DK173196B1

DK173196B1 - Insulinderivater, deres anvendelse og farmaceutisk præparat indeholdende mindst ét sådant insulinderivat

Info

Publication number: DK173196B1
Application number: DK198905547A
Authority: DK
Inventors: Michael Doerschug
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-11-08
Filing date: 1989-11-07
Publication date: 2000-03-13
Also published as: IE63338B1; PT92220A; EP0368187B1; NO177963C; HU210800A9; DE58905456D1; IL92222A0; DE10075022I1; NO894424D0; HU895678D0; PT92220B; NL300019I2; HUT52549A; AU621680B2; LU90614I2; DK554789A; JPH02218696A; KR0158197B1; CA1339044C; FI100185B

Description

i DK 173196 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte insulinderivater, anvendelsen af disse som virksomme forbindelser til farmaceutiske præparater til behandling af diabetes mellitus samt et farmaceutisk præparat indeholdende mindst ét af de 5 omhandlede insulinderivater.

Insulin og insulinderivater kræves som bekendt i betydelige mængder til behandling af sygdommen diabetes mellitus og produceres til dels også i storteknisk målestok.

Til trods for det betragtelige antal allerede eksisterende 10 insulinpræparater og -varianter med forskellig virknings -profil findes der på grund af organismernes forskellighed med deres inter- og intraindividuelle variationer stadig et behov for yderligere insulinprodukter med andre egenskaber og andre virkningskarakteristikker.

15 Insulinderivater med en forhalet virkning er f.eks.

beskrevet i EP patentskrifterne nr. 132.769 og nr. 132.770.

Det drejer sig især om positionen B31 i insulin-B-kæden i basisk modificerede derivater med den følgende formel I: 2 0 Al S-S A21

H-Gly ·-1-A-Kæde -1-j-Asn-OH

S S

I I (I>

25 SS

B2 BIO B29 1 30 31

R -Val-B-Kæde-His -R -R

2 DK 173196 B1 tion, som amidfunktion, som lacton eller reduceret til CH2OH.

Et isoelektrisk punkt mellem 5,8 og 8,5 (målt ved isoelektrisk fokusering) er karakteristisk for disse insulinderivater. Det i forhold til det isoelektriske punkt 5 for det ikke-modificerede, native insulin eller proinsulin (ved en pH-værdi på 5,4) i neutralområdet forskudte isoelektriske punkt er betinget af de eller den yderligere, på molekylets overflade forekommende positive ladning eller ladninger som følge af den basiske modifikation. Hermed er 10 disse basisk modificerede insulinderivater i det neutrale område mindre opløselige end f.eks. nativt insulin eller proinsulin, der i det neutrale område normalt foreligger opløst.

Forsinkelses- eller depotvirkningen af de basisk 15 modificerede insulinderivater med formlen I går tilbage til tungtopløseligheden ved det isoelektriske punkt. Genopløsningen af insulinderivaterne under fysiologiske betingelser skal ifølge begge de ovennævnte patentskrifter opnås ved fra-spaltning af de yderligere basiske grupper, hvilket alt 20 efter derivatet foregår ved hjælp af tryptisk eller trypsin-lignende og/eller carboxypeptidase B- eller carboxypeptidase B-lignende og/eller esterase-aktivitet. De hver gang fraspaltede grupper er enten rent fysiologiske metaboliter eller let metaboliserbare, fysiologisk uskadelige stoffer.

25 Det førnævnte depotprincip som følge af basisk modi fikation af insulinet udnyttes yderligere gennem tilvejebringelsen og den tilsvarende anvendelse af andre, hovedsageligt inden for A- og B-kæderne, basisk modificerede insulinderivater, jf. f.eks. EP offentliggørelsesskrift 30 nr. 194.864 og nr. 254.516.

I insulinderivaterne ifølge EP offentliggørelsesskrift nr. 194.864 er der i B27-position indbygget en basisk aminosyre, og/eller der sidder en neutral aminosyre i positionerne A4, A17, B13 og/eller B21. Desuden er den C-termi-35 nåle carboxylgruppe i B-kaeden blokeret med en amid- eller estergruppe.

3 DK 173196 B1

Insulinderivaterne ifølge det EP offentliggørelsesskrift nr. 254.516 minder meget om de derivater, der kendes fra det ovennævnte EP offentliggørelsesskrift. Med henblik på stabilitetsforøgelse ved de svagt sure pH-værdier af de 5 tilsvarende farmaceutiske præparater kan imidlertid her aminosyren Asn i position A21 være erstattet med eller erstattes med andre, i surt medium mere stabile aminosyrer, f.eks. Asp. Asn (asparagin) adskiller sig som bekendt fra Asp (asparaginsyre) ved blokeringen af en af de to carboxyl-10 grupper ved hjælp af en amidgruppe:

COOH COOH

1 1

HN-C-H HN-C-H

15 2 2

CH CH

,2 ,2

CONH COOH

2 20 Asparagin Asparaginsyre

Ved en yderligere anden modifikation af insulinmolekylet i A- og B-kæden, især ved udskiftning af den for kom-25 pleksdannelsen med zink, og dermed for en vis forsinkelsesvirkning ansvarlige, aminosyre His i Bio-stilling med andre, tilsvarende aminosyrer skal der opnås hurtigt virkende insulinderivater, jf. EP offentliggørelsesskrift nr. 214.826.

Samtlige insulinderivater ifølge de 3 sidstnævnte 30 trykskrifter er hovedsageligt modificeret inden for A- og B-kæderne. Deres fremstilling sker ad genteknologisk vej.

Ved bestræbelserne på at forøge stabiliteten af de ved den C-terminale ende af B-kæden basisk modificerede insulinderivater ifølge de allerede nævnte EP patentskrifter 35 nr. 132.769 og 132.770 i surt medium og eventuelt også ved at ændre deres virkningsprofil har det nu vist sig, at dette 4 DK 173196 B1 formål på fordelagtig måde opnås ved erstatning af AsnA21 med andre, genetisk kodelige aminosyrer, der ikke indeholder nogen amidgruppe, og eventuelt ved substitution af His810 med andre, genetisk kodelige aminosyrer.

5 Opfindelsen angår således insulinderivater med formlen

Al S·-S A21 1 I 2

H-Gly -'-A-Kæde ---,-R

i ! I I <1J> S s B2 BIO B29 15 1 30 31

R -Val - B- Kæde-X -- R -R

i hvilken R1 betyder H eller H-Phe, R2 betyder en genetisk kodelig L-aminosyre, der ikke indeholder nogen amidgruppe, 20 R30 betyder resten af en neutral, genetisk kodelig L-amino- syre, R31 betyder en fysiologisk uskadelig, organisk gruppe valgt blandt amino-C2-Cg-alkoxy, Ci-C4-alkylamino-C2-Cg-alkoxy, di-C1-C4-alkylamino-C2-Cg-alkoxy, tri-Ci-C4-anmonio-C2-Cg-alkoxy, amino-C2-Cg-alkylamino, (C1-C4-alkylamino)-25 C2-Cg-alkylamino, di-C1-C4-alkylamino-C2-Cg-alkylamino og (tri-Ci-C4-alkylamino)-C2-Cg-alkylamino, især -0-[CH2]p-NR2, -O-[CH2]p-N®R3, -NH-[CH2]p-NR2 eller -NH-[CH2]p-N®R3, hvor p = 2-6, og R er ens eller forskellige og betyder hydrogen eller C1-C4-alkyl, eller betyder 1-3 of-aminosyrer, 30 hvis eventuelt tilstedeværende, endestillede carboxyfunkt ion kan foreligge frit, som esterfunktion, som amidfunktion, som lacton eller reduceret til CH20H, og X betyder en genetisk kodelig L-aminosyre, og er karakteriseret ved et iso-elektrisk punkt mellem 5 og 8,5, samt disse derivaters fy-35 siologisk tålelige salte.

Disse hidtil ukendte insulinderivater og deres fysio- 5 DK 173196 B1 logisk tålelige salte er ved de svagt sure pH-værdier for de tilsvarende farmaceutiske præparater også stabile over længere tidsrum og har, især når også HisB1° er ombyttet med andre aminosyrer, en i forhold til de kendte, uændrede, 5 basisk modificerede insulinderivater med den allerede angivne formel I ændret (kortere) virkningsprofil.

I formlen II betegner R1 fortrinsvis H-Phe.

Genetisk kodelige L-aminosyrer, der ikke indeholder nogen amidgruppe, jfr. definitionen af R2, er Gly, Ala, 10 Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Glu, Cys, Met, Arg, Lys, His,

Tyr, Phe, Trp og Pro, idet Gly, Ala, Ser, Thr, Asp og Glu foretrækkes, navnlig Asp.

Neutrale, genetisk kodelige L-aminosyrer, jfr. definitionen af R30, er Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, 15 Gin, Cys, Met, Tyr, Phe og Pro, idet Ala, Thr og Ser fore-t række s.

Når der i opbygningen af R31 deltager op til 3 a-aminosyrer, er disse i første række neutrale eller basiske, naturligt forekommende L-aminosyrer og/eller de til disse 20 svarende D-aminosyrer. Neutrale, naturligt forekommende aminosyrer er især Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn,

Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro og Hyp. Basiske, naturligt forekommende aminosyrer er især Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit og His. Såfremt der kun deltager neutrale a-aminosyrer, kan 25 deres endestillede carboxyl funkt ion, for at R31 kan have basisk karakter, ikke være fri. Carboxyl funktionen må derimod i dette tilfælde være esterificeret eller amideret med en basisk gruppe, idet der som basiske grupper f.eks. kommer de allerede, i det tilfælde, at der i opbygningen af R3* 30 ikke deltager nogen a-aminosyrer, nævnte basiske grupper på tale. Naturligvis kan disse basiske ester- eller amidgrupper også blokere carboxyl funktionen af basiske o;-aminosyrer.

Til blokeringen af carboxyl funktionen af de basiske «-aminosyrer kan der, såfremt blokeringen ønskes, også komme neu-35 trale ester- eller amidgrupper, f.eks. C3-Cg-alkoxy, C3-Cg-cycloalkyloxy, NH2, C^-Cg-alkylamino eller di-C3-Cg-alkyl- DK 173196 Bl 6 amino, på tale.

Som lacton kan den endestillede carboxyl funktion naturligvis kun foreligge, når den endestillede aminosyre er en hydroxyaminosyre.

5 Desuden kan den endestillede carboxylfunktion også være reduceret til CH2OH.

R31 består fortrinsvis af 1, 2 eller 3 af de oven nævnte, basiske, naturligt forekommende aminosyrer, idet R31 i særlig grad foretrækkes at være Arg-OH eller Arg-Arg- 10 OH.

Som genetisk kodelige L-aminosyrer, jfr. definitionen af X, kommer de samme aminosyrer som for på tale, idet imidlertid her også de genetisk kodelige L-aminosyrer, der indeholder en amidgruppe, f.eks. Asn og Gin, er mulige. De 15 sidstnævnte, Asn og Gin, foretrækkes endog. Når Asn eller Gin befinder sig i position BIO, er amidgruppen under alle omstændigheder stabil i svagt surt medium (i modsætning til Asn eller Gin i position A21).

Sekvenserne (A1-A20) og (B1-B9, B11-B29) er fortrins-20 vis sekvenserne for humaninsulin, svineinsulin eller okseinsulin, navnlig sekvenserne for humaninsulin.

Eksempler på insulinderivater med formlen II er følgende : 25 30 35 7 DK 173196 B1 A21 B31

Asp - Humaninsul in-Arg -OH

A21

Glu - 11 A21

Gly - " A21

Ser - " ς A21 b Thr - ” A21

Ala - » A21 B31 B32

Asp -Humaninsul in-Arg -Arg -OH A21

Glu - " in A21 10 Gly - " A21

Ser - " A21

Thr - " A2i

Ala - " i c m A21 BIO B31

A3 Asp -Asn -Humaninsulin-Arg -OH

A21

Glu - " A21

Gly - " A21

Ser - " A21

Thr - " ,n A21 20 Ala _ " - A21 BIO B31 B32

Asp -Asn -Humaninsulin-Arg -Arg -OH A21

Glu - " A21

Gly - ” 25 SerA21-

ThrA21- " A21

Ala "

Fremstillingen af insulinderivaterne med formlen II sker hovedsagelig genteknologisk ved hjælp af sted-dirigeret 30 mutagenese ifølge standardmetoder.

Til dette formål konstrueres der en for det ønskede insulinderivat med formlen II kodende genstruktur og bringes til ekspression i en værtscelle, fortrinsvis i en bakterie såsom E. coli eller en gærart, især Saccharomyces cerevisiae, 35 og såfremt genstrukturen koder for et fusionsprotein, frigøres insulinderivatet med formlen II fra fusionsproteinet.

DK 173196 B1 8

Analoge metoder er f.eks. beskrevet i EP offentliggørelsesskrifterne nr. 211.299, nr. 227.938, nr. 229.998 og nr. 286.956 samt i DE-patentansøgning P 3.821.159.9 af 23. juni 1988.

5 Fraspaltningen af fusionsproteinandelen sker efter celleoplukning enten kemisk ved hjælp af halogencyan, jf.

EP offentliggørelsesskrift nr. 180.920, eller enzymatisk ved hjælp af lysostaphin, jfr. DE offentliggørelsesskrift nr. 3.739.347.

10 Insulinforstadierne underkastes dernæst den oxidative sulfitolyse ifølge den f.eks. af R.C. Marshall og A.S. Inglis i "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (udgiver A. Darbre), 1986, s. 49-53 beskrevne metode og renatureres derpå i nærværelse af en thiol under dannelse af de korrekte 15 disulfidbroer, f.eks. efter den af G.H. Dixon og A.C. Wardlow i Nature, s. 721-724 (1960) beskrevne metode.

C-Peptidet fjernes ved hjælp af tryptisk spaltning, f.eks. ved hjælp af metoden angivet af Kemmler et al., J.B.C., s. 6786-6791 (1971), og insulinderivatet med formlen 20 II renses ved hjælp af kendte metoder, såsom chromatografi, jf. f.eks. EP offentliggørelsesskrift nr. 305.760, og krystallisation.

Fremstillingen af insulinderivaterne med formlen II, hvor R2 betyder Asp, og X betyder His, sker hensigtsmæssigt 25 ved hydrolyse af de kendte, basisk modificerede insulinderivater med formlen I i vandigt-surt medium, eftersom i dette tilfælde kun amidgruppen i asparaginet i position A21 skal hydrolyseres, fortrinsvis ved pH-værdier mellem ca. 2 og ca. 4, navnlig ca. 2,5, og ved temperaturer på fra ca. 0 30 til ca. 40°C, fortrinsvis ved stuetemperatur.

De her omhandlede insulinderivater med formlen II og/eller deres fysiologisk tålelige salte, f.eks. alkalimetal- eller ammoniumsaltene, anvendes hovedsageligt som virksomme stoffer til et farmaceutisk præparat til behandling 35 af diabetes mellitus.

Opfindelsen angår således også anvendelsen af insulin- 9 DK 173196 B1 derivaterne og deres fysiologisk tålelige salte som angivet i krav 8 samt et farmaceutisk præparat som angivet i krav 9-11.

Det farmaceutiske præparat er fortrinsvis en opløsning 5 eller suspension til injektionsformål. Det er karakteriseret ved et indhold af mindst ét insulinderivat med formlen II og/eller mindst ét af dettes fysiologisk tålelige salte i opløst, amorf og/eller krystallinsk form, fortrinsvis i opløst form.

10 Præparatet udviser fortrinsvis en pH-værdi mellem ca. 2,5 og ca. 8,5, navnlig mellem ca. 4,0 og ca. 8,5, indeholder et egnet isotonimiddel, et egnet konserveringsmiddel, og eventuelt et egnet pufferstof, samt fortrinsvis også en bestemt zinkionkoncentration, alt naturligvis i 15 steril vandig opløsning. De totale præparatbestanddele med undtagelse af det virksomme stof udgør præparatbæreren.

Egnede isotonimidler er f.eks. glycerol, glucose, mannitol, natriumchlorid, calcium- eller magnesiumforbindelser, f.eks. CaCl2 eller MgCl2.

20 Ved valget af isotonimidlet og/eller konserverings- stoffet øver man indflydelse på opløseligheden af insulinderivatet eller dettes fysiologisk tålelige salt ved de svagt sure pH-værdier.

Egnede konserveringsmidler er f.eks. phenol, m-cresol, 25 benzylalkohol og/eller p-hydroxybenzoesyreester.

Som pufferstoffer, især til indstilling af en pH-værdi mellem ca. 4,0 og ca. 8,5, kan der f.eks. anvendes natriumacetat, natriumcitrat eller natriumphosphat. I øvrigt egner sig til indstilling af pH-værdien også fysiologisk 30 tålelige fortyndede syrer, typisk fortyndet saltsyre, eller baser, typisk fortyndet natriumhydroxidopløsning.

Når præparatet har et zinkindhold, foretrækkes der et sådant på fra 1 μg til 2 mg, især fra 5 /ig til 100 μg zink pr. ml.

35 Til variation af virkningsprofilen for præparatet ifølge opfindelsen kan der også tilblandes ikke-modificeret 10 DK 173196 B1 insulin, fortrinsvis okse-, svine- eller humaninsulin, navnlig humaninsulin.

Foretrukne koncentrationer af virksomt stof er sådanne, der svarer til ca. 1 til ca. 1500, fortrinsvis ca. 5 5 til ca. 1000 og navnlig fra ca. 40 til ca. 400 internationale enheder pr. ml.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende udførelseseksempler.

10 A) Genteknologisk fremstilling Eksempel 1

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Gly (A21)-humaninsulin-Arg (B31-OH).

I DE patentansøgning P 3.821.159.9 beskrives plasmidet 15 pSW3.

Plasmid-DNA'en omsættes med restriktionsenzymerne Pvu2 og Sall og behandles derpå med alkalisk oksephosphatase.

De to dannede fragmenter adskilles gelelektroforetisk, og det store fragment isoleres. Dette fragment sammenknyttes 20 ved en T4-DNA-ligasereaktion med følgende syntetiske DNA-sekvens:

5'- CTG GAA AAC TAC TGT GGT TGA TAG

GAC CTT TTG ATG ACA CCA ACT ATC AGCT - 5’ 25

Kompetente E. coli W3110-celler transformeres med ligateringsudgangsmaterialet. Transformationsblandingen udplatteres på NA-plader, der indeholder 20 ^g Ap {= ampi-cillin)/ml, og inkuberes natten over ved 37°C. Fra enkelte 30 kolonier udvindes der en kultur natten over, og ud fra denne udvindes der plasmid-DNA. Denne DNA karakteriseres ved hjælp af restriktionsanalyse og DNA-sekvensanalyse. Korrekte plas-mider, der koder for den ændrede A-kaede, får betegnelsen pIKlOO. Ekspressionen finder sted analogt med eksempel 3 i 35 den ovennævnte DE-patentansøgning P 3.821.159.9. Fremstillingen af det modificerede mono-Arg-insulin sker ligeledes 11 DK 173196 B1 analogt med den i denne DE-patentansøgning beskrevne fremstilling af det umodificerede mono-Arg-insulin.

Eksempel 2 5 Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Ser(A21)-humaninsulin (Arg B31-0H).

Konstruktionen svarer til den i det ovenstående eksempel beskrevne vej. Den syntetiske DNA-sekvens er imidlertid ændret som følger: 10

5'- CTG GAA AAC TAC TGT TCA TGA TAG

GAC CTT TTG ATG ACA AGT ACT ATC AGCT - 5'

Der fås plasmidet pIKHO, der er karakteriseret ved en yderligere BspHl-genkendelsessekvens.

15

Eksempel 3

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Gly(A21) -Asn (BIO)-humaninsulin-Arg(B31-OH) .

DNA fra plasmidet pIKlOO spaltes med restriktionsen-20 zymerne Hpal og Dra3 og behandles med alkalisk oksephos-phatase. De to dannede fragmenter adskilles gelelektrofore-tisk, og det største af de to fragmenter isoleres. Fragmentet ligateres med den syntetiske DNA-sekvens

25 5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC TTG

TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA TTG - 5' og kompetente E. coli W3110-celler transformeres med ligateringsblandingen. Den yderligere karakterisering af det dannede plasmid ρΙΚΙΟΙ sker som beskrevet i eksempel l.

30

Eksempel 4

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Ser(A21)-Asn (BIO)-humaninsulin.

Konstruktionen svarer til den i eksempel 3 beskrevne 35 kloning, idet der dog gås ud fra DNA fra plasmidet pIKHO.

Det nykonstruerede plasmid får betegnelsen pIKlll.

12 DK 173196 B1

Eksempel 5

Konstruktion af et ekspressionsplasmid for abeproinsulin.

Abeproinsulin adskiller sig fra humant proinsulin blot ved ombytningen af en enkelt aminosyre i C-peptidet 5 (B37-Pro i stedet for Leu i denne position af det humane proinsulin).

Plasmidet pSW3 åbnes med Hpal og Sall, og restplasmid-DNA'en isoleres. Ud fra det i det europæiske offentliggørelsesskrift nr. 229.998 beskrevne plasmid pK50 isoleres Dra3-10 Sall-abeproinsulinfragmentet. Begge fragmenter sammenknyttes med det syntetiske DNA-fragment

51 - AAC CAG CAC CTG TGC GGT TCT CAC CTA

TTG GTC GTG GAC ACG CCA AGA GTG - 5' 15 ved en T4-DNA-ligasereaktion. Herved fås plasmidet pSW2, hvis DNA i det følgende tjener som udgangsmateriale til konstruktionerne af de ekspressionsplasmider, som koder for Di-Arg-humaninsulinderivaterne.

20 Eksempel 6

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Gly(A21)-humaninsulin-Arg(B31)-Arg(B32)-OH.

DNA fra plasmidet pSW2 spaltes svarende til eksempel 1 med Pvu2 og Sall og ligateres med den syntetiske DNA fra 25 eksempel 1. Herved dannes plasmidet pSW21.

Eksempel 7

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Ser(A21)-humaninsulin-Arg(B31)-Arg(B32)-OH.

30 Ud fra pSW2-DNA konstrueres plasmidet pSW22 analogt med eksempel 2.

Eksempel 8

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Gly(A21)-35 Asn(BlO)-humaninsul in-Arg(B31)-Arg(B32)-OH.

Ud fra pSW21-DNA konstrueres plasmidet pSW23 analogt 13 DK 173196 B1 med eksempel 3. Som syntetisk DNA-sekvens anvendes der herved følgende sekvens:

5’ - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC CTA

TTG GTT GTG AAC ACA CAA AGA TTG - 5'

Eksempel 9

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af Ser(A21)-10 Asn(BlO)-humaninsulin-B31(Arg)-B32(Arg)-OH.

Ud fra pSW22-DNA konstrueres der analogt med eksempel 4 under anvendelse af den i eksempel 8 beskrevne syntetiske DNA-sekvens plasmidet pSW24.

15 B) Fremstilling af Asp^21-humaninsulin-ArgB31-ArgB32-OH ud fra humaninsul in-Arg®3 ^--Arg53 2-OH ved hydrolyse.

20 1 g Humaninsulin-ArgB31-Arg532-OH opslæmmes i 100 ml H20. Ved tilsætning af HCl indstilles pH-værdien på 2,5, og opløsningen henstilles ved 37°C. Efter l uges forløb er ca. halvdelen af materialet omsat til AspA21-humaninsul in-ArgB31-ArgB32-OH. Produktet skilles på i og for sig kendt måde fra 25 udgangsmaterialet over en anionbytter, udfældes fra eluatet og krystalliseres i en puffer, der pr. liter indeholder 10,5 g citronsyre, 1 g phenol og 5 ml af en 1%'s zinkchlorid- - opløsning, med en proteinkoncentration på 5 g/1 ved en pH-værdi på 6,0. Udbyttet andrager 390 mg AspA21-humaninsulin-30 ArgB31-ArgB32.

C) Fremstilling af en iniektionsopløsning

Insulinderivatet ifølge B) opløses med en koncentra- r- tion på 1,4 mg/ml i en steril bæreropløsning med følgende = 35 sammensætning (pr. ml): 18 mg glycerol, 10 mg benzylalkohol " og 8 0 /ig Zn2+, pH-værdi = 4,0. - 14 DK 173196 B1 D) Virkningsprofil for et AspA21-humaninsulin-ArgB3l-Arg- B32-OH-præparat hos hunde i sammenligning med humaninsulin 5 -

ArgB31-ArgB32-OH og basal-H-insulin HoechstA = et NPH-(neutral-protamin ifølge Hagedorn)-præparat med ca. 10 pg Zn2+.

10

Blodsukker i procent af begyndel-Præparat sesværdien efter timer (h) 1 h 2 h 3 h 5 h 7 h 15

Γ API

Ifølge Asp -Huraaninsulin opfind- ArgB31-ArgB32-OH 99 62 51 75 98

elsen L

Humaninsulin 2 0 ArgB31-ArgB32-0H 77 52 6H 85 98

Sammen ligning

Basal-H-Insulin

Hoechst® 71 «9 59 83 100 25

Dette eksempel viser, at AspA21-humaninsul in-ArgB31-ArgB32-OH udviser samme fordelagtige basalprofil som human-30 insulin-ArgB31-ArgB32-OH. Ydermere har AspA2*-humaninsul in-ArgB31-Arg®32-OH den fordelagtige egenskab, at forbindelsen er langtidsstabil under de valgte betingelser.

Claims

1. Insulinderivater, kendetegnet ved, at de har formlen Al S-S A21 H-Gly ----i A-Kæde ---j- R s S S I (II)

2. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige salte ifølge krav 1, kendetegnet ved, at i formlen II betyder H-Phe.

3. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige 5 salte ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R2 i formlen II betyder Gly, Ala, Ser, Thr, Asp eller Glu, især kun Asp.

4. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-3, kendete g- 10 net ved, at R30 i formlen II betyder Ala, Thr eller Ser.

5. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at R31 i formlen II betyder Arg-OH eller Arg-Arg-OH.

6. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-5, kendetegnet ved, at X i formlen II betyder Asn eller Gin.

7. Insulinderivater og deres fysiologisk tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-6, kendete g- 20 net ved, at i formlen II sekvenserne (A1-A20) og (B1-B9, B11-B29) er sekvenserne af human-, svine- eller okseinsulin, navnlig sekvenserne af humaninsulin.

8. Anvendelse af insulinderivaterne og deres fysiologisk tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-7 25 som virksomme forbindelser til farmaceutiske præparater til behandling af diabetes mellitus.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved et indhold af en virksom mængde af mindst ét insulinderivat med formlen II og/eller mindst ét af dennes fysiologisk 30 tålelige salte ifølge ét eller flere af kravene 1-7 på opløst, amorf og/eller krystallinsk form, fortrinsvis på opløst form.

10. Farmaceutisk præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved et yderligere indhold af 1 μ9 til 2 mg, 35 fortrinsvis 5 μg til 200 μ9 zink/ml. 17 DK 173196 B1

10 I s S , *2 B1° B29 30 31 R -Val--B-Kæde-X --R -R 15 i hvilken R1 betyder H eller H-Phe, R2 betyder en genetisk kodelig L-aminosyre, der ikke indeholder nogen amidgruppe, R30 betyder resten af en neutral, genetisk kodelig L-amino-20 syre, R31 betyder en fysiologisk uskadelig, organisk gruppe ^ valgt blandt amino-C2-Cg-alkoxy, C;l-C4-alkylamino-C2-Cg- ~ alkoxy, di-C;L-C4-alkylamino-C2-Cg-alkoxy, tri-C2-C4-ammonio-C2-Cg-alkoxy, amino-C2-Cg-alkylamino, (C1-C4-alkylamino)-C2-Cg-alkylamino, di-Ci-C4-alkylamino-C2-Cg-alkylamino og 25 (t ri-Cj-C4-alkylamino)-C2-Cg-alkylamino, især -0-[CH2]p- NR2, -O-[CH2]p-N®R3, -NH-[CH2]p-NR2 eller -NH-[CH2]p-N®R3, hvor p = 2-6, og R er ens eller forskellige og betyder hydrogen eller C2-C4-alkyl, eller betyder 1-3 a-aminosyrer, hvis eventuelt tilstedeværende, endestillede carboxyfunkt ion 30 kan foreligge frit, som esterfunktion, som amidfunktion, = som lacton eller reduceret til CH2OH, og X betyder en gene- l tisk kodelig L-aminosyre, og er karakteriseret ved et iso- g elektrisk punkt mellem 5 og 8,5, samt disse derivaters fy- 1 siologisk tålelige salte. 35 16 DK 173196 B1

11. Farmaceutisk præparat ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved et yderligere indhold af ikke-modificeret insulin, fortrinsvis ikke-modificeret humaninsulin. 5