PT92220B

PT92220B - Processo para a preparacao de novos derivados da insulina e de preparacoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT92220B
Application number: PT92220A
Authority: PT
Inventors: Michael Dorschug
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1989-11-07
Publication date: 1995-07-06
Also published as: IE63338B1; PT92220A; EP0368187B1; NO177963C; HU210800A9; DE58905456D1; IL92222A0; DE10075022I1; NO894424D0; HU895678D0; NL300019I2; HUT52549A; AU621680B2; LU90614I2; DK554789A; JPH02218696A; KR0158197B1; CA1339044C; FI100185B; NO2001023I1

Description

Descrição

A insulina e os derivados da insulina são, como se sabe, necessários em quantidades importantes para o tratamento da doença diabetes mellitus e hoje em dia são produzidos em quantidades industriais. Apesar do número considerável de preparados e de diversas formas de insulina existentes com diferentes perfis de actividade, subsiste, devido às diferenças entre os organismos com a variabilidade entre os indivíduos e no mesmo indivíduo, a necessidade de novos preparados de insulina com novas propriedades e características de actividade.

Derivados da insulina com actividade retardada são descritos por exemplo em EP-B-132 769 e em EP-B-132 770. Trata-se especialmente de derivados básicos modificados na posição B31 da cadeia B da insulina da fórmula I seguinte:

ANA *

na qual significa H ou H-Phe,

R representa um resíduo de um ácido aminado L geneticamente codificável neutro e

R representa um grupo orgânico de carácter básico fisiologicamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos <t-aminados e cuja função carboxilo terminal livre eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função éster, de uma função amida, sob a forma de uma lactona ou reduzida a C^OH.

Para estes derivados da insulina é característico um ponto isoeléctrico entre 5,8 e 8,5 (medido por focagem isoeléctrica). 0 ponto isoeléctrico - ao contrário do ponto isoeléctri co na insulina ou da pró-insulina nativa não modificada (a pH 5,4) deslocado para a zona de neutralidade - é condicionado pela(s) carga(s) positiva(s) que se encontra(m) na superfície da molécula em consequência da modificação básica. Deste modo, estes derivados da insulina básicos modificados são menos solúveis na zona de neutralidade do que a insulina ou a pró-insulina nativas, as quais normalmente se encontram em dissolução na zona de neutralidade.

A actividade retardada ou depot dos derivados básicos modificados da insulina da fórmula I é devida à sua baixa solubilidade no ponto isoeléctrico. A dissolução dos derivados de insulina sob condições fisiológicas é conseguida, de acordo com as duas publicações referidas, por cisão dos grupos básicos adicionais, cisão que é realizada segundo o derivado por meio da acção da tripsina ou de enzimas dotadas de actividade semelhante à da tripsina e/ou de carboxipeptidase B ou de enzimas

dotadas de actividade semelhante à da carboxipeptidase B e/ou de esterase. Os grupos cindidos em cada caso são metabolitos fisiológicos puros ou substâncias fisiologicamente aceitáveis facilmente metabolizáveis.

O princípio dos produtos depot atrás referido conseguido por meio de uma modificação básica da insulina foi ainda utilizado na preparação e uso correspondente de outros derivados básicos modificados - fundamentalmente nas cadeias A e B - da insulina; ver por exemplo EP-A-0194 864 e EP-A-0254 516.

Nos derivados da insulina de acordo com a EP-A-0194 86' encontra-se integrado na posição B27 um ácido aminado básico e/ov um ácido aminado neutro situa-se nas posições A4, A17, B13 e/ou B21; além disso o grupo carboxilo C-terminal da cadeia B é bloqueado por meio da formação de uma amida ou de um éster.

Os derivados de insulina de acordo com a EP-A-0254 516 são muito semelhantes aos descritos nas EP-A anteriormente referidas; com o objectivo de aumentar a estabilidade na zona de valores de pH fracamente ácidos das correspondentes composições farmacêuticas é possível no entanto ainda substituir nestes derivados o ácido aminado Asn na posição A21 por outros ácidos aminados estáveis em meio ácido, como por exemplo Asp. 0 ácido aminado Asn (=asparagina) distingue-se, como se sabe, do Asp (=ácido aspártico) pelo bloqueamento de um dos dois grupos carboxilo por meio do grupo amida:

COOH

I

H„N -C-H

COOH

I

H„N -C-H

conh₂

Asparagina

COOH

Acido aspártico

Através de ainda outra modificação da molécula de insulina nas cadeias A e B, especialmente por permuta do ácido aminado His na posição B10 para a formação de complexos com zinco - e deste modo responsável por uma acção segura de retarda* mento - por outros ácidos aminados, resultam derivados da insu• lina de acção mais rápida; ver EP-A-0214 826.

A totalidade dos derivados da insulina das 3 publicações anteriormente referidas são fundamentalmente modificados nas cadeias.A e B; a sua preparação é efectuada por meio de manipulações genéticas.

No esforço para aumentar a estabilidade em meio ácido dos derivados da insulina básicos modificados na extremidade C-terminal da cadeia B de acordo com as publicações de Patentes anteriormente referidas EP-B-0132 769 e EP-B-0132 770 e eventual mente modificar ainda também o respectivo perfil de actividade, verificou-se agora que esta finalidade pode ser alcançada de modo vantajoso por substituição da Asn por outros ácidos aminados codificáveis geneticamente que não contenham qualquer grupo amida e eventualmente por substituição da His por outros ácidos aminados codificáveis geneticamente.

O objectivo da presente invenção é por conseguinte a preparação de derivados da insulina da fórmula II,

AI

H-Gly-Cadeia AA21 „2 (II)

B2

R¹-ValB10

Cadeia B - XB29

-R³⁰ - R³¹ na qual

R¹ significa H ou H-Phe,

R significa um ácido aminado L genéticamente codificável que não contém qualquer grupo amida,

R representa um resíduo de um ácido aminado L genéticamente codificável neutro,

R representa um grupo orgânico de carácter básico fisiologicamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos ec-aminados e cuja função carboxilo terminal livre eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função éster, de uma função amida, sob a forma de uma lactona ou reduzida a CH₂OH, e

X representa um ácido aminado L geneticamente codificável, com um ponto isoeléctrico entre 5 e 8,5, e dos sais fisiologicamente aceitáveis destes derivados da insulina.

Os novos derivados da insulina e os seus sais fisiologicamente aceitáveis são estáveis perante os valores de pH fracamente ácidos correspondentes aos preparados farmacêuticos mesmo durante longos períodos e apresentam - especialmente quando também se substituiu a His por outro ácido aminado - um perfil de actividade modificado (mais rápido) em comparação com os derivados básicos modificados conhecidos - sem alteração da fórmula I referida no início.

Na fórmula II é de preferência H-Phe.

Ácidos aminados L geneticamente codificáveis que não 2 contêm qualquer grupo amida - para R - são

Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Glu, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp e Pro;

de preferência Gly, Ala, Ser, Thr, Asp e Glu, de modo especialmente preferido Asp.

Ácidos aminados L geneticamente codificáveis neutros 30

- para R - são Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe e Pro; de preferência Ala, Thr e Ser.

z r r

R é um grupo orgânico de carácter básico fisiologicamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja composição participam 0 a 3 ácidos «-aminados. Quando na com31 posição de R não participa qualquer ácido eC-aminado, o significado deste resíduo pode ser por exemplo de um dos seguintes grupos básicos:

Amino-alcoxi-(C₂-Cg), alquil-(C^-C₄)-amino-alcoxi-(C₂-Cg), dialquil-(C₁-C₄)-amino-alcoxi-(C₂-C₆), tri-(^-^)-alquilamónio-alcoxi-(C₂-C₆), amino-alquil-(C₂~C₆)-amino, ^alquil-(C₁~C₄)-aminoj-alquil-ÍC^C^)-amino, dialquil-(C^-C₄)-amino-alquil—(C₂—Cg)—amino ou £tri-alquil-(C₁-C₄)-aminoj-alquil-(C₂-Cg)-amino, especialmente -O-^CH^ “^NR2» “°“ C^CH2^p^-N^ ⁺ ^^R3'

-NH- [CH₂] p-NR₂ ou -NH-fCH^p-N^+^Rg, em que pé = 2a6eRé

igual ou diferente e representa hidrogénio ou alquilo-(C^-C₄).

Quando na composição de R participam até um máximo de 3 ácidos Λ-aminados, estes são principalmente ácidos aminados L de ocorrência natural neutros ou básicos e/ou os ácidos aminados D correspondentes a estes. Os ácidos aminados de ocorrência natural neutros são especialmente Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro e Hyp. Os ácidos aminados de ocorrência natural básicos são especialmente Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit e His. No caso de apenas participarem ácidos β-aminados neutros, a respectiva função carboxilo terminal - que confere a R carácter básico - não pode estar livre; a função carboxilo terminal deverá, pelo contrário, neste caso, estar esterificada com um grupo básico ou transformada em amida, podendo neste caso serem considerados os grupos básicos já anteriormente referidos - para o caso de na composição de R^Jnão participar qualquer ácido ec-aminado. Naturalmente estes grupos éster ou amida podem também bloquear a função carboxilo de ácidos ct-aminados básicos. Para o bloqueamento da função carboxilo dos ácidos ac-aminados básicos podem utilizar-se também - no caso de se pretender um bloqueamento - grupos éster neutros ou grupos amida, como por exemplo alcoxi-(C^-Cg), cicloalquiloxi-ÍC^-Cg), NH , alquil-(C^-Cg)-amino ou dialquil-(C^-Cg) -amino.

Naturalmente a função carboxilo terminal apenas pode estar sob a forma de uma lactona quando o ácido aminado terminal é um ácido hidroxiaminado.

Além disso uma função carboxilo terminal também se pode apresentar sob forma reduzida CH₂OH.

z

De preferência R é constituído por 1, 2 ou 3 ácidos aminados básicos de ocorrência natural de entre os anteriormen31 te referidos; de modo especialmente preferido R é = Arg-OH ou Arg-Arg-OH.

Os ácidos aminados L codificáveis geneticamente podem 2 ser - para X - os mesmos ácidos aminados considerados para R , podendo neste caso no entanto também ser considerados os ácidos aminados L geneticamente codificáveis que contêm um grupo amida,

isto é, Asn e Gin; os últimos - Asn e Gin - são mesmo neste caso preferidos. Quando os ácidos tini nados Asn ou Gin se encontram na posição ΒΙΟ, o grupo amida em cada caso é estável em meio ácido fraco (na presença de Asn ou de Gin na posição A21).

As sequências (Al - A20) e (Bl - B9, Bll - B29) são de preferência as sequências da insulina humana, de suíno ou de bovino, especialmente as sequências da insulina humana.

São exemplos de derivados da insulina da fórmula I:

A21 B31

Asp -Insulina humana-Arg -OH

Glu^A21Gly

Ser

Thr

Ala

A21.

A21_

A21

Asp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ala

A21

R31 R8 7

Insulina humana-Arg -Arg -OH

II

Asp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ala

A21

BlO B31

Asn -Insulina humana-Arg -OH

II

Asp^A21-Asn^B10-Insulina humana-Arg^B31-Arg^B32-OH

Glu

Gly

Ser

Thr

Ala

A21

A21_

A21.

A21

A preparação dos derivados da insulina da fórmula II é levada a efeito segundo uma alternativa processual principal por via de tecnologia genética por meio de mutagénese dirigida

utilizando técnicas conhecidas.

De acordo com esta variante processual, constrói-se uma estrutura genética que codifica para o derivado da insulina pretendido da fórmula II e provoca-se a expressão numa célula hospedeira - de preferência numa bactéria com E. coli ou numa levedura, especialmente em Saccharomyces cerevisiae - e - no caso de a estrutura génica codificar para uma proteína de fusão

- liberta-se o derivado da insulina da fórmula II a partir da proteína de fusão; métodos análogos são por exemplo descritos em EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 933, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 e no pedido de Patente DE P 38 21 159.9 de 23.6.1988 (HOE 88/F 158).

A cisão da proteína de fusão nas suas fracções é levada a efeito após desintegração das células por meio de um halogeneto de cianogénio - ver EP-A-0 180 920 - ou por via enzimática por meio de lisostafina - ver DE-A-37 39 347.

O precursor da insulina é em seguida submetido a sulfitólise oxidativa de acordo por exemplo com o método descrito por R.C. Marshall e A.S. Inglis em Praticai Protein Chemistry

- A Handbook (Editor A. Darbre) 1986, págs. 49 - 53 e em seguida renaturado na presença de um tiol com formação das pontes de dissulfureto correctas, por exemplo de acordo com o método descrito por G.H. Dixon e A.C. Warlow em Nature (1960), págs. 721 - 724.

O peptídeo C é eliminado por meio de cisão tríptica

- por exemplo de acordo com o método de Kemmler et al., J.B.C. (1971), págs. 6786 - 6791 e o derivado da insulina da fórmula II é purificado de acordo com técnicas conhecidas como cromatografia - ver por exemplo EP-A-0 305 760 - e cristalização.

A preparação de derivados da insulina da fórmula II com R = Asp e X = His é levada a efeito de modo conveniente por hidrólise dos derivados da insulina da fórmula I em meio aquoso ácido (devendo neste caso hidrolisar-se apenas o grupo amida da asparagina na posição A21), de preferência a valores de pH entre cerca de 2 e cerca de 4, especialmente de cerca de

_ 2,5, e a temperaturas de cerca de 0 até cerca de 40°c, de preferência à temperatura ambiente.

Os derivados da insulina da fórmula II da presente invenção e/ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis (como por exemplo os sais alcalinos ou de amónio) são utilizados principalmente como substâncias activas para uma composição farmacêutica para o tratamento de diabetes mellitus.

A composição farmacêutica é de preferência uma solução ou uma suspensão para uso injectável; o processo para a preparação desta composição farmacêutica caracteriza-se por se incorporar como princípio activo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado da insulina da fórmula II e/ou pelo menos um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis sob forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina - de preferência sob forma dissolvida.

A composição farmacêutica apresenta de preferência um valor de pH entre cerca de 2,5 e 8,5, especialmente entre cerca de 4,0 e 8,5, contém um agente de isotonicidade adequado, um conservante adequado e eventualmente um tampão adequado, bem como de preferência ainda uma concentração determinada de iões de zinco, tudo naturalmente em solução aquosa estéril. O conjunto dos componentes da composição farmacêutica com excepção da substância activa formam a substância veicular do preparado.

São agentes de isotonicidade adequados por exemplo glicerina, glucose, manitol, NaCl e compostos de cálcio ou de magnésio como CaC^, MgC^, etc..

Por meio da selecção do agente de isotonicidade e/ou do conservante é possível influenciar a solubilidade do derivado da insulina ou dos seus sais fisiologicamente aceitáveis nos valores de pH fracamente ácidos.

São conservantes adequados por exemplo fenol, m-cresol, álcool benzílico e/ou p-hidroxibenzoatos.

Como substâncias tampão, especialmente para o ajuste . de um valor de pH entre 4,0 e 8,5, é possível usar por exemplo ’ acetato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio, etc..

Em alternativa são também adequados para o ajuste do valor do pH ácidos fisiologicamente aceitáveis diluídos (normalmente HCl) ou bases (normalmente NaOH).

Quando a composição farmacêutica contém zinco, considera-se preferida uma concentração de zinco de 1 pg a 2 mg/ml, de preferência de 5 jig a 200 ug/ml.

Com o objectivo de variar o perfil de actividade da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é possível incorporar adicionalmente à composição farmacêutica uma insulina não modificada, de preferência insulina de bovino, de suíno ou humana, de modo especialmente preferido insulina humana.

As concentrações da substância activa são tais que correspondem a cerca de 1 a 1500 unidades internacionais/ml, de preferência de cerca de 5 a 1000 Unidades internacionais/ml e de modo especialmente preferido de cerca de 40 a 400 Unidades internacionais/ml.

A presente invenção é em seguida elucidada mais em pormenor por meio dos exemplos que se seguem.

A) Preparação por tecnologia genética

Exemplo 1

Construção de um plasmídeo para a preparação de Gly (A21)-insulina humana Arg (B31-OH)

No pedido de patente DE-P 38 21 159.9 (HOE 88/F 158) é descrito o plasmídeo pSW3.

O ADN plasmídico é feito reagir com as enzimas de restrição Pvu2 e Sall e em seguida é tratado com fosfatase alcalina de bovino. Os dois fragmentos resultantes são separados por electroforese em gel e o fragmento maior é isolado. Este fragmento é acoplado numa reacção com ligase de ADN T4 com a seguinte sequência de ADN sintética:

5' - CTG GAA AAC TAC TGT GGT TGA TAG

GAC CTT TTG ATG ACA CCA ACT ATC AGCT - 5'

Transformam-se células competentes de E. coli W3110 com a mistura de ligação. Inoculam-se placas de NA com a mistura de transformantes que contêm 20 ug de Ap (=ampicilina)/ml e incuba-se de um dia para o outro a 37°C. A partir das colónias isoladas obtém-se uma cultura com um dia de idade e a partir desta isola-se o ADN plasmídico. Este ADN é caracterizado por meio de análise de restrição e de análise de sequenciação de ADN. Os plasmídeos correctos que codificam para a cadeia A alterada foram designados por pIKlOO. A expressão é levada a efeito de modo análogo ao do Ex. 3 do pedido de Patente DE-P 38 21 159.9 anteriormente referido. A preparação da insulina mono-Arg modificada é igualmente levada a efeito de modo análogo à preparação descrita neste pedido de Patente da insulina mono-Arg não modificada.

Exemplo 2

Construção de um plasmídeo para a preparação de Ser (A21)-insulina humana (Arg B31-OH)

A construção corresponde à via descrita no Exemplo anterior. A sequência de ADN sintético tem, no entanto, a seguinte composição:

5' - CTG GAA AAC TAC TGT TCA TGA TAG

GAC CTT TTG ATG ACA AGT ACT ATC AGCT - 5'

Obtém-se o plasmídeo pIKllO que se caracteriza por uma sequência adicional de reconhecimento por BspHl.

Exemplo 3

Construção de um plasmídeo para a preparação de Gly(A21)Asn(B10)-insulina humana-Arg(B31-OH)

Cinde-se o ADN do plasmídeo pIKlOO com as enzimas de restrição Hpal e Dra3 e trata-se com fosfatase alcalina de bovino. Os dois fragmentos resultantes são separados por electroforese em gel e isola-se o maior dos dois fragmentos. Liga-se o fragmento com a sequência sintética de ADN

5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC TTG

TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA TTG - 5'

e transformam-se células competentes de E. coli W3110 com a mistura de ligação. A caracterização-adicional do plasmídeo resultante pIKlOl é levada a efeito conforme descrito no Exemplo 1.

Exemplo 4

Construção de um plasmídeo para a preparação de Ser(A21)Asn(BlO)-insulina humana

A construção é levada a efeito de modo correspondente à clonagem descrita no Exemplo 3 partindo-se, no entanto, do ADN do plasmídeo pIKllO.

novo plasmídeo construído recebe a designação pIKlll.

Exemplo 5

Construção de um plasmídeo de expressão para a pró-insulina de macaco

A pró-insulina de macaco diferencia-se da pró-insulina humana apenas pela substituição de um único ácido aminado no peptídeo C (B37-Pro em vez de Leu nesta posição da pró-insulina humana).

Abre-se o plasmídeo pSW3 com Hpal e Sall e isola-se o ADN do plasmídeo residual. A partir do plasmídeo pK50 descrito em EP-A-0 229 998 isola-se o fragmento da pró-insulina de macaco Dra3-Sall. Ligam-se os dois fragmentos com o fragmento de ADN sintético

5' - AAC CAG CAC CTG TGC GGT TCT CAC CTA

TTG GTC GTG GAC ACG CCA AGA GTG - 5' por reacção com ligase de ADN T4. Obtém-se o plasmídeo pSW2, cujo ADN serve em seguida de material de partida para as construções dos plasmídeos de expressão que codificam para os derivados da di-Arg-insulina humana.

Exemplo 6

Construção de um plasmídeo para a preparação de Gly(A21)insulina humana Arg(B31)-Arg(B32)-OH

Cinde-se ADN do plasmídeo pWS2 de modo análogo ao des12

crito no Exemplo 1 com Pvu2 e Sall e liga-se com o ADN sintético do Exemplo 1; obtêm-se o plasmídeo pSW21.

Exemplo 7

Construção de um plasmídeo para a preparação de Ser(A21)insulina humana-Arg(B31)-Arg(B32)-OH

Constroi-se o plasmídeo pSW22 a partir do ADN de pSW2 de modo análogo ao do Exemplo 2.

Exemplo 8

Construção de um plasmídeo para a preparação de Gly(A21)Asn(B10)-insulina humana-Arg(B31)-Arg(B32)-OH

Constroi-se o plasmídeo pSW23 a partir do ADN de pSW21 de modo análogo ao do Exemplo 3.

A sequência de ADN sintético utilizada é neste caso a seguinte sequência:

5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC CTA

TTG GTT GTG AAC ACA CAA AGA TTG - 5'

Exemplo 9

Construção de um plasmídeo para a preparação de Ser(A21)Asn(BlO)-insulina humana-B31(Arg)-B32(Arg)-OH

Constroi-se o plasmídeo pSW24 a partir do ADN de pSW22 de modo análogo ao do Exemplo 4 usando a sequência de ADN sintético descrita no Exemplo 8.

A2X B31 B32

B) Preparação de Asp -insulina humana-Arg -Arg -OH a partir de insulina humana-Arg -Arg -OH por hidrólise

Prepara-se uma suspensão de 1 g de insulina humanaB31 B32

-Arg -Arg -OH em 100 ml de H₂O. Por adição de HCl ajusta-se o valor do pH a 2,5 e deixa-se a solução em repouso a 37°C.

Após uma semana cerca de metade do material encontra-se transA2X B31 B32 formado em Asp -insulina humana-Arg -Arg -OH. Separa-se o produto do material de partida segundo uma técnica conhecida em si num permutador aniónico, precipita-se a partir do eluído e cristaliza-se num tampão que contém por litro 10,5 g de ácido

cítrico, 1 g de fenol e 5 ml de uma solução a 1% de cloreto de zinco com uma concentração proteica de 5 g/1 a pH 6,0. O rendimento é de 390 mg de Asp^A2X--insulina humana-Arg^B3X-Arg^B32-OH.

C) Preparação de uma solução injectâvel

Dissolve-se o derivado de insulina obtido de acordo com B a uma concentração de 1,4 mg/ml numa solução veicular estéril com a seguinte composição (por ml):

mg de glicerina, 10 mg de álcool benzilico, 80 pg de Zn²⁺ , pH 4,0.

A21

D) Perfil de actividade de um preparado de Asp -insulina humaB31 B32 na-Arg -Arg -OH em cães em comparação com insulina humaB31 B32 (R) na-Arg -Arg -OH e com insulina basal-H Hoechst = um preparado de NPH (protamina neutra segundo Hagedorn) com cerca de 10 pg de Zn²⁺.

Preparado

Açúcar no sangue em do valor inicial em h 2 h 3 h percentagem horas (h) h 7 h de acordo com a presente invenção

Comparação

AspA21_ínsulina humana B31 . . B32

Arg -Arg ‘-OH insulina humana Arg^B31-Arg^B32-OH insulina basal-H Hoechst

100

A21

Este exemplo mostra que a Asp -insulina humana-ArgD3X B32

-Arg -OH apresenta o mesmo perfil basal vantajoso que a insulina humana-Arg^B31-Arg^B32-OH. Adicionalmente a Asp^A21-inB31 B32 sulina humana-Arg -Arg -OH possui a propriedade vantajosa de ser um composto estável durante longos períodos nas condições seleccionadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lâ Processo para a preparação de derivados da insulina da fórmula II,

AI

H-Gly-Cadeia AA21

R² (II)

B2

R¹-ValB10

Cadeia B - X—

B29

-R³⁰ - R³¹ na qual

R^X significa H ou H-Phe,
2 x

R significa um ácido L-aminado geneticamente codificável que não contém qualquer grupo amida,

R representa um resíduo de um ácido L-aminado geneticamente codificável neutro,

R representa um grupo orgânico de carácter básico fisiologicamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos<-aminados e cuja função carboxilo terminal livre eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função ester de uma função amida, sob a forma de uma lactona ou reduzida a C^OH, e

X representa um ácido L-aminado geneticamente codificável, com um ponto isoeléctrico entre 5 e 8,5, e dos sais fisiologicamente aceitáveis destes derivados da insulina, caracterizado por se provocar a expressão de uma estrutura génica que codifica para este derivado da insulina numa célula hospedeira, de preferência numa bactéria ou numa levedura e caso a estrutura genica codifique para uma proteína de fusão libertar o referido derivado da insulina da fórmula II a partir da proteína de fusão obtida e eventualmente transformá-lo num sal fisiologicamente aceitável.

ftaaru.

_ - 2â • Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um derivado da insulina da fórmula II na qual R^X representa H-Phe.

- 3â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se obter um derivado da insulina da fórmula II na qual R representa Gly, Ala, Ser, Thr, Asp, ou Glu, especialmente apenas Asp.

- 4â Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se obter um derivado da insulina da fórmula II na qual R representa Ala, Thr ou Ser.

- 5ã Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se obter um derivado da insulina da fórmula II na qual R representa Arg-OH ou Arg-Arg-OH.

- 6ã Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se obter um derivado da insulina da fórmula II na qual X significa Asn ou Gin.

- 7ã Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se obter um derivado da in. sulina da fórmula II na qual as sequências (Al a A20) e (Bl a • B9 e Bll a B29) são as sequências da insulina humana, de suíno

- 8â Processo para a preparação de derivados da insulina da fórmula II de acordo com a definição na reivindicação 1, em que, no entanto,

R é = apenas a Asp e

X é = a His, e dos sais fisiologicamente aceitáveis destes derivados da insulina caracterizado por se submeter a hidrólise num meio aquoso ácido um derivado da insulina da fórmula I

Al

H-GlyCadeia AA21

-Asn-OH (II)

B2

R^ValBIO

Cadeia B - His

B29

R³⁰ - R³¹ .30 ,31 na qual R¹·, R*'^w e R~'^J' possuem os significados definidos para a fórmula II (de acordo com a definição da reivindicação 1) e even· tualmente transformar-se o derivado da insulina da fórmula II deste modo obtido num seu sal fisiologicamente aceitável.

- 9ã Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de diabetes mellitus caracterizado por se incorporar como princípio activo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado da insulina da fórmula II e/ou pelo menos um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis com uma substância veicular fisiologicamente inócua bem como eventualmente com outros aditivos e/ou adjuvantes numa forma de apresentação farmacêutica adequada.

- 10ã 17

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se incorporar adiçionalmente na composição farmacêutica pelo menos um composto de zinco correspondente a um conteúdo de zinco de 1 pg a 2 mg/ml, de preferência de 5 pg a 200 pg/ml.

- llâ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11, caracterizado por se incorporar adicionalmente à composição farmacêutica uma insulina não modificada, de preferência insulina humana não modificada.