NO864555L

NO864555L - Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinpreparat.

Info

Publication number: NO864555L
Application number: NO864555A
Authority: NO
Inventors: Per Balschmidt; Finn Benned Hansen
Original assignee: Nordisk Gentofte
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1986-11-14
Also published as: EP0216832A1; DK545786D0; ATE84546T1; AU596968B2; NO864556D0; DK159856C; WO1986005497A1; IL78160A0; NO864556L; DK545686A; FI864559A0; EP0216832B1; DE3673737D1; WO1986005496A1; US5028586A; DE3687500D1; AU5622786A; JPS62502538A; NO174278C; FI864560A0

Description

FREMGANGSMÅTE VED FREMSTILLING AV INSULINPREPARAT

Foreliggende oppfinnelse omhandler nye insulinderivater og insulinpreparater som viser forlenget virkning og som omfatter minst et av de nye insulinderivater og om ønsket et rasktvirkende insulin.

I alvorlige eller kroniske tilfeller av sykdommen diabetes blir det vanligvis behandlet med injeksjonspreparater inneholdende insulin foreksempel svineinsulin, bovint insulin eller humant insulin. Oppløselige insulingpreparater er vanligvis rasktvirkende men til gjengjeld opphører virkningen etter et par timer. Derfor er det nødvendig å gi hyppige injeksjoner normalt flere ganger om dagen.

For å overvinne disse ulemper har insulinpreparater med forlenget virkning blitt fremstilt slik at virkningen opprettholdes i flere timer eller til og med opp til 24 timer eller lengre. Ved å bruke slike forlengede preparater be-høver diabetespasienten kun å motta et mindre antall injeksjoner foreksempel en enkelt til to injeksjoner i løpet av 24 timer.

En slik forlenget virkning kan oppnås ved å konvertere insulin til et dårlig oppløselig salt så som sinkinsuling eller protamininsulin. De dårlige oppløselige insulinsalt-er blir brukt i form av suspensjoner fra hvilke insulinet gradvis frigjøres etter subkutan injeksjon.

Nylig har andre metoder blitt innført for å oppnå en forlenget virkning. Et eksempel på dette er innkapslingen av insulinkrystaller i polymerisert serum albumin. Et annet eksempel er kontinuerlig virkende infusjonsanordninger så-kalte insulinpumper som imidlertid kan være ukomfortable og representere en risiko for pasienten.

Beskrivelsen til dansk patentansøkning nr. 3582/84 og nr. 3583/84 angir fremstilling og bruk av insulinderivater hvori C-terminalen til B-kjeden er forlenget med en organ-isk gruppe som bærer minst en positiv ladning fortrinnsvis Arg-OH eller Arg-Arg-OH. Preparatene inneholdende suspensjoner av slike insulinderivater oppviser en forlenget virkning.

Det har nå overraskende blitt funnet at ved bruk av insulin

-derivater hvori B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og valgfritt opp til 4 av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonen A4, A17, A21, B13 og B21 er blokkert eller konvertert til en uladet gruppe i

insulinpreparater spesielt injeksjonspreparater, en tidlig-ere ukjent og ønsket langlivet forlenget virkning blir opp-nådd. Denne effekt er spesielt uttalt dersom B30 karboksyl -gruppen er blokkert med en gruppe inneholdende en alkyl-kjede på minst 8 karbonatomer eller dersom B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og minst en og ikke flere enn fire ytterligere karboksylgrupper på samme tid er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe.

Følgelig omhandler oppfinnelsen insulinderivater hvori B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og valgfritt en til fire av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, A21, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe forutsatt at når kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfatter nevnte gruppe en alkylgruppe med minst 8 karbonatomer.

Oppfinnelsen omhandler spesielt insulinderivater hvor kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe som omfatter en alkylgruppe med 8 til 12 karbonatomer.

Oppfinnelsen omfatter spesielt insulinderivater hvor B30 karboksylgruppene er blokkert med et alkylamid med minst 8 karbonatomer.

Oppfinnelsen omhandler spesielt insulinderivater hvori en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og B30 karboksylgruppen er blokkert som et amid eller med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 1 til 12 karbonatomer.

Oppfinnelsen omhandler spesielt insulinderivater hvor en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidium i posisjon A4, A17, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 8 til 12 karbonatomer .

Oppfinnelsen omhandler også insulinpreparater inneholdende minst et insulinderivat hvor B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og valgfritt 1 til 4 av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiet i posisjon A4, A17, A21, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe forutsatt at når kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfatter nevnte gruppe en alkylgruppe med minst 8 karbonatomer og om ønsket også inneholdende et rasktvirkende insulin.

En spesielt fordelaktig utførelsesform av insulinpreparater ifølge oppfinnelsen er et injeksjonspreparat som oppviser forlenget insulinvirkning og omfattende en suspensjon av minst et insulinderivat ifølge oppfinnelsen i et isotont vandig medium med en nøytral pH og valgfritt inneholdende en buffer og/eller et preserveringsmiddel og om ønsket et rasktvirkende insulin.

Insuliner som vanligvis er brukt for behandling av diabetes så som svin, bovin, ovin og humant insulin, inneholder alle seks fri karboksylgrupper dvs. i posisjonene A4, A17, A21, B13, B21 og B30 aminosyreresidiene. Tallangivelsen refe-rerer til posisjonene i insulin A- og B-kjeden henholdsvis som starter fra N-terminalene. Det er kjent at et insulin hvori B30 karboksylgruppen er konvertert til en metylester eller amid har uforandret biologisk aktivitet ifølge H. Zahn et al.: Naturwissenschaf ten, 6_8, (1981), p. 56-62, og M. Kobayashi, et al.: Diabetes,30_, (1981), p. 519-22. En forlenget virkning var ikke nevnt. Den biologiske aktivitet av insulin vil vanligvis avta ved økende grad av derivatisering. Imidlertid influeres den biologiske aktivitet overraskende lite selv ved høy grad av derivatisering av de fri karboksylsyregrupper, men når alle seks fri karboksylsyregrupper er derivatisert forsvinner den biologiske aktivitet fullstendig ifølge D. Levy: Biochem. Biophys. Acta, 310, (1973), side 406-415.

Ved hjelp av insulinpreparatene ifølge oppfinnelsen kan insulinaktiviteten opprettholdes og på samme tid kan en overraskende forlenget aktivitet oppnås. Denne forlengede effekt er avhengig av egenskapene til det spesielle derivat dvs. ikke bare på antall karboksylsyregrupper som er blokkert men også på størrelsen og den kjemiske sammensetning av blokkeringsgruppen. Således er det mulig å variere den

forlengede virkning vilkårlig.

I tilfelle med Insulin-avhengig diabetes består en ofte brukt terapi av to daglige injeksjoner av et forlenget insulinpreparat et om morgenen og et om kvelden like før leggetid for å danne et basalt insulinnivå. I tillegg blir tre injeksjoner av rasktvirkende insulinpreparat gitt før hovedmåltidene. Ulempene ved denne terapi er at den sene injeksjon med forlenget preparat kan resultere i et farlig lavt blodsukkernivå i løpet av natten. Denne situasjon kan unngås ved å injisere et blandet preparat av et forlenget og et rasktvirkende insulin før middag hvorved hypoglysemi vil om i det hele tatt opptre i løpet av kvelden hvor det kan unngås ved hjelp av et lett måltid. Imidlertid result-erer denne type terapi ofte i hyperglysemi i løpet av morgenen i det de mest anvendte forlengede insulinpreparater "Insulatard"<®>og "Monotard"<®>ikke virker lenge nok.

Derfor er det ønskelig å gi diabetespasienten insulinpreparater som virker lengre enn preparatene i vanlig bruk spesielt hvis en injeksjon av slike preparater vil være tilstrekkelig for en eller flere dager. Insulinpreparater fremstilt ifølge oppfinnelsen oppviser en forlenget insulinvirkning av samme eller lenger varighet enn det vanlig brukte forlengede insulinpreparat "Insulatard" (r).

Med spesielle insulinderivater ifølge oppfinnelsen hvori kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe er derivater foretrukket hvori blokkeringen finner sted i form av alkylester eller alkylamid hvori alkylgruppen inneholder fra 8 til 18 karbonatomer spesielt i form av N-alkyl. Hvis alkylgruppen er mindre vil forlengelsen ikke bli vesentlig forskjellig fra den til "Insulatard"^ (R)og hvis alkylgruppen er større vil oppløselighetsproblemer oppstå som kan gjøre fremstillingen av derivatene meget vanskelig.

Blandt insulinderivatene ifølge oppfinnelsen hvori B30 karboksylgruppen og ytterligere fra 1 til 4 karboksylgrupper er blokkert med en uladet gruppe er derivater foretrukket hvori blokkeringen finner sted i form av amid, alkylester og med hensyn til B30 karboksylgruppen også i form av alkylamid hvorved en alkylgruppe i B30 karboksylgruppen kan inneholde opp til 18 karbonatomer men i de resterende karboksylgrupper ikke mer enn kun 4 karbonatomer .

Oppfinnelsen omhandler spesielt de følgende spesifikke for-bindelser : Insulin-B30-oktylester, insulin-B30-dodecyl amid, insulin-B30-heksadecylamid, insulin-(B21,B30)-dimetylester, insulin-(Al 7,B30)-dimetylester, insulin-(A4, B30)-diamid, insulin-Al 7-amid-B30-oktylester, insulin-(A4,Bl3)-diamid-B30-heksylamid, insulin-(A4,B13)-diamid-B30-heksylamid, insulin-(A4,Al 7,B21,B30)-tetramid, insulin-(Al 7,B30)-di-amid, A4-ala-insulin-B30-amid, B30-leu-insulin-(A4, B30)-diamid.

Når insulinpreparåtene ifølge oppfinnelsen inneholder rasktvirkende insulin kan dette insulin være foreksempel humant eller svineinsulin.

Insulinderivatene som omtales kan være avledet fra svin, bovin, ovin, kanin eller spesielt humant insulin innebe-fattende andre slike insuliner hvori B30 aminosyreresinet har blitt byttet med andre naturlig forekommende aminosyre-residier foreksempel ved semisyntese.

Insulinderivatene kan fremstilles på i og for seg kjent vis for konversjonen av en karboksylsgruppe til en uladet gruppe foreksempel ved esterifisering amidering. Således fremstilles foreksempel et insulinderivat hvor to eller fler av de totale seks karboksylsyregruppene er metylert ved å reagere human insulin B30 metylester i bortrifluorid/ metanol i en passende tid fulgt av en fraksjonering av de modifiserte insulinderivater på en anionebytterkolonne ved en lett basisk pH-verdi. Endelig kan de mulige produkter fraksjoneres og isoleres ved preparativ HPLC.

Derivatisering av B30 karboksylgruppen kan finne sted ved enzymatisk katalyse foreksempel ved å følge fremgangsmåten angitt i dansk patentspesifikasjon nr. 146.482. I henhold til denne fremgangsmåte fjernes B30 aminosyren ved å for-døye foreksempel svineinsulin med karboksypeptidase A og i det andre steg reageres det dannede des-B30 insulin i nærvær av trypsin eller et trypsinlignende enzym med en naturlig aminosyreester spesielt treoninmetylester.

En lignende fremgangsmåte er kjent fra dansk patentansøkn-ing nr. 574/80 i henhold til hvilken fremgangsmåte B30 aminosyren et insulin ved en en-trinnsmetode byttes ut ved tryptisk katalyse med den ønskede aminosyreester eller amid. Ifølge ovenfor angitte beskrivelse kan reaksjonen dessuten utføres ved å bruke et proinsulin som utgangsmate-riale.

Enkelte av karboksylgruppeblokkeringene foretrukket ifølge oppfinnelsen kan utføres ved bioteknologiske metoder. Dette gjelder blokkeringen av karboksylgruppene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 i form av amider eller ved å forandre enkelte eller alle av glutaminsyrene lokalisert ved disse posisjoner med naturlig forekommende aminosyrer som bærer en uladet sidekjede.

Vanligvis er aminosyrene i disse posisjoner glutaminsyre men i enkelte av insulinderivatene ifølge oppfinnelsen er de byttet ut med glutamin.

Det er innlysende å fremstille disse modifiserte insuliner ved biosyntese som ved å forandre kun en enkelt base i kodonnet i DNA-kjeden som koder for glutaminsyre hvor dette kodon kan bli forandret til å kode for foreksempel glutamin. Ved å forandre baser i DNA-kjeden som koder for insulin (eller proinsulin) er det således mulig å utføre modifikasjoner som ville være vanskelige eller umulige å foreta kjemisk på grunn av begrensningene med hensyn til isolering .

Det finnes et antall forskjellige metoder for å fremstille human insulin ved biosyntese. Det er felles for alle av dem at DNA-kjeden som koder for enten det fullstendige proinsulin, en modifisert versjon derav eller A- og B-kjeden separat har blitt innskutt i et repliserbart plasmid inneholdende en passende promotor. Ved å transformere dette system i en gitt vertsorganisme kan et produkt dannes som kan konverteres til ekte humant insulin på i og for seg kjent måte.

Enkelte kjente metoder for biosyntese av proinsulin eller A- og B-kjede og deres konversjon til insulin er beskrevet nedenfor.

I den velkjente Genetech prosess dannes et intracellulært preparat i E. coli av polypeptider hvori disse polypeptider er en fusjon mellom (}-gal actosidase og A- og B-kjeden henholdsvis av insulin. Etter fermentering isoleres de to produkter. A- og B-kjedene spaltes av fra (}-galactosidase ved hjelp av cyanogenbromid hvoretter de sulfiterte kjeder kombineres under reduserende betingelser i nærvær av ditio-treitol ved en pH-verdi på 10,5. Endelig isoleres humant insulin fra reaksjonsblåndingen.

Ved fremgangsmåten angitt i EPO 55945 syntetiseres produktet som et fusjonprotein med et annet protein separert ved et spaltningssete. Dette kan være et protease spaltningssete eller et sete som kan spaltes kjemisk (foreksempel metionin). Genet for proinsulin er foreksempel klonet som en genfusjon med et annet protein ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Etter isolering spaltes det kimeriske protein ved å bruke et passende enzym eller CNBr hvorpå det denaturerte protein isoleres i en sulfitolisert form. Dette produkt renatureres under reduserende betingelser ved å bruke p-merkaptoetanol ved en pH på 10,5 som beskrevet av Frank, fulgt av trypsin/CpB-spalting som beskrevet av Kemmler (1971). Det resulterende insulin isoleres på i og for seg kjent måte.

Endelig kan proinsulin fremstilles biosyntetisk ved å bruke metoden angitt i EPO 116201. I denne metode utskilles proteiner i kulturmediet ved å bruke a-faktorsystemet fra Saccharomyces cerevisiae. Ved å sette inn genet som koder for proinsulin i dette system kan proinsulin isoleres fra kulturmedier ved å bruke systemet beskrevet i DK patentan-søkning nr. 3091/84. Deretter kan proinsulin konverteres til insulin ved de kjente metoder beskrevet ovenfor.

Ovenfor er metoder beskrevet i hvilke produktet enten er proinsulin eller A- og B-kjede separat. Videre er disse produkter enten syntetisert sammen med en signalsekvens hvor formålet av denne er å bringe produktet gjennom celle-overflaten hvor det spaltes eller som en fusjon med et protein hvor formålet til dette er å stabilisere produktet. Dessuten er det mulig å fremstille modifisert proinsulin biosyntetisk. Europeisk patentansøkning nr. 82303071.3 beskriver proinsuliner hvor C-kjeden er modifisert ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker.

Ovenfor nevnte modifikasjoner av insulin kan fremstilles ved å uttrykke de modifiserte DNA-sekvenser i et passende ekspresjonssystem. Forandringene i DNA-sekvensen kan ut-føres ved in vitro mutagenese av insulingenet ved en metode beskrevet av Thomas A. Kunkel, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, Vol _82, sidene. 448-492 (1985). I henhold til denne metode klones insulingenet i den enkeltkjedede DNA-bacteriophage M13. DNA fra denne phage renses og til dette kobles en primer, typisk en 15-25-mer, som inneholder den gitte mutasjon (et mispar) så vel som en homologi på hver side av denne mutasjon. Primeren blir så utvidet ved bruk av en DNA polymerase i den fullstendige lengde på phage genomet og gir således de fullstendige dobbeltkjedede molekyler hvori en kjede inneholder mutasjonen og den andre inneholder villtypegenet. Ved å innføre dette molekyl i en E. coli celle vil phage-avkommet delvis være phager inneholdende villtypegen, delvis phager inneholdende mutasjonen. Blandt disse phager er det så mulig å skjerme for den ønskede type ved hybridisering med mutageniseringsprimeren til enkelt-kjedet DNA av phage-avkommet. Primeren vil ha fullstendig homologi med den muterte kjede men vil være forskjellig fra villtypen ved et enkelt nukleotid. Etter skjerming kan dobbeltkjedet DNA isoleres fra E. coli-cellene hvori phagen repliseres og det modifiserte insulingen kan isoleres fra dette. Dette gen blir deretter gjeninnsatt i det opprinne-lige ekspresjonssystem.

Injeksjonspreparatene kan omfatte insulinderivatene ifølge oppfinnelsen som amorfe og/eller krystallinske suspensjoner enten separat eller i kombinasjon med andre slike insulinderivater og/eller naturlig forekommende insuliner. Det har blitt funnet at et flertall av disse derivater kan krystalliseres med sink enten ved en pH-verdi som er høyere enn deres isoelektriske punkt eller ved en pH-verdi omkring den isoelektriske pH-verdi når krystalliseringsmediet inneholder en fenol. Det er også mulig å krystallisere insulin -derivatene ifølge oppfinnelsen i nærvær av protamin eller et overskudd av sink som forårsaker en ytterligere forlenget aktivitet.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved hjelp av følgende eksempler. Imidlertid illustrerer eksempel 5 fremstillingen av et insulinderivat som faller utenfor rammen av oppfinnelsen og brukt som sammenligningsforbindelse i eksempel 6. Eksempel 9 illustrerer fremstillingen av startmaterial-er brukt i eksemplene 1 og 5.

Eksempel 1

Fremstilling av human insulin-B30-n-dodecylamid.

970 mg L-treonin-n-dodecylamid ble oppløst i en blanding av 3,60 ml t.butanol, 1,20 ml dimetylformamid og 1,40 ml vann. 450 mg des-B30-alanin svineinsulin ble oppløst i blandingen under omrøring og pH-verdien justert til 6,4-6,5 med eddiksyre. En oppløsning av 8 mg trypsin i 0,20 ml 0,001M

kalsiumacetat ble tilsatt og reaksjonsblandingen oppbevart ved 20°C i 2 timer. Prøven ble analysert ved revers fase høytrykks vaeskekromatografi som viste at 71% av des-B30-insulinet var konvertert til insulin-B30-n-dodecylamid.

Reaksjonsblandingen ble helt opp i 5 ml 2-propanol og oppbevart i 15 min. Det utfelte protein ble isolert ved sentrifugering og presipitatet vasket med 25 ml 2-propanol og igjen sentrifugert.

Presipitatet ble gjenoppløst i 15 ml IM eddiksyre i 7M urea og etter filtrering ble oppløsningen satt på en 2,6 x 90 cm kolonne pakket med Sephadex^ G50 Superfine og ekvilibrert med IM eddiksyre. Proteinet ble eluert med samme buffer ved en hastighet på 25 ml per time og fraksjoner på 5 ml ble samlet opp. Den optiske tetthet ved 277 nm til frak-sjonene ble undersøkt hvorpå den proteinholdige hovedfraksjon ble samlet opp og frysetørket.

Det frysetørkede protein ble gjenoppløst i 25 ml 60 volum-% etanol og pH justert til 9,0 med IM TRIS. Etter filtrering ble oppløsningen tilført en 1,6 x 20 cm kolonne av Q-Sepharose^ CL-6B FF, ekvilibrert med 0,02M TRIS/saltsyre

i 60 volum-% etanol, pH 8,25. Kolonnen ble eluert ved 20°C ved en hastighet på 50 ml per time, først i en og en halv time med ekvilibreringsbuffer og så med en linjær gradient på fra 0 til 0,1M natriumklorid i samme buffer over 16 timer. Den proteinholdige hovedfraksjon eluert ved en saltstyrke på ca. 0,05M natriumklorid ble samlet opp

hvorpå etanolen ble fjernet ved evakuering. pH-verdien til det vandige residium ble justert til 6,3 med saltsyre og sentrifugert etter oppbevaring ved 4 o5C i 1 time hvorpå

det isolerte human insulin-B30-n-dodecylamid ble fryse-tørket. Utbytte: 96 mg.

Eksempel 2

Dannelse og biologisk aktivitet av et insulinpreparat inneholdende human insulin-B30-n-dodecylamid. 30 mg human insulin-B30-n-dodecylamid ble oppløst i 10 ml M-creosol ved tilsetning av en liten mengde saltsyre hvorpå oppløsningen ble sterilisert ved filtrering. 5 ml av en steril oppløsning som var 0,05M med hensyn til natrium-di-hydrogenfosfat og 0,7M med hensyn til glycerol ble så tilsatt oppløsningen hvorpå pH-verdien ble justert til 7,3 med natriumhydroksydoppløsning. Endelig ble volumetøket til 20 ml ved tilsetning av sterilt vann.

Når det resulterende suspensjonspreparat ble injisert subkutant i marsvin (20 ul per kg) ble hypoglycemi opprett-holdt vesentlig lenger enn den hypoglycemiske effekt dannet

(R)

ved standard NPH insulinpreparat "Insulatard" .

Eksempel 3

Fremstilling av human insulin-(B21,B30)-dimetylester og human insulin-(Al 7,B30)-dimetylester henholdsvis.

500 mg human insulin-B30-metylester ble suspendert i 50 ml tørr metanol. 2,0 ml 20 vekt-% bortrifluorid i metanol ble tilsatt under omrøring. Etter oppbevaring ved romtempera-tur i 2 timer ble prøven helt i 400 ml eter og sentrifugert i 20 minutter ved x g, 4°C. Presipitatet ble vasket to ganger med eter, resuspendert i 150 ml eter, fordampet in vacuo og oppløst i 50 ml 20 mM TRIS/saltsyre, 60 volum-% etanol, pH-verdi 8,25. Prøven ble så tilført en 1,6 x 21

cm Q-Sepharose® CL-6B Fast Flow-kolonne ekvilibrert med samme buffer. Etter 1 time isokratisk eluering ved en strømningshastighet på 24 cm per time ble natriumklorid-konsentrasjonen øket linjært fra 0 til 0,1M i løpet av de følgende 16 timer. Toppen inneholdende insulin dimetyl-ester ble samlet opp i 3 hovedfraksjoner.

Den ført eluerte fraksjon ble ytterligere fraksjonert på 4 x 250 mm LiChrosorb<*>RP18 kolonne (Merck 503339), ekvilibrert med en buffer inneholdende 0,125M ammoniumsulfat, pH-verdi 4,0 og acetonitril. 1 - 2 mg protein ble tilført kolonnen og eluert med ovenfor angitte buffer inneholdende 38% acetonitril. Den proteinholdige hovedfraks jon eluerte etter 20 - 25 minutter. Acetonitrilen ble fjernet fra prøven in vacuo og proteinet satt på en SepPak (R) C18 kolonne (Waters Ass. nr. 51910), vasket med F^O og eluert med 70% metanol. Sistnevnte ble fjernet in vacuo og proteinet ble frysetørket. Herved ble det erholdt 20 ml human insulin-B21,B30-dimetylester. ;Den neste eluerte fraksjon ble behandlet på tilsvarende måte hvorved 15 mg human insulin-Al 7,B30-dimetylester ble erholdt. ;Begge human insulindimetylestere blekarakterisert vedplasma desorbsjons massespektrometri hvorved den korrekte molekylvekt ble funnet og ved dekomponering med S. Aureus protease hvorved de esterifiserte glutaminsyrer ble identi-fisert . ;Eksempel 4;Biologisk effekt av preparatene inneholdende human insulin dimetylestere. ;25 ml av medium inneholdende 1,6% (w/v) glycerol, 0,33% ;(w/v) m-cresol, 1/75 M natriumfosfat, pH-verdi 7,3 ble fremstilt. Oppløsningen ble sterilisert ved filtrering. ;2,1 mg human insulin-(A17,B30)-dimetylester fremstilt som beskrevet i eksempel 3 ble suspendert i 1,0 ml medium. ;Sterkt forlenget hypoglycemi ble observert ved tilføring av disse sinkfrie preparater subkutant til marsvin. Som det fremgår av tabellen nedenfor kan forlengelsen sammenlignes med det vanlig brukte krystallinske protamin-insulinpreparat "Insulatard"®. ; Tabellen viser blodsukkerverdier i % av utgangsverdien (n = 6 dyr). ;Eksempel 5;Fremstilling av human insulin-B30-n-heksylamid;290 mg L-treonin-n-heksylamid fremstilt som beskrevet i eksempel 9 ble oppløst i en blanding av 2,60 ml 96 volum-0/ etanol, 0,80 ml vann og 0,16 ml eddiksyre. 240 mg des-B30-alanin svineinsulin ble tilsatt under omrøring og pH-verdien justert til 6,3 til 6,4 trietylamin. En oppløsning på 5 mg trypsin i 0,10 ml 0,001M kalsiumacetat ble så tilsatt og reaksjonsblåndingen oppbevart ved 12°C. Etter to timer ;ble reaksjonsblåndingen helt opp i 20 ml 2-propanol og etter oppbevaring i 15 min. ble det utfelte protein isolert ved sentrifugering. Presipitatet ble vasket med 20 ml 2-propanol og igjen sentrifugert. ;Analyse av presipitatet ved revers fase høytrykksvæske-kromatografi viste en konversjon på 65%. ;Presipitatet ble igjen oppløst i 10 ml IM eddiksyre i 7M urea og etter filtrering ble oppløsning tilført en 2,6 x 90 cm Sephadex G50 Superfine kolonne ekvilibrert med IM eddiksyre. Denne kolonnen ble eluert med samme buffer ved en hastighet på 25 ml per time. Den proteinholdige hovedfraksjon ble samlet opp og frysetørket. ;Det frysetørkede protein ble igjen oppløst i 20 ml 60 volum-0/ etanol ved å justere pH-verdien til 8,25 med IM tris-(hydroksymetyl)-aminometan (TRIS). Etter filtrering ble oppløsningen tiført en 1,5 x 20 cm Q-Sepharose^ CL-6B FF kolonne ekvilibrert med 0,02M TRIS/saltsyre i 60 volum-"/ etanol, pH 8,25. Kolonnen ble eluert ved 20°C med en hastighet på 50 ml per time, først med ekvilibreringsbuffer i en og en halv time og i de følgende 16 timer med en linjaer gradient på fra 0 til 0,1M natriumklorid. Proteinmate-rialet som ble eluert ved en saltstyrke på ca. 0,05 M natriumklorid ble samlet opp hvorpå etanolen ble fjernet in vacuo. pH-verdien til det vandige fordampningsresidium ble justert til 6,3 med saltsyre og sentrifugert etter oppbevaring ved 4°C i 4 timer. Det isolerte humane insulin-B30-n-heksylamid ble frysetørket. Utbytte: 50 mg. ;Eksempel 6;Dannelse og biologisk effekt av et insulinpreparat inneholdende human insulin-B30-n-heksylamid. ;30 mg human insulin-B30-n-heksylamid ble oppløst i 10 ml 0,05M m-cresol ved å tilsette en liten mengde saltsyre hvorpå oppløsningen ble sterilisert ved filtrering. 5 ml av en steril oppløsning som var 0,05M med hensyn til natriumdihydrogenfosfat og 0,7M med hensyn til glycerol ble tilsatt oppløsningen og pH-verdien justert til 7,3 med en stril natriumhydroksydoppløsning. Endelig ble sterilt vann ;tilsatt for å gi et endelig volum på 20 ml.;Sukutan injeksjon (20 ul/kg) av dette preparat i marsvin resulterte i forlenget hypoglycemi som tilsvarte hypoglycemi som ble indusert ved et standard NPH insulinpreparat ("Insulatard"®) . ;Eksempel 7;Fremstilling av human insulin-A4-amid-B30-etylester.;50 mg human proinsulin hvori glutaminsyren i posisjon A4 har blitt erstattet med glutamin tilført ved en av de bioteknologiske metoder beskrevet i innledningen, ble oppløst i en blanding inneholdende 400 ul N,N-dimetylformamid, 100 ul vann og 125 mg L-treoninetylester. pH-verdien til opp-løsningen ble justert til 6,5 med eddiksyre. 2,5 mg svine-trypsin oppløst i 100 ul 0,001M kalsiumacetat ble tilsatt og reaksjonsblandingen oppbevart ved 12°C. Reaksjonen ble stoppet etter 48 timer ved å utfelle proteinene med 10 ml 2-propanol. Presipitatet ble isolert ved sentrifugering og derpå fraksjonert ved gelfiltrering og ionebytterkroma-tografi som beskrevet i eksempel 5. Herved ble 15 mg human insulin-A4-amid-B30-etylester erholdt. ;Eksempel 8;Dannelse og biologisk effekt av et insulinpreparat inneholdende human insulin-A-amid-B30-etylester. 15 mg human insulin-A4-amid-B30-etylester ble suspendert i 5 ml vandig oppløsning inneholdende 15 mg natriumacetat trihydrat, 400 mg mannitol og 30 mg fenol hvorpå pH-verdien ble justert til 7,3 og vann ble tilsatt for å gi et endelig volum på 10 ml. ;Subkutan injeksjon (20 ul/kg) av dette preparat til marsvin resulterte i en hypoglycemi av lengre varighet enn hypo- glycemien indusert ved et standard NPH insulinpreparat ("Insulatard"®) . ;Eksempel 9;Fremstilling av L-treonin alkylamider;10 mmol t-butyloksykarbonyl-L-treonin og 10 mmol alkylamin ble oppløst i 25 ml kloroform hvorpå 11 mmol N-etyloksy-karbonyl-2-etyloksy-l,2-dihydroquinolin (EEDQ) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 20°C i 16 timer hvorpå oppløsningsmiddelet ble fjernet ved fordamping in vacuo. Den resulterende viskøse olje ble igjen oppløst i 100 ml etylacetat, vasket med 2 x 50 ml 10% sitronsyre, 2 x 50 ml IM natriumbikarbonat og 2 x 50 ml vann. Den organiske fase ble tørket over vannfritt natriumsulfat og fjernet ved fordamping in vacuo. ;For å spalte av den beskyttende gruppe ble residiet oppløst i 25 ml trifluoreddiksyre og oppbevart ved 20°C i 30 min. Etter fjerning av trifluoreddiksyren ved fordampning ble den resulterende viskøse olje blandet med 50 ml IM natrium-karbonat og blandingen ekstrahert med 3 x 50 ml kloroform. De kombinerte ekstrakter ble tørket over vannfritt natriumsulfat og fordampet in vacuo. Residiet størknet til voks-aktige krystaller ved oppbevaring ved 4°C. Utbytte: 50 - 8 5%. *

Claims

1. Insulinderivat, karakterisert ved at B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og at valgfritt en til fire av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, A21, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe forutsatt at når kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfatter gruppen en alkylgruppe med minst 8 karbonatomer.

2. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe som omfatter en alkylgruppe på 8-12 karbonatomer.

3. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at B30 karboksylgruppen er blokkert som et alkylamid med minst 8 karbonatomer.

4. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og at B30 karboksylgruppen er blokkert som et amid eller med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 1-12 karbonatomer.

5. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og at B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 8-12 karbonatomer.

6. Insulinderivat ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et insulin-(A4-B30)-diamid.

7. Insulinpreparat, karakterisert ved at det inneholder minst et insulinderivat hvorved B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe og valgfritt en til fire av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, A17, A21, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe forutsatt at når kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfatter gruppen en alkylgruppe med minst 8 karbonatomer og om ønsket også inneholdende et rasktvirkende insulin.

8. Insulinpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter minst et insulinderivat hvorved kun B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe med 8-12 karbonatomer.

9. Insulinpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter minst et insulinderivat hvori B30 karboksylgruppen er blokkert som et alkylamid med minst 8 karbonatomer.

10. Insulinpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter minst et insulinderivat hvori en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjonene A4, Al 7, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og at B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 1-12 karbonatomer.

11. Insulinpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter minst et insulinderivat hvori en av karboksylsyregruppene på aminosyreresidiene i posisjon A4, Al 7, B13 og B21 er blokkert med eller konvertert til en uladet gruppe og at B30 karboksylgruppen er blokkert med en uladet gruppe omfattende en alkylgruppe på 8-12 karbonatomer. a q m a /q ir nnn r qa

12. Insulinpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter et insulin-(A4-B30)-diamid.

13. Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at det er et injeksjons -preparat som oppviser forlenget insulinvirkning og som omfatter en suspensjon på minst et insulinderivat i et isotont vandig medium med en nøytral pH og valgfritt inneholdende en buffer og/eller et preserveringsmiddel og om ønsket et rasktvirkende insulin.