JPH05508406A - 新規保護インスリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規保護インスリン類似、体 発明の分野 本発明は、遷延されたインスリン作用を有する新規インスリン類似体、そのよう なインスリン類似体の調製方法、および該インスリン類似体を含有する注射液に 関する。

発明の背景 遷延されたインスリン作用を有するインスリン類似体は、以前にＥＰ　０１９４ ８６４ＡとＥＰ　０２５４５１６Ａにおいて記載されている。

ＨＰ　０１９４８６４Ａには、Ｂ鎖のＣ末端カルボキシル基がアミドまたはエス テル基により保護されておりそしてＡ４．　Ａ１７．　Ｂ１３およびＢ２１位の アミノ酸残基がＧｌｎにより置換されていることがある遷延ヒトインスリン類似 体が記載されている。ＥＰ　０２５４５１６Ａは、ＥＰ　０１９４４８６４Ａと 同じ型であるが更にＡ２１位が変更されているヒトインスリンを記載している。

しかしながら、上記インスリン類似体の幾つかは低すぎる生物学的効力を示すこ とがあり、または遷延のレベルが特定の目的には低すぎることがある。

本発明の目的は上述の欠点を有することなく遷延されたインスリン作用を有する 新規インスリン類似体を開発することである。

発明の要約 本発明によれば、驚くべきことに、Ｂ鎖のＮ末端への正電荷の導入が、ヒトイン スリンに比較して非常に遷延されたインスリン作用を有し且つ高い生体内効力も 有するインスリン類似体をもたらすことが発見された。

本発明は、その最も広い観点によれば、８１〜Ｂ６のアミノ酸残基の少なくとも １つが塩基性アミノ酸残基、即ちリジンまたはアルギニン残基（ＬｙｓまたはＡ ｒｇ　）により置き換えられているヒトインスリンの新規類似体に関する。

新規インスリン類似体の安定性を向上させる目的で、更にＡ２１位のアスパラギ ン（Ａｓｎ）を別のアミノ酸残基により置換することもてきる。

また、８３０位のＣ末端カルボキシル基を好ましくはアミドまたはエステル基に よって保護することにより、更なる正電荷を導入することもできる。

本発明のインスリン類似体がいわゆるペプチド転移法（詳細については下記を参 照のこと）により調製される場合、ＬｙｓまたはＡｒｇ残基置換基のＣ末端に結 合するアミノ基がプロリン残基であることが更に有利であるかもしれない。

本発明は、インスリン類似体の生合成前駆体を酵素的または化学的変換によりイ ンスリン類似体に変換する新規インスリン類似体の調製方法、および新規インス リン類似体を含有するインスリン溶液にも関する。

本明細書中で使用する「インスリン類似体」とは、Ｃｙ　Ｓ　Ａ　７とＣｙＳＢ ７との間およびＣｙ　ｓ　Ａ　ｔ　ＯとＣｙ　ｓ　Ｂ　Ｉ　１との間にジスルフ ィド架橋を含みそしてＣｙ　ｓ　Ａ　＠とＣｙ　ｓ　Ａ　Ｉ　Ｉ　との間に鎖内 ジスルフィド架橋を含むインスリンに類似した分子構造を有し、且つインスリン 活性を持つ化合物を意味する。

発明の詳細な説明 本発明のインスリン類似体は、下記の式Ｉにより表すことができる。

上式中、ＺはＡｓｎまたは他の天然アミノ酸残基であり、Ｘ、はＰｈｅ。

しｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＶａｌ、　ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ、 はＡｓｎ、　Ｌｙｓ、　ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ４はＧｉｎ、　Ｌｙｓ、 　ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ、はＨｉｓ、　Ｌｙｓ、　ＡｒｇまたはＰｒｏ であり、Ｘ、はＬｙｓ。

Ａｒｇ、　ＬｅｕまたはＰｒｏであり、そしてＹはカルボキシル基がエステル基 またはアミド基により保護されることがあるスレオニン残基であり、ただしｘ、 、ｘ２．ｘ、、ｘ、、ＸｓおよびＸ、のうちの少なくとも１つかＬｙｓまたはＡ ｒｇである。

ヒトインスリンに比較して、８１〜Ｂ６位の１または複数のアミノ酸残基をアル ギニンまたはリジンで置き換えることにより、電荷の変化が得られる。加えて、 Ｂ鎖のＣ末端カルボキシル基がエステル基またはアミド基により保護されること がある。

Ｚがアスパラギンでない場合、それは中性アミノ酸、例えばバリン、グルタミン 、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、または 好ましくはグリシン、セリン、スレオニンもしくはアラニンである。２は酸性ア ミノ酸、即ちグルタミン酸もしくはアスパラギン酸、または塩基性アミノ酸、即 ちリジン、アルギニンもしくはヒスチジンであることもできる。２は好ましくは グリシン、アラニンまたはセリンである。

Ｂ３０アミノ酸残基（スレオニン）のＣ末端カルボキシル基の保護基の例は、エ ステル成分、例えば好ましくは８個以下の炭素原子、好ましくは５個以下の炭素 原子を有する低級アルコキシである。好ましいアルコキシ基はメトキシ、エトキ シおよび第三ブトキシである。

保護基は式−ＮＲ’　Ｒ”を有するアミド基であることもでき、ここでＲ１およ びＲ２は同一であるかまたは異なり、そして各々水素であるかまたは好ましくは ８個までの炭素原子を有するアルキル基である。Ｒ１およびＲ２は好ましくは各 々水素である。

式Ｉの化合物は、遷延作用を有する溶液として臨床適用することができるので、 汎用されるブタまたはヒトインスリンの懸濁液と比較して免疫原性の低下をもた らし得る。

遷延の程度は亜鉛イオンの添加によつて増強、調節することができる。

インスリン作用の遷延の程度を調節することかできるパラメーターは、亜鉛の濃 度および式Ｉの化合物の選択である。好ましい亜鉛含量の範囲は、Ｉ−あたり約 ２４０ナノモルの式Ｉの化合物を含む製剤中、０〜約２■／−１好ましくはＯ〜 ２００μｇ／ｍｉ、より好ましくは約２０〜２００μｇ／ｍ／の亜鉛である。式 Ｉの化合物の別の濃度を使った時、亜鉛の含量をそれに対応して調節することが できる。

亜鉛イオンの存在下での式Ｉの化合物の溶液の遷延作用は、中性ｐＨではそのよ うな化合物の溶解度が低いためである。

本発明の注射液のｐＨは、好ましくは生理的ｐＨよりも低（、上限は沈澱が起こ るＩ）Ｈであろう。生理的ｐＨ値では、本発明の式１の化合物は低い溶解度を有 する。ｐＨ約５．５において約２４０ナノモル／−の式■の化合物を含む安定な 溶液が得られた。上限は溶液の構成成分、即ち等張化剤、保存剤および亜鉛の濃 度、並びに式■の化合物の選択に依存する。溶液のｐＨの下限はなく、Ｚがアス パラギン以外のものである式Ｉの化合物の化学的安定性はｐＨ３でさえも高い。

本発明の注射液の好ましいｐＨ領域は約２．５〜８．５であり、より好ましくは 約４．５〜８である。約２．５〜５．５のｐＨ領域が特に好ましく、約３〜４． ５が最も好ましい。

本発明の更なる観点は、本発明が改善された融通性を患者に提供することである 。１つは式Ｉの化合物を含み、もう１つは亜鉛塩を含む２つの水溶液を使って、 その２溶液を適当に混合することにより、患者は所望の程度の遷延作用と所望の プロフィールを得ることができる。このように、患者は２つの原液を使って、朝 の注射には成る作用とプロフィールを選択し、そして晩の注射には別の作用とプ ロフィールを選択する可能性を有する。好ましくは、本発明の亜鉛溶液は１ｒＩ ｄｌあたり約２μｇ〜約２０■の亜鉛を含有する。あるいは、両方の原液が同一 のまたは異なる濃度で亜鉛を含むことができ、そして／または両方の原液が同一 のまたは異なる式１の化合物を含むことができる。

好ましくは、本発明の注射液は、１−あたり約６０〜６０００ナノモルの濃度の 式■の化合物を有する。

本発明の新規インスリン類似体の例は下記のものである。

Ａｒｇ”、Ｓｅｔ”’、　Ｔｈｒ”’−Ｎｆ（、ヒトインスリンＡｒｇ”、Ｐｒ ｏ”、Ｓｅｔ”’、　Ｔｈｒ８２’−ＮＨｚヒトインスリンＡｒｇｓｓ、Ｇｌｙ ”’、　Ｔｈｒ″”−ＮＨ，ヒトインスリンＡｒｇ”、　Ｐｒｏ″’、ＧｌｙＡ ”、　Ｔｈｒ”コ’−ＮＨ，ヒトインスリンＡｒｇ８ｔｈ、５ｅｒＡ２’、　Ｔ ｈｒ１３’−ＮＨ，ヒトインスリンＡｒｇｓ２．Ｐｒｏ１．Ｓｅｒ”’、　Ｔｈ ｒ”’−ＮＨ＊ヒトインスリンＡｒｇ”、Ｇｌｙ”’、　ＴｈｒＩ’−ＮＨ，ヒ トインスリンＡｒｇＢ２．Ｐｒｏ”、Ｇｌｙ”’、　ＴｈｒＩ’−ＮＨｚヒトイ ンスリンＡｒｇ”、Ａｒｇ”、Ｓｅｒ”’、　：ｒｈｒ”’−ＮＨ＊　ヒトイン スリンＡｒｇｌ！、　Ａｒｇｔｒ３．５ｅｒＡ２Ｉ　ヒトインスリンＡｒｇ”、 Ｐｒｏ”、Ｓｅｔ”’、　Ｔｈｒａ２’−ＮＨｚヒトインスリンＡｒｇ”、Ａｒ ｇ”、Ｐｒｏ”、ＧｌｙＡ！’、　Ｔｈｒ”″ＯヒトインスリンＡｒｇ”コ、Ｇ ｌｙＡ１’、　Ｔｈｒ”’−ＮＨｔ　ヒトインスリンＡｒｇ”、５ｅｒＡ２’、 　Ｔｈｒ”’−ＮＨ２ヒトインスリンＡｒｇ”、Ｇｌｙ”’、　ＴｈｒＩ２’− Ｎｌ（２ヒトインスリンＡｒｇ”、　５ｅｒＡ１宜、Ｔｈｒ”コ’　−ＮＨ２ヒ トインスリンＡｒｇ”、Ｐｒｏ”、Ｇｌｙ”’、　Ｔｈｒ”６−ＮＨ，ヒトイン スリン。

本発明の新規インスリン類似体は、生米のヒトプロインスリン遺伝子中の適当な 部位のコドンを、所望のアミノ酸残基置換体をコードするコドンにより置き換え ることによってプロインスリン遺伝子を変更することにより、または所望のイン スリン類似体をコードする全ＤＮＡ配列を合成することにより、調製することが できる。次いで、所望のインスリン類似体をコードする遺伝子を適当な発現ベク ター中に挿入し、その発現ベクターを適当な宿主生物、例えばＥ。

るか否かに応じて、細胞からまたは培養ブロスから発現産物を単離する。

新規インスリン類似体は、ＭＫｒｋｉ　ら（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ 、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、３６０　（１９７９）、　１６１９−１６３２　）により記載され た方法と同様な方法による化学合成によっても調製することができる。それらは 、適当なアミノ酸残基置換を含む別々に試験管内調製したＡおよびＢ鎖から、既 知方法〔例えばＣｈａｎＣｅら、Ｒｉｃｋ、　ＤＨ，Ｇｒｏｓｓ　ＥＣ編）。

Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉ ｏｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅｖｅｎｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　［１ｌｉｎｏｉｓ、　？２１−７ ２８頁〕に従ってジスルフィド結合を樹立せしめることによって変更されたＡお よびＢ＃ｊを一緒に連結することにより作製することもできる。

インスリン類似体は、更に、ＥＰ　０１６３５２９Ａに記載の方法に類似した方 法により調製することもできる。その開示は参考として本明細書中に組み込まれ る。そのような方法により、ｌ　ｙ　ｓ　ｌ　ｔ　Ｉがペプチド結合または様々 な長さのペプチド鎖のいずれかを介してＱｌｙＡｌに連結されており正しく配置 されたジスルフィド架橋を有するヒトインスリンのインスリン前駆体が酵母によ り発現・分泌され、次いでいわゆるペプチド転移反応によりヒトインスリンに変 換される。

ペプチド転移反応は、米国特許第４．３４３．８９８号明細書（その開示は参考 として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。この反応において、１ｙ ｓＩｌｌ　とにｌｙＡ　Ｉとを連結するペプチド結合またはペプチド鎖が切除さ れ、そしてスレオニンエステル基またはスレオニンアミド基がＬｙｓ１！ＩのＣ 末端に結合される。

新規インスリン類似体は、下記の式■を有する生合成インスリン前駆体： （上式中、Ｑはｑ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｑはθ〜３３の 整数であり、ＴはＬｙｓまたはＡｒｇであり、ｒは０またはｌであり、そしてＸ ＋　、Ｘｔ　、Ｘ−、Ｘ−、Ｘｓ　、Ｘ−およびＺは上記で定義した通りである ）を、触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を使って、水と有機溶媒の 混合物中で、式■の化合物二ＨＹ　（ＤＩ） （上式中、Ｙはカルボキシル基がエステル基またはアミド基で保護されている保 護スレオニンアミノ酸である）と反応させる方法により、調製することができる 。次いで酸または塩基加水分解により、エステルまたはアミド保護基を切断する ことができる。

好ましい式■の化合物は、Ｔｈｒ−ＮＨｔ、　Ｌｙｓ（Ｂｏｃ＞−ＮＨｚ、　Ｔ ｈｒ（Ｂｕ’　）−ＯＢｕ　’およびＴｈｒ−ＯＢｕ　’である。

本発明のインスリン製剤は、式Ｉの化合物を、例えば２４０または６００ナノモ ル／ｒｄの濃度において、わずかに酸性条件の水性媒質中に溶解することにより 調製される。水性媒質は、例えば塩化ナトリウムまたはグリセロールを使って等 張にされる。更に、水性媒質は、式Ｉの化合物１ナノモルあたり約３０μｇまで のＺｎ−濃度の亜鉛イオン、緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはヒスチジ ン、・並びに保存剤、例えばｍ−クレゾール、ニバギンまたはフェノールを含む ことができる。最終インスリン製剤のｐＨ値は、式１の化合物中の変更されてい る電荷の数、亜鉛イオンの濃度、式Ｉの化合物の濃度および選択した式Ｉの化合 物に依存するａ　ｐ）Ｉ値は、沈澱を防ぐために約２．５〜５．５といったよう な投与に好都合の値に調整される。インスリン製剤は滅菌濾過により無菌にされ る。

本発明のインスリン製剤は既知のインスリン製剤の使用法と同様に用いることが できる。

３５５８に記載されたものである。アミノ酸はＬ配置のものである。異なって指 摘されない限り、本明細書中で言及するインスリンの種はヒトである。

のヒトインスリンの短縮ＢｗＩを意味し、そしてＡ（１−２１）はヒトインスリ ンのＡ鎖を意味する。

本発明のブラクチスに従ってヒトインスリン分子中に行われた１または複数の置 換は、ヒトインスリンの前に接頭辞を付けて表示される。例として、４１ｇ１１ ！ヒトインスリンは、Ｂｆｉｌｉの２位のＶａｌがＡｒｇに置換されているヒト インスリン類似体を意味する。

Ａｒｇ”、　Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）ヒトイ ンスリンは、短縮Ｂ鎖中の２位のＶａｔがＡｒｇに置換されておりそしてＢ（１ −２９）　＃１とＡ（１−２１）鎖がペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓを介 して連結されている上記インスリン類似体の前駆体を意味する。

別記しない限り、Ｂ（１−２９）鎖とＡ（１−２１）鎖は、それぞれｃｙｓＡ７ とＣｙ　ｓ　Ｂ　？との間およびＣｙｓＡ！＋１とＣｙｓ”Ｆどの間でジスルフ ィド架橋により連結されており、そしてＡ鎖はヒトインスリンと同様にＣｙｓ口 とＣｙＳＡｌとの間に鎖内ジスルフィド架橋を含むと解釈すべきである。

Ａｒｇｍ２．Ｐｒｏ”、５ｅｒＡ！’、　Ｔｈｒ”’−ＮＨｚ　ヒトインスリン 、Ａｒｇ”、Ｓｅｒ”、　ＴｈｒＩ’−ＮＨｔ　ヒトインスリン、Ａｒｇ”、Ｇ ｌｙ”’、　Ｔｈｒ”’−ＮＨｚ　ヒトインスリン、Ａｒｇ″ｔ、　ｐｒｏ１２ ．　ＱｌｙＡ！真　ｙｈ、！１２６　ヒトインスリン、およびＡｒｇ”、Ｇｌｙ ”’、　Ｔｈｒ”’−ＮＨｚ　ヒトインスリン上記化合物は、ＥＰ　０１９４８ ６４Ａの実施例４と６に記載された通りに、Ｔｈｒ−ＮＨ，の存在下で有機／水 性溶液中でのトリプシンペプチド転移反応により、次の対応する前駆体： Ａｒｇｌ＋２．Ｐｒｏｌ′２．Ｓｅｔ”’、、　Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌ ａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）ヒトインスリン、 Ａｒｇ８ｓ、Ｓｅｔ”、　Ｂ（ｔ−２９）−Ａ１．ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１ −２１）ヒトインスリン、Ａｒｇ１１４．Ｇｌｙ”’、　Ｂ（１−２９）−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）ヒトインスリン、Ａｒｇ”、Ｐｒｏ”、Ｇ ｌｙ”、　Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）ヒトイン スリン、および Ａｒｇ”、Ｇｌｙ”’、　Ｂ（１，−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１ −２１）ヒトインスリンから合成した。収率、ヒトインスリンに関する電荷、ｐ Ｈ８，９のディスクＰＡＧＥ電気泳動におけるインスリンに関する移動度、およ びヒトインスリンからのアミノ酸組成の偏差を表１に示す。

インスリン前駆体はＥＰ　０１６３５２９Ａに記載の方法に類似した方法により 製造した。

ＥＰ　０１６３５２９Ａの実施例７に記載の如＜　ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐＴＩ″ ＲＰ−１８への吸着により醗酵ブロスからインスリン前駆体を回収した。３３％ （Ｖ／Ｖ）エタノール中の０．２Ｍ　ＫＣｌ、　０．００１Ｍ　［（ＣＩを用い てカラムから前駆体を溶出させた。水（ブール１容あたり１容）、固体のクエン 酸三ナトリウム（０，０５Ｍのモル濃度を与える）および最後に酢酸亜鉛（０， ００６Ｍのモル濃度を与える）の連続添加により、前記プールからインスリン前 駆体を結晶化させた。ｐＨ値を６．８に調整し、そして混合物を４°Ｃで一装置 いた。遠心により結晶を単離し、水洗し、真空乾燥した。

酵素的半合成用の保護アミノ酸および保護ペプチドを標準法によりｍ＊するか、 またはＮｏｖａ　ＢｉｏｃｈｅｍもしくはＢａｃｈｅｍ　（共にスイス）のいず れかから購入したく注文合成）。

遷延作用の程度を試験するために上記化合物の無菌注射液を、等張剤として１． ６％（ｗ／ｖ）グリセロール、保存剤として０．２６％（ｗ／ｖ）フェノールを 使って作製した。亜鉛イオンの濃度は８．８０または１６０μｇｏｄであった。

類似体の等電点から十分に離れて該溶液のｐＨ値を調整し、４℃での貯蔵の間該 溶液を透明に維持した。該溶液は２４０ナノモル／−の試験化合物を含んだ。２ ４０ナノモル／−の濃度はＨＰＬＣによって確かめた。

次いで表■に記載の化合物２４０ナノモル／−を含みモして３のｐＨと表中に記 載の亜鉛含量を有する注射液を作製した。

Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　１９８０．　Ａ　１４２に従っ て断食ウサギにおいて低血糖効果の遷延を試験しな。３〜４ｋｇの体重を有する １２羽のウサギにおいてウサギ−羽あたり１４，３ナノモルの用量で各試験溶液 を皮下投与し、そして低血糖の経過を６時間追跡した。比較のため、最も早く作 用する製剤であるＡｃｔｒａｐｉｄＴＴｈｌヒトインスリンを試験に加えた。試 験結果を１．　２．　４および６時間（ｈ）後のグルコースの百分率を与えた表 ■に示す。マウス血中グルコースアッセイ（ＭＢＣ）および遊離脂肪細胞試験（ ＦＦＣ）での生物学的効力の測定結果を表■に示す。

表■ 化合物　Ｚｎ−初期値の％としての ヒトインスリン中の置換　μｇｏｄ　Ｉｈ　２ｈ　４ｈ　６ｈＡｒｇ″’、５ｅ ｔＡ！１．Ｔｈｒ”’−ＮＨ！８　５９　６４　９６　９４Ａｒｇ”、Ｓｅｔ” ’、Ｔｈｒｌ′３’−ＮＨｚ　８０　８５　９２　９７　９５Ａｒｇ”、Ｓｅｒ ”’ｒ　Ｔｈｒ”■−ＮＨｔ　１６０　７６　８９　９６　９４Ａｒｇ”、Ｐｒ ｏ”、Ｓｅｒ”’、ＴｈｒＩＩ３’−ＮＨ，８５８６７７３７２Ａｒｇ”、Ｐｒ ｏ”、Ｓｅｒ”’、　Ｔｈｒ”！’−ＮＨＩ　８０　７３　６６　６４　６１Ａ ｃｔｒａｐｉｄ　”ヒトインスリン　７　５３　５３　９２　９７要　約　書 新規保護インスリン類似体 Ｂ１−８６位のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つがＬｙｓまたはＡｒｇによ り置き換えられているヒトインスリン類似体は、遷延されたインスリン作用を有 する。酸溶液中でのインスリン類似体の安定性を増加させるためにＡ２１位のＡ ｓｎを別のアミノ酸残基により置き換えることもできる。更にＢ３０をアミド基 またはエステル基により保護することができる。

国際調査報告 １−一−ａｙ＋、ＩＩｍ　ａｔ　ＰＣＴ／ＤＫ　９１１０Ｑ１６７

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．下式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＺはＡｓｎまたは他の天然アミノ酸残基であり、Ｘ１はＰｈｅ，Ｌｙｓ またはＡｒｇであり、Ｘ２はＶａｌ，Ｐｒｏ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ２ はＡｓｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ またはＰｒｏであり、Ｘ５はＨｉｓ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ６ はＬｙｓ，Ａｒｇ，ＬｅｕまたはＰｒｏであり、そしてＹはカルボキシル基がエ ステル基またはアミド基により保護されることがあるスレオニン残基であり、た だしＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５およびＸ６のうちの少なくとも１つがＬｙｓ またはＡｒｇである）を有するヒトインスリン類似体。
2. ２．Ｘ１がＰｈｅである、請求項１に記載のヒトインスリン類似体。
3. ３．ＺがＧｌｙ，ＡｌａまたはＳｅｒである、請求項１または２に記載のヒトイ ンスリン類似体。
4. ４．Ｘ１がＰｈｅであり、Ｘ２がＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ３がＰｒｏであ り、Ｘ４がＧｌｎであり、Ｘ５がｈｉｓであり、Ｘ６がＬｅｕであり、ＺがＧｌ ｙ，ＡｌａまたはＳｅｒでありそしてＹがＴｈｒ−ＮＨ２またはＴｈｒである、 請求項１に記載のヒトインスリン類似体。
5. ５．Ｘ１がＰｈｅであり、Ｘ２がＶａｌであり、Ｘ３がＡｓｎであり、Ｘ４がＧ ｌｎであり、Ｘ５がＨｉｓであり、Ｘ６がＡｒｇまたはＬｙｓであり、ＺがＧｌ ｙ，ＡｌａまたはＳｅｒでありそしてＹがＴｈｒ−ＮＨ２またはＴｈｒである、 請求項１に記載のヒトインスリン類似体。
6. ６．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ＺはＡｓｎまたは他の天然ア ミノ酸残基であり、Ｘ１はＰｈｅ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＶａｌ， ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＡｓｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり 、Ｘ４はＧｌｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ５はＨｉｓ，Ｌｙｓ， ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ４はＬｙｓ，Ａｒｇ，ＬｅｕまたはＰｒｏであり 、そしてＹはカルボキシル基がエステル基またはアミド基により保護されること があるスレオニン残基であり、ただしＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５およびＸ４ のうちの少なくとも１つがＬｙｓまたはＡｒｇである）を有するヒトインスリン 類似体を、常用の補助剤、例えば緩衝剤、保存剤および溶液を等張にする剤と一 緒に含有する、遷延されたインスリン作用を有する注射液。
7. ７．下式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ＺはＡｓｎまたは他の天然ア ミノ酸残基であり、Ｘ１はＰｈｅ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ２はＶａｌ， Ｐｒｏ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ３はＡｓｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒ ｏであり、Ｘ４はＣｌｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ５はＨｉｓ， Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＰｒｏであり、Ｘ６はＬｙｓ，Ａｒｇ，ＬｅｕまたはＰｒ ｏであり、そしてＹはカルボキシル基がエステル基またはアミド基により保護さ れることがあるスレオニン残基であり、ただしＸ１，Ｘ２，Ｘ２，Ｘ４，Ｘ５お よびＸ６のうちの少なくとも１つがＬｙｓまたはＡｒｇである）を有するインス リン類似体の製造方法であって、下式ＩＩのインスリン前駆体： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（上式中、Ｑはｑ個のアミノ酸残基 を有するペプチド鎖であり、ｑは０〜３３の整数であり、ＴはＬｙｓまたはＡｒ ｇであり、ｒは０または１であり、そしてＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５，Ｘ６ およびＺは上記で定義した通りである）を、触媒としてトリプシンまたはトリプ シン様酵素を使って、水と有機溶媒の混合物中で、式ＩＩＩの化合物：ＨＹ（Ｉ ＩＩ） （上式中、Ｙはカルボキシル基がエステル基またはアミド基で保護されている保 護スレオニンアミノ酸である）と反応させ、次いで所望であれば、酸または塩基 加水分解により、保護基を除去することを特徴とする方法。