lidský insulin, Lys^B3°—Lys³³¹ —NI-I2-lidský insulin, Arg^B3°—NH2,-lidský insulin,

Arg³³⁰—Arg^B31—NH2-lidský insulin nebo Arg^B3°—Lys^B31—NH2-lidský insulin.

Dalšími výhodnými sloučeninami jsou sloučeniny obecného vzorce I, v nichž E¹, E², E³ a/nebo E⁴ znamenají zbytky glutaminu a/nebo X znamená Lys nebo Arg a v této podskupině sloučenin obecného vzorce I jsou dalšími výhodnými látkami ty sloučeniny, v nichž skupina —Y_m—Z_n—R znamená —Thr—NH₂ nebo — Lys—NH_2;.

Výhodnými sloučeninami tohoto typu jsou

Gln^B13,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Gln^A17,Thr^B3°—NH2-lidský insulin, Lys^B27,Thr^B3°—NH2-lidský insulin a Arg^B27,Thr^B3°— NH2-lidský insulin.

V jedné skupině výhodných sloučenin obecného vzorce I znamenají E¹, E³ i E⁴ zbytek kyseliny glutamové.

V další skupině výhodných sloučenin obecného vzorce I znamená E² glutaminový zbytek.

V další skupině výhodných sloučenin obecného vzorce I znamená X zbytek argininu nebo lysinu.

Jak je v oboru známo, ne všechny zbytky aminokyselin lidského insulinu jsou podstatné pro insulinový účinek.

Je možno užít i vepřový insulin a insulin skotu, které se liší od lidského insulinu několika aminokyselinovými zbytky к léčbě cukrovky. Existují charakteristické mezidruhé variace v molekule insulinu. Je tedy možno řadu peptidových zbytků v molekule lidského insulinu vyměnit bez snížení účinnosti insulinu, včetně některých peptidových zbytků, které jsou důležité pro hodnotu isoelektrického bodu, molekuly.

Je zřejmé, že je nutno volit skupiny E¹, E², E³, E\ X, Y, Z a R tak, aby výsledná sloučenina obecného vzorce I byla přijatelná z farmaceutického hlediska.

Ve známých bifázických farmaceutických prostředcích s obsahem insulinu je známo· mísit rychle účinkující, rozpustný insulin s krystalickým insulinem s prodlouženým účinkem v téže injekci. Při použití sloučenin obecného vzorce I, vyrobených způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout podobného kombinovaného účinku při použití roztoku jediné sloučeniny vzorce I. Poměr mezi rychlým a pomalým účinkem se snižuje při zvyšování koncentrace zinečnatých iontů v roztoku.

Při provádění způsobu podle vynálezu jsou výhodnými sloučeninami vzorce III sloučeniny: Thr—NH₂, Lys (Boc) —NH₂, ThrfBu¹)—OBu\ Thr—OBu¹, Ala—NH₃ a Arg(Boc)—NH₂.

V případě, že Y a Z obsahují skupiny, které je možno přechodně chránit ochrannými skupinami, užívanými pro aminoskupiny, je možno tyto skupiny později odstranit v případě potřeby po izolaci meziproduktu s chráněnými aminoskupinami od trypsinu nebo podobného enzymu. Z enzymů, podobných trypsinu je možno použít například lysylendopeptidázu z Achromonacte lyticus.

Sloučeniny obecného vzorce II mohou být získány expresí v hostitelském organismu, například v kvasinkách způsobem podle zveřejněné evropské patentové přihlášky č.

259538

163 529 při použití genu se správnými kodony pro požadované aminokyseliny. Gen, který je kódem pro nový insulinový derivát, se pak včlení do vhodného vektoru pro expresi a tento vektor se pak přenese do kvasinek, kde se dosáhne exprese požadované sloučeniny. Produkt, získaný touto expresí se pak izoluje z buněk nebo z živného prostředí v závislosti na tom, zda je z buněk vylučován nebo zda vylučován není.

Příkladem vhodných reversibilně použitelných ochranných skupin pro aminoskupinu muže být terc.butoxykarbonylová skupina, příkladem ochranných skupin pro použití na hydroxylových skupinách může být terc.butylová skupina. Tyto skupiny je možno odstranit za podmínek, které nevedou к nežádoucímu porušení sloučeniny obecného vzorce I, například působením trifluoroctové kyseliny.

V případě, že se insulin získává genetickým inženýrstvím, je možno přídavné dva nebo jeden pozitivní náboj zavádět do molekuly insulinu uvnitř, tj. v poloze A4, A17, B13, B21 nebo B27, přičemž pro semisyntetický postup, katalyzovaný trypsinem se terminální karboxylová skupina na C-zakončení řetězce В blokuje amidem nebo esterem na aminokyselině.

Výhoda zavádění přídavných positivních nábojů do vzorce s obsahem 51 aminokyseliny za vzniku nových sloučenin obecného vzorce I místo prodloužení řetězce В nad 30 zbytků insulinových derivátů savců spočívá v jednoduchosti přípravy. Při polosyntetické transpeptidaci se užívá velkého molárního přebytku amidu nebo esteru aminokyseliny. V případě, že by měl být užit při této reakci amid nebo ester dipeptidu, byla by cena tohoto postupu příliš vysoká a výsledná látka by měla příliš velkou rozpustnost, mimo to by se rovněž snížily výtěžky. V případě, že se užije téhož molárního přebytku sloučeniny Lys(Boc)—NH₂ a Lys(Boc)—Lys [Boc)—NH₂ při transpeptidační reakci za normálních podmínek, je výtěžek při použití amidu aminokyseliny podstatně vyšší než výtěžek při použití amidu dipeptidu. '

Farmaceutické prostředky s obsahem sloučenin, vyrobených způsobem podle vynálezu je možno získat rozpuštěním sloučeniny obecného vzorce I ve vodném prostředí za mírně kyselého pH, například do koncentrace 240 až 600 nmolů/ml. Vodné prostředí je isotonické, isotonicita se zajistí například přidáním chloridu sodného nebo glycerolu. Mimo to může vodné prostředí obsahovat ionty zinku v kncentraci až 20 ^g zinečnatých iontů na jednotku insulinu, dále puFry, například octanový nebo citrátový pufr a konzervační prostředky, například m-krcsol nebo fenol.

Roztok se upraví na přibližně neutrální pH, aniž by se však pH příliš blížilo isoelekirickému budu sloučeniny obecného vzorce I, aby nedošlo к jejímu vysrážení. V ko nečném farmaceutickém prostředku s obsahem insulinu závisí pH na počtu nábojů, které byly ve sloučenině obecného vzorce I změněny, na koncentraci zinečnatých iontů, na koncentraci sloučeniny vzorce I a na její volbě. Insulinové prostředk se sterilizují filtrací.

Farmaceutické prostředky s obsahem analogů insulinu, připravených způsobem podle vynálezu se užívají obdobným způsobem jako známé prostředky.

Zkratky, které byly v průběhu přihlášky užity pro aminokyseliny, byly navrženy v publikaci J. Biol. Chem. 243 (1968), 3 558. Uvedené aminokyseliny mají konfiguraci L. V obecném vzorci I znamenají A(l—3) řetězec Gly— Ile—Val, A(5—6) řetězec Gin--Cyr apod., tj. vždy sled aminokyselin molekuly lidského insulinu. Insulinové deriváty jsou odvozeny od lidského insulinu, není-li výslovně uvedeno jinak.

Způsob výroby insulinových sloučenin.

Zdrojem insulinu byl insulin vepře nebo prekursor insulinu, získaný expresí v kvasinkách, jak bylo· popsáno ve svrchu uvedené dánské patentové přihlášce.

Prekursory insulinu byly izolovány z fermentačního prostředí adsorpcí na LiChroprep™ RP—18 způsobem, popsaným v příkladu 7 svrchu uvedené dánské patentové přihlášky. Prekursory byly ze sloupce výmývány 0,2M KC1 a 0,001M HC1 v 33% (objemová procenta) ethanolu. Prekursory insulinu pak byly krystalizovány postupným přidáváním vody, a to jednoho objemu vody na objem materiálu, pak byl přidán pevný citronan sodný do koncentrace 0,05M a nakonec octan zinečnatý do koncentrace 0,0006M.

Pak bylo upraveno pH na hodnotu 6,8 a směs stála přes noc při teplotě 4 °C. Krystaly byly izolovány odstředěním, promyty vodou a usušeny ve vakuu.

Chráněné aminokyseliny a chráněné peptidy pro enzymatickou semisyntézu byly buď připraveny standardním způsobem, nebo jsou běžně dodávány (Nova Biochem nebo Bachem, Švýcarsko).

TM za názvem prostředku znamenají, že běží o obchodní značku.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Syntéza Lys^B30—NH₂-lidského insulinu

Roztoky 1 g insulinu vepře, rozpuštěného ve 4 ml kyseliny octové o koncentraci 7,5M a 7,1 g Lys(Boc)—NH₂,CH₃COOH(Nepsilon—Boc—L-lysin amid, hydrogenát jako sůl) v 15 ml Ν,Ν-dimethylacetamidu se smísí a směs se zchladí na 12 °C, Přidá se 0,1 g trypsinu ve 2,08 ml roztoku octanu vá13

259336 penatého o koncentraci 0,05M. Po 96 hodinách stání při teplotě 12 °C se bílkoviny v.ysráží přidáním 200 ml acetonu a sraženina se oddělí odstředěním. Pak se sraženina promyje s 100 ml acetonu, opět se oddělí odstředěním a usuší se ve vakuu.

Sraženina se rozpustí v 50 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,01 N ve směsi ethanolu a vody v objemovém poměru 28 : 72 a roztok se nanese na sloupec preparativní vysokotlaké kapalinové chromatografie (dále HPLC) o rozměrech 5 x 30 cm s obsahem oxidu křemičitého, substituovaného oktadecyldimethylsilylovými skupinami, střední průměr částic tohoto materiálu je 15 μηι, rozměr pórů 10~⁶ cm. Sloupec se uvede do rovnovážného stavu v roztoku síranu amonného v ethanolu o koncentraci 0,2M po úpravě pH na hodnotu 3,5 přidáním kyseliny sírové, v poměru 38 : 62 objemových dílů.

Bílkoviny se za sloupce vymývají tímtéž pufrem rychlostí 2 litry za hodinu.

Lys(Boc)^B30—NH₂-lidský insulin byl nalezen ve vrcholu který se ze sloupce vymývá mezi 60. a 75. minutou, před tímto vrcholem vychází ze sloupce nezreagovaný insulin vepře. Ethanol se odpaří ve vakuu a směs se odpařuje dále až na objem 125 ml.

Lys(Boc)^B3°—NH2-lidský insulin se izoluje postupným přidáváním 25 ml acetonu, 100 mg analyticky čistého monohydrátu kyseliny citrónové a 9 mg analyticky čistého chloridu zinečnatého. Pak se pH upraví na hodnotu 6,5, směs se nechá 1 hodinu stát při teplotě místnosti a pak se nechá krystalizovat 24 hodin při teplotě 4 °C za opatrného míchání. Krystaly se oddělí odstředěním, prcmyjí se 5 ml ledové vody, opět se odstředí a usuší se ve vaku. Tímto způsobem se získá 456 mg Lys(Boc)^B30—NH3-lidského insulinu.

456 mg Lys(Boc)^B3°—NH3-lidského insulinu se rozpustí v 15 ml kyseliny trifluoroctové a směs se nechá 3 hodiny stát při teplotě místnosti. Pak se kyselina trifluoroctová odstraní lyofilizací. Lyofilizovaný materiál se rozpustí v 50 ml vody, pH se upraví na hodnotu 2,5 a přidá se 10 g chloridu sodného. Materiál s obsahem Lys^B30—NH2-lidského insulinu se izoluje odstředěním. Pak se tento materiál rozpustí ve 125 ml vody a I,ys^B30—NH3-lidský insulin se nechá vykrystalizovat postupným přidáváním 25 mililitrů acetonu, 100 mg kyseliny citrónové ve formě monohydrátu, analyticky čisté a 9 mg analyticky čistého chloridu zinečnatého, načež se pH upraví na hodnotu 7,0. Směs se nechá jednu hodinu stát při teplotě místnosti, krystalizace pak pokračuje při teplotě 4 °C celkem 24 hodin za opatrného míchání. Krystaly se odstředí, promyjí se 5 mililitry ledové vody, opět se odstředí a usuší. Výtěžek byl 387 mg surového Lys^B3í)— —NH2-lidského insulinu.

Kystaly se rozpustí v 50 ml 0,005N kyseliny chlorovodíkové ve směsi ethanolu a vo dyv objemovém poměru 20 : 80 a roztok se nanese na preparativní sloupec pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii svrchu uvedeným způsobem, sloupec je v rovnovážném stavu v ethanolovém roztoku 0,3M chloridu draselného a 0,001N kyseliny chlorovodíkové v objemovém poměru 35,5 : 64,5. Sloupec se vymývá tímtéž pufrem rychlostí 2 litry za hodinu, čímž se získá vrchol, v němž se nachází Lys^B30—NH3-lidský insulin, tento materiál se ze sloupce vymývá mezi 55. a 90. minutou. Produkty se izolují tak, jak je svrchu popsáno pro Lys(Boc)^B3°— —NH3-lidský insulin s tím rozdílem, že pH při krystalizaci z citrátsvého pufru s obsahem zinku se upraví na 7,0 a nikoliv na 6,5. Tímto způsobem se získá 262 mg čistého Lys^B3()—NH₃-lidského insulinu.

Složení aminokyselin bylo v souladu s teoretickými údaji, alanin byl přítomen v množství 1 zbytek/molekula a lysin v množství 2 zbytky/molekula. Produkt byl čistý při elektrofořeze (DISC PAGE1 při pH 8,9, rychlost postupu je 55 % ve srovnání s vepřovým insulinem, což odpovídá přibližně dvojnásobnému rozdílu v náboji. Pokud jde o uvedený typ elektroforézy, jsou podrobnosti uvedeny v publikaci Horm. Met. am. Res. Supplement Series č. 5 (1974), 134.

Příklad 2

Způsob výroby Arg^B3°—NH2-lidského insulinu a Arg^B30—Arg^B3J-— NH2-lidského insulinu

Roztoky 1 g vepřového insulinu ve 3,32 mililitrech kyseliny octové o koncentraci 8M a 3,9 g Arg—NH₂, (CH₂COOH)₂ (L-arginin amiddihydrogenacetát) v roztoku v 10 ml Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) se smísí a směs se zchladí na 12 °C. Pak se přidá roztok 0,1 g trypsinu v 1,2 ml octanu vápenatého o koncentraci 0,05M. Po 144 hodinách při teplotě 12 °C se bílkoviny vysráží přidáním 200 ml acetonu a sraženina se izoluje odstředěním. Pak se sraženina promyje 100 ml acetonu, znovu se oddělí odstředěním a usuší se ve vakuu.

Pak se sraženina rozpustí v 50 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové ve směsi ethanolu a vody v objemovém poměru 27 : 73 o koncentraci 0,01M a bílkoviny se nanesou na sloupec pro preparativní chromatografii stejně jako v příkladu 1. Nejprve se sloupec promývá ethanolovým roztokem chloridu draselného o koncentraci 0,3M a kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,001M v objemovém poměru 35 : 65, roztok se do sloupce vhání rychlostí 2 litry za hodinu celkem 4 hodiny. Získají se tri vrcholy, které se objeví mezi 60. a 120. minutou, mezi 120. až 150. minutou a mezi 150. až 180. minutou. Každý z těchto vrcholů se odděleně izoluje způsobem, který byl popsán v příkladu 1 pro Lys^B3°—NI-I₂-lidský insulin. Tímto způsobem bylo získáno 414 mg ma teriálu z vrcholu I, 142 mg z vrcholu II a 107 mg z vrcholu III.

Analýza aminokyselin, kombinovaná s elektroforézou (DISC PAGE) ukázala, že insulinové molekuly z vrcholu I byly vázány na dva nebo více argininové zbytky. Hlavní složkou materiálu z vrcholu II byl insulin, vázaný na jediný zbytek argininamidu, tj. Arg™—NH._rlidský insulin. V materiálu z vrcholu III se nacházela směs insulinu vepře, des(B30)-lidského insulinu, Arg™-lidského insulinu, Arg^B3°—NH₂-lidského insulinu.

Arg^B3Q—NH₂-lidský insulin

Bílkoviny z vrcholu II se rozpustí v 10 mililitrech směsi ethanolu a vody v objemovém poměru 3 : 2 při pH 2. Po přidání 12 miligramů kyseliny ethylendiamintetraoctové se pH upraví na 10 přidáním O,1N roztoku hydroxidu sodného. Roztok se nanese na sloupec o rozměru 2,5 x 25 cm, naplněný materiálem QAE-Sephadex A—25 v rovnovážném stavu v pufru, který obsahuje 0,5M amoniaku, 0,05N kyseliny chlorovodíkové a 0,04M roztoku chloridu sodného v 60% ethanolu (objemová procenta). Sloupec se vymývá rychlostí 30 ml za hodinu lineárním gradientem chloridu sodného od hodnoty 0,04M do 0,lM, celkem se užije 1 litr rozpouštědla, v průběhu promývání sloupce se pH stále udržuje na hodnotě 10,0. Odebírají se frakce o objemu 10 ml. Arg^B3()— —NH2-lidský insulin se nachází ve frakcích 58 až 74. Produkt se izoluje odpařením s následnou krystalizací při pH 7 v citrátovém pufru s obsahem zinku a 15 objemových % acetonu, tak, jak bylo popsáno v příkladu 1 pro Lys^ot—NH2. Výtěžek je 53 ml materiálu, který je homogenní při elektroforéze (DISC PAGE) při pH 8,9, rychlost pohyArg^B30—NH₂-lidský insulin molekula insulinu obsahovala dva zbytky argininu a jeden zbytek alaninu.

Arg^B3°—Arg^B31—NH₂-lidský insulin

Bílkoviny z vrcholu I se rozpustí a podrobí iontoměničové chromatografii na materiálu QAE-Sephadex™ A—25 stejně jako v případě bílkovin z vrcholu II. Arg^B3°— —Arg^B31—NH2-lidský insulin se nachází ve frakcích číslo 34—47. Produkt se izoluje stejným způsobem jako Lys^B3°—NH2-lidský insulin v příkladu 1. Výtěžek 10 mg.

Produkt je homogenní při elektreforéze (DISC PAGE) při pH 8,9, rychlost postupu je 35 % rychlosti insulinu. Složení aminokyselin prokazuje tři argininové zbytky a jeden zbytek alaninu na 1 molekulu insulinu.

Příklad 3

Způsob výroby Thr^B3í)—NH₂-lidského insulinu

Roztok 1 g vepřového insulinu v 5 ml ky seliny octové o koncentraci 10M a suspenze 2,365 g Thr—NH₂, (L-threoninamid ve volné formě) se uvede do suspenze tak, aby byl získán výsledný objem 13 ml v N,N-dimethylacetamidu. Thr—NH₂ se rozpustí.

Pak se směs zchladí na 12 °C a přidá se roztok 0,1 g trypsinu ve 2 ml octanu vápenatého o koncentraci 0,05M. Po 72 hodinách při teplotě 12 °C se bílkoviny vysráží přidáním 200 ml acetonu a sraženina se izoluje odstředěním. Pak se sraženina promyje 100 ml acetonu, oddělí se odstředěním a usuší ve vakuu.

Čištění Thr^B3°—NH₂-lidského insulinu od zbytků trypsinu a nezreagovaného vepřového insulinu se provádí tak, jak bylo popsáno pro estery lidského insulinu v publikaci Markussen: Methods in Diabetes Research, sv. 1, editor: Larner & Pohl (1984), 408. Výtěžek 599 mg.

Produkt je homogenní při elektroforéze (DISC PAGE) při pH 8,9 rychlost postupu je 75 % ve srovnání s insulinem. Složení aminokyselin je v souladu s teoretickou hodnotou, tj. tři zbytky threoninu a jeden zbytek alaninu na molekulu insulinu.

Ve výchozím materiálu v příkladech 4 až 10 byl pro výraz (Q_q — R)_r ve vzorci II zvolen řetězec Ala —Ala—Lys.

Nukleotidy, které jsou kódem pro Gln^B13, Gln^M7, Arg^B27 a Lys^B27 byly v· plasmidu pMT610 nahrazeny specifickou mutagenasou podle publikace Nucl. Acids. Res. 11 (1983), 5 103—5 112.

Příklad 4

Způsob výroby Gln^AJ7, Thr^B3°—NH₂-lidského insulinu

К suspenzi 3,12 g Gln^At7,BÍ l—29)—Ala — —Ala—Lys—A(1—21)-insulinového prekursoru v 15 ml směsi 11,4 ml kvseliny octové, 65,1 ml dimethylformamvlu a vody cio 100 mililitrů se přidá 30 ml 1M Thr- Níb, v dimethylformamidu. Směs se zchladí na teplotu 12 °C a přidá se 0,3 g vepřového trypsinu, rozpuštěného v 7,5 ml octanu vápenatého o koncentraci 0,05M. Směs se míchá do rozpuštění prekursoru insulinu. Po 48 hodinách při teplotě 12 °C se bílkoviny vysráží přidáním 400 ml acetonu. Bílkoviny se izolují odstředěním, promyjí se 100 ml acetonu a pak se usuší ve vakuu.

Sraženina se rozpustí v 70 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,04N, pH se upraví na 2,5 a derivát se čistí vysokorlakovou kapalinovou chromatografii, popsanou v příkladu 1, s tím rozdílem, že eluční činidlo obsahovalo 35 dílů ethanolu a 65 dílů 0,3M chloridu draselného a 0.001N kyseliny chlorovodíkové. Derivát se počal vymývat ze sloupce přibližně po 3 objemech sloupce a je možno- jej izolovat postupným přidáním jednoho objemu vody, pevného citronanu sodného do koncentrace 0,05M a pevného oc tanu zinečnatého do koncentrace 0,006M. Po; úpravě pH na hodnotu 6,5 a po míchání přes noc při teplotě 4 °C se vzniklé krystaly oddělí odstředěním, promyjí se vodou a usuší. Získá se 1,64 g materiálu, výtěžek je 53 %. Další čištění se provádí aniontoměničovou chromatografií, popsanou pro estery lidského insulinu ve svrchu popsané Markussenově publikaci na str. 410. Konečný výtěžek je 1,15 g = 37 %. Produkt je téměř homogenní při eleKíro.oréze [DISG PAGE) při pH 8,9, rychlost pohybu je 55 % rychlosti insulinu.

Jri analytické vysokotlaké kapalinové chromatografií v reversní fázi popsané v uvedené Markussenově publikaci na str. 410 se produkt vymývá téměř stejnou rychlostí jako vepřový insulin. Čistota produktu je přibližně 95 %. Složení aminokyselin odpovídá předpokládanému vzorci.

Příklad 5

Způsob výroby Gln^A,7,Lys^B3°—NH₃-lidskéh'j insulinu

К suspenzi 3,15 g Gln^AI7,B(l--29)—Ala—Ala—Lys—A (1—21)-prekursoru insulinu v 15 ml směsi kyseliny octové, dimethylformamidu a vody 4,57 ml kyseliny octové, 71,9 ml dimethylformamidu, (voda do 100 mililitrů) se přidá 30 ml Lys(Boc) — NH_? v dimethylformamidu o koncentraci 0,4M. Směs se zchladí na 12 °C a přidá se 0,3 g trypsinu, rozpuštěného v 7,5 ml octanu vápenatého o- koncentraci 0,05M. Pak se směs míchá až do rozpuštění prekursoru insulimi. Po 48 hodinách stání při teplotě 12 Ό se bílkoviny izolují způsobem, popsaným v příkladu 4.

Sraženina se rozpustí v 73 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,4N, pH se upraví na 2,5 a pak se Gln^Aj7,Lys(Bocl'^3í—NHo,-lidský insulin čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií, popsanou v příkladu 1 s tím rozdílem, že sloupec se nejprve promývá 2,3 litry rozpoštědla, sestávajícího ze 37 dílů ethanolu a 63 dílů 0,3M chloridu draselného a 0,001 N kyseliny chlorovodíkové, pak se sloupec promývá rozpouštědlem, které sestává z 39 dílů ethanolu a 61 dílu vodného· roztoku 0,3M chloridu draselného a 0,001 N kyseliny chlorovodíkové. Hledaný derivát vychází ze sloupce 25 minut po změně rozpouštědla a byl izolován podobným způsobem jako Gln^A|7,Thr^?'·⁰— —NH2-lidský insulin v příkladu 4. Výtěžek Gln^A17,Lys(Boc)^B3(,~NH2-lidského insulinu je 906 mg = 29 °/o.

1,55 g Gln^A17,Lys(Boc)™—NH₂.-lidskéno insulinu se rozpustí ve 30 ml kyseliny tri fluoroctové (TFA) a roztok se nechá stát dvě hodiny při teplotě místnosti. Pak se kyselina trifluoroctová odstraní lyofilizací. Odparek se rozpustí v 15 ml vody, pH se upraví na 3 přidáním 1N hydroxidu sodného a přidá se ml ethanolu. Roztok se nanese na sloupec o rozměrech 2,5 x 20 cm s náplní prostředku SP-Sephadex™ C—25 v rovnovážném stavu ve směsi ethanolu a vody v objemovém průměru 3 : 2 s obsahem 0,01M kyseliny citrónové, 0,03M chloridu sodného, po úpravě pH na 4,5 přidáním hydroxidu sodného. Sloupec se vymývá tímtéž pufrem při použití lineárního gradientu chloridu sodného od hodnoty 0,03M do 0,4M, užije se celkem 1,6 litrů roztoku.

Derivát se vymývá ve frakci o objemu 440 mililitrů po dosažení 0,2M chloridu sodného. Produkt krystalizuje po přidání 1100 ml vody, pevného citronanu sodného do koncentrace 0,05M a pevného octanu zinečnatého do· koncentrace 0,006M. Je možno upravit pH na hodnotu 6,8. Po míchání pres noc při teplete 4 °C se krystaly oddělí odstředěním, promyjí se vodou a usuší se ve vakuu. Tímto způsobem se získá 1,001 g krystalů, což odpovídá výtěžku 65 °/o vzhledem к poslednímu stupni a 19 % vzhledem к výchozímu Gln^{A j7},B (1—29) — Ala—Ala—Lys—A (1—21) -prekursoru insulinu. Produkt je téměř homogenní při elektrcforéze (DISC PAGE) při pH 8,9 rychlost postupu je 35 % ve srovnání s insulinem.

Při analytické vysokotlaké kapalinové chromatografií vychází produkt ze sloupce před vepřovým insulinem a jeho čistota je přibližně 97 %. Při analýze aminokyselin je možno prokázat, že molekula obsahuje dva zbytky lysinu a jinak je zcela totožná s molekulou lidského insulinu.

Příklad 6

Způsob výroby Arg^B27,Thr^B3°—NHylidského insulinu

К suspenzi 3,8 g Arg^B?7,B(l—29)—Ala- -Ala—Lys—A(1—21)-prekursoru insulinu v 18 ml směsi kyseliny octové, vody a dimethylformamidu (11,4 ml kyseliny octové, 35 mililitrů vody a dimethylformamid do 100 mililitrů) se přidá 36 ml roztoku 1M Thr— —NH₃ v dimethylformamidu. Směs se zchladí na 12 C a přidá se 0,38 g vepřového trypsinu v 6,84 ml 0,05M octanu vápenatého. Po 48 hodinách při teplotě 12 ^CC se bílkoviny vysráží acetonem způsobem podle příkladu 4.

Derivát se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií podle příkladu 1 nejprve se užije 1 800 ml rozpouštědla které sestává z 35 dílů ethanolu. a 65 dílů vodného roztoku 0,3M chloridu draselného a 0.001N kyseliny chlorovodíkové a pak rozpouštědla z obsahu 37 dílů ethanolu a 63 dílů uvedeného vodného roztoku. Derivát vychází ze sloupce 10 minut po změně rozpouštědla a izoluje se způsobem, popsaným pro Gln^Aj7,Thr™—NH₃-insulin v příkladu 4.

Nakonec se čistí na sloupci prostředku SP-Sephadex^TM C—25 tak, jak bylo pspsáno pro Gln^A17,Lys^B3°—NH₂-lidský insulin v příkladu 5.

Výtěžek Arg^B27,Thr^B30—NH₂-lidského insulinu byl 1,63 g, což odpovídá 43 °/o. Při elektrofořeze (DISC PAGE) se tvoří jediný pás, rychlost postupu je 55 % ve srovnání s insulinem. Při analytické vysokotlaké kapalinové chromatografií vychází produkt ze sloupce před vepřovým insulinem a jeho čistota je přibližně 96 %. Analýza aminokyselin prokazuje dva zbytky argininu na molekulu, která je jinak totožná s molekulou lidského insulinu.

Příklad 7

Způsob výroby Arg^B27,Lys^B30-—NH₂,-lidského· insulinu

Sloučeninu je možno získat z 3 61 g Arg^B27,B(l—29)—Ala—Ala-Lys-A( 1-21)-prekursoru insulinu při použití způsobu, popsaného v příkladu 5.

Výtěžek Arg^B27,Lys^B3°—NH₂-lidského insulinu je 0,78 g, což odpovídá 22 %. Při elektroforéze (J1ISC PAGE) vzniká jeden hlavní pás, rychlost postupu je 35 % rychlosti insulinu. Mimo to je možno pozorovat ještě dva menší pásy. Při analytické vysokotlaké kapalinové chromatografií má produkt čistotu 92 % a vychází ze sloupce před vepřovým insulinem. Při analýze aminokyselin je možno prokázat dva argininové a dva lysinové zbytky v molekule, která je jinak totožná s molekulou lidského insulinu.

Příklad 8

Způsob výroby Lys^B27,Thr^B3°—NH₂-lidského insulinu

Sloučeninu je možno získat ze 7,0 g Lys^B27,B (1—29)—Ala—Ala—Lys—A (1—21)-prekursoru insulinu při použití způsobu podle příkladu 6. Výtěžek Lys^B27,Thr^B30—NH_:i-lidského insulinu je 3,15 g, což odpovídá 45 proč. Elektroforéza (DISC PAGE) prokazuje jeden hlavní a dva menší pásy, hlavní pás má rychlost pohybu 55 % ve srovnání s pásem pro insulin. Při vysokotlaké analytické kapalinové chromatografií je čistota produktu 96 %, produkt vychází ze sloupce dříve než vepřový insulin. Při analýze aminokyselin je možno prokázat dva lysinové zbytky, jinak je molekula totožná s lidským insulinem.

Příklad 9

Způsob výroby Lys^B27,Lys^B3(l—NH₂-lidského insulinu

Sloučeninu je možno získat ze 7,0 g Lys^B27,B (1—29) — Ala—Ala—Lys—A (1—21) -prekursoru insulinu při použití způsobu podle příkladu 5. Výtěžek Lys^B27,Lys^B3°—NH₂-lidského insulinu byl 1,57 g, což odpovídá

%. Elektroforéza (DISC PAGE) má jeden hlavní pás jehož rychlost pohybu je 35 % rychlosti insulinu vepře. Dále je možno pozorovat jeden malý pás nečistoty. Čistota výsledného produktu při analytické vysokotlaké kapalinové chromatografií byla 94 °/o, sloučenina se ze sloupce vymývá daleko před insulinem vepře. Analýzou aminokyselin je možno prokázat, že molekula tohoto analogu obsahuje tři lysinové zbytky a jinak je totožná s molekulou lidského insulinu.

Příklad 10

Způsob výroby Gln^Bj3,Thr^n3B—NH₂-lidského· insulinu

Sloučeninu je možno získat z 3,05 g Gln^{B !3},B (1—29) — Ala—Ala—Lys—A (1—21) -prekursor insulinu při použití způsobu podle příkladu 6. Výtěžek výsledného produktu byl 088 g, což odpovídá 29 %. Při elektroforéze (DISC PAGE) je možno pozorovat jeden hlavní pás, jehož rychlost pohybu je 55 % rychlosti insulinu vepře. Čistota výsledného produktu byla 95 % při vysokotlaké kapalinové chromatografii, sloučenina vycházela ze sloupce později než insulin vepře. Při analýze aminokyselin je možno prokázat, že sloučenina je totožná s lidským insulinem.

Příklad 11 '

Způsob výroby injekčních roztoků sloučenin vzorce I

Sterilní injekční roztoky sloučenin obecného vzorce I pro· sledování prodlouženého účinku těchto analogů byly připravovány při použití 0,9% chloridu sodného к zajištění isotonického prostředí s přísadou 0,15 % objemových m-káresolu jako konzervačního činidla. Injekční roztoky byly rovněž připraveny v 1,6% glycerolu (hmotnostní/objemová procenta) к zajištění isotonického prostředí a 0,3 % (hmotnostní/objemová procenta) m-kresolu jako konzervačního či nidla, jako pufr se užije 0,01 M octan sodný. Koncentrace zinečnatýcli iontů byla měněna od 0 do 160 ^g/ml. Hodnoty pH roztoků byly upravovány tak, aby neležely blízko isoelektrického bodu sloučenin obecného vzorce I, tak, aby bylo možno zachovat čirost roztoků při sledování při teplotě 4 °C. Roztoky obsahovaly 240 nmolů/ml sloučenin vzorce I. Tato koncentrace byla určena měřením absorpce při 276 nm při použití koncentrovanějšího zásobního roztoku, prostého- m-kresolu při použití molárního extikčního koeficientu vepřového insulinu 6 100 pro tyto deriváty, jak bylo popsáno v Handbuch der Inneren Medizin, sv. 7, část 2A, vydavatel Oberdisse, 1975, 113 a při použití stanovené účinnosti pro jednosložkový

259528 insulin vepře 28,5 jednotek/ml suché látky, jak je uvedeno v Diabetes Care, sv. 6, doplněk 1 [1983] 4. Jedna jednotka odpovídá 5,95 nmolu.

Injekční roztoky s obsahem 240 nmolů/ml sloučenin obecného vzorce I jsou uvedeny v tabulce 1 včetně hodnota pH a obsahu zinku.

Test na prodloužení insulinového účinku

Prodloužení hypoglykemického účinku při použití injekčních roztoků insulinu bylo zkoumáno podle British Pharmacopoeia 1980, A 142 u králíků na lačno. Každý roztok byl podán podkožně v dávce 15,5 nmolu, králík, skupiny obsahovaly 6 nebo 12 zvířat o hmotnosti 3 až 4 kg, hladina krevního cukru byla sledována 6 hodin. Pro srovnání byl užit prostředek s rychlým účinkem, a to Actrapid™ vepřový insulin. Výsledky pokusů jsou uvedeny v následujících tabulkách 1 a 2.

Výsledky zkoušek na prodloužený účinek některých sloučenin u králíku jsou uvedeny v tabulce 1. Hodnota glukózy je průměr ze šesti králíků v procentech počáteční hodnoty. К zajištění isotonicity byl užit 0,9% chlorid sodný s 0,15% m-krnsolom jako konzervačním činidlem.

Výsledky dalších látek na prodlouženy účinek u králíků jsou uvedeny v tabulce 2. Hodnota glukózy je průměr z 12 králíků v procentech počáteční hodnoty. Isotonicita byla zajištěna 1,6 °/o glycerolu, 0,3 °/o rn-kresolu bylo užito jako konzervační prostředek. jako pufr byl užit 0,01M octan sodný.

Tabulka 1

Sloučenina vzorce I Zn⁺⁺ pH Glukóza v % počáteční hodnoty jUg/ml 1/2 h 1 h 2 h 4 h 6 h

OOCDrHCOrHCDOOOCMCOCOCO OOOCTJOOtxCDCOOOOCOCOCOCD гЧ tH cnmoinowoawHsmo tsrsOCDtxíDtsSCDNíDSrs □ COcDHCOCDOOTOWgOOON ^NOMoOCDoOlOlDOOtxCO ЮСОООЮСО^ЮСОС^СООСО^ inCDOOLT![S^CDincOCC)[>(3in

ID IT^ Ю' LD IT^ CM CM~ (D CD O ΙΟ ΙΧγ χφ χφ~ χφ⁴ χφ чфГ хф* хф~ хф Хф~ хф~ хф~ чф*⁴ О, о ш СО гЧ

T a bu 1 к a 2
Sloučenina vzorce I	Zn^{+ +}jug/ml	pH	Glukóza v % počáteční hodnoty
1 h	2 h	4 h	6 h
Gln^A17,Thr^B3°—NH₂ insulin	80	4,5	65	63	68	83
Gln^A17,Lys^B3°—NH₂ insulin	80	4,5	60	56	73	86
Gln^B13,Thr^B3°—NH₂ insulin	6,7	4,5	91	92	92	90
Arg^B27, Thr^B3°—NH₂ insulin	80	4,5	88	86	85	81
Arg^B27,Thr^B3°—NH₂ insulin	8,5	4,5	62	64	66	67
Arg^B27,Lys^B3()—NH₂ insulin	80	4,5	85	83	81	79
Arg^B27,Lys^B3°—NH₃ insulin	10,9	4,5	78	73	69	67
Lys^B27,Thr^B3°—NH₂ insulin	7,4	4,5	56	55	62	61
Lys^B27,Thr^B3°—NH₂ insulin	9,5	4,5	72	65	65	60
Lys^B3°—NH₂ insulin	80	4,5	74	83	80	82
Kontrolní insulin
Actrapid™ vepřový insulin	15	7	58	56	87	100
Účinnost jednotlivých insulinových ana-		luntů. Připravované	roztoky byly	иpravo-
logů byla stanovena vyčerpáním hladiny		vány na obí	sah 240	nmolů/ml, úpr	byla
cukru v krvi u myší jak je popsáno v Bri-		prováděna pomocí absorpce při 276	i nm. Ob-
tish Ph.armacopoeia 1980 A 141.	— A 142.		sah zinku v	roztocích určených ke	stanovo,-
Aby bylo možno snížit na ncjmenší míru		ní účinnosti byl 8 až	10 /íg/ml s ohledem na
problém, vznikající při stanové	ní účinnosti		obsah této látky v krystalických derivátech,
insulinových derivátů s různým časovým		užitých pro	srovnání. Stanovené	účinnosti
průběhem této účinnosti, byly	roztoky in-		pro některé	insuline	vé sloučeniny	jsou uve-
sulinu, určené pro stanovení této účinnes-		děny v následující tabulce 3.
ti připravovány bez přidávání	zinečnatých

Tabulka 3

Účinnost ve srovnání Meze spolehlivosti s insulinem v % (P — 0,05), %

Gln^AJ7Thr^B3°—NH₂ insulin	67	58—75
Gln^A17,Lys^B3°—NH₂ insulin	62	51—72
Arg^B27,Thr^B3°—NH₂ insulin	122	102—145
Arg^B27,Lys^B3°—NH₂ insulin	84	74—94

PŘEDMĚT VYNALEZU

Claims

1. Způsob výroby nových derivátů insulinu obecného vzorce I

A{ 1—3)—EA(5-6)-Cys—A(8-16 ] -E-—A( 18—19) -Cys - Asn | | (A-řetězec)

SS

II ss

II

B(1 --6J —Cys—13(8 —12)— E³—B[14—18)- Cys | (B-řetězec)

R—Z_n—Y_m—Lys—Pro—X—В (26—22) —E⁶- -G1 у kde n a m mají nezávisle na sobě lmdnotu O nebo 1,

A a B, následované čísly v závorkách znamenají peptidové fragmenty řetězců A a B, s délkou uvednou čísly v závorkách,

E¹, E³, E³ a E\ stejné nebo různé, znamenají zbytek kyseliny glutamové nebo zbytek neutrální aminokyseliny ze skupiny glycin, valin, isoleucin, leucin, fenylalanin, tyrosin, methionin, asparagin, glutamim alanin, šeřin nebo threonín, pro niž může být kódem nukleotidový sled,

X znamená zbytek L-threoninu, L-argininn nebo [,-lysinu.

Y a Z stejné nebo různé znamenají zbytek aminokyseliny glycinu, valinu, isolencinu, leiminu. fenylaianinu, tyrosinn, methioninu, asparaginu, glutaminu alaninu, šeřinu, threoninu, argininu ornithinu, lysinu, ky259536 seliny alfa,gamma-diaminomáselné nebo kyseliny alfa,beta-diaminopropionové, přičemž kterákoliv aminoskupina postranního řetězce může být acylována kyselinou o 2 až 18 atomech uhlíku a kterákoliv hydroxyskupina postranního řetězce může být alkylována alkylovým zbytkem o 1 až 4 atomech uhlíku, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci insulin vepře nebo sloučenina obecného vzorce II z

В (1—12) —E³—В (14—20) —E^Z|—В (22—26) — —X-B(28—29) — (Q_q—R)_r—A(l—3)—E¹— —A(5—16)—E²—A(18—21) (П) kde '

А а В znamenají fragmenty řetězců A a B, jejichž délka je uvedena čísly v závorkách,

Q znamená peptidový řetězec s q-aminokyselinami, q znamená celé číslo 0 až 33,

X, E¹, E², E³ a E⁴ mají svrchu uvedený význam,

R znamená skupinu —NR^², kde R¹ a R², stejné nebo různé, znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 6 atomech uhku nebo zbytek laktonu o> nejvýš 7 atomech líku, alkoxyskupinu o 1 až 4 atomech uhlíuhlíku v kruhu, r znamená celé číslo 0 nebo 1, působením sljučeniny obecného vzorce III.

H—Y_ni—Z_n—R (III) kde

Y, Z, R, m a n mají svrchu uvedený význam, přičemž kterákoliv aminokyselina a hydroxylová skupina postranního řetězce v substituentech Y a Z je popřípadě chráněna příslušnými ochrannými skupinami, při použití trypsinu nebo trypsinu podobného enzymu, s výhodou proteázy z Achromobacter lyticus jako katalyzátoru, při teplotě nejvýše 50 °C a popřípadě přítomné chránící skupiny se odštěpí.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučenina obecného vzorce II, v němž E^l, E² a E⁴ znamenají zytek kyseliny glutamové a ostatní symboly mají význam z bodu 1.

3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučenina obecného vzorce II, v němž E² znamená zbytek kyseliny glutamové a ostatní symboly mají význam z bodu 1.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž Y a/nebo Z znamená zbytek bazické aminokyseliny ve svrchu uvedeném význam, v níž je popřípadě aminoskupina postranního řetězce acylována a ostatní symboly mají význam z bodu 1.

5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž n = 0, Y znamená zbytek bazické aminokyseliny ve svrchu uvedeném významu m! = 1 a R a Z mají význam z bodu 1.

6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž Y i Z znamenají zbytky bazických aminokyselin ve výše uvedeném významu m=l,n = laR má význam z bodu 1.

7. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž R znamená skupinu obec ného vzorce — NRiR², v němž R^l a R², stejné nebo různé znamenají atom vodíku, alkylový zbytek o 1 až 6 atomech uhlíku, s výhodou znamená R aminoskupinu, ostatní symboly mají význam z bodu 1.

8. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž R znamená alkoxyskupinu o 1 až 4 atomech uhlíku, s výhodou terc.butoxyskupinu a ostatní symboly mají význam z bodu 1.

9. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se působí sloučeninou obecného vzorce III, v němž R znamená zbytek laktamu s nejvýš 7 atomy uhlíku v kruhu a ostatní symboly mají význam z bodu 1.

10. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E² znamená glutamin, X znamená L-arginin, Y znamená threonin, R znamená aminoskupinu, n — 0 a E¹, E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty, mají výše uvedený význam.

11. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E² znamená glutamin, E³ znamená kyselinu glutamovou, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu, E¹ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové, X znamená L-threonin a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

12. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E² znamená glutamin, X znamená L-lysin, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu, E¹, E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

13. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E² znamená glutamin, X znamená L-threonin, Y znamená lysin, n — 0, R znamená aminoskupinu, E^J, E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

14. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E² znamená glutamin, X znamená L-threonin, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu, E¹, E² a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

15. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E³ znamená glutamin, X znamená L-arginin, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminokyselinu, E¹, E² a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

16. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E³ znamená glutamin, X znamená L-lysin, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu, E¹, E² a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

17. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E³ znamená glutamin, X znamená L-threonin, Y znamená lysin, n = 0, R znamená aminoskupinu, E¹, E² a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mail výše uvedený význam.

18. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž E³ znamená glutamin, Y znamená threonin, X znamená L-threonin, n. — 0, R znamená aminoskupinu, E¹, E² a E'¹ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

19. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-arginin, Y znamená arginin, n = ~ 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

20. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III. v nichž X znamená L-arginin, Y znamená lysin, n = 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

21. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučenina obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-arginin, Y znamená threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

22. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeni ny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-lysin, Y znamená arginin, n -- 0. R znamená aminoskupinu, E¹, E², E³ a E⁴znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený vyžne m.

23. Způsob podle bodu 1₇ vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-lysin, Y znamená lysin, n =·- 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁵znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

24. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-lysin, Y znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

25. Způsob podle bodu 1, vyznačující sc tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, n = 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

26. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená threonin, n = = 0, R znamená aminoskupinu a E^J, E², E³a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

27. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená lysin, n 0, R znamená aminoskupinu, a E^l, E², E³ a E'¹znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

28. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená lysin, jehož aminoskupina je acylována zbytkem kyseliny laurové, n = 0, R znamená aminoskupinu a E¹·, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

29. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená lysin, Z znamená arginin, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

30. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená lysin, Z znamená lysin, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

31. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená arginin, n = 0, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a L·'¹znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

32. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X. znamená L-threonin, Y znamená arginin, Z znamená arginin, R znamená aminoskupinu a

E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.

33. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se podrobí transpeptidaci sloučeniny obecného vzorce II а III, v nichž X znamená L-threonin, Y znamená arginin, Z znamená lysin, R znamená aminoskupinu a E¹, E², E³ a E⁴ znamenají zbytky kyseliny glutamové a ostatní substituenty mají výše uvedený význam.