NO167810B

NO167810B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater.

Info

Publication number: NO167810B
Application number: NO842977A
Authority: NO
Inventors: Ulrich Grau
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-07-22
Filing date: 1984-07-20
Publication date: 1991-09-02
Also published as: IL72469A; DK1790A; US4701440A; PT78940A; FI842914A; AR241864A1; DE3326472A1; DK172209B1; AU569097B2; ES535706A0; HUT37805A; FI842914A0; ES534487A0; EP0132770A1; JPH052654B2; AU3092284A; NZ208959A; GR81551B; IE841889L; DK358284D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analogifremgangsmåte til fremstilling av et insulinderivat.

Ved behandlingen av diabetes mellitus administreres i dag vanligvis preparater av det blodsukkersenkende hormonet insulin parenteralt. Insulinets spesielle egenskaper og dets metabolisme medfører at virkningsvarigheten av en enkelt oppløsning bare er svært kortvarig, slik at det for vedvar-ende blodsukkerkontroll hos diabetikeren må tilføres enten en kontinuerlig infusjon med doseringsinnretning, mange daglige injeksjoner eller et forsinket virkende insulinpreparat. Som forsinkningsprinsipper er slike tilstandsformer av insulin som på injeksjonsstedet er tungtløselige (for eksempel krystallinsk eller amorft) av særlig betydning. Blant disse er for eksempel sinkinsulinkrystaller eller protamin-insulin-krystaller som under sin langsomme oppløsning frisetter insulin over et visst tidsrom.

Nå har det vist seg ytterst hjelpsomt å ha forskjellige insulinpreparater til rådighet under behandlingen som i sin virkningskarakteristikk kommer så nært opptil den enkelte pasients behov som mulig. I sammenheng med ikke-optimal tilførsel omtales ved siden av umiddelbare virkninger som hyper- eller hypoglykemi, særlig de diabetiske senkomplikasjoner, deriblant retinopathia, neuropathia, sephropatia, mikro- og makrioangiopathia.

Insulinmangelen hos diabetikeren fører til at kroppen ikke lenger kan oppnå sin naturlige hormonelle likevekt.

Formålet med oppfinnelsen er fremstillingen av et insulinderivat som man kan nærme seg den naturlige hormonelle likevekten i en diabetisk tilstand bedre med, og hvorved denne bedre lar seg opprettholde enn ved administreringen av insulin i de tidligere vanlige formene.

Insulinderivater som har resten arg-OH eller arg-arg-OH 1 C-enden av B-kjeden, er allerede beskrevet. Som bekjent fremstilles disse derivatene ved den enzymatiske omvandling av proinsulin til insulin in vlvo som naturlige mellomprodukter og er også påvisbar i små mengder i ekstrakter fra bukspyttkjertelen. Den nevnte resten avspaltes vanligvis ved hjelp av trypsin og/eller karboksypeptidase B eller enzymer med lignende spesifisitet under frigivelse av naturlig insulin.

Oppfinnelsen vedrører følgelig insulinderivat med formel I

hvori

R<1> betyr H eller H-Phe,

R30 betyr Ala eller Thr og

R31 cholinrester, LysB31-ArgB32-0H, ArgB31-LysB<32->0CH3,

Arg eller ArgB31-ArgB32-0H,

idet hvis R1 betyr H-Phe, kan C-terminusen -R30-R31 ikke bety

-Thr(Arg)m-OH, -Ala(Arg)m-OH eller-Ser-(Arg)m-OH med m = 1 eller 2

som har et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5, eller fysiologisk tålbare salter, kjennetegnet ved at

a) et des-oktapeptid, des(B23-30 )-insulin med formel II, hvori R<1> betyr Phe eller en binding og S<1> betyr en proton-solvolytisk eller p<->eliminerlng avspaltbar aminobeskyttel-sesgruppe som tert-butyloksykarbonyl-(boc), tert-amyl-oksykarbonyl-(aoc) eller metylsulfonyl-etyloksykarbonyl-(msc)-resten, kondenseres med et peptid med formel III hvori R<30> eller R<3*> er av ovennevnte betydning, S<2>, betyr hydrogen, bzl eller bu<*> og S<3> betyr en uretanbeskyttel-sesgruppe som boe, moe, fmoc eller Z, idet i restene R<30 >og R<31> tilstedeværende fri 0H-, NH2, quanidino og/eller trlmetylammoniumetoksy hvis nødvendig foreligger på 1 og for seg kjent måte beskyttet og eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper avspaltes på i og for seg kjent måte, b) et des(B30)humaninsulin, hvori R<1> betyr H eller H-Phe og C-terminusen R<30->R<31> sammen betyr OH, omsettes i nærvær av lysylendopeptidase med en forbindelse med formel IV

hvori R<30> og R<31> har ovennevnte betydning og hvori tilstedeværende fri OH-, (0-NH2-, guanidino- og/eller trlmetylammoniumetoksy hvis nødvendig, foreligger på i og for seg kjent måte beskyttet, og deretter avspalter

eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper på I og for seg kjent måte,

c) et proinsulln, proinsullnderlvat, preproinsulin eller intermedlat av disse forbindelsene omsettes i nærvær av

trypsin og eventuelt overfører de oppnådde forbindelser ifølge formel I til deres fysiologisk tålbare salter.

A-kjeden og kjede (B 2 - 29) i insulinderivatet har hensikts-messig sekvensen til insulin fra storfe, eller humaninsulin.

Genetisk utkodbar er de følgende L-aminosyrer:

giv. ala. ser, thr. val, leu, ile. asp. asn, glu, gin, cys. met, arg, lys. his. tyr. phe, trp. pro (nøytrale aminosyrer er understreket).

Med en nøytral, naturlig forekommende aminosyre forstår man særlig gly, ala, ser, thr, val, leu, ile, asn, gin, cys, met, tyr, phe, pro eller hyp. Med en basisk, naturlig forekommende aminosyre forstår man særlig arg, lys, hyl, orn, eit eller his.

Blant grupper som eventuelt blokkerer en fri karboksylgruppe i C-enden av B-kjeden i forbindelsene forstår man fremfor alt ester- og amidgrupper, fortrinnsvis (C^-C^)-alkoksy, (C3-C5)-cykloalkoksy, NH2, (Cj-Cfc )-alkylamino, Di-( Cj-Cf, )-alkylamino eller basiske grupper, som amino-(C2-C6)-alkoksy, (C1-C4)-alkylamino-(C2-Cf, )-alkoksy, Di-(C1-C4 )-alkylamino-( C^-C^, )-alkoksy, tri-(C1-C4 )ammonio-(C2-C6 )-alkoksy, amino-(C2-C£, )-alkylamino, [(C1-C4 )-alkylamino]-(C^-Cf, )-alkylamino, [Di-(Ci~ C4)-alkylamino]-(C2-C6)-alkylamino eller [Tri-(C1-<C>4)-alkylammonio]-(C2-C6)-alkylamino, særlig -0-[CH2]p-NR3, -0-[CH2]p-NR3, -NH-[CH2]p-NR2 eller -NH-[CH2]p-NR3, hvor p - 2-6 og R er lik eller forskjellig og står for hydrogen eller (C^ til C4)-alkyl.

Ved fremgangsmåtevarianten a) omsetter man eksempelvis NotAl >NaBl_bls_Boc_derlvatet av et des-oktapeptid^ des(B23-30)-insulin; analogt med den i US-patentskriftet nr. 4 029 642 beskrevne fremgangsmåte direkte med en ekvivalent av en forbindelse méd formel III, idet dicykloheksylkarbodiimid i et lite underskudd i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol tjener som kondensasjonsmiddel.

Ettersom det ved denne fremgangsmåtevarianten vanligvis ikke er nødvendig med noen beskyttelse av karboksylgruppene, bortfaller vanligvis også beskadigelsen av insulinderivatet så vel ved forestringen som også ved den alkaliske forsåp-ning. Ikke omsatt des-oktopeptid og et peptid som oppstår ved kondensasjon av IV til asp<A21->0H, er på grunn av den særskilte molekylstørrelse og ladningstallet, lett utskillbar ved fordelingskromatografering på Sephadex<®->LJ 20 eller ved gelkromatografering Sephadex<®->G 75 eller G 50 "superfine".

For avspalting av tert.-butylbeskyttelsesgruppen må reak-sjonsproduktet bare behandles med trifluoreddiksyre i 30-60 minutter ved værelsestemperatur. Denne reaksjonen skader ikke insulinderivatet. Dersom man velger metylsulfonyletyl-oksykarbonylresten som N-beskyttelsesgruppe, så er det nødvendig med en alkalibehandling for avspalting ved e-eliminering. Reaksjonsbetingelsene er slik (for eksempel 0,1 NaOH, 0"C, 5 sek.) at insulinderivatet ikke skades. Det som utgangsmateriale anvendte NaA1,N<aB1->bis-Boc-des-B23_3o-oktapeptid-insulin fremstiller man eksempelvis på følgende måte: Svineinsulin omsettes i en blanding av dimetylformamid, dimetylsulfoksyd og vann i nærvær av N-etylmorfolin med overskudd av tert.-butyloksykarbonyl-N-hydroksysuksinimid-ester. Derved oppstår det forventede N0^1 ,NaB1 ,NcjB29-tris-Boc-insulin.

For oppløsningen av denne forbindelse i dimetylformamid og tris-buffer (pH 7,5) tilsettes trypsin i små porsjoner inntil ikke noe utgangsmateriale lengere kan sees I elektroforesen. jjotAl ,NaB1-bis-Boc-des-B23_3o-oktapeptid-insulinet renses ved fordelingskromatografering på Sephadex<®> varemerke LH 20.

Denne forbindelsen bringes så til reaksjon med 1 mol av peptidet med formel III, som er fremstilt på i og for seg kjent måte etter fremgangsmåtene i peptidkjemien, 1-1 mol 1-hydroksybenzotriazol og ca. 0,9 mol dicykloheksylkarbodiimid i dimetylformamid ved ca. pH 7-8 (ifølge Chem. Ber. 103

(1970), side 788).

Råproduktet renses ved fordelingskromatografering og befris for beskyttelsesgruppene ved behandling med trifluoreddiksyre/anisol ved værelsestemperatur. Etter utfelling med eter, isoelektrisk utfelling fra vann og kromatografering på Sephadex<®->G 75 eller G 50 "superfine" er forbindelsen elektroforetisk ren og kan bringes til å utkrystallisere på kjent måte. Det således utvunnede insulinderivat er biologisk fullt aktivt.

Des-phe<B1->insulin som utgangsforbindelse for fremgangsmåten er kjent for eksempel fra DE-PS 2005 658 eller fra EP-A-46 979.

Des-B30-insulinet som anvendes som utgangsforbindelse ved fremgangsmåtevariant b), er eksempelvis kjent fra EP-A-46 979 eller Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978) 799. Det ved variant b) anvendte utgangsmateriale med formel IV fremstilles på i og for seg kjent måte etter fremgangsmåter innen peptidkjemien. Anvendbare beskyttelsesgrupper for IV er beskrevet nærmere i M. Bodanzyky et al., Peptide Synthe-sis, Ind. Ed. 1976, WIley & Sons.

Des-B30-insulinet og forbindelsene med formel IV kondenseres med hverandre analogt med den i US-patentskrift nr. 4 320 196 beskrevne fremgangsmåte i nærvær av trypsin eller en trypsinlignende endopeptldase i et organisk-vandlg oppløsningsmid-delsystem ved pH 5-9 og ved en temperatur på 20 til 40<*>C. Det erholdte insulinderivatet kan isoleres etter de vanlige fremgangsmåtene innen peptidkjemien.

Gjennom genteknologiske fremgangsmåter er blant annet proinsulin fra mennesker eller primater tilgjengelig som utgangsmateriale for fremgangsmåtevarianten c). Derivatet Arg (B31) og Di-Arg(B31-32) er derved tilgjengelig ved enkel nedbrytning ved trypsin eller trypsinlignende enzymer. Dessuten lar også forholdsvis enkle plasmider seg konstruere, som ved spalting av passende preproinsulinderivater, fører til nye insulinderivater, mens de i stedet for arginin som naturlig befinner seg i B31 eller B32, koder for andre nøytrale eller basiske aminosyrer.

Fremstillingen av proinsulin under anvendelse av rekombinant-DNA-teknologi krever dannelsen av en DNA-sekvens, som koder for aminosyresekvensen til et proinsulin, noe som lar seg frembringe enten ved isolering, konstruksjon eller en kombinasjon av begge disse. Det proinsulin kodende DNA Innføres så i en avlesningsfase i et egnet kloning- og ekspresjonsplasmid. Plasmidet tjener til transformering av en egnet mikroorganisme og den derved erholdte transformerte mikroorganisme underkastes så dyrkningsbetingelser som fører til dannelsen av ytterligere kopier av den proinsulingen-holdige vektoren og til ekspresjon av proinsulin, et proinsulinderivat eller en proinsulinforløper (henholdsvis et preproinsulinderivat).

Når det gjelder ekspresjonsproduktet dreier det seg om en proinsulinforløper, da et slikt produkt vanligvis inneholder proinsulinaminosyresekvensen, hvor aminogruppen I enden er bundet til fragment av et protein som normalt uttrykkes av gensekvensen, hvor proinsulinet eller proinsulinderivåtet innsettes. Proinsulinaminosyresekvensen er bundet til proteinfragmentet over et spesifikt spaltbart sete, idet det eksempelvis dreier seg om methionin. Den erholdte proinsulinaminosyresekvensen avspaltes fra det sammensmeltede genproduktet, eksempelvis slik som det er beskrevet i

DE-A-32 32 036 og proinsulinet isoleres etter rensing.

Den enzymatiske spalting av det på denne måten erholdte proinsulin eller proinsulinderivat skjer analogt med den i Excerpta Medica International Congress Series nr. 231, side 292 ff. eller den 1 patentsøknad P 32 09 184 (HOE 82/F 047) beskrevne fremgangsmåte.

Ved hjelp av de beskrevne halvsyntetiske fremgangsmåtene er i tillegg til de kjente arginin (B30)- og diarginin (B31-32)-derivatene samt de ved genteknologiske fremgangsmåter tilgjengelige derivater som i R<31> har naturlige L-aminosyrer, en rekke nye insulinderlvater tilgjengelige, som er kjennetegnet ved en eller flere basiske grupper og/eller fravær av den frie karboksylgruppen, slik at nettoladningen til molekylet er minst en positiv ladning mer enn hos naturlig forekommende insulin eller hos des-phe <B>^-insulin.

Til disse hører for eksempel derivater som i posisjon B31 i stedet for de naturlige aminosyrene L-lysIn, L-histidln eller L-arginin, har deres D-enantiomere eller anvendbare D- eller L-aminosyreanaloger, som i sidekjeden har en basisk gruppe (for eksempel ornitin, hydroksylysin). I stedet for en aminosyre kan for eksempel cholinestergruppen tre inn i posisjon B31, hvorved det vinnes netto to positive ladninger. Aminosyren eller aminosyreanalogen i posisjon B31 kan ha en fri karboksylende eller kan være forestret med en alkohol (for eksempel metanol, etanol) henholdsvis med en nitrogen-base (for eksempel ammoniakk, mono-, dimetylamin); de kan dessuten være forestret for eksempel med cholin. I posisjon B32 kan for eksempel en nøytral eller også en ytterligere naturlig basisk aminosyre eller en av de ovenfor beskrevne aminosyrederivater følge; på analog måte kan disses karbok-sylgrupper være frie eller forestrede henholdsvis amiderte. Eksempelvis kan også her cholinestergrupper henholdsvis nok en ytterligere nøytral basisk aminosyre henholdsvis en aminosyreanalog følge.

Alle disse insulinderivatene har det til felles at den eller de ytterligere positive ladning(er) som befinner seg på overflaten av molekylet, gir molekylet et isoelektrisk punkt som er forskjøvet over mot det nøytrale området. Alt etter derivat måles isoelektriske punkter fra 5,8 til 8,5, særlig 6,2 til 8,2 i den isoelektriske fokusering. Derved er derivatene mindre løselige i det nøytrale området enn naturlig forekommende insulin eller proinsulin, som har sitt isoelektriske punkt og derved området for maksimal uopp-løselighet ved pH = 5,4, mens de i nøytralområdet vanligvis foreligger oppløst.

Oppløselighetsegenskapene til insulin og proinsulin lar seg påvirke i området over det isoelektriske punktet, det vil si i det terapeutiske særlig interessante nøytralområdet, ved tilsetning av sinkioner. Sink virker derved som et depotprinsipp på den måten at det stabiliserer den heksamere tilstanden til insulinet samt dettes krystalliseringstendens. Disse aggregatene oppløses igjen i subkutant vev.

Et ytterligere, lettvint deponeringsprinsipp er utkrystal-liseringen av insulinet eller prolnsulinet som kompleks med et basisk protein, for eksempel globin eller protamin.

Ved anvendelsen av prolnsulinet i oppløsning eller 1 forbindelse med en av de beskrevne deponeringsprinsipper, trengs det en ytterligere protolytisk avbygning for å frisette naturlig, fullt virksomt insulin. Intakt proinsulin har bare ca. 1/8 av den biologiske aktivitet til insulin ettersom en del av det biologisk aktive overflateområdet, reseptorbindingsområdet, er maskert med C-peptidet som er tilstede i prolnsulinet. Som proinsulin kommer riktignok bare homologer, altså bare slike med humansekvens, på tale for diabetesterapi (jfr. for eksempel DE-A1-32 32 036). Heterologt proinsulin har en signifikant immunogenitet. Det er i denne sammenheng verdt å legge merke til at også humane proinsuliner kan oppvise variasjoner i C-peptiddelen.

Svineinsulin-arg<B31>0H og det tilsvarende diarginin-derivatet oppviser i undersøkelsen av Chance, Excerpta Medica International Congress Series nr. 231, side 292 ff bare 62#, henholdsvis 66# av aktiviteten til naturlig forekommende svinelnsulin.

Det ble nå overraskende funnet at insulin-argB3:1--0H, insulin-argB31_arg<B>3<2_>QH og andre insulinderivater, hvor C-enden i B-kjeden bærer en organisk gruppe med basisk karakter, til forskjell fra proinsulin oppviser en omtrent like høy biologisk aktivitet som naturlig forekommende insulin.

Legemidlene for behandling av diabetes mellitus tilveiebrin-ger videre fullstendig nye forsinkelsesprinsipper som uten depothjelpestoffer, som sink eller protaminsulfat, kan bringes til å virke. Depotvirkningene skyldes et Iboende, proteinkjemisk betinget fysikalsk prinsipp; tungtløsligheten til insulinderivatet ved dets isoelektriske punkt. Deres oppløsning under fysiologiske betingelser oppnås muligens ved avspalting av de basiske tilleggsgruppene, som alt etter derivat skjer ved hjelp av trypsin eller en trypsinlignende aktivitet og/eller karboksyspeptidase B eller aktivitet som ligner på karboksypeptidase B og/eller esterase aktivitet. Gruppene som avspaltes i hvert enkelt tilfelle, er enten rent fysiologiske metabolitter, som aminosyrer, ornitin eller cholin, eller fysilogisk uskadelige stoffer som igjen er lett metabollserbare.

Det insulinderivat som er den aktive forbindelse 1 dette nye legemidlet, er også til forskjell fra de 1 litteraturen beskrevne mellomprodukter, som bare inneholder deler av det heterologe C-peptidet, ikke sterkere immunogent enn tilsvarende Insulinet selv.

Den ovenfor nevnte, nedre aktivitetsverdien hos Chance har muligens sin årsak i en utilstrekkelig renhet hos de undersøkte fraksjonene eller i en systematisk målefeil. Deres anvendbarhet som legemlddelforbindelser ble i alle fall tidligere (og kanskje derfor) ikke erkjent.

Midlene inneholder som aktiv forbindelse ett eller flere av de nye insullnderivatene med formel I eller insulin-arg<B31->0H eller insulin-argB31-argB32-0H.

De har fortrinnsvis en pH-verdi mellom 2,5 og 8,5, inneholder et egnet isotoniseringsmiddel, et egnet konserveringsmiddel og eventuelt en egnet buffer for et pH-område mellom 5,0 og 8,5.

En typisk anvendelsesform av de beskrevne derivatene utgjøres av preparater som foreligger som oppløsninger under det isoelektriske punktet i en fysiologisk uskadelig bærer. Oppløsningens pH kan da typisk være pH 5,0, og ligger altså betydelig høyere enn hos typiske gamle insuliner (vanligvis pH - 3,0). En mer nøytral injeksjonsoppløsning byr under visse omstendigheter på tydelige fordeler med hensyn til deres forenlighet.

En ytterligere typisk anvendelsesform er suspensjoner av amorfer eller krystallinske utfellinger av de beskrevne derivatene i en fysiologisk uskadelig bærer med omtrent nøytral pH.

Det er imidlertid også mulig å forsterke den i derivatene Iboende tunge oppløselighet i det fysiologiske pH-området ved ytterligere deponeringsprinsipper, som muligens ved tilset-ningen av sink eller protaminsulfat. Den tilsatte sinkmengde kan utgjøre opp til 100 p Zn<2+>/100 insulinenheter, vanligvis ca. 50 >i Zn<2+>/100 insulinenheter. Pro tami mengd en kan utgjøre mellom 0,28 mg og 0,6 mg 100 enheter (referert til protmin-sulfat). På denne måten lar særlig preparater med langvarig virkning seg fremstille som det i fremtiden vil være en bredere anvendelse for enn tidligere, etter at en grunnmengde med insulin allerede har vist seg terapeutisk fordelaktig. Dette er allerede nå en erkjennelse av terapien med insulin-doseringsapparater.

Som fysiologisk uskadelig og med insulinderivatet forenlig bærermedium, egner det seg en steril vandig oppløsning, som gjøres isotont til blod på den vanlige måten, for eksempel ved glycerol, koksalt, glykose, og som dessuten inneholder enda en av de vanlige konserveringsmidlene, for eksempel fenol, m-kresol eller p-hydroksybenzosyreester. Bærermediet kan i tillegg inneholde en bufferforbindelse, for eksempel natriumacetat, natriumcitrat, natriumfosfat. Til innstilling av pH anvendes fortynnet syre (vanligvis HC1) henholdsvis lut (vanligvis NaOH).

InsulinderIvatene kan også innføres i midlene som alkali-eller som ammoniumsalt. En vilkårlig andel av ett eller flere insulinderivater med formel I eller et insullnderivat med formel I kan foreligge i en blanding med ytterligere av disse insulinderivatene, uavhengig av hverandre, henholdsvis i oppløst, amorf og/eller krystallinsk form.

Det er mange ganger fordelaktig å tilsette en passende mengde av en egnet stabilisator til preparatet som forhindrer utfellingen av protein ved termisk-mekanisk belastning ved kontakt med forskjellige stoffer. Slike stabilisatorer er eksempelvis kjent fra EP-A18609 og DE-A-32 40 177 eller fra WO-83/00288.

I midlene som også kan inneholde et av de kjente forsinkel-sesprinsippene, som kanskje protalminsulfat, globin eller sink i passende mengde, kan et slikt forsinkelsesprinsipp anvendes i kombinasjon med den samlede andel av aktiv forbindelse eller med deler derav eller ett eller flere insul inder i vater med formel I i en blanding. Et middel kan inneholde forskjellige insulinderivater med formel I i kombinasjon med flere forskjellige hjelpestoffer med forsinkende virkning.

Med de terapeutiske midlene lar altså mangfoldige ålment kjente og svært fint avstembare virkningskarakteristika seg oppnå; med i disse skulle, etter de bemerkningene som er gjort i innledningen, særlig fremskritt med hensyn på diabetiske senkomplikasjoner være forbundet.

De følgende eksempler skal tjene som ytterligere belysning av oppfinnelsen: Fremstillingseksempel 1:

Humaninsulin-(B30)-0-CH2-CH2-N(CH3)3

5 g svineinsulin oppløses i 45 ml dimetylformamid, 25 ml dimetylsulfoksyd, 0,5 ml N-etylmorfolin og 2,5 ml vann. Under omrøring tilsettes ved værelsestemperatur 1,5 g tert.-butyloksykarbonyl-N-hydroksysuksinimid og man lar de reagere i 6 timer. Deretter stanses reaksjonen ved tilsetning av noen dråper iseddik, produktet utfelles med eter og frafil-treres. Resten oppløses i 360 ml dimetylformamid og fortynnes med 320 ml tris-buffer (0,05 M, 0,01 M på CaCl2, pH 7,5). Ved 36°C tilsettes med 1 times mellomrom porsjoner av 20 mg trypsin.

Etter tilsammen 12 tilsetninger innstiller man med eddiksyre på pH 4,5 og inndamper oppløsningen. Den tilsluttede rensing av materialet på en kolonne med Sephadex<®->LH 20-søyle (8 x 200 cm) ved fordelingskromatografering i systemet n-butanol-iseddik-vann (2:1:10) gir 3,25 g NaA1 ,NcxB1-Bis-Boc-Des-B23_ 30-oktapeptidinsulin (svin), som i den sure og den basiske elektroforese ikke lenger oppviser noe utgangsmateriale. Aminosyreanalysen av forbindelsen er korrekt. Etter en forsøksvis avspalting av BOC-gruppen finnes det ikke lenger noen insullnaktivitet. Dette materialet (3,25 g) oppløses i 30 ml dimetylformamid sammen med 100 mg 1-hydroksybenzotriazol, 750 mg HC1•Gly-Phe-Phe-Tyr(Bu<t>)-Thr-pro-Lys (Boc)-

0

Thr(Bu<t>)-0CH2CH2-N (CH3)3*HC1 og 0,5 ml N-etylmorfolin.

Og så tilsetter man ved værelsestemperatur 120 mg dicykloheksylkarbodiimid og omrører reaksjonsblandingen i 24 timer. Det utskilte dicykloheksylkarbamid frafUtreres, produktet utfelles ved etertilsetning.

Bunnfallet f raf Utreres, vaskes med eter og tørkes. Stoffet forrenses ved fordelingskromatografering på Sephadex<®->LH 20 i det ovenfor nevnte systemet. 2,6 g materiale fra hovedtoppen isoleres ved utfelling med aceton/eter. Det tørkede, ennå ubeskyttede derivatet lar man reagere med en blanding av 5 ml trifluoreddiksyre og 1 ml anisol i 60 minutter ved værelsestemperatur. Fra den med is avkjølte oppløsning utfeller man deretter råstoffet ved tilsetning av eter.

Det tørkede bunnfallet oppløses i vann, utfelles med vandig ammoniakk og sentrifugeres. Rensingen av produktet skjer i 10% eddiksyre over Sephadex<®->G 50 "superfine" eller G 75. Fra fraksjonene til de ønskede toppene kan man isolere

©

humaninsulin-(B30)-0CH2CH2N (CH3)3 ved frysetørking. Utbytte etter utkrystallisering: 1,2 g. Det således utvunnede insulinderivat viser i den biologiske prøven en virkning som er ekvivalent med humaninsulinets.

Fremstillingen av oktapeptidet med formel III skjer Ifølge kondensasjonsskjemaet nedenunder etter vanlige kondensasjons-fremgangsmåter for peptid:

Synteseskjema for oktapeptidet med formel III

Fremstillingseksempel 2:

Svineinsulin-ArgB31-ArgB32-0H ved trypsinspalting av svine-proinsulin

350 mg svineproinsulln oppløses i 25 ml 0,1 M tris-HCl-buffer, pH = 7,5. Til denne oppløsningen tilsettes ved værelsestemperatur 500 jj trypsin, hvorved det i løpet av få timer oppstår en turbiditet. Etter fullendt reaksjon frasentrifugeres det, bunnfallet oppløses ved surgjøring og analyseres ved hjelp av lecetatfolieelektroforese eller HPCL. Etter fornyet utfelling og vasking av bunnfallet, opparbeides dette på i og for seg kjent måte eller det renses på en kationebytter med 0,05 M acetat, pH = 4,0, med en koksalt-gradient opp til 0,5 M. De passende fraksjoner slås sammen og felles ut. Etter vasking og omkrystallisering isoleres 104 mg svineinsulin-ArgB31-ArgB322-0H som identifiseres ved aminosyreanalyse og som karakteriseres som enhetlig etter HPLC og isoelektrisk fokusering.

På analog måte erholdes Insulinderivatet svineinsulln-Lys<B31->Arg<B32->0H fra det tilsvarende i posisjon B31 modifiserte svineproinsulln.

Eksempel 1:

Insulin-ArgB31-ArgB3<2->0H fra svin (fremstilt ved trypsinspalting av proinsulin fra svin) i svakt surgjort, oppløst tilberedning med 40 I.E. pr. ml og dennes depotvirkning:

Man oppløser i et totalt volum på 10 ml vann:

pH-verdien innstilles ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH på pH 4,5.

En slik oppløsning oppviser ved en dosering på 0,4 I.E./kg til kaniner en utpreget depotvirkning. Flateinnholdet under blodsukkerkurven er som for et standardpreparat med 40 I.E./ml.

Eksempel 2:

Humaninsulin-(B30)-cholinester, fremstilt halvsyntetisk fra svineinsulin i nøytralt preparat med 40 I.E. pr. ml og dens depotvirkning:

Det oppløses i et totaltvolum på 10 ml vann:

pH-verdien innstilles på pH = 7,3 ved tilsetning av 1 NHC1, henholdsvis NaOH.

En slik suspensjon oppviser ved en dosering på 0,4 I.E./kg en utpreget depotvirkning på kaniner.

Eksempel 3:

Humaninsulin-Arg<B31->0H fremstilt halvsyntetisk fra svineinsulin, i form av en krystallinsk NPH-tilberednlng med 40 I.E./ml og dens sterkt forsinkede virkning:

Det oppløses i et totalvolum på 10 ml med vann:

pH-verdien innstilles på pH = 7,3 ved tilsetning av 1 N HC1, henholdsvis 1 N NaOH.

En slik krystallsuspensjon oppviser ved en dosering på 0,4 I.E./kg en sterkt forsinket virkning hos kaniner.

Eksempel 4:

Blanding av humaninsulin-ArgB31-0H og humaninsulin-ArgB31-Arg<B32->0H, begge fremstilt halvsyntetisk fra svineinsulin, i form av en sinkholdig suspensjon med 40 I.E./ml og dens Sterkt forsinkede virkning:

Det oppløses i et totalvolum på 10 ml med vann:

pH-verdien innstilles på pH - 7,0 ved tilsetning av 1 N HC1, henholdsvis 1 N NaOH.

En slik suspensjon oppviser ved en dosering på 0,4 I.E./kg en sterkt forsinket virkning hos kaniner.

Eksempel 5:

Humaninsulin-ArgB31-LysB32-0CH3 fremstilt halvsyntetisk fra svineinsulin i form av en svakt sur, oppløst tilberedning med 100 I.E./ml og dens forsinkende virkning:

Ved tilsetning av 1 N HC1 henholdsvis 1 N NaOH innstilles det på pH = 6,0.

En slik oppløsning oppviser en forsinket virkning hos kaniner.

Eksempel 6:

Humaninsulln-ArgB31-0H, fremstilt ved trypsinspaltingg av primat-preproinsulin fra bakterielt opphav, 1 form av NPH-krystaller, i blanding med humaninsulin-ArgB31-ArgB32-OH, fremstilt ved trypsinspalting av primat-preproinsulin fra bakterielt opphav:

Det oppløses 1 et totalvolum på 10 ml med vann:

pH innstilles på pH = 7,2 ved tilsetning av 1 N NaOH, henholdsvis 1 N HC1.

Denne suspensjonen oppviser på kaniner (0,4 I.E./kg) en sterkt forsinket virkning.

Claims

Analogifremgangsmåte til fremstilling av et insulinderivat med formel I hvori R<1> betyr H eller H-Phe,R<30> betyr Ala eller Thr ogR31 cholinrester, LysB31-ArgB32-0H, ArgB31-LysB<32->0CH3,

Arg eller ArgB31-ArgB32-0H, idet hvis R<1> betyr H-Phe, kan C-terminusen -R30-R31 ikke bety -Thr(Arg)m-OH, -Ala(Arg)m-0H eller-Ser-(Arg)m-OH med m =1 eller 2 som har et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5, eller fysiologisk tålbare salter, karakterisert ved at a) et des-oktapeptid, des-(B23-30)-insulin med formel II,

hvori R<1> betyr Phe eller en binding og S<*> betyr en proton-

solvolytisk eller p<->elimlnering avspaltbar aminobeskyttel-sesgruppe som tert-butyloksykarbonyl-(boc), tert-amyl-oksykarbonyl-(aoc) eller metylsulfonyl-etyloksykarbonyl-(msc)-resten, kondenseres med et peptid med formel III

hvori R3** eller R<3*> er av ovennevnte betydning, S<2>, betyr hydrogen, bzl eller bil<*> og S<3> betyr en uretanbeskyttel-sesgruppe som boe, moe, fmoc eller Z, idet i restene R<30 >og R<31> tilstedeværende fri OH-, NH2, quanidino og/eller trlmetylammoniumetoksy hvis nødvendig foreligger på i og for seg kjent måte beskyttet og eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper avspaltes på i og for seg kjent måte, eller b) et des(B30 )humaninsulin, hvori R<1> betyr H eller H-Phe og C-termlnusen R<3>^-R<3>^ sammen betyr OH, omsettes i nærvær av lysylendopeptidase med en forbindelse med formel IV hvori R<30> og R<31> har ovennevnte betydning og hvori tilstedeværende fri OH-, 0-NH2-, guanidino- og/eller trlmetylammoniumetoksy hvis nødvendig, foreligger på i og for seg kjent måte beskyttet, og deretter avspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper på i og for seg kjent måte, eller

et proinsulin, proinsulinderivat, preproinsulin eller

intermediat av disse forbindelsene omsettes i nærvær av trypsin og eventuelt overfører de oppnådde forbindelser ifølge formel (I) til deres fysiologisk tålbare salter.