JP2606915B2

JP2606915B2 - 新規インシュリン誘導体

Info

Publication number: JP2606915B2
Application number: JP63502325A
Authority: JP
Inventors: ラングクヤエル，リセロッテ; ノーリス，キェルド; マルクセン，ヤン; ホルゲルイェルゲンセン，クラブス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1988-02-24
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2012-05-07
Also published as: FI884914A; DE3880346D1; DE10075034I1; WO1988006599A1; PT86819A; EP0280534B1; AU1397688A; AU612141B2; JPH01502434A; EP0280534A3; NZ223630A; PT86819B; CA1339416C; IE880499L; EP0280534A2; NL300029I1; IE62879B1; DE3880346T2; FI884914A0; ES2053723T3

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、改良された性質を有する新規インシュリン
誘導体、その製法、並びに該新規インシュリン誘導体を
含有する製剤に関する。

発明の背景糖尿病の治療において、多種類のインシュリン製剤が
提案されかつ用いられてきた。改良されたインシュリン
製剤は、インシュリン年代の期間中定常的に創案されて
きているけれども、未だ改良された性質を有するインシ
ュリン製剤の必要性が存する。

インシュリンの酸性溶液は、作用時間の短い製剤とし
て並びにプロタミンおよび／又は亜鉛と共に持続性製剤
としてすでに用いられてきた。しかし、通常の環境のも
とでは、pH4.5未満でのインシュリンの化学的安定性は
低い。と言うのは、デスアミドインシュリンの形成（サ
ンドバイ、F.,J.Biol.Chem.237（1962）,3406−3411）
および共通結合ダイマー（ステイナー等、Diabetes 17
（1968）,725−736）が生起する。従って、可溶性の作
用時間の短いインシュリン製剤（血流増加剤の添加によ
る）および持続性製剤（プロタミンおよび／又は亜鉛の
添加による）を得るために、低pHで安定なインシュリン
が望ましい。

本発明の目的は、改善された性質を有するインシュリ
ン誘導体の溶液を供給することにある。

本発明の第二の目的は、改善された安定性を有するイ
ンシュリン誘導体の溶液を提供することにある。

本発明の第三の目的は、免疫遺伝学的活性が低いか又
はそれを有しないインシュリン誘導体の製剤を得ること
にある。

本発明の第四の目的は、pH約2.0〜約8.0、好ましくは
pH約2.0〜約4.5およびpH約6.5〜約8.0で安定であるイン
シュリン製剤を提供することにある。

本発明の第五の目的は、pH約３〜４で改善された安定
性を有するインシュリン誘導体の溶液を提供することに
ある。

本発明の第六の目的は、インシュリン誘導体の持続性
溶液を提供することにある。

発明の開示本発明は、ヒト、豚、家兎およびデス（B30）インシ
ュリンに関し、ここにおいてA21アミノ酸はAla,Gln,Gl
u,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Try,Val又はh
Serによって置換されている。

かかる化合物は次式I: （式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシ
ュリンを表し、A21はINSUL中のCys^A20に結合したアミノ
酸Ala,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,
Tyr,Val又はhSerの一種を表し、更にB30はINSUL中のLys
^B29に結合した水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの
一種を表す）で表される化合物である。

以下の内容は公知である。すなわち、哺乳動物インシ
ュリンの酸性エタノール抽出中において、多くのダイマ
ーが形成され（シュタイナー）、更にモノデスアミドイ
ンシュリンが酸性条件下で形成される（サンドバイ）今や、驚くべきことに以下の内容が見出だされた。す
なわち、そのような好ましくないダイマーの形成は、用
いたインシュリンが上記インシュリン誘導体（この誘導
体中、Asn^A21は上記アミノ酸の一種によって交換されて
いる）の一種である場合に実質的に減少又は殆ど除去さ
れる。この置換は、またはモノデスアミドインシュリン
の形成をも排除する。

新規インシュリン誘導体は、次の利点を有する：１）免疫学的ダイマー、すなわち、２個のＡ鎖を介し
て（AAダイマー）又は１個のＡ鎖を１個のＢ鎖（ABダイ
マー）のいずれかに結合した共有結合インシュリン分子
（ヘルビック、H.J.,Deutsche Wollforschungsinstitu
t,dissertation,1976）の形成は、実質的に除去される
（粗製豚インシュリンのクロマトグラフィー分画、ダイ
マー含有ｂ−成分は家兎において免疫原性である（Schl
ichtkrull等、Horm.Metab.Res.Suppl.5（1974）,134−1
43）。

２）新規インシュリン誘導体の安定性は、非常に高
く、従ってこれらの新規インシュリン誘導体を含有する
製剤を室温で長時間保存することは恐らく可能である。
これは患者にとって主な利点である。

３） pH約２〜８、好ましくはpH約２〜約4.5の範囲内
で更に6.5超でのpH値で新規インシュリン誘導体を含有
する溶解製剤を調製することが可能である。

４） pH約３で、実質的に改善された化学安定性を有す
る、新規インシュリン誘導体を含む製剤を調製すること
が可能である。

５）化学的不安定性のため、哺乳動物インシュリンに
対し不適当であるpH約３〜４の範囲において、インシュ
リン誘導体の有用な溶液が約0.05M〜0.5Mの濃度のマグ
ネシウムイオンの存在中で調製である。

６）吸収を高める化合物を添加することにより、新規
インシュリン誘導体を含有する可溶性の速効性製剤を調
製することが可能である。

７）酸性溶液、すなわちpH約2.5〜約４の範囲内のpH
値を有する溶液に、亜鉛および／又はプロタミンを添加
することによって新規インシュリン誘導体を含有する可
溶性遅延製剤を調製することが可能である。

８）異なったプロフィルを有する新規インシュリン誘
導体を含有する製剤を調製することが可能である。

前記式Ｉの化合物は、ペプチド転位反応によって調製
することができ、この反応において次式II: （式中、A21は先に定義した意味であり、Ｘは結合、ア
ミノ酸残基又はGly^A1のアミノ基に対しLys^B29のカルボ
キシル基を架橋するペプチド残基である）で表される生
合成前駆体化合物を、米国特許第4,343,898号明細書に
記載されると同様に、水および有機溶剤の混合物中触媒
としてトリプシン又はトリプシン様酵素を用いて次式II
I: Ｚ−OR （III）（式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒド
ロキシル基は保護されてることができ、更にＲはカルボ
キシ保護基（例えばメチル又は第三ブチル）である）で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボ
キシ保護基およびヒドロキシ保護基を除去する。

Ｘは例えば次式IV: −（Qq−Ｋ）ｒ（式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表
し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、
更にｒは０又は１である）で表される部分である。

式IIの化合物は、ヨーロッパ特許出願163,529および2
14,826に記載された方法と類似の方法で調製できる。こ
の方法により、式IIを有する化合物をコードするDNA−
配列が適当な発現ベクターに挿入され、該ベクターは適
当な酵母株に移送されると、正しく位置決めされたジス
ルフィド架橋を有する所望化合物を発現しうる。発現さ
れた生成物は、次いで細胞から分泌されているか否かに
応じて細胞又は培養ブロスから単離される。

中性pHで、式Ｉの化合物はヒトインシュリンと同じ電
荷を有する。溶液中、式Ｉの化合物はヘキサマーとして
存在する。

本発明による特異的な好ましい化合物の例は、次の通
りである:Gly^A21ヒトインシュリン、Ala^A21ヒトインシ
ュリン、Ser^A21ヒトインシュリン、Thr^A21ヒトインシュ
リン、hSer^A21ヒトインシュリン、Gly^A21豚インシュリ
ン、Ala^A21豚インシュリン、Ser^A21豚インシュリンおよ
びThr^A21豚インシュリンである。

本発明のインシュリン製剤は、わずかに酸性条件での
水性媒質中に式Ｉの化合物を、例えば約240〜約60nモル
／の濃度に溶解することにより調製できる。

水性媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグ
リセロールを添加して等張にすることができる。

もし接続性製剤が要求される場合、上記等張化剤を、
亜鉛塩又は亜鉛塩の混合物により式Ｉの化合物のｎモル
当たり約５μｇまでのZn²⁺濃度で一部又は完全に置換で
きる。

更に、以下の内容が見出だされた。すなわち、多くの
マグネシウム塩はpH約４〜約6.2でインシュリンに対す
る可溶化作用並びにインシュリンの吸収に対する増強作
用を有する。マグネシウム塩の種々の混合物が同様の効
果を有する。従って、次のように結論づけられる。一定
濃度のマグネシウムイオンの存在は、約４〜約6.2のpH
値でインシュリンの溶解性並びに吸収速度に対する臨界
的パラメターである。適用可能なマグネシウムイオン濃
度の範囲は、約0.005M〜約0.5M、好ましくは約0.05M超
である。上限はある場合において（例えば腹腔内浸剤に
対し）等張を幾分超えることがもしも許容できると仮定
することから幾分任意に選択される。

本発明の好ましい態様によれば、製剤は約0.08M〜約
0.3Mの濃度のマグネシウムイオンを有する。

更に以下の内容が見出だされた。すなわち、本発明の
インシュリン誘導体の持続性（又は更に持続性）製剤
は、プロタミンを上述の製剤、すなわち、亜鉛イオンお
よびマグネシウムイオンを有しない製剤、亜鉛イオンお
よびマグネシウムイオンを有する製剤に添加すると、得
られる。用いるプロタミンの量はインシュリン基準（重
量／重量）で約５％〜約50％、好ましくは約８％〜約40
％、更に好ましくは約10％〜約30％である。

吸収性を増加したインシュリン製剤はまたは、インシ
ュリンの水溶液にアルギニン又はリシンを添加すること
により得ることもできる。アミノ酸の好ましい濃度は、
約0.01M〜約0.2Mである。

インシュリン製剤は、更に例えばアセテートおよびシ
トレート並びに保存剤、例えばフェノール、ｍ−クレゾ
ールおよびメチルパラベンを含有できる。溶液のpHは所
望の値に調節され、インシュリン製剤は、殺菌ろかによ
り殺菌される。

pH3〜6.2を有する本発明をインシュリン溶液はまた、
ポンプによる注入の目的に対し特に有用である。と言う
のは、カテーチルを介しての二酸化炭素拡散によるイン
シュリンの沈殿がないからである。このような沈殿は、
中性注入溶液では時おり観察され、そして二酸化炭素に
よって引きおこされるpH値の低下に寄因するものと信じ
られている。

アミノ酸残基に対し本発明で用られる略記号は、J.Bi
ol.Chem.243（1968）,3558頁で記載されたものである。
本発明で述べられているアミノ酸は、Ｌ配置である。本
発明に関する限り、語句「インシュリン」は複数の又は
一般的意味で用いられる場合、天然のインシュリンおよ
びインシュリン誘導体の双方をも含むものと意図されて
いる。Gly^A21ヒトインシュリンは、Asn^A21がGlyによっ
て交換されているとヒトインシュリンでありかつ同様の
名称に対し同様である。

本発明のインシュリン製剤は、糖尿病の治療に用いる
ことができる。本発明の用量は、注射用の公知のインシ
ュリン製剤の用量の選択にするのと同様に医者により選
択されることが望まれる。

本発明で述べる特徴の組み合わせ又は新規特徴は、本
発明に対し必須と考えられる。

例１ Gly^A21ヒトインシュリンの調製 Gly^A21ヒトインシュリンを、次式：（式中、架橋ペプチドの末端AlaはLys^B29のカルボキシ
ル基に結合しており、さらにLysはGly^A21のアミノ基に
結合している）として表すことのできる式IIに係る化合物を、Thr−OMe
（レートレオニンメチルエステル）を用いてペプチド転
位反応させ、次いでエステル基を水性水酸化ナトリウム
で加水分解することにより調製した。すなわち、100mg
の式Ｖの化合物を10Mの酢酸0.5mlに溶解し、次いでN,N
−ジメチルアセトアミドに溶解した2MのThr−OMe 1mlを
添加した。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カ
ルシウム0.2mlに溶解した10mgのトリプシンを添加し
た。12℃で48時間後、20mlのアセトンを添加してタンパ
ク質を沈殿させた。出発物質のGly^A21−（Thr−OMe）
^B30への変換は、HPLCにより88％であった。

250mgのGly^A21−（Thr−OMe）^B30ヒトインシュリン
を、25mlの水に懸濁させ、次いでpH10.0に1Nの水酸化ナ
トリウム溶液を添加して溶解した。pH値を25℃で24時間
10.0に保持する。得られたインシュリン誘導体を、2gの
塩化ナトリウム、350mgの酢酸ナトリウム三水和物およ
び2.5mgの酢酸亜鉛二水和物を添加して結晶化させ、次
いで1N塩酸を添加してpH5.52を得た。４℃で24時間後、
結晶物質を遠心分離により単離し、3mlの水で洗い、遠
心分離により単離し、真空下で乾燥する。収率:Gly^A21
ヒトインシュリン210mg。

式Ｖの化合物は、ヨーロッパ特許出願214,826の例２
と同様の方法で調製した。

例２式Ｉの化合物の注射用溶液の調製 0.5％の亜鉛を含有するGly^A21ヒトインシュリン10μm
olを、塩酸（1Nの80μｌ）を含有する水（5ml）に溶解
し、次いでフェノール（65mg）およびグリセロール（40
0mg）を含有する水溶液（10ml）を添加する。溶液のpH
値を、水酸化ナトリウム溶液により、3.0に調節し、全
量を水で25mlに調節する。得られた溶液を減菌ろ過し、
引き続き無菌的にバイアル（5ml）に移す。

例３持続作用を有するGly^A21ヒトインシュリンの可溶性製剤 10μmolのGly^A21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水
（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）
および塩化亜鉛（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫
酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および
塩化ナトリウム（200mg）を含有する水溶液（15ml）を
添加する。pHを水酸化ナトリウム溶液で3.5に調節し、
全量を水で25mlに調節する。最後に、溶液を過して滅
菌し、滅菌バイアルに無菌的に移す。

豚に皮下投与後の吸収状態は、周知のインシュリン懸
濁液プロタファン（商標）HR 100IU/mlのそれに匹敵す
ることが判明した。

例４速効性を有するGly^A21ヒトインシュリンの可溶性製剤 15μmolのGly^A21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水
（10ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの40μｌ）
および塩化マグネシウム（1Mの2.6ml）を添加し、次い
でベンジルアルコール（0.3Mの8ml）を添加する。pHを
水酸化ナトリウム溶液で5.7に調節し、全量を水で2.5ml
に調節する。最後に、溶液を過して滅菌し、滅菌バイ
アルに無菌的に移す。

例５製剤中のGly^A21ヒトインシュリンの化学的安定性 0.24mMのGly^A21ヒトインシュリン（亜鉛なし）、0.26
％（w/v）のフェノールおよび1.6％（w/v）のグリセロ
ールを含有する三種の製剤を調製し、それらのpH値をそ
れぞれ3.0,4.0、および5.0に調節した。

対照として同じ組成を有するヒトインシュリン製剤を
用い45℃で２週間保存後サンプルを分析した。

第１表は、HPSEC（高性能サイズ排除クロマトグラフ
ィー）によって測定されるようなインシュリン二量化お
よび重合生成物の含量を示す。

第２表は、DISC PAGE（ポリアクリルアミドゲルエレ
クロトフォレシス）によって測定したインシュリン酸ア
ミド加水分解の含量を示す。

例６ Gly^A21ヒトインシュリンの生物学的効力 Gly^A21ヒトインシュリンの効力に関し、英国ファルマ
コピア（1980版）による研究では、これはヒトインシュ
リンの効力の約85％であった。治療目的に関する用量範
囲内で、毒性の発現は観察されなかった。

例７更に持続作用を有するGly^A21ヒトインシュリンの可溶性
製剤 15μmolのGly^A21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水
（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）
および塩化亜塩（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫
酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および
塩化マグネシウム（200mg）を含有する水性溶液（15m
l）を添加する。pHを3.5に調節し、全量を水で25mlに調
節する。

豚に皮下投与後のこの製剤の吸収は、周知のインシュ
リン懸濁液プロタファン（商標）HM 100IU/mlのそれよ
りも実質的により遅いことが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マルクセン，ヤンデンマーク国，デーコー―2730 ヘルレウ，キクドバケン７ (72)発明者イェルゲンセン，クラブスホルゲルデンマーク国，デーコー―2830 ビルム，アスケベーンゲト 47

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式I: （式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシ
ュリンを表わす）で表されるインシュリン誘導体であって、 A21がINSUL中のCys^A20に結合したアミノ酸Ala,Gln,Glu,
Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val又はhSe
rの一種を表し、更にB30はINSUL中のLys^B29に結合した
水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの一種を表す、前
記インシュリン誘導体。
【請求項２】A21がPheとは異なっている、請求の範囲第
１項記載のインシュリン誘導体。
【請求項３】A21がGly,Ala,Ser,Thr、又はhSerを表し、
B30がAla、又はThrを表す、請求の範囲第１項記載のイ
ンシュリン誘導体。
【請求項４】請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
で定義した意味を有する請求の範囲第１項〜第３項のい
ずれか１項記載の式Ｉの化合物を含有することを特徴と
する、製剤。
【請求項５】可溶性である、請求の範囲第４項記載の製
剤。
【請求項６】吸収を促進する化合物を含有する、請求の
範囲第５項記載の製剤。
【請求項７】前記化合物がマグネシウム塩である、請求
の範囲第６項記載の製剤。
【請求項８】３〜４の範囲内のpH値で溶液であり、更に
0.005M〜0.5Mの濃度でマグネシウムイオンを含有し、更
に該製剤が式Ｉ（式中、A21はGlnとは異なる）の化合物
を含有する、請求の範囲第７項記載の製剤。
【請求項９】前記化合物が、アルギニン又はリシンであ
る、請求の範囲第６項記載の製剤。
【請求項１０】亜鉛イオンおよび／又はプロタミンを含
有する、請求の範囲第4,5,7,8又は９項のいずれかに記
載の製剤。
【請求項１１】2.0〜８の範囲内のpH値を有する、請求
の範囲第４〜第10項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】2.5〜4.5又は6.5〜8.0の範囲内のpH値を
有する、請求の範囲第11項記載の製剤。
【請求項１３】請求の範囲第１項記載のインシュリン誘
導体の調整方法であって、次式II: （式中、A21は請求の範囲第１項で定義した意味であ
り、更にＸは結合、アミノ酸残基又はGly^A1のアミノ基
に対しLys^B29のカルボキシル基を架橋するペプチド残基
である）で表される生合成前駆体化合物を、水および有機溶剤の
混合物中触媒としてトリプシン又はトリプシン様酵素を
用いて次式III: Ｚ−OR （III）（式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒド
ロキシル基は保護されることができ、更にＲはカルボキ
シ保護基である）で表されるアミノ化合物と反応させ、
しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロキシ保護を除
去する、前記方法。
【請求項１４】前記Ｘが次式IV: −（Qq−Ｋ）ｒ− （式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表
し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、
更にｒは０又は１である）で表される部分である請求の範囲第13項記載の方法。