PT86819B

PT86819B - Processo para a preparacao de novos derivados da insulina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT86819B
Application number: PT86819A
Authority: PT
Inventors: Jan Markussen; Liselotte Langkjaer; Kjeld Norris; Klavs Holger Jorgensen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1988-02-24
Publication date: 1992-05-29
Also published as: CA1339416C; JPH01502434A; JP2606915B2; EP0280534A2; EP0280534A3; IE880499L; FI884914A; DE10075034I1; IE62879B1; ES2053723T3; AU612141B2; EP0280534B1; WO1988006599A1; FI884914A0; PT86819A; NZ223630A; DE3880346T2; DE3880346D1; NL300029I1; AU1397688A

Description

A presente invenção refere-se a novos derivados da insulina com propriedades melhoradas, aos métodos rara a sua preparação e a composições farmacêuticas que contêm estes novos derivados da insulina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Têm sido sugeridas e utilizadas muitas variedades de composições de insulina para o tratamento da diabetes mellitus. Embora tenham sido inventadas muitas composições de in sulina aperfeiçoadas na era da insulina, ná ainda necessidade de encontrar composições de insulina com propriedades melhora das.

No início utilizaram-se soluções ácidas de insulina como composições de acção rápida e, em conjunto com protamina e/ou zinco, como composições de acção lenta. Contudo, em circunstâncias normais, a estabilidade química da insulina a um pH da ordem de 4,5 é baixa, em virtude de se formarem desamido-insulinas (Sundby, F.; J.Biol. Chem., 237, 1962, p. 3406-3411) e dímeros covalentes (Steiner et al., Diabetes, 17, 1968, p.725-736). Para valores de pH compreendidos entre 4,5 e 6,5 a insulina precipita. Assim, é desejável obter uma insulina estável para um pE baixo, para se obterem oomr.osições

de insulina de acção rápida solúveis (ror meio da adição de agentes que aumentem a corrente sanguínea) e comrosições de insulina de acção lenta (pela adição de protamina e/ou de zinco).

Um dos objectivos da rresente invenção e rrerarar derivados de insulina com rrorriedades melhoradas.

Um segunde objectivo da presente invenção e ureparar soluções de derivados de insulina com uma maior estabili dade.

Um terceiro objectivo da presente invenção é prepa rar composições de derivados de insulina sem actividade imunogénica ou com baixa actividade imunogénica.

Um quarto objectivo da presente invenção consiste em preparar composições farmacêuticas de insulina solúveis para valores de píl compreendidos, aproximadamente, entre 2,0 e 8,0, de preferência entre cerca de 2,0 e cerca de 4,5 e en tre cerca de 6,5 e cerca de 8,0.

Um quinto objectivo da presente invenção consiste em preparar soluções de derivados de insulina com uma maior estabilidade rara valores de pH comrreendidos, arroximadamen te entre 3 e 4.

Um sexto objectivo da presente invenção é rrerarar soluções de derivados de insulina de acção lenta.

DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a insulina humana, porcina, de ccelho e des(B30) na qual o amino ácido A21 foi substituído por Ala, Gin, Glu, Gli, His, Ile, Leu, Met, Ser, Ter, Trr, Tir, Vai ou hSer.

Estes comrostos rodem representar-se rela fórmula geral I

INSUL-A21

I

B3õ (I) na qual INSUL representa insulina humana des(A21). des(B3O) em que A21 representa um dos aminoácidos Ala, Gin, Glu, Gli, His, Ile, leu,'· Met, Ser, Ter, Trr, Tir, Vai ou hSer ligado à oisteína ASO na INSUL e B30 representa um átomo de hidrogénio ou um dos aminoácidos Ser, Ala ou Tre ligado à lisina B29 na IMSUL.

Sabe-se que durante a extracção de etanol ácido das insulinas dos mamíferos formam-se muitos dímeros (Steiner) e além disso, também se formam monodesamido-insulinas em condições ácidas (Sundby).

Surpreendentemente, verificou-se agora que a formação desses dímeros indesejáveis reduz-se substancialmente ou é mesmo quase eliminada quando o comrosto de insulina utilizado é um dos derivados de insulina anteriores no qual Asn^ foi substituído ror um dos aminoácidos atrás referidos. Esta substituição elimina também a formação de monodesamido-insu linas

Os novos derivados de insulina têm as seguintes van tagens:

A formação de aímeros imunogenicos, isto lácuias de insulina ligadas ror uma ligação covalente quer através das duas cadeias A, dímero limadas (AA) quer através de uma cadeia A e uma cadeia B, dímero (AB)

-, minada (verificou-se que a fracção cromatográfica de insulina de porco impura, o componente b, contendo os dím.eros era imunogénica em relação aos coelhos (Schlichtkrull et al·, Horm. Metab.

Res. Suppl. 5 (1974), 134 - 143)).

2. A estabilidade dos novos derivados de insulina é tão elevada que talvez seja possível armazenar as composições farmacêuticas contendo estes novos derivados da insulina à temperatura ambiente e por um longo período de tempo. Esta, será uma das maio, res vantagens para o doente.

3. Será possível preparar composições dissolvidas conten do os novos derivados de insulina pera valores de pH compreendidos entre cerca de 2 e cerca de 8, de preferência no intervalo com preendido entre cerca de 2 e cerca de 4,5 é valores acima de 6,5.

4. Será possível preparar composições contendo os novos derivados de insulina que, para valores de pH próximos de 3, Ponham uma estabilidade química substancialmente aumentada.

5. Para um intervalo de pH entre cerca de 3 e 4, que é ina dequada para a insulina de mamíferos por causa da instabilidade química, podem preparar-se soluções úteis de derivados de insuli ns na presença de iões de magnésio em concentrações de cerca de 0,005 M até 0,5 M.

6. Será possível preparar composições solúveis de acção rápida contendo os novos derivados de insulina por adição de com postos que aumentam a absorção.

7. Será possível preparar composições solúveis de acção lenta contendo os novos derivados de insulina pela adição de zin, co e/ou protamina a soluções ácidas, isto é, soluções com um valor de pH no intervalo compreendido entre cerca de 2,5 θ 4.

8. Será possível preparei’ composições contendo novos de- rivados de insulina com diferentes perfis.

Os compostos de fórmula geral I podem preparar-se por uma reacção de transpeptidação na qual se faz reagir um composto precursor bio-sintético de fórmula geral II.

INSUL-A-21 (II)

I

X na qual

A21 tem o significado definido antes e X representa uma ligação, um resíduo de sminoácido ou um resíduo peptídico ligando o grupo carboxilico da Lis ⁷ ao grupo amino de com um composto aminado de fórmula geral

Z-OR (III) na qual

Z representa Tre, Ala ou Ser, qualquer grupo hidroxi po. de estar protegido e R representa um grupo protector do grupo carboxi (por exemplo metilo ou terc.-butilo), utilizando tripsina ou um enzima do tipo da tripsina como catali sador, no seio de uma mistura de água e solventes orgânicos, tal como está descrito na memória da patente de invenção americana _no 4 545 898, da qual se elimina o grupo protector do grupo car boxi e qualquer grupo protector do grupo hidroxi. O símbolo X po. de representar, por exemplo, um radical de fórmula geral

-(Qq-K)_r- (IV) na qual

Q representa uma. cadeia peptidica com q aminoácidos, em que q representa um número inteiro de 0 a 55, K represen ta Lis ou Arg e r representa 0 ou 1.

Os compostos de fórmula geral II podem preparar-se por um método semelhante ao método descrito nos pedidos de patente de invenção europeia n2s 165 529 e 214 826. Por este método insere-se uma sequência de DNA, que codifica um composto de fórmu la geral II, num vector de expressão apropriado que, quando trans ferido para uma estirpe de levedura adequada, é susceptível de expressar o composto desejado com as pontes de di-sulfureto corre£ tamente posicionadas. Isola-se então o produto expresso das célu las ou do caldo da cultura, dependendo se é segregado no seio das células ou não.

Para um pH neutro, os compostos de fórmula geral I tem a mesma carga que a insulina humana. Em solução, os compostos de fórmula geral I podem estar presentes como hexâmeros.

São exemplos de compostos específicos preferidos de acor do com a presente invenção os seguintes compostos: insulina huma

A21 A21A21 na Gli , insulina humana Ala ' , insulina humana Ser , insuA21A21 lina humana Tre * , insulina humana hSer , insulina porcina

A21 A21A21

Gli , insulina porcina Ala , insulina porcina Ser e insuA21 lina porcina Tre

As composições de insulina da presente invenção podem pre parar-se por dissolução de um composto de fórmula geral I num meio

aquoso em condições ligeiramente ácidas, por exemplo, numa concen trscção compreendida entre cerca de 240 e cerca de 600 nmole/ml.

Pode tornar-se o meio aquoso isotónico pela adição de cio reto de sódio acetato de sódio ou glicerol.

Se for necessária uma composição de acção prolongada, os agentes isotónicos atrás referidos podem ser parcial ou totalmen te substituídos por um sal de zinco ou uma mistura de sais de zinco a uma concentração não superior a 5 /ig de Zn^; por mole de composto de fórmula geral I.

Além disso, verificou-se que muitos sais de magnésio tem um efeito solubilizante na insulina para valores de pH compreendidos entre cerca de 4 e cerca de 6,2 e aumentam o efeito de absor ção de insulina. Várias misturas de sais de magnésio têm o mesmo efeito. Conclui-se por isso que a presença de iões de magnésio em certas concentrações é um parametro crítico para a solubilidade da insulina para valores de pH compreendidos entre cerca de 4 e cerca de 6,2 e pa>a a velocidade de absorção. A gama de concentra, ções de iões magnésio aplicável está compreendida entre cerca de 0,005 M e cerca de 0,5 M, de preferência superior a 0,05 M. 0 li mite superior é de certo modo arbitrário sendo tomado por decisão caso a caso (por exemplo por infusão intraperitoneal) sendo aceitável alguma ultrapassagem da isotonicidade. De acordo com 0 aspecto preferencial da presente invenção as composições contêm iões magnésio numa concentração compreendida entre cerca de 0,08 M e cerca de 0,3 M.

Verificou-se também que as composições de derivados da in sulina da presente invenção de acção prolongada ou muito prolon gada, obtêm-se quando se adiciona protamina as composições anterior

- 8 / mente mencionadas, isto é, composições sem iões de zinco ou de mag nésio, composições contendo iões de zinco e composições contendo iões de magnésio. A quantidade de protamina a utilizar varia entre cerca de 5% θ cerca de de preferência entre cerca de

8% e cerca de 40%, e ainda mais preferencialmente entre cerca de 10% e cerca de 30% com base na insulina (peso/peso).

As composições de insulina com melhores propriedades de absorção podem obter-se por adição de arginina ou lisina a uma solução aquosa de insulina. A concentração preferida destes amino ácidos varia entre cerca de 0,1 M e cerca de 0,2 M.

As composições de insulina podem ainda conter tampões co mo acetato e citrato e conservantes como fenol , m-cresol e metil paraben. Ajusta-se o pH da solução para o valor desejado e torna -se a composição de insulina estéril por meio de uma filtração estéril.

As soluções de insulina da presente invenção com um valor de pH compreendido entre 3 θ 6,2 podem também ser particularmente úteis para infusões por meio de bombas, devido à não precipi, tação da insulina causada pela difusão de dióxido de carbono atra, vés de catatéres. Observou-se essa precipitação casualmente com soluções de infusão neutras e crê-se que isso é devido ao abaixa mento do valor do pH causado pelo dióxido de carbono.

As abreviaturas que se usam aqui para os resíduos de ami noácidos são as estabelecidas no ”J. Biol. Ohem.”, 243, 1968, p. 3558. Os aminoácidos aqui referidos estão na configuração L. No contexto da presente invenção, o termo insulina quando utiliza, do no plural ou no sentido genérico refere-se tanto as insulinas

- 9 -j que ocorrem naturalmente como aos derivados da insulina. A insu

A21 * A 21 lina humana Gli e insulina humana quando o Asn foi trocado por Gli e do mesmo modo para nomes semelhantes.

As composições de. insulina da presente invenção podem uti lizar-se no tratamento de diabetes. Recomenda-se que as doses das composições de insulina da presente invenção sejam prescritas por um médico assim como a dose das composições de insulinas conhecidas para injecção.

| Qualquer característica nova ou combinação de caracterís ticas aqui descrita é considerada essencial para, a presente in venção.

EXEMPLO 1

A21

Preparou-se insulina humana Gli por transpeptidaçao de um composto que, de acordo com a fórmula geral II, pode ser formulado como

INSUL-GLI^A21 (V)

I

Ala-Ala-Lisna qual o terminal Ala da ponte peptidica está ligado a.o grupo carboxílo de Lis^²^ e o terminal Lis está ligado ao grupo amina de Gli^A3·, com Tre-OMe (metiléster de L-treonina) seguida de hidrólise do grupo éster com hidróxido de sódio aquoso. Assim, dissolveu-se 100 mg do composto de fórmula, geral V em

0,5 ml de ácido acético 10 M e adicionou-se 1 ml de Tre-OMe 2M em Ν,Ν-dimetilacetamida. Arrefeceu-se a mistura até 12°C. Adicio naram-se 10 mg de tripsina dissolvida em 0,2 ml de acetato de cálcio 0,05 M. Após 48 horas a 12°0 as proteínas precipitaram por adição de 20 ml de acetona. A conversão do material de partida em insulina humana Gli^A21-(Tre-0Me)^B5° foi de 88% por HPLC.

Fez-se uma suspensão de 250 mg de insulina humana Gli -(Tre-OMe )^Β^^ϋ em 25 ml de água e dissolveu-se por adição de uma solução de hidróxido de sódio 1 N até o pH atingir 0 valor 10,0. Manteve-se 0 pH constante no valor 10,0 durante 24 horas a ?5°θ· Cristalizou-se 0 derivado de insulina formado por meio da -dição de 2 g de cloreto de sódio, 350 mg de acetato de sódio tri-hidratado e 2,5 mg de di-hidrato de acetato de zinco, seguida da adição de ácido clorídrico IN até se obter um pH com 0 valor de 5,25. Após 24 horas a. 4°C isolou-se 0 material cristalizado por centrifugação, lavou-se com 3 ml de água, isolou-se por centri fugação e secou-se in vacuo. Rendimento: 210 mg de insulina

A 91 humana Gli .

composto de fórmula geral V preparou-se por um método análogo ao exemplo 2 do pedido de patente europeia n-9 214 826.

EXEMPLO 2

Preparação de soluções injectáveis dos compostos de ____________________________________

A21 Dissolve-se 15 Jimol de insulina humana Gli contendo

0,5% de zinco em 5 ml de água contendo 80 yol de ácido clorídrico

N e adiciona-se 10 ml de uma solução aquosa contendo 65 mg de

fenol e 400 mg de glicerol. Ajusto-se o pH da solução para 3,0 por meio de uma solução de hidróxido de sódio e ajusta-se o volu me total até 25 mlpor adição de água. Esteriliza-se a solução resultante por filtração θ transfere-se assepticamente para fras.

cos de 5 ml.

EXEMPLO 3 Λ ΟΊ

Composição solúvel de insulina humana Gli de acção prolongada

A21 Dissolve-se 15 )imole de insulina humana Gli (livre de zinco) em 5 ml de água. Adiciona-se a esta solução 80 pl de ácido clorídrico 1 N e 100 pl de cloreto de zinco 0,6 M e depois adiciona-se 15 ml de uma solução aquosa, contendo 37 mg de sul. fato de protamina, 50 mg de m-cresol e 200 mg de cloreto de só, dio Ajusta-se o pH para 3,5 com uma solução de hidróxido de sódio e ajusta-se o volume total até 25 ml com água. Finalmente es teriliza-se a solução por filtração e transfere-se assepticameja te para frascos pequenos estéreis.

Verificou-se que o perfil de absorção, após injecção sub -cutânea nas cobaias, era comparável ao da suspensão de insulina Protaphane®HM 100 Ul/ml bem conhecida.

EXEMPLO 4 z A21

Composição solúvel de insulina humana Gli de acçao rápida

A°1

Dissolve-se 15 yimole de insulina humana Gli (livre de zinco) em 10 ml de água. Adiciona-se 40 ^ul de ácido clorí

drico 1 N e 2,6 ml de cloreto de magnésio 1 M a esta solução e depois adiciona-se 8 ml de uma solução aquosa 0,3 M de álcool benzílico. Ajusta-se o pH para 5,7 com um? solução de hidróxido de sódio e ajusta-se o volume total até 25 ml cem água. Fina].

mente esteriliza-se a solução por filtração e transfere-se assej^ ticamente para frascos pequenos esterilizados.

EXEMPLO 5 • A?1

Estabilidade química da insulina humana Gli em composições farmacêuticas

Prepararam-se três composições contendo 0,24 mM de insu

Λ ΟΊ lina humana Gli (livre de zinco), 0,26% (p/v) de fenol e 1,6% (p/v) de glicerol. Ajustou-se os respectivos pH para 3,0, 4,0 e 5,0.

Analisaram-se as amostras depois de estarem armazenadas durante duas semanas a. 45°C, utilizando como referência composi. ções de insulina humana com a mesma composição.

quadro 1 mostra o teor de dimerização de insulina e os produtos de polimerização determinados por crnmatografi? de exclu são de dimensão de elevada resolução.

quadro 2 mostra o teor de pmdutos de desa^idação de insulina determinado por DISC PAGE (Electrofnrese de gel de poli, -acrilamida).

Quadro 1

pH da preparação	Insulina hunana	Insulina huna na Gli^A?1
3,0	4,9 %	0,51%
4,0	41,6 %	1,0 %
5,0	16,1 %	2,8 %
Insulina anidra	0,29%	0,05%

pH da preparação	Quadro 2
Insulina hunana	Insulina hu nana Gli^A^
3,0	90 %	2 %
4,0	40 %	X
5,0	3 %	4 %
Insulina anidra.	0,5%	0,5%

EXEMPLO 6

Potência biológica da insulina humana Gli^^-^

A investigação, de acordo com a British Pharmacopeia, ed_i a A21 ção de 1980, da potência de insulina humana Gli , mostrou que era aproximadamente 85 % da insulina humana. Não se observaram efeitos tóxicos dentro da gamo de doses relevantes para fins tera peuticos.

EXEMPLO 7

A21

Composição solúvel de insulina humana Gli com acção mais prolongada

de zinco) em 5 ml de água. Adiciona-se a esta solução 80 jil de ácido clorídrico 1 N e 100 yul de cloreto de zinco 0,6 M. Adicio na-se 15 ml de uma solução aquos^ contendo 37 mg de sulfato de protamina, 5θ mg de m-cresol e 200 mg de cloreto de magnésio. Ajusta-se o pH para 3,5 e ajusta-se o volume total até 25 ml com água. Finalmente esteriliza-se a solução por filtração e trans fere-se assepticam.ente para frascos peauenos estéreis.

Verificou-se que a absorção desta composição, após injec.

ção sub-cutânea nas cobaios, era substancialmente mais lenta do (R) que a bem conhecida suspensão de insulina ProtaphaneHM 100 UI/ /ml.

Claims

Reivindicações

1.- Processo para a preparação de derivados da insulina de fórmula geral

INSUL-A21

B30 na gual TNSUL representa insulina humana des(A21)_zdes(B30) em que A21 representa um dos aminoácidos alamina, glicina, glutamina, ácido glutâmico, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, ou hSer ligado ã cisteína A20 na INSUL e B30 representa um átomo de hidrogénio ou um dos aminoácidos Ser, Ala ou Tre ligado ã lisina B29 na INSUL, e não representando de preferência Ά21 o aminoácido fenilalanina, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um composto precursor bio-sintético de fórmula geral

INSUL-A21 III)

X

-16na qual

A21 tem o significado definido antes e X representa uma ligação, um resíduo de aminoãcido ou um resíduo peptidico ligando o grupo carboxilico da Lis ao

A1 grupo amina do Gli , com um composto aminado de fórmula geral ’ 2-OR (III) na qual

Z representa Tre, Ala ou Ser qualguer grupo hidroxi pode estar protegido e R representa um grupo protecto: do grupo carboxi, utilizando tripsina ou um enzima do tipo da tripsina como catalisador, no seio de uma mistura de água e dissolventes orgânicos, da qual se elimina o grupo protector do grupo carboxi e qualquer grupo protector do grupo hidroxi.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prep ração de compostos de fórmula geral I na g_ual o símbolo A21 repr senta Gli, Ala, Ser, Tre ou hSer e o símbolo B30 representa Ala ou Tre, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efec tiva de um composto de fórmula geral I, preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, com' agentes auxiliares de formulação apropriados.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se preparar a composição farmacêutica sob uma forma solúvel.

I
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se incluir um composto que aumenta a obsorção.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido composto ser um sal de magnésio.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6_y caracterizado pelo facto de se obter a composição farmacêutica sob a forma de uma solução com um pH compreendido entre cerca de 3-4 e contendo iões magnésio numa concentração compreendida entre cerca de 0,005M e cerca de 0,5 M incluindo de preferência um composto de fórmula geral I na qual o símbolo A21 é diferente de Gin.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido composto ser arqinina ou lisina.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

3, 4, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de se incluírem iões zinco e/ou pròtamina.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

3 a 9, caracterizado pelo facto de o valor do pH estar compreendido entre cerca de 2,0 e cerca de 8, de preferência entre cerca de 2,5 e cerca de 8.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o valor do pH estar compreendido entre cerca de

2,5 e cerca de 4,5 ou entre cerca de 6,5 e cerca de 8,0.
12,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um composto de fórmula geral II na qual o símbolo X representa um radical de fórmula geral

-(Q_g-K)_r- (IV) na qual

Q representa uma cadeia peptidica com q aminoácidos, em que q representa um número inteiro de 0 a 33, K representa Lis ou Arg e r representa zero ou um.