DK172209B1 - Lægemidler indeholdende basisk modificerede insulinderivater - Google Patents

Description

DK 172209 B1

Opfindelsen angår lægemidler indeholdende basisk modificerede insulin-derivater.

Ved behandlingen af Diabetes mellitus indgives der i dag parenteralt almindeligvis præparater af det blodsuk-5 kersænkende hormon insulin. Den specielle natur af insulinet og dets metabolisme fører det med sig, at virketiden for en enkel opløsning kun er meget kort, at der således til en vedvarende blodsukkerkontrol hos diabetikeren skal indgives enten en langtidsinfusion med doseringsapparat, i 10 flere daglige injektioner eller et forhalet virksomt insulinpræparat. Som forhalingsprincipper er i denne forbindelse sådanne tilstandsformer af insulinet af særlig betydning, som på injektionsstedet er tungtopløselige (f.eks. krystallinske eller amorfe). Hertil skal henregnes eksempelvis 15 zink-insulinkrystaller eller protamin-insulinkrystaller, som under deres langsomme genopløsning over et vist tidsrum frigiver insulin.

Nu har det ved behandlingen vist sig yderst nyttigt at have forskellige insulinpræparater til rådighed, som i 20 deres virkningskarakteristik kommer den enkelte patients behov så nær som muligt. I sammenhæng med en ikke-optimal indstilling diskuteres foruden de umiddelbare effekter, såsom hyper- eller hypoglykæmier, især de diabetiske senkomplikationer, hvortil hører retinopathi, neuropathi, nephro-25 pati, mikro- og makroangiopathi.

Insulinmanglen hos diabetikeren fører til, at legemet ikke længere kan opnå sin naturlige hormonale ligevægt.

Opfindelsen har til formål at tilvejebringe lægemidler indeholdende insulin-derivater, med hvilke man bedre kan 30 nærme sig den naturlige hormonale ligevægt i en diabetisk tilstand, og med hvilke denne bedre kan opretholdes end ved indgivelsen af insulin i de hidtil gængse former.

Formålet opfyldes ifølge opfindelsen med lægemidler indeholdende insulin-derivater, hvis B-kæde i det C-terminale 35 område bærer en organisk gruppe med basisk karakter.

Disse insulin-derivater udmærker sig ved, at de har 2 DK 172209 B1 en retarderet virkning i forhold til nativt insulin på grund af det mod neutralområdet forrykkede isoelektriske punkt.

Insulin-derivater, der ved den C-terminale ende af B-kæden bærer grupperne Arg-OH eller Arg-Arg-OH, er allerede 5 beskrevet. Som bekendt opstår disse derivater ved en enzymatisk omdannelse af pro-insulin til insulin in vivo som naturlige mellemprodukter og er også påviselige i små andele i pancreas-ekstrakter. De nævnte grupper fraspaltes normalt med trypsin og/eller carboxypeptidase B eller enzymer med 10 lignende specificitet under frigørelse af nativt insulin.

Opfindelsen angår lægemidler af en farmaceutisk acceptabel bærer og et virksomt stof, som er ejendommelige ved, at de som virksomt stof indeholder et basisk modificeret insulin-derivat med et isoelektrisk punkt mellem 5,8 og 8,5 15 og med formlen I

Ål_i—S----S—i A21

H- Gly A-kæde Asn -OH

3 DK 172209 B1 A-kæden og kæden (B2-29) i de her omhandlede forbindelser udviser hensigtsmæssigt samme sekvens som okse- eller svineinsulin, men især som humaninsulin.

Ved en neutral, naturligt forekommende aminosyre 5 forstås især Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gin,

Cys, Met, Tyr, Phe, Pro eller Hyp. Ved en basisk, naturligt forekommende aminosyre forstås især Arg, Lys, Hyl, Orn,

Cit eller His.

I rækken af insulin-derivater ifølge opfindelsen 10 skal eksempelvis nævnes de i det følgende anførte forbindelser, uden at opfindelsen er begrænset til disse:

Des-PheB1-svineinsulin-ArgB31-OH,

Des-PheB1-humaninsulin-ArgB31-OH,

Des-PheB1-svineinsulin-ArgB31-ArgB3 2 -OH, 15 Des-PheB1-humaninsulin-ArgB31-ArgB32-OH, Des-ThrB30-humaninsulin-ValB30-ArgB31-OH,

Des-ThrB30-humaninsulin-ValB3B-AlaB31-ArgB32-OH, humaninsulin-LysB31-OH, humaninsulin-LysB31-ArgB3 2-OH, 20 humaninsulin-ArgB31-LysB32-OH, humaninsulin-ValB31-ArgB32-OH, humaninsulin-ValB31-ArgB32-ArgB33-OH, humaninsulin-LysB31-ArgB32-ArgB33-OH, humaninsulin-ArgB31-NH2, 25 humaninsulin-ArgB31-ArgB32-NH2, human insulin-OrnB31-OH, humaninsulin-LeuB31-CitB32-OH.

Insulin-derivaterne med formlen (I) kan fremstilles ved, at 30 a) et des-octapeptid (B23-30)-insulin med formlen

Al_i—S S—i_A21

S^- Gly A-kæde Asn -OH

35 SS (II)

I I

S S

B2 B22

S^-R1- Val B-kæde Arg -OH

0 4 DK 172209 B1 hvor R betyder Phe eller en binding, og betyder en proton-solvolytisk eller ved β-eliminering fraspaltelig aminobeskyttelsesgruppe, såsom en tert.butyloxycarbonyl--(Boc)-, tert.amyloxycarbonyl-(Aoc) - eller methylsulfonyl-5 ethyloxycarbonyl-(Msc)-gruppe, kondenseres med et peptid med formlen H-Gly-Phe-Phe—Tyr(S2)-Thr(S2)-Pro-Lys(S3)-R30-R31 (III) 10 hvor R30 og R3^ har de ovenfor anførte betydninger, betyder hydrogen, Bzl eller But, og S3 betyder en urethanbe-skyttelsesgruppe, såsom Boc, Moc, Fmoc eller Z, idet i grupperne R30 og R3^ forekommende, frie C00H-, OH-, SH-, NH2“, guanidino- og/eller imidazol-grupper, om nødvendigt, 15 foreligger beskyttet på i og for sig kendt måde, og eventuelt forekommende beskyttelsesgrupper fraspaltes på i og for sig kendt måde , b) et des-B30-insulin med formlen (I), hvori R^ betyder H eller Η-Phe, og den C-terminale ende R^-R31 til- 20 sammen betyder OH, i nærværelse af trypsin eller en tryp-sinlignende endopeptidase omsættes med en forbindelse med formlen H-R30-R31 (IV) 25 hvori R30 og R3^ har de ovenfor anførte betydninger, og hvori forekommende, frie COOH-, OH-, SH-, guani dino- og/eller imidazol-funktioner, om nødvendigt, foreligger beskyttet på i og for sig kendt måde, hvorpå even-30 tuelt forekommende beskyttelsesgrupper fraspaltes på i og for sig kendt måde, eller c) et proinsulin, proinsulinanalog eller præpro-insulinanalog eller et intermediat af disse forbindelser spaltes kemisk og/eller enzymatisk.

35 DK 172209 Bl 0 5 QAl

Ved fremgangsmådevariant a) omsættes f.eks. N ,

g I

N -Bis-Boc-derivatet af et des-octapeptid-(B23-30) insulin analogt med den i US patentskrift nr. 4.029.642 beskrevne fremgangsmåde direkte med et ækvivalent af en for-5 bindelse med formlen (III), hvor dicyclohexylcarbodiimid i ringe overskud i nærværelse af 1-hydroxybenzotriazol tjener som kondensationsmiddel.

Da det ved denne fremgangsmådevariant sædvanligvis ikke er nødvendigt med en beskyttelse af carboxylgrupper-10 ne, sker der normalt heller ingen beskadigelse af insulin--derivatet hverken ved forestringen eller ved den alkaliske forsæbning. Ikke-omsat des-octapeptid og et peptid, der opstår ved kondensation af forbindelsen (IV) til A21

Asp -OH, er på grund af de forskellige molekylstørrel-15 ser og ladningstal let at adskille ved fordelingschromato-grafi på "Sephadex"-LH 20 eller ved gelchromatografi på "Sephadex"-G 75 eller G 50 superfine.

Til fraspaltning af tert.butylbeskyttelsesgrupper-ne skal reaktionsproduktet kun behandles med trifluored-20 dikesyre i 30-60 minutter ved stuetemperatur. Denne reaktion beskadiger ikke insulin-derivatet. Såfremt der som N-beskyttelsesgruppe vælges methylsulfonylethyloxycarbo-nylgruppen, er det nødvendigt med en alkalibehandling til fraspaltning ved (3-eliminering. Reaktionsbetingelser-25 ne er således (f.eks. 0,1 N NaOH, 0°C, 5 sekunder) at insulin-derivatet ikke beskadiges. Det som udgangsprodukt anvendte NaA^ , NaB^-Bis-Boc-Des-B23_2Q-octapeptid-insulin fra svin fremstilles f.eks. på følgende måde: svineinsu-lin omsættes i en blanding af dimethylformamid, dimethyl-30 sulfoxid og vand i nærværelse af N-ethylmorpholin med overskud af tert.butyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimid-ester. Herved fremkommer det forventede NaA^, NaB^, N^B^--Tris-Boc-insulin.

Opløsningen af denne forbindelse i dimethylformamid 35 og tris-puffer (pH 7,5) tilsættes nu trypsin i små portio- 6 0 DK 172209 B1 ner, indtil der ved elektroforese ikke længere kan påvises noget udgangsprodukt. NaA1, NaB1-Bis-Boc-Des-B23_3Q-octa-peptid-insulinet renses ved fordelingschromatografi på "Sephadex" LH 20.

5 Denne forbindelse bringes til reaktion med 1 mol peptid med formlen (III) , som fremstilles på i og for sig kendt måde ifølge metoderne anvendt inden for peptidkemien, 1-2 mol 1-hydroxybenzotriazol og ca. 0,9 mol dicyclo-hexylcarbodiimid i dimethylformamid ved ca. pH 7-8 (jfr.

10 Chem. Ber. 103 (1970) , side 788) .

Råproduktet renses ved fordelingschromatografi og befries for beskyttelsesgrupperne ved behandling med tri-fluoreddikesyre/anisol ved stuetemperatur. Efter fældning med ether, isoelektrisk fældning fra vand og chromatogra-15 fi på "Sephadex''-G 75 eller G 50 superfine, er forbindelsen elektroforetisk ren og kan bringes til krystallisation på kendt måde. Det således udvundne insulin-derivat er biologisk fuldt aktivt.

Bl

Des-Phe -insuliner ud fra udgangsforbindelser til 20 de her omhandlede fremgangsmåder er f.eks. kendt fra tysk patentskrift nr. 2.005.658 eller fra EP-A-46.979.

De ved fremgangsmådevariant b) som udgangsforbindelser anvendte des-B30-insuliner er f.eks. kendt fra EP-A--46.979 eller Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978) 25 799. Det ved variant b) anvendte udgangsmateriale med form len (IV) fremstilles på i og for sig kendt måde ifølge metoder anvendt inden for peptidkemien. Brugbare beskyttelsesgrupper for forbindelsen (IV) er detaljeret beskrevet af M. Bodanzyky et al i Peptide Synthesis, Ind. Ed. 1976, Wiley 30 & Sons.

Des-B30-insulinet og forbindelsen med formlen (IV) kondenseres analogt med den i US patentskrift nr. 4.320.196 beskrevne fremgangsmåde i nærværelse af trypsin eller et trypsin-lignende endopeptidase i et organisk-vandigt opløs-35 ningsmiddelsystem ved en pH-værdi på 5-9 og en temperatur o 7 DK 172209 B1 på 20-40°C. Det fremkomne insulin-derivat kan isoleres ifølge gængse metoder anvendt inden for peptidkemien.

Ved gen-teknologiske metoder er humant eller primat- proinsulin imidlertid blevet tilgængeligt som udgangs-5 materiale til fremgangsmådevariant c). Derivaterne Arg(B31) og di-Arg(B31-32) er tilgængelige ud fra disse ved en enkel fordøjelse med trypsin eller trypsinlignende enzymer. Desuden kan der imidlertid også konstrueres relativt enkle plasmider, som ved spaltning af de tilsvarende præproinsu-10 linderivater fører til nye insulinderivater, fordi de i stedet for de naturligt ved B31 eller B32 forekommende ar-gininer koder for andre neutrale eller basiske aminosyrer.

Fremstillingen af proinsulin under anvendelse af re-kombinations-DNA-metodologien kræver dannelse af en DNA-se-15 kvens, der koder for aminosyresekvensen i et proinsulin, hvilket kan opnås enten ved isolering, konstruktion eller en kombination af begge. Pro-insulin-DNA'et indsættes derpå i læsefasen i en egnet klondannelses- og ekspressionsbærer. Bæreren tjener til transformering af en egnet mikro-20 organisme, og den herved fremkomne transformerede mikroorganisme underkastes derpå fermenteringsbetingelser, hvilket fører til dannelse af yderligere kopier af den proinsulingen-holdige vektor og til ekspression af proinsulin, et proin-sulinderivat eller en en proinsulinprecurser (eller et præ-25 proinsulinderivat) .

Såfremt det ved ekspressionsproduktet drejer sig om en proinsulinprecursor, indeholder et sådant produkt almindeligvis proinsulinaminosyresekvensen, som ved den endestillede aminogruppe er bundet til et brudstykke af et protein, 30 der normalt udtrykkes gennem gensekvensen, hvori proinsuli-net eller proinsulinderivatet er blevet indsat. Proinsulinaminosyresekvensen er bundet til proteinbrudstykket over et specifikt spalteligt sted, som f.eks. kan være methionin.

Den fremkomne proinsulinaminosyresekvens spaltes fra det 35 sammensmeltede genprodukt, f.eks. som beskrevet i tysk frem- 0 8 DK 172209 B1 læggelsesskrift nr. 3.232.036, hvorefter proinsulinet isoleres efter rensning. Den enzymatiske spaltning af det på denne måde fremstillede proinsulin eller proinsulinderi-vat sker analogt med metoden beskrevet i Excerpta Medica 5 International Congress Series No. 231, side 292 ff. eller metoden beskrevet i tysk patentansøgning P 32 09 184.

Ved hjælp af de beskrevne semisyntetiske fremgangsmåder er en række hidtil ukendte insulinderivater blevet tilgængelige ud over de kendte arginin (B30)- og diargi-10 nin (B31-32)-derivater samt de ved genteknologiske metoder tilgængelige derivater, der i bærer naturlige L- -aminosyrer, hvilke hidtil ukendte insulinderivater som karakteristikum udviser en eller flere basiske grupper og/eller fravær af frie carboxylgrupper, således at mole- 15 kylets nettoladning øges med mindst én positiv ladning i

Bl forhold til nativt insulin eller i forhold til Des-Phe -insulin.

Hertil hører f.eks. derivater, der i position B31 i stedet for de naturlige aminosyrer L-lysin, L-histidin eller 20 L-arginin bærer gængse L-aminosyreanaloge, som i sidekæden udviser en basisk gruppering (f.eks. ornithin). Aminosyren i position B31 kan udvise en fri carboxylende eller være amideret med ammoniak. Ved position B32 kan der f.eks. følge en neutral eller også en yderligere naturlig basisk aminosyre 25 eller en af de ovenfor beskrevne aminosyrederivater. På analog måde kan disses carboxylgruppe være fri eller amideret. Også her kan der følge en yderligere neutral eller basisk aminosyre.

30 35 9 DK 172209 B1

Alle disse insulinderivater har det til fælles, at de yderligere, ved molekylets overflade forekommende, positive ladninger giver molekylet et isoelektrisk punkt, der er forrykket ind i neutralområdet. Afhængig af derivatet 5 måles der isoelektriske punkter fra 5,8 til 8,5, især fra 6,2 til 8,2, i den isoelektriske fokusering. Dermed er derivaterne mindre opløselige i neutralområdet end nativt insulin eller proinsulin, der har deres isoelektriske punkt og dermed området for maksimal uopløselighed ved en pH-vær-10 di på 5,4, medens de normalt foreligger opløst i neutralområdet .

Insulinets og proinsulinets opløselighedségenskaber kan påvirkes i området over det isoelektriske punkt, dvs. i det terapeutisk særligt interessante neutralområde, ved 15 tilsætning af zinkioner. Zink virker i denne forbindelse som depotprincip på den måde, at det stabiliserer insulinets hexamere tilstand samt dets krystalliseringstendens.

I det subcutane væv opløses disse aggregater igen.

Et yderligere velkendt depotprincip er krystallisa-20 tionen af insulinet eller proinsulinet som kompleks med et basisk protein, f.eks. globin eller protamin.

Ved anvendelse af proinsulinet i opløsning eller i forbindelse med et af de beskrevne depotprincipper behøves der en yderligere proteolytisk nedbrydning for at frigøre 25 nativt, fuldt virksomt insulin. Intakt proinsulin har kun ca. en ottendedel af insulinets biologiske virkning, fordi, således forestiller man sig det, en del af det biologisk aktive overfladeområde, receptor-bindingsområdet, er maskeret med det i proinsulinet forekommende C-peptid. På tale 30 som proinsulin til diabetesbehandling kommer ganske vist kun homologt proinsulin, dvs. kun sådant proinsulin med menneskelig sekvens (jfr. f.eks. DE-Al-32 32 036). Heterologt proinsulin har en signifikant immunogenitet. Det er i 35 DK 172209 B1 10 o denne sammenhæng bemærkelsesværdigt, at også humane proin- suliner kan udvise variationer i C-peptiddelen.

H31

Svineinsulin-Arg OH og det tilsvarende diarginin-derivat udviser ifølge undersøgelser af Chance, Excerpta 5 Medica International Congress Series No. 231, side 292, 293 kun 62% henholdsvis 66% af det native svineinsulins aktivitet.

Overraskende nok har det nu vist sig, at insulin-B31 B31 B32

Arg -OH, insulin-Arg -Arg -OH og andre insulinderiva-10 ter, hvis B-kæde i den C-terminale ende bærer en organisk gruppe med basisk karakter, til forskel fra proinsulin udviser en omtrent lige så høj biologisk aktivitet som na-tivt insulin.

De her omhandlede lægemidler repræsenterer fuldstæn- 15 digt nye forhalingsprincipper, der kan bringes til at virke ' uden depothjælpestoffer, såsom zink eller protaminsulfat.

Depotvirkningen hidrører fra et inherent, proteinkemisk betinget, fysisk princip, nemlig insulin-derivatets tungt- opløselighed ved dets isoelektriske punkt. Dets genopløsning 20 under fysiologiske betingelser opnås muligvis ved fraspalt- ning af de yderligere basiske grupper, som afhængig af derivatet kommer i stand ved tryptiske eller trypsinlignende og/eller carboxypeptidase B eller carboxypeptidase B-lignende og/eller esterase aktivitet. De hver gang fraspaltede grupper 25 er enten rent fysiologiske metabolitter, såsom aminosyrer, ornithin eller cholin, eller let metaboliserbare, fysiologisk acceptable stoffer.

Insulinderivaterne som aktive stoffer i disse hidtil ukendte lægemidler er desuden til forskel fra de i lit-30 teraturen beskrevne intermediater, som desuden indeholder dele af det heterologe C-peptid, ikke stærkere immunogene end det tilsvarende insulin selv.

De ovenfor anførte, for lave aktivitetsværdier ifølge Chance har muligvis deres årsag i en utilstrækkelig ren-35 hed af de undersøgte fraktioner eller i en systematisk målefejl. Deres anvendelighed som aktive stoffer i lægemidler har i hvert fald (og måske derfor) ikke hidtil været kendt.

11 DK 172209 B1

De her omhandlede midler indeholder som aktivt stof et eller flere af de hidtil ukendte insulinderivater med B31 B31 formlen (I) eller insulin-Arg -OH eller insulin-Arg -ArgB32-OH.

5 De udviser fortrinsvis en pH-værdi på mellem 2,5 og 8,5, indeholder et egnet isotont middel, et egnet konserveringsmiddel og eventuelt en egnet puffer for et pH-område mellem 5,0 og 8,5.

En typisk anvendelsesform af de beskrevne derivater 10 er præparationer, der foreligger under det isoelektriske punkt som opløsninger i en fysiologisk acceptabel bærer..I denne forbindelse kan opløsningens pH-værdi typisk være 5,0, dvs. den ligger tydeligt højere end pH-værdien for sure kendte insuliner (typisk pH = 3,0). En mere neutral injek-15 tionsopløsning betyder eventuelt tydelige fordele med hen-, syn til forenelighed.

En yderligere typisk anvendelsesform er suspensioner ud fra amorfe eller krystallinske bundfald af de beskrevne derivater i en fysiologisk acceptabel bærer med en om-20 trent neutral pH-værdi.

Det er imidlertid også muligt at forstærke den i derivaterne inherente tungtopløselighed i det fysiologiske pH-område ved yderligere depotprincipper, såsom eventuelt ved tilsætning af zink eller protaminsulfat. Den 25 tilsatte zinkmængde kan i denne forbindelse andrage højst 100 jag Zn2+/100 insulinenheder, typisk ca. 50 jig Zn2+/100 insulinenheder. Protaminmængden kan andrage mellem 0,28 mg og 0,6 mg pr. 100 enheder (beregnet på basis af protaminsulfat) . På denne måde kan der fremstilles særligt lang-30 tidsvirkende præparationer, som i fremtiden vil finde en bredere anvendelse end hidtil, fordi netop en basal mængde insulin viser sig terapeutisk fordelagtig. Dette er allerede nu en erkendelse, man er kommet frem til ved behandling med insulindoseringsapparater.

35 Som fysiologisk acceptabelt og med insulinderiva tet foreneligt bæremedium egner sig en steril vandig opløsning, der gøres isotonisk med blod på gængs måde, f.eks.

12 DK 172209 B1 med glycerol, kogsalt eller glucose, og desuden indeholder et af de gængse konserveringsmidler, såsom phenol, m-zresol eller p-hydroxybenzoesyreester. Bæremediet kan desuden indeholde et pufferstof, såsom natriumacetat, natriumcitrat 5 eller natriumphosphat. Til indstilling af pH-værdien anvendes der fortyndede syrer (typisk HCl) eller hydroxidopløsninger (typisk NaOH).

Insulinderivaterne kan anvendes i de her omhandlede midler som alkalimetal- såvel som ammoniumsalte..En vil-10 kårlig andel af et eller flere insulinderivater med formlen (I) eller et insulinderivat med formlen (I) kan foreligge i en blanding af yderligere sådanne insulinderivater uafhængig af hinanden, hver gang i opløst, amorf og/eller krystallinsk form.

15 Det er ofte en fordel at sætte en passende mængde egnet stabilisator til det her omhandlede præparat, som forhindrer udfældning af protein ved termisk mekanisk belastning ved kontakt med forskellige materialer. Eksempler på sådanne stabilisatorer er anført i EP-A-18.609, i DE-A-20 -32 40 177 eller i W0-83/00288.

Ved de her omhandlede midler, som også kan indeholde et af de kendte forhalingsprincipper, såsom protamin-sulfat, globin eller zink i passende mængder, kan et sådant forhalingsprincip anvendes i en blanding i kombina-25 tion med den samlede andel af aktivt stof eller med dele deraf eller et eller flere insulinderivater med formlen (I). Et middel kan indeholde forskellige insulinderivater med formlen (I) i kombination med flere forskellige hjælpestoffer, der virker forhalende.

30 Med de her omhandlede terapeutiske midler kan der således opnås åbenlyst mangfoldige virkningskarakteristika, som desuden kan afstemmes meget fint. Med dette skulle der ifølge de tidligere gjorte bemærkninger være forbundet fremskridt især med henblik på diabetiske senkomplikationer.

35 Opfindelsen er belyst nærmere i de følgende eksemp ler .

0 13 DK 172209 B1

Fremstillingen af octapeptidet med formlen (III) sker som anført i det følgende kondensationsskema ifølge gængse peptid-kondensationsmetoder: 5 Synteseskema for octapeptidet med formlen (III)

Gly___Phe___Phe_Tyr Thr____Pro__Lys Thr_ Z- OH H-OBu1^ DCC/H03t 10 Z--4--0Bufc H^/Pd Bufc BOG Eufc Z-OH H-----0Bufc z/o’H H-OMe z/oH HZOCholin DCC/H03t DCC/HOBt DCC/HOBt 1 Bu^ [ BOC I Bu*' 15 „ v t/V / V / Z---OBu IL-1--OMe zl---^OCholin TFE H2/Pd H2/Pd I Bu1^ BOC | Bu* Z--OH vJ-----OMe Z-OH tf/---/icholin 20 DCC/HOBt DCC/HOBt I Eu* I BOC Ku* Z------1_L-OMe Z--ϊ-L-/ocnolin

KaOH H2/Pd

Bu*j BOC I But 25 Z------L-OH H----/oCnolin DCC/H03t

Bu* I EOC Bu1 Z_______.___, _^_ _________ _ _ /__/)Cholin i2/Pd 30 Es11 BOC Bu* H ____________ _____/__________/____/JOCholin

Aminosyre- og elementæranalyse svarer til det teoretiske.

35 14 DK 172209 B1 0

Fremstillingseksempel 1 &31 B32

Svineinsulin-Arg- -Arg -OH ved tryptisk fordøjelse ud fra svineproinsulin 350 mg svineproinsulin opløses i 25 ml 0,1 M tris-5 -HCl-puffer, pH = 7,5. Til denne opløsning sættes der ved stuetemperatur 500 ^g trypsin, hvorved der i løbet af nogle få timer optræder en uklarhed. Efter fuldendt reaktion skilles ved fra ved centrifugering, bundfaldet opløses surt og analyseres ved hjælp af acetatfolieelektroforese eller io HPLC. Efter fornyet udfældning og vaskning af bundfaldet oparbejdes dette på i og for sig kendt måde eller renses på en kation'bytter med 0,05 M acetat, pH = 4,0, med en kogsaltgradient til 0,5 M. De tilsvarende fraktioner forenes og udfældes. Efter vaskning og omkrystallisatioh isoleres 15 der 104 mg ved aminosyreanalyse identificeret og med HPLC og isoelektrisk fokusering som éntydigt karakteriseret svineinsulin-ArgB^^-ArgB^^-0H.

På analog måde fås insulinderivatet svineinsulin-B31 B 3 2 -Lys -Arg -OH ud fra det tilsvarende, i position B31 20 modificerede svineproinsulin.

Lægemidler

Eksempel 1 B 31 B3 2 25 Insulin-Arg -Arg -OH fra svin (fremstillet ved tryptisk fordøjelse ud fra proinsulin fra svin) i svagt sur, opløst formulering med 40 I.E. pr. ml samt dets depotvirkning : I et samlet rumfang på 10 ml vand opløses der nil R77 30 insulin-Arg -Arg -OH fra svin 14,8 mg (27 I.E./mg) druesukker (monohydrat) krystallinsk 540,0 mg p-hydroxybenzoesyremethylester 10,0 mg pH-værdien indstilles til 4,5 ved tilsætning af 1 N 35 HC1 eller 1 N NaOH.

DK 172209 B1 15

En sådan opløsning udviser en udpræget depotvirkning ved en dosering på 0,4 I.E./kg til kaniner. Fladen under blodsukkerkurven er lige som ved et standardpræparat med 40 I.E./ml.

5

Eksempel 2.

B31

Humaninsulin—Arg —OH fremstillet ud fra svinein— sulin ved semisyntes'e, i form af et krystallinsk NPH-præpa-10 rat med 40 I.E./ml samt dets stærkt forhalende virkning: I et samlet rumfang på 10 ml opløses der sammen med vand B31 humaninsulin-Arg -OH 14,5 mg (27,5 I.E./mg) 15 protaminsulfat 1,3 mg natriumdihydrogenphosphat-dihydrat 21,0 mg m-kresol 15,0 mg

Phenol 6,0 mg glycerol 160,0 mg

20 pH-værdien indstilles til 7,3 ved tilsætning af 1 N

HC1 eller 1 N NaOH.

En sådan krystalsuspension udviser en stærkt for-25 halende virkning ved en dosering på 0,4 I.E./kg til kaniner.

30 35 B31 16 DK 172209 B1

Eksempel 3

Blanding af humaninsulin-Arg -OH og humaninsu-lin-Arg -Arg -OH, begge fremstillet ved semisyntese ud fra svineinsulin, i form af en zinkholdig suspension 5 med 40 I.E./ml samt den stærkt forhalende virkning deraf: I et samlet rumfang på lO ml opløses der sammen med vand: B31 humaninsulin-Arg- -OH 7,3 mg (27,5 I.E./mg) 10 humaninsulin-Arg-^^-Arg^^-OH 7,4 mg (27,0 I.E./mg) zinkchlorid, vandfrit 0,46 mg natriumacetat 14,0 mg p-hydroxybenzoesyremethylester 10,0 mg 15 kogsalt 80,0 mg pH-værdien indstilles til 7,0 ved tilsætning af 1 N HC1 eller 1 N NaOH.

En sådan suspension udviser en stærkt forhalet virkning ved en dosering på 0,4 I.E./kg til kaniner.

20 25 30 35 B31 17 DK 172209 B1

Eksempel 4

Humaninsulin-Arg -OH, fremstillet ved tryptisk spaltning ud fra primat-præproinsulin af bakteriel oprindelse, i form af NPH-krystaller, i blanding med humaninsu-B 31. B 3 2 5 lin-Arg -Arg -OH, fremstillet ved tryptisk spaltning ud fra primat-præproinsulin af bakteriel oprindelse: I et samlet rumfang på 10 ml opløses der sammen med vand B 31 humaninsulin-Arg -OH 11,1 mg 10 (27,5 I.E./mg) B31 B32 humaninsulin-Arg -Arg -OH 3,7 mg (27,0 I.E./mg) protaminsulfat 1,0 mg natriumdihydrogenphosphat-2-hydrat 21,0 mg 15 m-cresol 15,0 mg phenol 6,0 mg glycerol 160,0 mg pH-værdien indstilles til 7,2 ved tilsætning af 1 N NaOH eller 1 N HC1.

20 Denne suspension viser en kraftig forhalet virkning på kaniner (0,4 I.E./kg).

25 30 35 18 0 DK 172209 B1 SUPPLERENDE EKSEMPLER Eksempel 1.

Blodglucose hos fastende hunde efter subcutan indgivelse af krystal- B31 5 linsk NPH-svineinsulin eller opløsninger af svineinsulin, Ala , - B32 B31 B32

Arg -svineinsulin eller Arg /Arg -svineinsulin.

Insulinerne anvendes i formuleringer indeholdende: 400 internationale enheder af svineinsulin eller en ækvimolær koncentration af svineinsulinderivaterne 10 160 mg glycerol 27 mg m-cresol i et totalt volumen på 10 ml vand.

Desuden er NPH-insulinet (krystalsuspension indeholdende ca. 20 15 2+ ^ug/ml Zn ) anvendt som langvarigt virkende referencepræparat pufret til pH 7,3 med phosphat, medens svineinsulinet og derivaterne anvendes som sure opøsninger (pH 4,0 ved tilsætning af IN HC1) uden 2+ puffer. Disse opløsninger indeholder 80^ug/ml Zn 20 Hundene modtager 0,3 I.E./kg af NPH-insulinet eller det opløselige svineinsulin eller en ækvimolær mængde af svineinsulinderivaterne ved subcutan injektion. Der anvendes 6 hunde pr. insulinpræparat. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel, der viser blodsukkerkoncentrationerne i procent af udgangsværdien.

25

Tid (timer) 0 1 2 34 5 6 7 8 NPH 100 97 83 66 64 72 74 89 101

Opløseligt svineinsulin 100 81 59 57 67 71 83 98 103 30 AlaB31,ArgB32- svineinsulin 100 95 71 61 63 66 85 91 96 . B31 . B32

Arg ,Arg svineinsulin 100 101 91 72 59 58 69 81 89

Resultaterne demonstrerer den langvarige virkning på grund af for-35 skydningen af det isoelektriske punkt. Opløseligt svineinsulin har B 31 den maksimale virkning 2-3 timer efter injektion, medens Ala 332 331 B3 2

Arg -svineinsulin og Arg ,Arg -svineinsulin udviser deres mak- 19 0 DK 172209 B1 simale blodglucosesænkende virkning 3-4 timer hhv. 4-5 timer efter injektion. Dette ligger meget tæt på eller er endog bedre end den forlængede virkning af standarddepotpræparatet, NPH-svineinsulin, som fremstilles ved co-krystallisation med et særligt depotadditiv, 5 protamin, og som udviser en maksimal virkning 3-4 timer efter injektion .

Eksempel 2.

Blodglucose hos fastende hunde efter subcutan indgivelse af opløse- B31 B31 R32 10 ligt svineinsulin, Trp -NH2-svineinsulin eller Arg ,Trp - -NH2-svineinsulin.

Insulinerne anvendes i formuleringer indeholdende: 400 internationale enheder svineinsulin eller en ækvimolær koncentration af svineinsulinderivaterne 15 160 mg glycerol 27 mg m-cresol i et totalt volumen på 10 ml vand indstillet til pH 4,0 ved tilsæt- * 2+ ning af IN HC1. Opløsningerne indeholder ca. 6-lO^.ug/ml Zn (som kommer fra det aktive stof).

20

Hundene modtager 0,3 I.E. svineinsulin eller en ækvimolær mængde af svineinsulinderivatet ved subcutan injektion. Der anvendes 6 hunde pr. insulinpræparat. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel, som viser blodsukkerkoncentrationerne i procent af ud-25 gangsværdien.

Tid (timer) 012345678

Opløseligt svineinsulin 100 69 54 70 82 99 104 100 99 30 TrpB31-NH2- svineinsufin 100 76 61 59 63 87 96 102 103 _ B31 m B3 2

Arg ,Trp -NH2~svineinsulin 100 99 89 71 61 63 78 84 92 35 Resultaterne demonstrerer igen den forlængede virkning på grund af forskydningen af det isoelektriske punkt. Opløseligt svineinsulin 1 en formulering uden tilsætning af zink har sin maksimale virkning B31 2 timer efter injektion, medens Trp -NH2~svineinsulin udviser sin 20 0 DK 172209 B1 maksimale blodglucosesænkende virkning 3 timer efter injektion.

Virkningen ophører efter ca. 5 timer for svineinsulin og efter ca.

B3 X

6-7 timer for Trp -NH2-svineinsulin.

5 Eksempel 3.

Blodglucose hos fastende hunde efter subcutan indgivelse af krystal- B»31 linsk NPH-huraaninsulin eller opløsninger af humaninsulin, Ala ,- B32 ' B31 B32

Arg -humaninsulin eller Arg , Arg -humaninsulin.

10 Insulinerne anvendes i formuleringer indeholdende: 400 internationale enheder humaninsulin eller en ækvimolær koncentration af humaninsulin-derivaterne 160 mg glycerol 27 mg m-cresol 15 i et totalt volumen på 10 ml vand.

Desuden pufres NPH-humaninsulin (krystalsuspension) til pH 7,3 med phosphat, medens humaninsulinderivaterne og det opløselige humaninsulin anvendes som sur opløsning (pH 4,0. ved tilsætning af IN HCl) 2+ uden puffer. Disse opløsninger indeholder 80^ug/ml Zn

Hundene modtager 0,3 I.E. humaninsulin eller en ækvimolær mængde af humaninsulinderivaterne ved subcutan injektion. Der anvendes 6 hunde pr. insulinpræparat. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel, der viser blodsukkerkoncentrationerne i procent af udgangsvær-25 dien.

Tid (timer) 0 12 3 4 5 6 7 8 NPH 100 98 81 64 65 70 75 88 96

Opløseligt humaninsulin 100 79 56 60 69 71 84 101 99 B31 . B32

Ala ,Arg humaninsulin 100 97 73 64 64 68 81 89 97 . B31 . B32

Arg /Arg - humaninsulin 100 102 88 69 58 59 68 79 88 35 Resultaterne demonstrerer den forlængede virkning på grund af forskydningen af det isoelektriske punkt. Opløseligt humaninsulin 0 B31 21 DK 172209 B1 har sin maksimale virkning 2-3 timer efter injektion, medens Ala ArgB22-humaninsulin og ArgB2^,ArgB32-humaninsulin udviser deres maksimale blodglucosesænkende virkning 3-4 timer hhv. 4-5 timer efter injektion. Dette ligger meget tæt på eller er endog bedre end den 5 forlængede virkning af et standarddepotpræparat, NPH-humaninsulin, med en maksimal virkning mellem 3 og 4 timer efter injektion.

10 15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Lægemidler af en farmaceutisk acceptabel bærer og et virksomt stof, kendetegnet ved, at de som virksomt stof indeholder et basisk modificeret insulinderivat 5 med et isoelektrisk punkt mellem 5,8 og 8,5 og med formlen I Al i—S-S—i A21 H- Gly A-kæde Asn -OH 10. j (I) SS i i S S B2 B29 1 ‘ _30 _31 R - Val B-kæde 15 hvor R1 betyder H eller H-Phe, R-*0 betyder Ala, Thr eller Ser, og R^l betyder en gruppe med formlen -XnS, hvori n betyder 1, 2 eller 3, 20. betyder ens eller forskellige rester af naturligt forekommende, neutrale eller basiske L-aminosyrer, og S betyder -OH eller en carboxylgruppeblokerende NH2-gruppe, eller fysiologisk acceptable salte deraf.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, 25 at det som virksomt stof indeholder insulin-B31-Arg-OH eller insulin-B31-Arg-Arg-OH.

3. Middel ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det har en pH-værdi mellem 2,5 og 8,5, indeholder et egnet isotoni-middel og et egnet konserveringsmid- 30 del, og at insulinderivatet foreligger opløst og/eller i suspension.

4. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det indeholder en egnet puffer, og at pH-værdien ligger mellem 4,0 og 8,5.

5. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det indeholder mellem 0 og DK 172209 B1 100 zink/100 I.E.

6. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-5, kendetegnet ved, at insulinderivatet med formlen I foreligger i form af et alkalimetalsalt eller ammonium- 5 saltet.

7. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-6, kendetegnet ved, at en vilkårlig andel af et eller flere insulinderivater med formlen I foreligger i en blanding af yderligere sådanne insulinderivater uafhængigt 10 af hinanden hver for sig i opløst, amorf og/eller krystallinsk form.

8. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at det indeholder en egnet mængde af et hjælpemiddel med forhalende virkning.

9. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved,' at dette forhalingsprincip anvendes i kombination med den samlede andel af aktivt stof eller med dele deraf eller et eller flere insulinderivater med formlen I i en blanding.

10. Middel ifølge et eller flere af kravene 1-9, 20 kendetegnet ved, at det indeholder forskellige insulinderivater med formlen I i kombination med flere forskellige hjælpestoffer, der virker forhalende.