NO174278B

NO174278B - Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinderivat

Info

Publication number: NO174278B
Application number: NO864556A
Authority: NO
Inventors: Per Balschmidt; Finn Benned Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1994-01-03
Also published as: EP0216832A1; DE3673737D1; FI93460C; WO1986005496A1; AU5622786A; EP0216833B1; DK545786A; IL78160A; IL78160A0; NO864555L; DK545686A; AU596968B2; DK545786D0; DE3687500T2; NO864555D0; NO864556L; EP0216832B1; DE3687500D1; DK545686D0; ATE84546T1

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler fremgangsmåter ved fremstilling av insulinderivater med et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylesterresiduum i minst én av posisjonene A4, A17, B13 og B21, hvor B-kjeden i enden ikke omfatter en amido- eller ester-rest, og fremgangsmåtene er særpreget ved at

a) minst en av glutaminsyreresiduene i posisjonene A4, A17, B13 og/eller B21 i naturlig forekommende animalt eller

humant insulin konverteres, eksempelvis ved esterifisering fortrinnsvis metylering eller amidering, til et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylester-residuum; b) det fremstilles en DNA-kjede som koder for et enkelt-kjedet forstadium (pre-pro- eller pro-form) av insulinmolekylet med glutamin i minst én av posisjonene A4, A17, B13 og/eller B21 syntetisk, hvorpå en slik DNA-kjede settes inn ved hjelp av restriksjonsenzymer i en ekspresjonsvektor, fortrinnsvis omfattende et amplifiseringssystem, som er virksom i en encellet mikroorganisme (fortrinnsvis E. coli eller Saccharomyces cerevisiae), hvorpå vektoren innføres i mikroorganismen, hvorpå det uttrykte forstadium ad enzymatisk vei omdannes til insulinderivatet; c) det fremstilles, ved rekombinante DNA-teknikker omfattende innsetting av et gen som koder for et forstadium

av et insulinderivat med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21 i et gen som koder for et annet protein som uttrykkes i en mikroorganisme, ved et sete som koder for en spaltbar aminosyre og ekspresjon av genet, et fusjonsprotein omfattende et forstadium (pre-pro- eller pro-form) av insulinmolekylet med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21, hvorpå fusjonsproteinet isoleres og spaltes med enzymer og/eller ad kjemisk vei ved den spaltbare posisjon i fusjonsproteinet, avspalt-ningsproduktene separeres og eventuelt renses, og det isolerte or renaturerte forstadium av insulinderivatet omdannes ad enzymatisk vei til det ønskede insulinderivat,

d) det fremstilles, ved rekombinante DNA-teknikker ved innsetting av en ekspresjonsvektor omfattende kodende

elementer for henholdsvis A-kjede og B-kjede til et insulinmolekyl med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21 i en encellet mikroorganisme, de enkelte A- og B-insulinkjeder, hvorpå kjedene ad kjemisk vei settes sammen til det ønskede insulinmolekyl.

I alvorlige eller kroniske tilfeller av sykdommen diabetes blir det vanligvis behandlet med injeksjonsblandinger inneholdene insulin, for eksempel svineinsulin, bovint insulin eller humant insulin.

Oppløselige insulinpreparater er vanligvis rasktvirkende, men til gjengjeld avtar virkningen etter et par timer. Derfor er det nødvendig å gi hyppige injeksjoner normalt flere ganger om dagen.

For å overvinne denne ulempen har insulinpreparater med forlenget virkning blitt dannet slik at virkningen opprettholdes i flere timer eller helt opp til 24 timer eller lengre. Ved å bruke slike forlengede preparater behøver enkelte diabetes-pasienter bare å motta et lite antall injeksjoner, for eksempel en enkelt eller to injeksjoner i løpet av 24 timer.

Slik forlenget virkning kan oppnås ved å konvertere insulinet til et dårlig oppløselig salt, så som sinkinsulin eller protamininsulin. De dårlige oppløselige insulinsalter blir brukt i form av suspensjoner fra hvilke insulinet gradvis frigjøres for eksempel etter subkutaninjeksjon.

Nylig har andre metoder blitt involvert for å oppnå en forlenget virkning. Et eksmpel på dette er innkapslingen av insulinkrystaller i polymerisert serumalbumin. Et annet eksempel er kontinuerlig virkende infusjonsanordninger, såkalte insulinpumper, som imidlertid kan være ukomfortable og representere en risiko for pasienten.

Beskrivelsene i danske patentansøkninger nr. 3582/84, nr. 3583/84 og nr. 3757/84 omhandler fremstillingen og bruken av insulinderivater hvori C-terminalen til B-kjeden er forlenget med en organisk gruppe som bærer minst en positiv ladning, fortrinnsvist Arg-OH eller Arg-Arg-OH. Preparater inneholdene supensjoner av slike insulinderivater oppviser en forlenget virkning.

Imidlertid innebefatter de foretrukne metoder for fremstilling av insulinderivater gjengitt i beskrivelsen til dansk patentansøkning nr. 3582/84 på industriell skala bruken av trypsinliknende enzymer som impliserer at enzymatisk aktivitet kan forurense de endelige preparater, jevnfør utfør-ingseksempler i beskrivelsen til dansk patentansøkning nr. 3757/84. Den forlengede virkning av ovenfornevnte insulinderivater hvori C-terminalen til B-kjeden er forlenget med en organisk gruppe som bærer minst en positiv ladning, kom-mer ene og alene fra forlengelsen av B-kjeden. Imidlertid er den forlengede B-kjeden følsom overfor enzymer som spalter B-kjeden spesielt ved B29-lysin, og følgelig kan den forlengede virkning reduseres og også fjernes. Denne enzy-matiske spalting kan også finne sted etter subkutan injeksjon, jevnfør beskrivelsen til dansk patentasøkning nr. 3583/84, side 15, linje 18. Som et resultat av den enzymat-iske aktivitet, kan den forlengede virkning av preparatene inneholdene de ovenfor nevnte insulinderivater hvori C-terminalen til B-kjeden er forlenget med en organisk gruppe som bærer minst en positiv ladning, variere vesentlig.

Det har nå overraskende blitt funnet at ved bruk av insulinderivater hvori et eller flere av de fire aminosyrerestene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylesterresiduum i insulinpreparater, spesielt injeksjonspreparater, kan man oppnå en hittil ukjent og ønsket langvarig forlenget virkning.

Følgelig omhandler oppfinnelsen fremgangsmåter ved fremstilling av insulinderivater hvori en eller flere av de fire aminosyreresiduene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylesterresiduum.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av slike insulinderivater hvori aminosyreresidier i posisjon A4 omfatter en glutaminrest eller en glutaminsyremetylesterrest.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av slike insulinderivater hvor aminosyreresidiene i posisjon A17 utgjør en glutaminrest eller en glutaminsyremetylesterrest.

En spesielt fordelaktig utførelsesform av insulinpreparater som inneholder insulinderivater frenstilt ifølge oppfinnelsen, er injeksjonspreparater som oppviser forlenget insulinvirkning og som omfatter en suspensjon av minst ett in-sul inder ivat fremstilt ifølge oppfinnelsen i et isotontvan-dig medium med en nøytral pH og valgfritt inneholdende en buffer og/eller et preserveringsmiddel og, om ønsket, et raskt-virkende insulin.

Insuliner som vanligvis brukes for behandling av diabetes, så som svin, bovin, ovin og humant insulin, inneholder alle seks frie karboksylgrupper, det vil si i A4, A17, A21, B13, B21 og B30 aminosyreresidiene. Nummereringen refererer til posisjonene i insulin A og B kjeden henholdsvis og starter ved N-terminalene. Den biologiske aktivitet til insulin vil vanligvis avta ved en økende grad av derivatisering. Imidlertid påvirkes den biologiske aktivitet overraskende lite selv ved en høy grad av derivatisering av de fri karboksylsyregrupper, men når alle seks fri karboksylsyregrupper er derivatisert blir den biologiske aktivitet fullstendig fjernet, ref. D. Levy: Biochem. Biophys. Acta, 310 (1973), side 406-415.

Ved hjelp av insulinpreparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan insulinaktiviteten opprettholdes og på samme tid kan det oppnås en overraskende forlenget virkning. Denne forlengede effekt er avhengig av antallet aitiinosyreresidier som utgjør en glutaminrest eller en glutaminsyremetylesterrest i de anførte posisjoner. Således er det mulig å variere den forlengede virkning etter ønske. En vesentlig fordel og nytt trekk til insulinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen er at den forlengede virkning er relativt ufølsom overfor tryptisk aktivitet uavhengig av opprinnelsen til den tryptiske aktivitet.

I tilfelle med insulinavhengig diabetes består en ofte brukt terapi av to daglige injeksjoner med et forlenget in-sul inpreparat, en om morgenen, og en om kvelden like før leggetid for å danne et grunnleggende insulinnivå. I tillegg blir tre injeksjoner av et raskt-virkende insulinpreparat gitt før hovedmåltidene. Ulempen med denne terapi er at den sene injeksjon av det forlengede preparat kan resultere i et farlig lavt blodsukkernivå over natten. Denne situasjonen kan unngås ved å injesere et blandet preparat av forlenget og raskt-virkende insulin før middag, hvorved hypoglycemi vil, om i det hele tatt, inntreffe i løpet av aftenen hvor det kan unngås ved hjelp av et lite måltid. Imidlertid res-ulterer denne typen terapi ofte i hyperglycemi i løpet av morgenen idet de mest brukte forlengede insulinpreparater "Insulatard" og "Monotard" ® ikke virker lenge nok. Derfor er det ønskelig å gi diabetes-pasienten insulinpreparater som virker lenger enn preparatene som vanligvis er i bruk, spesielt hvis en injeksjon av slike preparater vil være tilstrekkelig for en eller flere dager. Insulinprepa-ater fremstilt i henhold til oppfinnelsen oppviser en forlenget insulinvirkning av samme eller lenger varighet enn den til det vanligvis brukte forlengede insulinpreparat "Insulatard" ®.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av de følgende spesielle forbindelser:

Humant insulin-A17-gln

Humant insulin-A4-gin

Svine insulin-B21-gln

Humant insulin-B13-gln

Humant insulin-(A17,B21)-gin

Humant insulin-B21-metyl ester

Humant insulin-A17-metyl ester

Når insulinpreparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder et raskt-virkende insulin, kan dette insulinet for eksempel være humant eller svine-insulin.

Ved å bruke svine, bovin, ovin, kanin eller spesielt humant insulin kan insulinderivatene fremstilles på i og for seg kjent måte som angitt i krav l's karakteriserende del, såsom for konversjonen av glutaminsyrerestene til et glutamin-eller glutaminsyremetylesterresiduum, for eksempel ved esterifisering eller amidering. Således blir et insulinderivat hvori en eller flere av karboksylsyregruppene i posisjonene A4, A17, B13 og B21 er metylert, fremstilt ved å omsette humant insulin-B30-metyl ester i bornitrofluorid/metanol over passende tid fulgt av fraksjonering av de modifiserte insulinderivater og en anionbytterkolonne ved lett basisk pH-verdi. Produktene fraksjoneres og isoleres ved preparativ HPLC, hvoretter B30 metylestergruppene fjernes ved forsiktig hydrolyse i en iskald oppløsning på 0,1 N natriumhydroksyd.

Fremstillingen av insulinderivatene ifølge oppfinnelsen hvori et eller flere aminosyreresidier i posisjonene A4, A17, B13 og B21 utgjør en glutamin- eller glutaminsyremetylesterrest, kan utføres ved bruk av bioteknologiske metoder. Således kan noen eller alle av glutaminsyrerestene lokali-sert ved disse posisjoner erstattes av naturlig forekommende glutamin.

Den foretrukne fremstillingsmetode for disse modifiserte insuliner er ved biosyntese som ved for eksempel å skifte kun en enkel base i det kodon i DNA kjeden som koder for glutaminsyre, og dette kodon kan gjøres om til å kode for glutamin. Ved å forandre basene i DNA kjeden som koder for insulin (proinsulin) er det således mulig å gjøre modifikasjoner som kunne være vanskelige eller umulige å gjøre kjemisk på grunn av begrensninger med hensyn til isolering.

Det eksisterer et antall forskjellige metoder for å fremstille humant insulin ved biosyntese. Det er felles for alle av dem at DNA-kjeden som koder for enten det fullstendige proinsulin, en modifisert versjon derav eller A- og B-kjeden separat, har blitt innkodet i et repliserbart plasmid inneholdende en passende promotor. Ved å transformere dette systemet i en gitt vertsorganisme, kan et produkt dannes som kan konverteres til autentisk humant insulin på i og for seg kjent måte.

Enkelte kjente metoder for biosyntese av proinsulin eller A- og B-kjede og deres konvertering i insulin er beskrevet nedenfor.

I den velkjente Genentech- prosessen dannes et intracel-lulært preparat i E. coli av polypeptider hvori disse polypeptider er en fusjon mellom P-galaktosidase og A- og B-kjeden henholdsvis av insulin. Etter fermentering isoleres de to produkter, A- og B-kjeden spaltes av fra P-galack-tosidase ved hjelp av cyanogenbromid, hvoretter de sul-fiterte kjeder kombineres under reduserende betingelser i nærvær av ditiotreitol ved en pH-verdi på 10.5. Endelig isoleres humant insulin fra denne reaksjonsblanding.

I prosessen angitt i EPO 55945 syntetiseres produktet som et fusjonsprotein med et annet protein separert ved et spaltningssete. Dette kan være et protease-spaltbart sete eller et sete som kan spaltes kjemisk (for eksempel metio-nin). Genet for proinsulin blir for eksempel klonet som en genfusjon med et annet protein ved hjelp av rekombinante DNA teknikker. Etter isolering spaltes det kimeriske protein ved å bruke et passende enzym eller CNBr hvorpå det denatu-rerte proinsulin isoleres i en sulfitolisert form. Dette produkt renatureres under reduserende betingelser ved å bruke P-merkaptoetanol ved en pH på 10.5 som beskrevet av Frank, fulgt av trypsin/CpB spalting som beskrevet av Kemmler (1971). Det resulterende insulin isoleres på i og for seg kjent måte.

Endelig kan proinsulin fremstilles biosyntetisk ved å bruke metoden angitt i EPO 116201. I denne metoden utskilles pro-teiner i kulturmediet ved å bruke oc-faktor systemet fra Saccharomyces cerevisiae. Ved å sette inn genet som koder for proinsulin i dette system, kan proinsulin isoleres fra kulturmediet ved å bruke systemet beskrevet i dansk patent-ansøkning nr. 3091/84. Heretter kan proinsulin konverteres til insulin ved de kjente metoder beskrevet ovenfor.

Ovenfor er det beskrevet metoder i hvilke produktet enten er proinsulin eller A- eller B-kjeden separat. Videre blir disse produkter enten syntetisert sammen med en signalsek-vens med det formål å bringe produktet gjennom til cel-leoverflaten hvor det spaltes, eller som en fusjon med et protein med det formål å stabilisere produktet.

Videre er det mulig å fremstille modifisert proinsulin biosyntetisk. Europeisk patentansøkning nr. 82302071.3 angir proinsulin hvor C-kjeden er modifisert ved hjelp av rekombinante DNA teknikker.

Precursorene for humaninsulinderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles biosyntetisk i en gjærvert, som uttrykker en DNA-sekvens som koder for precursoren.

For å oppnå utskilllelse i dyrkningsmediet, kan DNA-sekvens en som koder for insulinprecursoren, fusjoneres til en annen DNA-sekvens som koder for et signalpeptid som er virksomt i gjær. Utskillelse kan oppnås ved innsettelse av Saccharomyces cerevisiae MFotl-leader-sekvensen (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)) i ekspresjonsplasmidet. Ved en foretrukket konstruksjon anvendes en DNA-sekvens som koder for hele MFcxl-leader-sekvensen inklusive det dibasiske område LysArg, men uten peptidsekvensen GluAlaGluAla, som er substratet for gjærproteasen DPAP (dipeptidylaminopep-tidase). På denne måte oppnås en effektiv utskillelse av insulinprecursorer med den korrekte N-terminal.

DNA-sekvenser som koder for modifiserte insulinprecursorer, konstrueres ved hjelp av in vitro mutagense på ekspresjonskassetten, som er inneholdt i BamHI restriksjonsfragmentet fra ekspresjonsplasmidet pYGABA som vist i fig. 1. Plasmidet inneholder seleksjonsmarkører og replikasjonssig-naler som er virksomme i gjær, og har en lengde på 1103 basepar. BamHI-fragmentet inneholder GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase)-motstrømsområdet inneholdende promotorsekvensene fra posisjon -389 til -1 ifølge Bitter og Egan, Gene 32, (1984) 263-274. Til 5'-enden av motstrømsom-rådet adderes BamHi linkere. Denne promotorsekvens fusjoneres direkte til den av Kurjan & Herskowitz beskrevne sekvens, som koder for de 85 N-terminale aminosyrer i MFcxl-leader-sekvensen . MFocl-leader-sekvensen fusjoneres direkte til kodningssekvensen for insulinprecursoren enkeltkjedet des[Thr<B30>]-humaninsulin (SCI), som er et syntetisk fremstilt gen med sekvensen

Det er også vist, at translasjonen av insulinprecursorgenet er avsluttet med to stopkodoner, og umiddelbart etter finnes et Sali restriksjonssted. Terminatorområdet er identisk med Sall-BamHI restriksjonsfragmentet beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 0 116 201 AL. Sekvensen konstrueres utelukkende under anvendelse av standardteknikker.

Ovenfor nevnte modifikasjoner av insulin kan fremstilles ved å uttrykke den modifiserte DNA-sekvens i et passende ekspresjonssystem. Forandringene i DNA-sekvensen kan foretas ved in vitro mutagenese av insulingenet ved en metode beskrevet av Thomas A. Kunkel, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, Vol. 82, pp. 448-492 (1985). I henhold til denne metode klones insulingenet i den enkeltkjedete DNA bakteriofag M13. DNA fra denne fag renses og til denne blir en primer, typisk en 15-25-mer som inneholder den gitte mutasjon (et ikkepar) såvel som en homologi på hver side av denne mutasjon, tilkoblet. Primeren blir så forlenget ved bruk av en DNA polymerase i den fullstendige lengde av faggenomet og gir således det fullstendige dobbelt-kjedete molekyl, hvori én kjede inneholder mutasjonen og den andre inneholder vill-typegenet. Ved å innføre dette molekyl i en E. coli-celle, vil fag-avkommet delvis være fager som inneholder villtype-genet, delvis fager som inneholder mutasjonen. Blant disse fager er det så mulig å isolere den ønskede type ved hybridisering med mutageniseringsprimeren til enkelt-kjedet DNA av fagavkommet. Primeren vil ha en fullstendig homologi med den muterte kjede, men vil være forskjellig fra vill-typen ved et enkelt nukleotid. Etter utvelgelse kan dobbelt-kj edet DNA isoleres fra E. coli-cellene hvori fagen repliseres, og det modifiserte insulingen kan isoleres fra dette. Dette gen blir deretter gjeninnført i det opprinne-lige ekspresjonssystem.

Injeksjonspreparatene kan omfatte insulinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen som amorfe og/eller krystallinske suspensjoner, enten seprarat eller i kombinasjon med andre slike insulinderivater og/eller naturlig forekommende insuliner. Det har blitt funnet at et flertall av disse derivater kan krystalliseres med sink enten ved en pH-verdi som er høyere enn deres isoelektriske punkter eller ved en pH-verdi omkring den isoelektriske pH-verdi når krystalliseringsmediet inneholder et fenol. Det er også mulig å krystallisere insulinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen i nærvær av protamin eller et overskudd av sink som forårsaker en ytterligere forlenget aktivitet. . Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved hjelp av de følg-ende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av human insulin-B21-metyl ester

500 mg av human insulin-B30-metyl ester ble suspendert i 50 ml tørr metanol. 2,0 ml 205 w/v bortrifluorid/metanol ble tilsatt ved omrøring. Etter oppbevaring ved romtemperatur i 2 timer ble suspensjonen helt oppi 400 ml eter og sentrifu-gert ved 2500 x g ved 4°C i 20 minutter. Precipitatet ble vasket to ganger med eter, resuspendert i 150 ml eter, for-dampet in vakuum og oppløst i 50 ml 20mM TRIS/HCl, 60 volum% etanol, pH 8,25. Prøven ble så tilført en 1,6 x 21 cm Q-Sepharose ® CL-6B Fast Flow kolonne ekvilibrert med samme buffer. Etter 1 time isokratisk eluering ved en strømnings-hastighet på 24 cm/time ble kolonnen eluert med en natriumklorid-gradient som øket fra 0 til 0,1 M over de neste 16 timer. Insulindimetylestertoppen ble delt i tre hoved-fraksjoner.

Fraksjonen som eluerte først ble ytterligere fraksjonert på en 4 x 250 mm LiChrosorb ® RP18 kolonne (Merck 503331) ekvilibrert med 0,125 M ammoniumsufat, pH-verdi 4,0 og 38 volum% acetonitril ved 45°C. Etter tilføring av 1-2 mg insulindimetylester eluerte hovedproteinfraksjonen ved 20-

25 minutter med en strømningshastighet på 12 cm/minutt.

10 mg insulindimetylester således erholdt ble oppløst i 1 ml iskald 0,1 N natriumhydroksydoppløsning. Reaksjonsblandingen ble tillatt oppbevart ved 0°C i 5 minutter hvorpå pH-verdien ble justert til 9 med saltsyre. Blandingen ble tilført en 0,5 x 5 cm Mono Q ® anionbytterkolonne og fraksjonert i 30 minutter i 20 mM TRIS/HCl, 60 volum% etanol, pH 8,25 med en liniær natriumkloridgradient som økte til 0,1 M med en strømningsgrad på 5,1 cm/minutt. Etter fjerning av etanolen in vakuum fra fraksjonen inneholdende human insulin-B21-metylester, ble proteinet utfelt ved en pH-verdi på 6,3. Utbytte: 7 mg.

Human-B21-metylester ble karakterisert ved Plasma Desorp-tion Mass Spectrometry som viste den korrekte molekylvekt og ved nedbrytning med S. Aureus protease, hvorved B21 ester posisjonen ble bekreftet.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av human insulin-A17-metylester

Human insulin-A17-metylester ble isolert og identifisert som beskrevet i eksempel 1, men hvor den andre eluerte insulindimetylesterfraksjonen isolert fra anionbytter-kromatograferingssteget ble brukt for ytterligere fraksjonering. Herved ble 6,5 mg human insulin-A17-metylester erholdt.

EKSEMPEL 3

Formulering og biologisk effekt av et preparat inneholdende human insulin-B21-dimetylester

25 ml medium inneholdende 1,6 % (w/v) glycerol, 0.33 % (w/v) m-cresol, 1/75 M natriumfosfat, pH-verdi 7,3 ble fremstilt. Oppløsningen ble sterilisert ved filtrering. 1,5 mg human insulin-B21-metylester fremstilt som beskrevet i eksmpel 1, ble suspendert i 1,0 ml medium.

En forlenget hypoglycemi ble observert i marsvin etter subkutan tilførsel av dette sinkfrie preparat. Den resulterende forlengede insulinvirkning kan sammenlignes med hypoglycemi observert etter injeksjon av et standard protamin-insu-1inpreparat "Insulatard"

EKSEMPEL 4

Formulering og biologisk effekt av et krystallinsk insulinpreparat inneholdende human insulin-A17-metylester.

4,5 mg human insulin-A17-metylester ble oppløst i 2,7 ml 0,015 M fosforsyre, 21 mg natriumklorid og 4,1 pl av en vandig oppløsning 152 mM sinkklorid ble tilsatt. Oppløs-ningen ble sterilisert ved filtrering. PH-verdien til opp-løsningen ble justert til 8,0 under aseptiske betingelser med en steril vandig oppløsning av natriumhydroksyd. PH-verdien av oppløsningen ble så rejustert til 7,3 med steril saltsyre og rhombohedriske krystaller med en gjennomsnittlig størrelse på 10 pm ble dannet under forsiktig omrøring ved 21<0>C. Volumet ble justert til 3 ml med sterilt vann.

Videre ble en steril oppløsning av 5 ml 13,5 mM fosforsyre

i blanding med 21 mg natriumklorid og 9 pl m-kresol fremstilt og pH-verdien ble justert til 7,3 med en steril vandig oppløsning av natriumhydroksyd. De to oppløsninger ble slått sammen.

En slik oppløsning induserer sterkt forlenget hypoglycemi i marsvin ved en dose på 18 pg/kg. Den forlengede insulinvirkning erholdt er lenger enn den forlengede virkning av det kjente injeksjonspreparat "Insulatard" ®. Arealet under blodglukosekurven indikerer at insulinderivatet oppviser nesten den samme biologiske aktivitet som humant insulin.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av human insulin-A4-gin

150 mg human proinsulin-A4-gln, dannet ved en av de biosyntetiske metoder beskrevet ovenfor, ble oppløst i 30 ml TRIS/saltsyre, pH-verdi 7,5, inneholdende 3 mg matrise-bundet trypsin (Trypsin-Sepharose ® Fast Flow). Blandingen ble tillatt oppbevart ved romtemperatur i 1 time hvorpå resinet ble fjernet ved filtrering. Det resulterende desB30-insulin-A4-gln ble isolert ved utfelling ved en pH-verdi på 6,3 og frysetørket. Proteinpulveret ble oppløst i en blanding inneholdende 200 mg treoninmetylester, 1000 pl etanol og 400 pl destillert vann. PH-verdien ble justert til 6,3 med eddiksyre og 1 mg matrisebundet trypsin ble blandet i. Etter oppbevaring i 2 timer ved romtemperatur under forsiktig omrøring ble proteinet utfelt etter filtrering ved tilsetning av 10 volumdeler 1-propanol. Det tørkete presi-pitat ble gjenoppløst i 20 mM TRIS/saltsyre, 60 volum% etanol, pH-verdi 8,25, tilført en 1,6 x 20 cm Q-Sepharose <®> CL-6B Fast Flow kolonne ekvilibrert med nevnte buffer og eluert med en liniær natriumkloridgradient som økte fra 0 til 0,1 M over 15 timer ved en strømningshastighet på 24 cm/h. Etanolen ble fjernet i vakuum fra fraksjonen inneholdende A4-gln-human-insulin-B30-metylester, og proteinet ble utfelt ved justering av pH-verdien til 6.8. B30-metylester ble hydrolysert i 10 minutter i kald 0,1 M natriumhydroksyd ved en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml fulgt av justering av pH-verdien til 8,25. Proteinoppløsningen ble tilført en 1,6 x 20 cm Q-Sepharose ® CL-6B Fast Flow kolonne etter fortynning med 2 volumdeler 20 mM TRIS/saltsyre pH-verdi 8.25, og eluert som beskrevet ovenfor. Proteinet ble utfelt ved en pH-verdi på 6,3 etter fjerning av etanolen. 3 0 mg human insulin-A4-gln ble erholdt etter frysetørking.

Renheten av produktet ble bekreftet ved revers fasehøytrykk-væskekromatografi og identiteten av produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, multisteg Edman-degradering og plasma-

desorpsj onsmassespektrometri.

EKSEMPEL 6

15 mg human insulin-A4-gin erholdt som beskrevet i eksempel 5, ble oppløst i 10 ml av en oppløsning inneholdende 13.5 mM fosforsyre, 0,3 % m-kresol og 1,6 % glycerol. Oppløsningen ble sterilisert ved filtrering og pH-verdien ble justert til 9,0 med en steril vandig oppløsning av natriumhydroksyd. PH-verdien ble rejustert til 8,2 med en steril oppløs-ning av saltsyre og human insulin-A4-gin krystallisert som rhombohedriske krystaller med forsiktig omrøring.

Ved subkutan injeksjon av denne krystallinske suspensjon i marsvin ved 0,5 IU/kg, er den resulterende forlengede hypoglycemi ske effekt nesten identisk både i tid og styrke til den hypoglycemiske effekt forårsaket ved injeksjon av "Insulatard" ® ved 0,5 IU/kg.

EKSEMPEL 7

15 mg humaninsulin-A4-gln, fremstilt som beskrevet i eksempel 5, oppløses i 7 ml 20 mM dinatriumfosfat, 1,0 % natriumklorid, 0,3% m-kresol, idet pH justeres til 9 med 1 M natriumhydroksyd. Etter tilsetning av 13 pl 0,1 M sinkacetat omrøres oppløsningen lett til den er klar, hvorpå den sterilfiltreres. pH-verdien innstilles derpå til 6,3 med steril saltsyre, hvorved insulinderivatet utkrystalliserer. Til slutt etterfylles til 10 ml med sterilfiltrert 0,3 % m-kresol.

Ved subkutan injeksjon av den resulterende krystallsuspen-sjon i griser i en mengde på 12 pl pr. kg inntrer tidspunktet for den maksimale hypoglycemiske virkning vesentlig senere enn ved et kjent humaninsulinprepaarat ("Velosulin"®) og faller omtrent sammen med tidspunktet for den maksimale virkning av et kjent protrahert humaninsulinpreparat ("Insulatard"®). Tidsforløpet av virkningen er vist på

tegningen i fig. 2.

EKSEMPEL 8

1800 mg enkeltkjedet (21-gln)-des(30-65)-humant proinsulin, som er fremstilt ved en av de ovenfor omtalte biosyntetiske fremgangsmåter, settes til 350 ml suspensjon av 70 ml (sedimentert volum) matriks-bundet trypsin (Trypsin-"Sepharose<11>® Fast Flow. 0,8 mg enzym pr. ml gel) i 0,05 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan, 20% (volum) etanol, pH 8,1 (saltsyre), og blandingen omrøres lett i 6 timer ved 4°C. Gelen frafiltreres, og filtratet inneholdende (B21-gln)-des(B30)-humaninsulin justeres til pH 6,3. Det herved utfelte protein isoleres ved sentrifugering og frysetørkes. Proteinet gjenoppløses i en blanding av 4 g threonin-metylester, 20 ml etanol og 8 ml vann. pH justeres til 6,3 med eddiksyre og 32 ml Trypsin-"Sepharose"® tilsettes. Etter henstand i 2 timer ved 20°C under lett omrøring, frafiltreres gelen og proteinet utfelles ved tilsetning av 10 volumdeler 2-propanol. Det lufttørkete bunnfall gjenoppløses i 0,02 M tris(hydroksymetyl)-aminometan, 60% (volum) etanol, pH 8,25 (saltsyre), settes på en 5 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast FLow-kolonne, ekvilibrert med samme puffer og elueres derpå med en liniær NaCl-gradient i samme puffer fra 0 til 0,1 M i løpet av 15 timer med et flow på 500 ml pr. time.

Etanol fjernes i vakuum fra fraksjonen inneholdende (B21-gln)-humaninsulin-B30-metylester, og proteinet utfelles ved innstilling av pH til 6,5. Etter sentrifugering og frysetør-king hydrolyseres metylesteren i 10 minutter i kaldt 0,1 M natriumhydroksyd etterfulgt av justering av pH til 9. Oppløsningen fortynnes med 2 volumdeler 0,02 M tris(hydrok-symetyl ) aminometan pH 8,5 (saltsyre), og settes på en 5 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow-kolonne, som deretter elueres som ovenfor anført. Proteinet felles ved justering av pH til 6,3 etter vakuumavdampning av etanolen. 175

mg humaninsulin-B21-gln ble oppnådd etter frysetørking.

Identiteten av produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse samt ved nedbrytning med S. Aureus-protease etterfulgt av flertrinns-Edman-nedbrytning av bruddstykkene.

EKSEMPEL 9

15 mg humaninsulin-B21-gln, fremstilt som beskrevet i eksempel 7, oppløses i 7 ml 20 mM dinatriumfosfat, 1,0% natriumklorid, 0,3% m-kresol, idet pH justeres til 9 med 1 M natriumhydroksyd. Etter tilsetning av 13 pl 0,1 M sinkacetat omrøres lett til oppløsningen er klar, hvorpå den sterilfiltreres. pH-verdien innstilles deretter til 6,3 med steril saltsyre, hvorved insulinderivatet utkrystalliserer. Til slutt etterfylles til 10 ml med sterilfiltrert 0,3% m-kresol.

Ved subkutan injeksjon av den resulterende krystallsuspen-sjon i griser i en mengde på 12 pl pr. kg inntrer tidpunktet for den maksimale hypoglycemiske virkning vesentlig senere enn ved et kjent humaninsulinpreparat ("Velosulin"®) og faller omtrent sammen med tidspunktet for den maksimale virkning av et kjent protrahert humaninsulinpreparat ("Insulatard"®) . Tidsforløpet av virkningen er vist på tegningen i fig. 2.

EKSEMPEL 10

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid samt uttrykkelse av og opprensning av [Gln<A4>»A17]-SCI precursoren og fremstilling av [GlnA4#A17]-humaninsulin herav.

Ekspresjonskassetten, som er inneholdt i ekspresjonsplasmidet pYGABA (se fig. 13) på et BamHI restriksjonsfragment, isoleres på følgende måte: Ekspresjonsplasmidet inkuberes med restriksjonsendonukleasen BamHI under følgende betingelser: 20pg plasmid, 50 enheter BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i en mengde på 100 pl. Det ble anvendt en temperatur på 37°C og en reaksjonstid på 2 timer. De to DNA-fragmenter ble adskilt på en 1%'s agarosegel, og det ønskete fragment isoleres.

Ligering av M13 vektoren M13mpl8

Det isolerte restriksjonsfragment ligeres til bakteriofag-vektoren M13mpl8, som likeledes er skåret med restriksjonsendonukleasen BamHI i følgende reaksjonsblanding: Fragment 0,2 pg, vektor 0,02 pg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i en mengde på 20 pl. 5 pl av denne blanding ble overført til E. coli stamme JM101. Tilstedevæ-relsen av fragmentet i vektoren og fragmentets orientering bestemmes ved restriksjonsenzymkortlegning på dobbeltstren-get M13-DNA isolert fra transformantene.

Isolering av enkeltstren<g>et ( ss) DNA ( templat)

Fra den ovenfor beskrevne transformant isoleres ss-DNA i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet av Messing i Gene, 19, 269-276 (1982).

51- fosforylering av mutageniseringsprimeren

Mutageniseringsprimeren med sekvensen

5'-ACAACATTGTTGAACAATACC-3• fosforyleres i 5<1->enden i en reaksjonsblanding på 30 pl som inneholder 70 mM Tris-HCl-, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonukleotid og 3,6 enheter T4 polynukleotidkinase. Reaksjonen gjennomføres i 30 minutter ved 38°C, hvoretter enzymet inaktiveres ved inkubering av blandingen i 10 minutter ved 65°C.

Annellering av templat og fosforvlert mutageniseringsprimer

Annellering av templat og primer gjennomføres i en mengde på 10 pl inneholdende 0,5 pmol templat, 5 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM DTT ved oppvarmning i 10 minutter til 65°C og etterfølgende avkjøling til 0°C.

Forlengelses/ ligeringsreaksion

Til den ovenfor anførte reaksjonsblanding settes IOjjI av en blanding med følgende sammensetning: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM JTTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enheter T4 DNA ligase og 2,5 enheter Klenow-polymerase. Reaksjonen ble gjennomført i 16 timer ved 16°C.

Transformasjon av JM101

Den ovenfor beskrevne reaksjonsblanding transformeres i forskjellige fortynninger til CaCl2-behandlete E. coli JM101 celler under anvendelse av standardteknikker og utplates i 2 x YT toppagar på 2 x YT agarplater. (2 x YT = trypton 16 g/l, gjærekstrakt 10 g/l, NaCl 5 g/l. 2 x YT toppagar = 2 x YT tilsatt 0,4 % agarose og autoklavert. 2 x YT agarplater = 2 x YT tilsatt 2 % agar og autoklavert). Platene inkuberes natten over ved 37°C.

Identifisering av positive kloner

Første mutageniseringstrinn

Det ble anvendte den såkalte "plaque-lift" hybridiseringsme-tode som beskrives i det følgende: Et nitrocellulosefilter ble anbragt på en plate med en egnet plague-tetthet, slik at filtret ble fuktet. Filtret ble deretter badet i følgende oppløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 30 sek., 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 min., 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsitrat) for senere anvendelse. Filtret ble tørket på 3 M filterpapir og oppvarmet i 2 timer ved 80°C i et vakuumskap.

Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5<1->ACAACATTGTTGAACAATACC-3<1> ble merket radioaktivt i 5<1->enden i 30 pl av en blanding inneholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 5 mM DTT, 10 pmol oligonukleotid, 20 pmol T-<32>p-ATP og 3,5 enheter T4 polynukleotidkinase. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter og derpå ved 100°C i 5 minutter.

Det tørkete filter forhybridiseres i 2 timer ved 65'C i 6 x SSC, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyr-rolidon, 0,2 % natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 pg/ml laksesperm DNA. Deretter settes reaksjonsblandingen inneholdende den merkee prøve, til 15 ml frisk forhybridise-ringsblanding, og filtret bades deri natten over ved 27°C under forsiktig rysting. Etter hybridisering vaskes filtret tre ganger i perioder på 15 minutter i 2 x SSC + 0,1% SDS, hvorpå det ble autoradiografert. Etter vask i den samme oppløsning, men ved en temperatur på 50°C og etterfølgende autoradiografering identifiseres plaque'er som inneholder DNA-sekvenser som er komplementære til mutageniseringsprimeren.

Da den identifiserte klon er et resultat av en hetero-dupleks, utplates plague'en igjen. Hybridiseringen og identifiseringen gjentas.

Annet mutaqeniserinqstrinn

Det ble gått frem som beskrevet ovenfor for det første mutageniseringstrinn, idet det dog som primer anvendes 5'-ACAGTAGTTTTGCAATTGGTA-3<1>.

Rensing av dobbeltstrenqet M13- faq DNA

En genscreenet klon anvendes til infisering av E.coli stamme JM101. En kultur inneholdende ca. IO<8> fager og 5 kolonier JM101 dyrkes i 5 timer i 5 ml 2 x YT medium ved 37°C. Deretter renses dobbelstrenget cirkulært DNA opp fra pelleten under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av

Birnboim og Doly, Nucleic Acis Res., 2, 1513 (1979).

Isolering av et restriksjonsfragment. som inneholder modifisert insulinprecursor

Den ovenfor isolerte DNA-preparasjon (ca. 5 pg) spaltes med 10 enheter av restriksjonsendonukleasen BamHI i 60 pl- 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37°C. DNA-produktene ble atskilt på en agarosegel, og fragmentet ble renset opp fra gelen.

Liqering til giærvektoren pAB24 ffig. 3)

Det isolerte restriksjonsfragment ligeres til gjærvektoren pAB24 spaltet med restriksjonsendonukleasen BamHI i en reaksjonsblanding med følgende sammensetning: Fragment 0,2 pg, vektor 0,02 pg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et samlet volum på 20 pl. 5 pl av denne reaksjonsblanding ble brukt til transformasjon av E. coli stamme MC1061, hvori det modifiserte ekspresjonsplasmid identifiseres og propageres. Plasmided betegnes pYGAB-A4-A17-A og er identisk med pYGABA, bortsett fra de endrete kodoner.

Transformasjon av gjær

Transformasjon av ekspresjonsplasmidet til gjærstammen Saccharomyces cerevisiae JC482ApepALeu2cir° (cx, his4, pep4, ura3, leu2, cir°) ble gjennomført som beskrevet av Ito et al., J. Bact., vol. 153. nr. 1, 163-168 (1983). De trans-formerte celler ble platet ut på SC-ura medium (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glukose, 0,5% kasaminosyrer, 2,0% agar) til seleksjon av plasmidholdige celler.

Ekspresjon av precursor og isolering fra dyrkningsmedium

Gjær transformert som beskrevet ovenfor propageres på Petri-plater inneholdende minimalmedium uten uracil i 48 timer ved 30°C. 100 ml rystekolber inneholdende minimalmedium uten uracil + 5 g/l kasaminosyrer + 10 g/l ravsyre + 3 0 g/l glukose ved pH 5,0, inokuleres med en enkelt koloni fra petriplaten. Kolbene rystes deretter ved 30°C i en inkubator i 72 timer.

Etter sentrifugering sterilfiltreres 1 liter sammenblandet supernatant, og pH ble innstilt på 4-4,5 og en ledningsevne

<10 mS ved tilsetning av 5 M HCl og vann. Med et flow på 120 ml/time settes supernatanten deretter på 1,6 x 6 cm søyle av "S-Sepharose<11>® FF, som er blitt ekvilibrert på forhånd med 50 mM eddiksyre, 50% (volum) etanol innstilt på pH 4,0 med NaOH. Søylen vaskes med 60 ml puffer, og precursoren elueres ved hjelp av en liniær NaCl-gradient fra 0 til 0,365 M i 360 ml puffer med et flow på 10 ml/time. Eluatet ble delt opp i fraksjoner på 4 ml og undersøkt for UV-absorpsjon. Precursorholdige fraksjoner identifiseres ved hjelp av RP-HPLC analyse og helles sammen. Etter avsaltning på en "Sephadex"® G25-søyle i 1 M eddiksyre isoleres precursoren ved frysetørking.

Fremstilling av [Gln<A4>'<A17>]-humaninsulin ut fra precursor

150 mg [Gln<A4>'<A17>]-SCT, fremstilt som beskrevet ovenfor, settes til 30 ml 50 mM TRIS/hydroklorid 20% (volum) etanol, pH 7,8, inneholdende 7,5 ml (bunnfelt volum) Trypsin-"Sepharose"® Fast Flow (0,8 mg enzym/ml gel). Blandingen henstår med forsiktig omrøring ved 4°C i 16 time, hvoretter harpiksen frafiltreres. Det dannete [Gln<A4>'A17]-des-(B30)~ insulin isoleres ved felling ved en pH-verdi på 6,3 og frysetørkes. Proteinpulveret oppløses i en blanding inneholdende 200 mg treoninmetylester, 1000 pl etanol og 400 pl destillert vann. pH-verdien ble innstilt på 6,3 med eddiksyre, og 1 g awannet matriksbunnet trypsingel iblandes. Etter henstand i 2 timer ved stuetemperatur med forsiktig omrøring felles proteinet ut etter filtrering ved tilsetning av 10 volum 2-propanol. Det tørre bunnfall gjenoppløses i 20 mM TRIS/HC1, 60 volum-% etanol, pH-verdi

8,25, oppløsningen settes på en 1,6 x 20 cm Q-<ll>Sepharose"® CL-6B Fast Flow søyle ekvilibert med pufferen, og det elueest med en liniær natriumkloridgradient fra 0 til 0,1 M i løpet av 15 timer med en flowrate på 48 ml/time. Etanolete fjernes i vakuum fra fraksjonen som inneholder [Gln<A4>»A17]-humaninsulin-B30-metylester, og proteinet felles ved innstilling av pH-verdien til 6,8. B30-metylesteren hydrolyseres i 10 minutter i kaldt 0,1 M natriumhydrok-sydoppløsning ved en proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml, hvoretter pH-verdien innstilles på 8,25. Proteinoppløsningen settes på en 1,6 x 20 cm Q-"Sepharose"® CL-6B Fast Flow søyle etter fortynning med 2 volum 20 mM TRIS/hydroklorid, pH-verid 8,25, og elueres som beskrevet ovenfor. Proteinet felles ved en pH-verdi på 6,3 etter fjernelse av etanolen. 30 mg [Gln<A4>'<A17>]-humaninsulin ble erholdt etter frysetør-king.

Produktets renhet bestemmes ved høytrykksvæskekromatografi ved omvendt fase, og produktets identitet bekreftes ved flertrinns Edman-nedbrytning og plasmadesorpsjonsmasse-spektrometri.

EKSEMPEL 11

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [Gln<A>4'B21]-SCI precursor, samt fremstilling [Gln<A4>'821]-humaninsulin herav.

Det ble gått frem på samme måte som beskrevet for GlnA4/17 ] - SCI precursoren, idet det imidlertid i det andre mutageniseringstrinn anvendes en mutageneriseringsprimer med sekvensen

5<1->GAACCTCTTTGACCACAAAC-3'.

200 mg [Gln<A>4'B21]-SCI fremstilt herved settes til 50 ml suspensjon av 10 ml (sedimentert volum) matriks-bunnet trypsin (Trypsin-"Sepharose"® Fast Flow, 0,8 mg enzym pr. ml gel) i 0,05 M trietylamin, 20% (volum) etanol, pH 9 (saltsyre), og blandingen omrøres lett i 15 minutter ved

20°C. Gelen filtreres fra og filtratet inneholdende [(A4,B21)-gin]-des(B30)-humaninsulin justeres til pH 6,5. Det ved dette utfelte protein isoleres ved sentrifugering og frysetørkes. Proteinet gjenoppløses i en blanding av 500 mg treonin-metylester, 2,5 ml etanol og 1 ml vann, og pH justeres til 6,3 med eddiksyre. 4 ml Trypsin-"Sepharose"® tilsettes, og etter henstand i 2 timer ved 20°C under lett omrøring fjernes gelen ved filtrering, og proteinet felles ut fra filtratet ved tilsetning av 10 volumdeler 2-propanol. Det lufttørkete bunnfall gjenoppløses i 0,02 M tris/hy-droksymetyl)aminometan. 60% (volum) etanol, pH 8,25 (saltsyre), settes på en 1,6 x 20 cm kolonne av "Q-Sepharose"® CL-6B Fast FLow, som er ekvilibrert med samme puffer og elueres deretter med en liniær NaCl-gradient i samme puffer fra 0 til 0,1 M i løpet av 15 timer med et flow på 50 ml pr. time.,

Etanolen fjernes i vakuum fra fraskjonen inneholdende [(A4,B21)-gin]-humaninsulin-B30-metylester, og proteinet felles ut ved justering av pH til 7. Etter sentrifugering og frysetørking hydrolyseres metylesteren i 10 minutter i kaldt 0,1 M natriumhydroksyd etterfulgt av justering av pH til 9,8. Oppløsningen fortynnes med 2 volumdeler 0,02 M tris(hydroksymetyl)aminometyl, pH 9 (saltsyre), og settes på en 1,6 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast flow-kolonne, som deretter elueres som ovenfor anført. Proteinet felles ved justering av pH til 6,5 etter vakuumavdampning av etanol. 20 mg [(A4,B21)-gin]-humaninsulin ble oppnådd etter frysetør-king.

EKSEMPEL 12

Formulering av injeksjonspreparat med protrahert virkning inneholdende en krystallinsk suspensjon av henholdsvis [GlnA4'A1<7>]-humaninsulin og [Gln<A4>'B21]-humaninsulin 60 pmol humaninsulinanalog oppløses i 70 ml 1%'s NaCl-oppløsning inneholdende 0,5 % m-kresol ved innstilling av pH-verdien på 9,7 med 1 M NaOH, og det tilsettes 325 pl 0,1 M sinkacetat. Etter gjeninnstillingen av pH-verdien på 9,7 ble volumet innstilt på 80 ml med vann og oppløsningen sterilfiltreres. 20 ml 65 mM NaH2P04-oppløsning inneholdende 0,3% m-kresol og innstilt på pH-verdien 6,0 med NaOH sterilfilteres.

Under sterile betingelser blandes to oppløsninger, og den dannete suspensjon får henstå ved 20"C i 1 time under meget forsiktig omrøring. Til slutt innstilles pH-veriden på 7,3 med HC1.

Påvisning av protrahert virkning etter subkutan injeksjon i rotter ved hjelp av ekstern ~ y- telling

Til forsøkene anvendes hunnrotter (Wistar) med en legemsvekt på ca. 250 g og en alder på over 90 dager. Rottene ak-klimatiseres i ca. 1 uke før forsøket og har fri adgang til for. I 4 dager før forsøket startet gis rottene en 20 mM vandig kaliumjodidoppløsning som drikkevann.

Det anvendes følgende forsøkspreparater:

1. Suspensjonspreparat inneholdende Gln<A4>'<A17>]-humanin-sul in. 2. Suspensj onspreparat inneholdende [GlnA4'B21]-humaninsulin. 3. Oppløsningspreparat inneholdende semisyntetisk humaninsulin ("Velosulin"®), 100 enheter/ml.

Alle tre formuleringer inneholder dessuten 50 pCi/ml av henholdsvis [mono-<125>I]-insulinsporstoff eller insulin-analogsporstoff fremstilt ved standardjoderingsmetoder med radioaktivt jod.

Rottene injiseres subkutant på baksiden av låret med 50 pl preparat inneholdende 3,5 nmol insulinforbindelse og 2,5 pCi [<125>I]-mkeret sporstoff. I løpet av forsøksperioden er rottene immobilisert i rotteholdere.

Sporstoffets forsvinning fra injeksjonsstedene, som er et mål for absorpsjonen av insulinforbindelsen fra det subkuktane depot (jf. C. Binder: Absorption of Injected Insulin, Munksgaard, København, 1969), måles under anvendelse av to stasjonære MIP-10 hastighetsmålere og detektorer E749 med 3 mm Nal-scintillasjonskrystaller med Be-vinduer og collimatorer med 60° synsvinkel og 10 mm åpninger (Raytronic). Hastighetsmålerne er forbundet med Mini-recordere 12IN (Raytronic). Detektorene er fastgjort 2 cm over huden på injeksjonsstedene. Radioaktiviteten måles over en 5 minutters periode 0, 0,5, 1, 1,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 og 24 timer etter injeksjon av preparatet. Etter subtraksjon av bakgrunnstellinger omregnes tellingene til prosent av begynnelsestellingen.

I fig. 4 er avbildet gjennomsnittsverdiene for den reste-rende radioaktivitet som funksjon for tiden av hvert preparat. Når tidspunktet for 50% restaktivitet (T50%) anvendes som uttrykk for den protraherte virkning, oppnås følgende verdier fra kurvene:

Disse resultater viser at preparatene, som inneholder de to humaninsulinanaloger fremstilt ifølge oppfinnelsen viser en uttalt protrahert virkning sammenlignet med preparatet inneholdende humaninsulin.

EKSEMPEL 13

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [Gln^f^-^-SCI precursor, samt fremstilling av [Gln<A4>'813]-humaninsulin herav

Det gås frem på samme måte som beskrevet for Gln<A4>'<A17>]p-SCI precursoren, idet det imidlertid i det andre mutageniseringstrinn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5<1->GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3<1>.

Ut fra 225 mg [Gln<A4>'B13]-SCI fremstilt herved oppnås det 30 mg [Gln<A4>'B13]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>'A17]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

Produktets renhet bestemmes ved høytgrykksvæskekromatografi med omvendt fase, og produktets identitet ble bekreftet ved hjelp av flertinns Edman-nedbrytning og plasmadesorp-sj onsmassespektrometri.

EKSEMPEL 14

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [Gln<A17>'B13]-sci recursor, samt fremstilling av [Gln<A17>'B13]-humaninsulin herav.

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [Gln<A14>'<A17>]-SCI precursoren, idet det imidlertid i det første mutageniseringstrinn ble anvendt en mutageniseringsprimer med sekvensen 5'-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3<1>, og i det andre mutageniseringstrinn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5<1->ACAGTAGTTTTGCAATTGGTA-3<1>.

Ut fra 175 mg [Gln<A17>'<B13>]-SCI fremstilt herved oppnås det 20 mg [Gln<A17>'B13]-humaninsulin analogt med den ovenfor for

[GlnA4'A17]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

Produktets renhet bestemmes ved høytrykksvæskekromatografi med omvendt fase, og produktets identitet bekreftes ved hjelp av flertrinns Edman-nedbrytning og plasmadesorpsjons-massespektrometri.

EKSEMPEL 15

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [Gln<B13>'B21]-SCI recursor, samt fremstilling av [Gln<B13>'<21>]-humaninsulin herav.

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [GlnA4'A1<7>]-SCI precursoren, idet det imidlertid i det første mutageniseringstrinn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5•-GAAACCTCTTTGACCACAAAC-3<1>, og det i det andre mutageniseringstirnn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5'-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3<1>.

Ut fra 150 mg [Gln<B13>,<B21>J-SCI fremstilt herved oppnås det 10 mg [Gln<B13>'B21]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>'B21]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

EKSEMPEL 16

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [GlnlA<1>7'B21]-SCI precursor, samt fremstilling av [Gln<A17>'<B21>]-humaninsulin herav.

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [Gln<A4>'A17]-SCI precursoren, idet det imidlertid i det første mutageniseringstrinn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5<1->ACAGTAGTTTTGCAATTGGTA-3<1>, og det i de andre mutageniseringstrinn anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5<1->GAAACCTCTTTGACCACAAAC-3<1>.

Ut fra 200 mg [Gln<A1>7'B21]-SCI fremstilt herved oppnås 15 mg [Gln<A17>/B21]-humaninsulin analogt med de ovenfor for [Gln<A>4/B21]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

EKSEMPEL 17

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [Gln<A4>'<A1>7'B21]-SCI recursor, samt fremstillling av [Gln<A4>'<A17>»B21]-humaninsulin herav.

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [Gln<A4>'A17]-SCI precursoren, idet det imidlertid i et tredje mutageniseringstrinn, som utføres på samme måte som det andre trinn, anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen

5 »-GAAACCTCTTTGACCACAAAC-31.

Ut fra 150 mg [Gln<A4>/<A1>7'B21]-SCI fremstilt herved oppnås det 10 mg [Gln<A4>'<A17>'B21]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>'B21]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

EKSEMPEL 18

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse og fremstilling av [GlnA4'B<13>'B21]-SCI precursor, samt fremstilling av [GlnA4»B13*B21]-humaninsulin herav

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [Gln<A4>'13]-SCI precursoren, idet det imidlertid i et tredje mutageniseringstrinn, som utfores på samme måte som andre tirnn, anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen

51-GAAACCTCTTTGACCACAAAC-3 «.

Ut fra 185 mg [Gln<A4>'<B13>'B21]-SCI <f>remstilt herved oppnås det 15 mg [Gln<A4>'<B13>'B21]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>'B21]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

Produktets renhet bestemmes ved høytrykksvæskekromatografi med omvendt fase og produktets identitet bekreftes ved hjelp av flertrinns Edman-nedbrytning og plasmadesorpsjons-massespektrometri.

EKSEMPEL 19

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [GlnA4'Al7,B13]-SCI precursor, samt fremstilling av Gln<A4>'<A17>'B13]-humaninsulin herav

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [Gln<A4>'<A>17]-SCI precursoren, idet det imidlertid i et tredje mutageniseringstrinn, som utføres på samme måte som andre trinn, anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen 5<1->

GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3<1>.

Ut fra 200 mg [Gln<A4>'<A1>7'B1<3>]-SCI fremstilt herved oppnås det 24 mg [GlnA4'A<17>,B13]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>,B21]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

EKSEMPEL 20

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, uttrykkelse av og fremstilling av [GlnA17'<B13>'B21]-SCI precursor, samt fremstilling av [GlnA17'B13»B2<1>]-humaninsulin herav.

Det gås frem på samme måte som beskrevet for [GlnA17'l<3>]-SCI precursoren, idet det imidlertid i et tredje mutaneriseringstrinn, som utføres på samme måte som andre trinn, anvendes en mutageniseringsprimer med sekvensen

5•-GAAACCTCTTTGACCACAAAC-3<1>.

Ut fra 165 mg [GlnA17'B13 >B21]-SCI <f>remstilt herved oppnås det 12 mg [GlnA1<7>'<B1>3'B21]-humaninsulin analogt med den ovenfor for [Gln<A4>'<B21>]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåte.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstiling av insulinderivat med et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylesterresiduum i minst en av posisjonene A4, A17, B13 og B21, hvor B-kjeden i enden ikke omfatter en amido- eller ester-rest, karakterisert ved at a) minst en av glutaminsyreresiduene i posisjonene A4, A17, B13 og/eller B21 i naturlig forekommende animalt eller humant insulin konverteres, eksempelvis ved esterifisering fortrinnsvis metylering eller amidering, til et glutaminresiduum eller et glutaminsyremetylester-residuum; b) det fremstilles en DNA-kjede som koder for et enkelt-kjedet forstadium (pre-pro- eller pro-form) av insulinmolekylet med glutamin i minst én av posisjonene A4, A17, B13 og/eller B21 syntetisk, hvorpå en slik DNA-kjede settes inn ved hjelp av restriksjonsenzymer i en ekspresjonsvektor, fortrinnsvis omfattende et amplifiseringssystem, som er virksom i en encellet mikroorganisme (fortrinnsvis E. coli eller Saccharomyces cerevisiae), hvorpå vektoren innføres i mikroorganismen, hvorpå det uttrykte forstadium ad enzymatisk vei omdannes til insulinderivatet; c) det fremstilles, ved rekombinante DNA-teknikker omfattende innsetting av et gen som koder for et forstadium av et insulinderivat med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21 i et gen som koder for et annet protein som uttrykkes i en mikroorganisme, ved et sete som koder for en spaltbar aminosyre og ekspresjon av genet, et fusjonsprotein omfattende et forstadium (pre-pro- eller pro-form) av insulinmolekylet med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21, hvorpå fusjonsproteinet isoleres og spaltes med enzymer og/eller ad kjemisk vei ved den spaltbare posisjon i fusjonsproteinet, avspalt-ningsproduktene separeres og eventuelt renses, og det isolerte or renaturerte forstadium av insulinderivatet omdannes ad enzymatisk vei til det ønskede insulinderivat, d) det fremstilles, ved rekombinante DNA-teknikker ved innsetting av en ekspresjonsvektor omfattende kodende elementer for henholdsvis A-kjede og B-kjede til et insulinmolekyl med glutamin i minst én av posisjonene A4, A7, B13 og/eller B21 i en encellet mikroorganisme, de enkelte A- og B-insulinkjeder, hvorpå kjedene ad kjemisk vei settes sammen til det ønskede insulinmolekyl.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av et insulinderivat med glutamin i 2 eller 3 av aminosyreposisjonene A4, A7, B13 og B21 ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,A17)-Gin ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,B21)-Gin ifølge krav 1 eller 2, karakterissert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,B13)-Gin ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(Al-

7. B13)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvaren de substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(Bl3,B2-1)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(Al-7,B21)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgansforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

9. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,Al-7,B21)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

10. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,B13,B21)-Gin ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

11. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A4,A17,B13)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.

12. Fremgangsmåte ved fremstilling av humaninsulin-(A17,B13,B21)-Gln ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes tilsvarende substituerte utgangsforbindelser eller tilsvarende kodende DNA-sekvenser.