HU213018B

HU213018B - Process for producing new human insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing them

Info

Publication number: HU213018B
Application number: HU895678A
Authority: HU
Inventors: Michael Doerschug
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1989-11-06
Publication date: 1997-01-28
Also published as: IE63338B1; PT92220A; EP0368187B1; NO177963C; HU210800A9; DE58905456D1; IL92222A0; DE10075022I1; NO894424D0; HU895678D0; PT92220B; NL300019I2; HUT52549A; AU621680B2; LU90614I2; DK554789A; JPH02218696A; KR0158197B1; CA1339044C; FI100185B

Description

A találmány tárgya eljárás diabetes mellitus kezeléséhez alkalmas inzulinszármazékok, valamint az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

Ismeretes, hogy a diabetikus mellitus kezeléséhez nagy mennyiségű inzulinra és inzulinszármazékokra van szükség, ezeket részben nagyiparilag is előállítják. Annak ellenére, hogy jelentős számban állnak már inzulinkészítmények és -változatok rendelkezésre különféle hatásprofilokkal, a szervezetek különbözősége és egyéni ingadozásai miatt még mindig fennáll az igény más sajátosságokkal és hatás-jellegzetességekkel rendelkező további inzulinkészítményekre.

Késleltetett hatású inzulin-készítményeket ismertetnek például az EP-B 0 132 769 és EP-B 0 132 770 sz. szabadalmi leírásban: az (I) általános képletű, az inzulin-B-lánc B31-es pozíciójában bázikusan modifikált származékról van szó. A képletben

R¹ jelentése hidrogénatom vagy H-Phe,

R³⁰ jelentése valamely neutrális, genetikusán kódolható L-aminosav maradéka,

R³¹ jelentése fiziológiai szempontból közömbös, bázikus karakterű, legfeljebb 50 szénatomos szerves csoport, melynek létrehozásában 0-3 a-aminosav részes, és amelynek adott esetben meglévő, véghelyzetű karboxilcsoportja észterfunkcióként, amidfunkcióként, laktonként vagy CH₂OH-vá redukálva lehet jelen.

Ezekre az inzulinszármazékokra 5, 8 és 8,5 közötti izoelektromos pont (az izoelektromos fokuszálásban mérve) jellemző. Az izoelektromos pont - mely a modifikálatlan természetes inzulinnal vagy proinzulinnal (pH 5,4-nél) szemben a semleges tartátományba tolódott - a járulékos, a bázikus modifikálás következtében a molekula felületén található pozitív töltések függvénye. így ezek a bázikusan modifikált inzulinszármazékok a semleges tartományban kevésbé oldhatók mint a természetes inzulin vagy proinzulin, melyek semleges közegben rendszerint oldott állapotban találhatók.

Az (I) általános képletű modifikált inzulin-származékok késleltető vagy retard hatása az izoelektromos ponton mutatkozó gyenge oldhatóságra vezethető vissza. Az előbb említett két leírás értelmében az inzulinszármazékok fiziológiai feltételek között újra oldhatóvá lesznek a járulékos bázisos csoportok lehasítása révén, ami a származéktól függően triptikus vagy tripszinhez hasonló és/vagy karboxipeptidáz B, vagy a karboxipeptidáz Bhez hasonló és/vagy észteráz aktivitás hatására megy végbe. A lehasított csoportok vagy tiszta fiziológiai metabolitok, vagy pedig könnyen metabolizálható, fiziológiai szempontból közömbös anyagok.

Az előbbiekben említett, az inzulin bázikus modifikációja következtében fennálló retardelvet még tovább hasznosítják más - főleg az A- és B-láncon belül bázikusan modifikált inzulinszármazékok megfelelő alkalmazásával; 1. pl. EP-A 0 194 864 és EP-A 0 254 516 sz. európai közrebocsátási iratot.

Az EP-AO 194 864 sz. európai közrebocsátási irat szerinti inzulin-származékok B27-pozíciójába egy bázikus aminosav van beépítve és/vagy az A4, A17, B13 és/vagy B21 pozíciókban egy semleges aminosav van;

ezenfelül a B-lánc C-terminális karboxilcsoportját egy amid- vagy észtermaradék blokkolja.

Az EP-A 0 254 516 sz. európai közrebocsátási irat szerinti inzulinszármazékok az előbb említett EP-A leírásban ismertetettekhez nagyon hasonlítanak; annak érdekében, hogy a megfelelő gyógyszerészeti készítmények stabilitását gyengén savas pH-értéknél megnöveljék, az A21 pozícióban lévő Asn aminosavakat még más, savas közegben stabil aminosavakkal, mint pl. Asp-vel helyettesítették. Asn (aszparagin) ismert módon abban különbözik az Asp-től (aszparaginsav), hogy a két karboxil-csoport egyike amidcsoporttal van helyettesítve. [(Γ) képletű vegyület: aszparagin, (2') képletű vegyület: aszparaginsav].

Az inzulinmolekulát az A- és B-láncban másképpen is modifikálták, különösen úgy, hogy a cinkkel történő komplexképzésért - és ezzel bizonyos késleltető hatásért - felelős, a BIO pozícióban lévő His-aminosavat más, megfelelő aminosavakkal cserélték ki, ily módon gyorsan ható inzulin-származékokat kaptak; 1.: az EP-A 0 214 826 sz. európai közrebocsátási iratot.

Az utoljára említett három leírásban szereplő valamennyi inzulin-származékot főleg az A- és B-láncon belül modifikálták; előállításukra géntechnológiai úton került sor.

Kutatásaink során azt a célt tűztük ki, hogy a bevezetőben említett EP-B 0 132 769 és EP-B 0 132 770 sz. szabadalmi leírások szerinti, a B-láncban a C-terminális végcsoportnál bázikusan modifikált inzulin-származékok stabilitását savas közegben megnöveljük és adott esetben hatásprofilját is megváltoztassuk. Azt tapasztaltuk, hogy ezt a célt előnyös módon úgy éljük el, hogy az Asn^A21-t más, genetikusán kódolható, amidcsoportot nem tartalmazó aminosavakkal helyettesítjük és adott esetben a His^B10-t más, genetikusán kódolható aminosavakkal szubsztituáljuk.

Találmányunk tárgya tehát eljárás a (Π) általános képletű humán inzulínszármazékok, valamint fiziológiai szempontból elfogadható sóik előállítására - a képletben

R¹ jelentése H-Phe,

R² jelentése Asp, Gly vagy Ser,

R³⁰ jelentése Thr,

R³¹ jelentése Arg-OH vagy Arg-Arg-OH,

X jelentése Asp, Asn vagy His.

Az új inzulinszármazékok és fiziológiai szempontból elfogadható sóik hosszabb időn át is stabilak a gyengén savas pH-értékeknek megfelelő gyógyászati készítményeknél és - különösen ha a His^BW is még Asp csoportra van helyettesítve - az ismert, változatlan, (I) általános képletű, bázikusan modifikált inzulinszármazékokkal szemben megváltozott (rövidebb) hatásprofillal rendelkeznek.

A (II) általános képletű humán inzulinszármazékokat főleg géntechnológiai úton, helyspecifikus mutagenezis révén, standard módszerekkel állítjuk elő.

A kívánt, (II) általános képletű inzulinszármazék előállításához kódoló génstruktúrát alakítunk ki, és egy gazdasejtben - előnyösen egy baktériumban, mint az E. coliban vagy egy élesztőgombában, különösen a Saccha2

HU 213 018 Β romyces cerevisiae-ben - expresszióra késztetjük és amennyiben a génstruktúra fúziós proteint kódol - a fúziós proteinből felszabadítjuk a (II) általános képletű inzulinszármazékot; analóg módszereket írnak le például a következő európai közrebocsátási iratokban: EP-A 0 211 299, EP-A 0 227 938, EP-A 0 229, EP-A 0 227 938, EP-A 0 229 998, EP-A 0 286 956.

A sejt feltárása után a fúziós protein-részt kémiai úton, halogén-cianiddal - az EP-A 0 180 920 szerint -, vagy enzimatikusan, lizosztafin alkalmazásával - a DE-A 3 739 347 szerint - hasítjuk le.

Ezután az elő-inzulint öxidatív szulfitolízisnek vetjük alá pl. az R. C. Marshall és A. S. Inglis „Practical Protein Chemistry-A. Handbook” (kiadó A. Darbre) 1986, c. kiadvány 49-53. oldalain leírt módszerrel, és végül egy tiol jelenlétében a szabályos diszulfid-hidak kiképzése mellett denaturáljuk, pl. G. H. Dixon és A. C. Warldow részéről a Nature-ben (1960), 721-724. old., leírt módszerrel.

A C-peptidet triptikus hasítás útján távolítjuk el, pl. Kemmler és tsai módszerét alkalmazva; 1.: J. B. C. (1971), 6786-6791. old., és a (II) általános képletű inzulinszármazékot ismert technikai eljárásokkal, mint kromatográfiával - 1.: pl. EP-A 0 305 760 - és kristályosítással tisztítjuk.

A (II) általános képletű inzulin-származékot, melynél R² = Asp és X = His célszerűen úgy is előállíthatjuk, hogy egy (I) általános képletű ismert, bázikusan modifikált inzulinszármazékot vizes-savas közegben hidrolizáljuk (mivel itt csak az aszparagin amidcsoportját az A21pozícióban kell hidrolizálni), előnyösen kb. 2 és kb. 4 közötti, különösen kb. 2,5 pH-értéknél, és kb. 0-40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten.

A találmány szerinti (II) általános képletű inzulinszármazékokat és/vagy ezek fiziológiai szempontból elfogadható sóit főleg gyógyszerészeti készítmények hatóanyagaiként, a diabetes mellitus kezeléséhez lehet alkalmazni.

A gyógyszerészeti készítmény előnyösen injekciós célokra szolgáló oldat vagy szuszpenzió; a készítmény legalább egy (II) általános képletű inzulinszármazékot és/vagy ennek legalább egy, fiziológiai szempontból elfogadható sóját tartalmazza oldott, amorf és/vagy kristályos - előnyösen oldott - formában.

A készítmény pH-ja előnyösen kb. 2,5 és 8,5 között, különösen kb. 4,0 és 8,5 között van, megfelelő izotonizáló szert, konzerválószert és adott esetben megfelelő puffért, valamint előnyösen egy meghatározott koncentrációban cink-ionokat tartalmaz, valamennyit természetesen steril, vizes oldatban. A készítmény alkotóinak összessége - a hatóanyagon kívül - képezi a hordozót a készítményben.

Megfelelő izotonizáló szerek pl. a glicerin, glükóz, 5 mannit, NaCl, kalcium- vagy magnéziumvegyületek, mint CaCl₂, MgCl₂ stb.

Az izotonizáló szer és/vagy a konzerválószerek megválasztásával befolyásolni lehet az inzulinszármazék illetve fiziológiai szempontból elfogadható sójának oldhatóságát enyhén savas pH-értéknél.

Alkalmas konzerválószerek pl. a fenol, m-krezol, benzilalkohol és/vagy p-hidroxi-benzoesavészter.

Pufferként, különösen a kb. 4,0 és 8,5 közötti pH értékek beállításához, pl. nátrium-acetátot, nátrium-cit15 rátot, nátrium-foszfátot stb. lehet alkalmazni. A pH-érték beállításához egyébként fiziológiai szempontból közömbös savak (különösen a HCI) illetve lúgok (különösen a NaOH) is megfelelnek.

Ha a készítmény cinket is tartalmaz, 1 gg és 2 mg, különösen 5 gg és 200 gg közötti Zn/ml mennyiségek részesülnek előnyben.

Előnyös hatóanyag-koncentrációk a következők: mintegy 1-1500, még előnyösebb a kb. 5-1000 és különösen előnyös a 40-400 nemzetközi egység/ml.

A találmány szerinti (H) általános képletű új inzulinszármazékok géntechnológiai előállítási eljárásában kulcsfontosságú közbenső termék a pSW3 plazmid [(22) képlet], amelyet először egy korábbi, mini-proinzulin előállítására vonatkozó szabadalmi bejelentésünkben írtunk le; előállítá30 si eljárását a jelen bejelentésünk példáiban is ismertetjük.

1. példa

A pSW3 plazmid előállítása

a) A plKl és pIK2 plazmidok előállítása

A kereskedelemben beszerezhető pUC 19 plazmidot a KpnI és PstI restrikciós enzimekkel felnyitjuk és a nagy fragmentumot (1) 0,8%-os „Seaplaque”-gélen elválasztjuk. Ezt a fragmentumot az 1. táblázat szerinti szintetikus

2. DNS-sel (2) és T4 DNS-ligázzal elegyítjük, és a ligáci40 ós elegyet kompetens Escherichia coli 79/02 sejtekkel inkubáljuk. A transzformációs keveréket 20 mg/1 ampicillint tartalmazó IPTG/Xgal lemezeken szélesztjük. A fehér telepekből izoláljuk a plazmid-DNS-t, és restrikciósés DNS-szekvenciaanalízis révén jellemezzük. A kívánt plazmidokat a továbbiakban pIK 1-nel (3) nevezzük. Hasonlóképpen ligáljuk a 2. táblázat szerinti DNS-t (5) is előzőleg Pstl-gyel és HindlII-mal felnyitott pUC19-cel (4). így a pIK2 plazmidot (6) kapjuk.

1. táblázat IK1 génfragmentum

B¹

Phe

CT TTG GAC AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT CAC CAT CGA AAC CTG TTC TCT AAG CAA TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA GTG «- 1 -► (KpnI]

Hpal

HU 213018 Β

60 70 80 90

-„ ,-:-₄ TTG GTG GAA GCG TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAG CGT GGT TTC TTC AAC CAC CTT CGC AAC ATG AAC CAA ACA CCA CCA CTC GCA AAG AAG --3 Β³⁰

Thr Arg Lys Gly Ser Leu

100 110 120

TAC ACT CCA AAG ACG CGT AAG GGT TCT CTG CA ATG TGA GGT TTC TGC GCA TTC CCA AGA G

Miül (PstI)

2. táblázat 1KII génfragmentum

A¹

Gin Lys Arg Gly

130 140 150 160

-- 6

G AAG CGT GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT AGT ATC TGT TCT AC GTC TTC GCA CCA TAG CAA CTT GTT ACA ACA TGA TCA TAG ACA AGA *---'- 5 (PstI) Spel

A²¹

Asn

170 180 190 200 210

TTG TAC CAG CTG GAA AAC TAC TGT AAC TGA TAG TCG ACC CAT GGA AAC ATG GTC GAC CTT TTG ATG ACA TTG ACT ATC AGC TGG GTA CCT TCG A (HindlII)

A pIK4 plazmid előállítása

A pIKl (3) és pIK2 (6) plazmidokból ismét izoláljuk az 1. és 2. táblázat szerinti DNS-szekvenciákat [(2) és (5)], és előzőleg KpnI-gyel és HindlII-mal felnyitott 40 puC19-cel (7) ligáljuk. így nyerjük a pIK3 (8) plazmidot, amely egy módosított humán inzulin-szekvenciát kódol.

A pIK3 (8) plazmidot Mlul-gyel és Spel-gyel felnyitjuk és izoláljuk a nagy fragmentumot (9). Ezt az alábbi DNS-szekvenciával (10)

	B30	Al	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9
	(Thr)	(Arg) Gly	Ile	Val	Glu	Gin	Cys	Cys	(Thr)	(Ser) (10
5		CG CGT GGT	ATC	GTT	GAA	CAA	TGT	TGT	A	3'
3		A CCA	TAG	CAA	CTT	GTT	ACA	ACA	TGA TC	5'

(Miül) (Spel) kapcsoljuk össze, amely a B-lánc utolsó kodonját (B30) egy arginin-kodonnal kiegészíti, az A-lánc első 7 aminosavját kódoló kivágott kodonokat helyettesíti, és az A-lánc 8. és 9. aminosavját kódoló kodonokkal kiegészíti. így a pIK4 plazmidhoz (11) jutunk.

c) A pIKIO expressziós vektor előállítása

Az A 0 229 999 számú európai szabadalmi leírásból ismert pK50 (12) plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk [ott a 3. példa: 3. ábra (33)]. Mindkét fragmentumot [(13) és (14)] izoláljuk. Az IL-2 rész-szekvenciájú kis fragmentumot (14) Mlul-gyel továbbhasítjuk és izoláljuk az IL-2 rész-szekvenciát (15).

A pIK4 plazmidot EcoRI-gyel és Hpal-gyel hasítjuk és a nagyobbik fragmentumot (16) izoláljuk, majd az IL-2 részszekvenciával (15) és az alábbi szintetikus DNS-sel (17)

Β¹ B²

Met Ile Glu Gly Arg Phe Val 5' CG CGT ATG ATT GAG GGC CGT TTC GTT 3' (17)

HU 213 018 Β

3' A TAC TAA CTC CCG GCA AAG CAA (Miül) (Hpal) ligáljuk, ezáltal nyerjük a pIK8 (18) plazmidot. Ez egy fúziós proteint kódol, amelyben az IL-2 első 38 aminosavját egy Met-Met-Ile-Glu-Gly-Arg képletű áthidaló tag követi, ezután pedig a mini-proinzulin aminosavszekvenciája következik.

A pIK8 (18) plazmidból kihasítjuk a fenti fúziós proteint kódoló EcoRI-HindlII-fragmentumot (19). Ezt a fragmentumot a pK50 hasításával kapott nagy fragmentummal (13) ligáljuk. így nyerjük a pIKlO (20) expressziós vektort, amely a fentebb jellemzett fúziós proteint kódolja.

d) A pSW3 plazmid előállítása

Ha eltávolítjuk a pIKlO (20) vektorból az NdelBstEII-szegmentumot, amely az úgynevezett „bőm site”-ot tartalmazza, olyan vektort kapunk, amely több példányban van jelen a sejtben és a „bőm site” hiánya miatt nem mobilizálható többé konjugativ plazmidok által.

A fenti célra a pIKlO (20) vektort BstEII-vel és Ndel-gyel hasítjuk, a DNS-t etanollal kicsapjuk, DNSpolimerázt tartalmazó pufferbe visszük és Klenow-féle polimeráz-reakciónak vetjük alá. Az így keletkezett csonka végű DNS-fragmentumokat gél-elektroforézissel szétválasztjuk, és a nagyobbik fragmentumot (21) izoláljuk. Ligálással kapjuk a pSW3 (22) vektort. A vektorral kompetens Escherichia coli MclOól sejteket transzformálunk, és a sejteket szaporítjuk, majd a pSW3 (22) plazmidot izoláljuk és jellemezzük.

2. példa

Plazmid létrehozása Gly^Á2] -humán-inzulin-Arg™OH előállításához

A plazmid-DNS-t a Pvu2 és Sáli restrikciós-enzimekkel átalakítjuk és utána alkalikus marhafoszfatázzal (a Boehringer Mannheim NSZK-beli cég készítménye) kezeljük az előállító vállalat használati utasításában előírt módon.

A keletkező két fragmentumot gél-elektroforetikusan szétválasztjuk és a nagy fragmentumot elkülönítjük. Ezt a fragmentumot T4-DNS-kapcsolási reakció során a következő szintetikus DNS-szekvenciával kapcsoljuk össze:

5' - CTG GAA AAC TAC TGT GGT TGA TAG GAC CTT TTG ATG ACA CCA ACT

ATC AGCT - 5'

A kapcsolási eleggyel E. coli W-3110 (ATCC 27 325) sejteket transzformálunk. A transzformációs elegyet 20 μg/ml ampicilint tartalmazó NA-lemezekre szélesztjük és éjjelen át 37 °C-on inkubáljuk. (Az NAlemezeket oly módon állítjuk elő, hogy 8 g Bacto tápanyagot (a Difco cég készítménye), 15 g Bacto-agart (Difco) és 5 g nátrium-kloridot 1 liter vízben oldunk, az oldatot autoklávban sterilizáljuk, azután hozzáadjuk a kívánt mennyiségű (20-25 mg/1) ampicillint, majd az így készített agar-oldatot lemezekké hagyjuk szilárdulni.) Az egyes képződött telepekből éjjelen át kultúrát készítünk és ezekből plazmid-DNS-t nyerünk. A megfelelő plazmidok, amelyek a megváltozott A-láncot kódolják, a pIKlOO megjelölést kapják.

A transzformált E. coli sejtekkel éjjelen át készített kultúrát, amely a pIKlOO plazmidot tartalmazza, 50 μg/ml ampicillint tartalmazó LB tápközeggel (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) hígítjuk 1:100 tf. arányban, és a kultúra fejlődését OD-méréssel követjük. OD = 0,5 érték elérésekor a kultúrát 1 mM lPTG-re állítjuk be és a baktériumokat 3 óra múlva lecentrifugáljuk. Az elkülönített baktériumokat 7 M karbamidot, 0,1 SDS-t és 0,1 M nátrium-foszfátot tartalmazó, 7,0 pH -értékű pufferoldatban 5 percig forraljuk, és egy SDS gélelektroforézis-lemezre mintákat veszünk. A gélelektroforézises analízis a kb. 10 000 móltömegnek megfelelő tartományban egy olyan sávot mutat, amely a kívánt fúziós fehéijének felel meg. Az itt kapott anyag a „Western Biot” próbában az inzulin elleni antitestekkel reagál.

A sejtek nyomás alatti feltárása és a centrifugálás után az üledékben kapjuk a fúziós fehérjét, egyéb oldhatatlan sejt-alkotórészek kíséretében.

A kapott fúziós fehérjéből a cím szerinti módosított inzulin-származékot az alábbi 3 példában leírt eljárással állítjuk elő.

3. példa

Gly^K2x-humán inzulin-Arg^B31 -OH előállítása

A centrifugálással és foszfát-pufferrel (pH 7), illetőleg vízzel való mosással tisztított fúziós proteinből (szárazanyagtartalma körülbelül 25%) 40 g-ot 75 ml 98-100%-os foszforsavban oldunk és 5 g BrCN-ot adunk hozzá. 6 órán keresztül hagyjuk szobahőmérsékleten reagálni, majd az elegyhez 2 liter vizet adunk és fagyasztva szárítjuk.

A fragmentumok keverékét (10 g) feloldjuk 1 liter pufferoldatban [8 mól/1 karbamid, 0,2 mól/1 Tris-HCl (pH 8,5)] 30 °C-ra melegítjük és 10 g nátrium-szulfitot és 2,5 g nátrium-tetrationátot adunk hozzá. 90 perc elteltével 30 °C-on 3 liter hideg vizet adunk hozzá és a pH-t 7,0 -re állítjuk. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük; a szupernatáns folyadékból a proinzulin S-szulfonátot tartalmazó nyers terméket a pH-érték 3,5-re állításával leválasztjuk. Az elegyet 15 óra hoszszat inkubáljuk, majd 4 °C-on centrifugáljuk. A csapadékot 200 ml vízzel mossuk és fagyasztva szárítjuk.

A kapott nyers termékben az S-szulfonát dúsítása két lépésben történik az alábbiak szerint:

1. lépés: Anioncserélő kromatográfiás eljárással 5x60 cm-es oszlopon, amely 3 mól/1 karbamidot és 0,05 mól/1 Tris-HCl-ot tartalmazó pufferben (pH 8,3) Fractogel^R TSK DEAE-650 M-mel van megtöltve. Az eluálást 0,05-0,5 mól/1 NaCl-gradienssel végezzük, 6 literes mennyiségekkel. Az eluátum analízise után izoelektromos fókuszálással csapjuk ki a terméket az egyesített frakciókból úgy, hogy 1 mól/1 karbamid-koncentrációig hígítunk és a pH-t 3,5-re állítjuk.

HU 213018 Β

2. lépés: Nagy és kis molekulatömegű szennyezések eltávolítása gélszűréssel, ^RSephacril S200-on 3 mól/1 karbamidot, 0,05 mól/1 Tris-HCl-ot, 0,05 mól/1 NaCl-ot tartalmazó pufferben (pH 8,3). A frakciók analízise és a termék izolálása ugyanúgy történik, mint az előző lépésnél. A csapadékot 20 ml vízzel mossuk és fagyasztva szárítjuk.

A térszerkezet kialakításához és a diszulfid-hidak képzéséhez az S-szulfonátot 50 ml 8 mól/1 karbamidot, 0,02 mól/1 Tris-HCl-ot tartalmazó pufferben (pH 8,6) oldjuk. Néhány csepp oktanol hozzáadása után 15 percen keresztül utótisztított nitrogént vezetünk keresztül az oldaton. 1,1 ml (16 mól/1 koncentrációjú) 2-merkapto-etanol hozzáadása után 1 órán belül, szobahőmérsékleten végbemegy a teljes redukció. Az oldatot ^RSephadex G25-oszlopra (5x60 cm) visszük, és 0,05 mól/1 koncentrációjú glicin/NaOH (pH 10,6) oldattal eluáljuk. 300 ml glicinpufferben lévő fehérje-frakciót a pH-érték ellenőrzése, és esetleges korrigálása (pH 10,6) után 2 napig 4 °C-on tartjuk. Ezután a pH-t 6,8-ra állítjuk, és az oldatot 1 mg (3,5 egység) L-[ 1 -(p-tozil-amino)-2-fenil-etil]-(klór-metil)-ketonnal (TPCK) kezelt tripszinnel (Merck) inkubáljuk szobahőmérsékleten, 4 órán keresztül. Ezután a pH-t 3,5-re állítjuk be, az oldathoz 1 mg tripszin-inhibitort [szójababból (Sigma)] és 3 ml 10%-os ZnCl2-ot adunk és a pH-t ismét visszaállítjuk 6,8-ra. A kivált csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A kapott nyers termék cím szerinti inzulint tartalmaz, amelyet S-Sepharose^R-on végzett ioncserélő kromatográfiás eljárással (2,5x40 cm-es oszlop) 50 mmól/1 tejsavat és 30% izopropanolt tartalmazó pufferben tisztítunk. Az eluálást 0,05-0,50 mól/1 koncentrációjú NaCl-oldattal (1-1 liter) végezzük, gradiens-elúcióval. Az eluátumot nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással analizáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat vízzel 1:1 arányban hígítjuk, majd a cím szerinti inzulint 10 ml/1 10%-os ZnCl2-ot tartalmazó víz hozzáadásával kicsapjuk a pH 6,8-ra való beállítása után. A centrifugálás útján elválasztott csapadékot 1 g/1 fenolt, 10,5 g/1 citromsavat és 200 mg/1 ZnCl₂-ot tartalmazó pufferből (pH 6) kristályosítjuk. A kevés vízzel mosott kristályokat fagyasztva szárítjuk.

4. példa

Plazmid létrehozása Gly(A21 )-Asn(B10)-humán inzulin-Arg(B3I-OH) előállításához A pIKlOO plazmid-DNS-t a Hpal és Dra3 restrikciós enzimekkel hasítjuk és alkálikus marha-foszfatázzal kezeljük. A keletkező két fragmentumot gél-elektroforetikus úton szétválasztjuk és a nagyobb fragmentumot elkülönítjük. A fragmentumot a következő szintetikus DNS-szekvenciával kapcsoljuk:

5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC TTG TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA TTG - 5' A kapcsolási keverékkel megfelelő E. coli W3110 sejteket transzformálunk. A keletkező pIKlOl plazmidot a továbbiakban a 2. példában leírtak szerint kezeljük.

5. példa

Plazmid létrehozása Gly^A21 -Asp^{S * * * i0}-humán inzulinArg^B3'-Arg^‘--OH előállításához.

A pSW21 plazmid-DNS-ből kiindulva, a 4. példában leírt módon hozzuk létre a pSW30 plazmidot; az eljárásban a következő szintetikus DNS-szekvenciát alkalmazzuk;

5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT GAC CTA TTG GTT GTG AAC ACA CAA AGA CTG - 5' Az eljárást a továbbiakban a fenti 2. példa szerint folytatjuk le.

6. példa

Expressziós plazmid létrehozása majom-proinzulinhoz A majom-proinzulin csupán abban tér el a humánproinzulintól, hogy a C-peptidben egyetlen aminosav különbözik [B37-Pro a humán proinzulin B37-Leu csoportja helyett, vö. (3') képlet].

ApSW3 plazmidot Hpal-gyel és Sall-gyel nyitjuk és a maradék plazmid-DNS-t elkülönítjük. Az EP-A 0 229 998 sz. szabadalmi dokumentumban leírt pK50 plazmidból a Dra3-Sall-majom proinzulin-fragmentumot elkülönítjük. A két fragmentumot egy T4-DNSkapcsolási reakcióban az alábbi szintetikus DNS-fragmentummal kapcsoljuk:

5' - AAC CAG CAC CTG TGC GGT TCT CAC CTA TTG GTC GTG GAC ACG CCA AGA GTG - 5'

Ily módon a pSW2 plazmidot nyerjük, melynek DNS-e kiindulási anyagul szolgál a következőkben a di-Arghumán inzulin-származékokat kódoló expressziós plazmidok létrehozásához.

7. példa

Plazmid létrehozása Gly(A21 )-humán inzulinArg(B31 )-Arg(B32)-OH előállításához

A pSW2 plazmid DNS-ét a 2. példának megfelelően Pvu2-vel és Sall-gyel hasítjuk és a nagyobb fragmentumot a 2. példa szerinti szintetikus DNS-seL kapcsoljuk; apSW21 plazmid keletkezik.

8. példa

Plazmid létrehozása Ser(A21)-humán inzulin (Arg

B31-OH) előállításához

A plazmidot a 2. példában leírt úton hozzuk létre. A szintetikus DNS-szekvencia azonban a következőképpen változik:

5' - CTG GAA AAC TAC TGT TCA TGA TAG GAC CTT TTG ATG ACA AGT ATC AGCT - 5'

9. példa

Plazmid létrehozása Ser(A21 )-humán inzulinArg(B31 )-A rg(B32)-OH előállításához A pSW2-DNS-ből kiindulva a 8. példával analóg módon a pSW22 plazmidot hozzuk létre.

10. példa

Plazmid létrehozása Gly(A21 )-Asn(B10)-humán inzulin-Arg(B31 )-Arg(B32)-OH előállításához A pSW21-DNS-ből kiindulva a 4. példával analóg módon a pSW23 plazmidot hozzuk létre.

Ennek során szintetikus DNS-szekvenciaként a következő szekvenciát alkalmazzuk:

HU 213 018 Β

5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC CTA TTG GTT GTG AAC ACA CAA AGA TTG - 5'

11. példa

Plazmid létrehozása Ser(A2I)-Asn(B10)-humán inzulin-B31(Arg)-B32(Arg)-OH előállításához A pSW22-DNS-ből kiindulva a 3. példával analóg módon, a 10. példában leírt szintetikus DNS-szekvencia alkalmazásával a pSW24 plazmidot hozzuk létre.

72. példa

Eljárás Asp^Á2}-humán inzulin-Arg^B31 -Arg³³--OH előállítására humán inzulin-Arg^³'-Arg^-OH-ből hidrolízis útján g humán inzulin-Arg^B31-Arg^B32-OH-t 100 ml vízben feliszapolunk. Sósav hozzáadásával a pH-értéket 2,5-re állítjuk be, és az oldatot 37 °C-on tartjuk. Egy hét után az anyagnak kb. a felét Asp^A21-humán inzulinArg^B3l-Arg^B32-OH-vá alakítjuk. A terméket anioncserélővei ismert módon elválasztjuk a kiindulási anyagtól, kicsapjuk az eluátumból, és literenként 10,5 g citromsavat, 1 g fenolt és 5 ml 1 %-os cink-klorid oldatot tartalmazó pufferben 5 g/1 protein koncentrációval 6,0 pH-nál kristályosítjuk. Hozam: 390 mg Asp^A21-humán inzulin-Arg^B3l-Arg^B32.

Hasonló módon alakítjuk át az egyéb hasonló, az A21 helyen Asn csoportot tartalmazó inzulinszármazékokban az Asn csoportot hidrolízis útján Asp csoporttá.

A 12. példa kiindulási anyagaként alkalmazott humán inzulin-Arg^B31-Arg^B32-OH az EP-A 0 132 770 számú európai közrebocsátási iratban leírt módon állítható elő.

13. példa

Injekció-oldat előállítása

A B/ szerinti inzulin-származékokat 1,4 mg/ml koncentrációval az alábbi összetételű (per ml) steril hordozó-oldatban oldjuk:

mg glicerin, 10 mg benzilalkohol, 80 gg Zn²⁺, pH 4,0.

14. példa

Asp^A2l-humán inzulin-Arg^B32-OH készítmény hatásprofilja kutyán, összehasonlítva a humáninzulinArg^B31-Arg^B32-OH és Basal-H-inzulin-Hoechst^(R) (= NPH azaz Neutral-Protamin Hagedorn szerint, kb. 10 gg Zn²⁺ tartalommal) készítményekkel.

A kutyáknak beadott inzulinszármazék adagja 0,3 NE/kg testtömeg volt.

Készítmény	Vércukor a kezdeti érték százalékában órákban (h)
1 h	2h	3h	5h	7h
találmány szerint	Asp^A21-humán inzulin Arg^B31Arg^B32-OH	99	62	51	75	98

Készítmény	Vércukor a kezdeti érték százalékában órákban (h)
1 h	2h	3h	5 h	7 h
Összeha- sonlítás	humán inzulin Arg^B31-Arg^B32OH	77	52	64	85	98
Basal-H-lnsulin Hoechst^(R>	71	49	59	83	100

Ez a példa azt mutatja, hogy az Asp^A21-humán inzulinArg^B31-Arg^B32-OH ugyanazzal az előnyös Bas 1 -profillal rendelkezik, mint a humán inzulin-Arg^B3l-Arg^B32OH. Kiegészítésként az Asp^A21-humáninzulin-Arg^B31Arg^B32-OH előnyös tulajdonságára kell rámutatni, vagyis arra, hogy a megválasztott feltételek között a vegyület hosszú ideig stabil.

Az alább A-E alatt felsorolt további új inzulinszármazékok ugyancsak 0,3 NE/kg adagjával hasonló körülmények között kezelt kutyákkal az alábbi eredményeket kaptuk:

Ve- gyű- let	Véreukor a kezdeti érték százalékában
1 h	2h	3h	4h	5h	6h	7h	8h
A	86	58	55	70	80	100
B	93	58	62	73	90	100
C	98	88	66	62	62	64	70	80
D	100	98	91	87	78	72	70	69
E	70	72	78	81	93	92	94	96

A fenti kísérletekben az alább felsorolt humán inzulin-származékokat alkalmaztuk, amelyeket a találmány szerinti eljárással, a fentebbi példákban leírthoz hasonló módon állítottunk elő:

A Asp^B10-Gly^A21-Arg^B3l-Arg^B32-OH

B Asp^{B 1} °- Ser^A21 -Arg^{B 31} -Arg^B32-OH

C Gly^A2l-Arg^B31-OH

D Gly^A21-Arg^B31-Arg^B32-OH

E Ser^A2l-Arg^B31-Arg^B32-OH

A fentebbi összehasonlító kísérletek eredményeihez hasonló módon ezek a kísérleti eredmények is mutatják a találmány szerinti új inzulinszármazékok hatáserősség és hatásprofil szempontjából előnyös tulajdonságait.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (II) általános képletű humán inzulinszármazékok - ebben a képletben R¹ jelentése H-Phe,

R² jelentése Asp, Gly vagy Ser,

R³⁰ jelentése Thr,

R³¹ jelentése Arg-OH vagy Arg-Arg-OH,

X jelentése Asp, Asn vagy His és adott esetben fiziológiai szempontból elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti meghatározásnak megfelelő inzulin-származékot és kívánt

HU 213 018 Β estben egy fúziós partner-peptidet kódoló génstruktúrát expressziós plazmidba építjük, bakteriális gazdasejtben kifejezzük és a fehérjét kinyerjük, és amennyiben a génstruktúra fúziós fehérjét kódol, a kapott fúziós fehérjéből az inzulin-származékot felszabadítjuk - és 5 adott esetben a kapott (II) általános képletű inzulinszármazékot fiziológiai szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű inzulin-származékot állítunk elő, amelynél R² jelentése Asp csoport.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletű inzulinszármazékot állítunk elő, amelynél X jelentése Asp csoport.
4. Eljárás olyan (Π) általános képletű humán inzu- 15 linszármazékok és adott esetben fiziológiai szempontból elfogadható sóik előállítására, amelyeknél R¹ jelentése Η-Phe, R² jelentése Asp, R³⁰ jelentése Thr, R³¹jelentése Arg-OH vagy Arg-Arg-OH és X jelentése His csoport, azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletű inzulinszármazékot - ahol R¹, R³⁰ és R³¹ jelentése egyezik a fent megadottal - vizes-savas közegben hidrolizálunk, és adott esetben a kapott (II) általános képletű inzulinszármazékot fiziológiai szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.
5. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. igénypont szerint előállított (II) általános képletű inzulinszármazékot

10 - ahol R¹, R², R³⁰, R³¹ és X jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal - vagy ennek fiziológiai szempontból elfogadható sóját vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal, és adott esetben cinkvegyülettel összekeverve gyógyászati célokra alkalmas készítménnyé alakítjuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű inzulinszármazék oldatához 1 ml-re számítva 1 pg-l mg, előnyösen 5 pg200 pg cinkvegyületet, előnyösen cink-kloridot adunk.