CN104688677B - 一种稳定的甘精胰岛素注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种稳定的甘精胰岛素注射液及其制备方法。所述稳定的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌10～100μg/mL、间甲酚1.5～3.5mg/mL、苯酚0.7～1.7mg/mL、甘油15～20mg/mL、盐酸和/或氢氧化钠及注射用水，pH＝3.8～4.2。本发明通过优化甘精胰岛素注射液的原料组成以及制备工艺，既能够增加甘精胰岛素注射液的制剂稳定性，提高制剂质量，又无过敏反应的发生，安全性更好。

Description

一种稳定的甘精胰岛素注射液及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂学领域，具体涉及一种稳定的甘精胰岛素注射液及其制备方法。

背景技术

甘精胰岛素是长效的人胰岛素类似物，经皮下注射后能形成稳定的六聚体，增加分子间的结合力，延缓溶解和吸收的时间，持续释放少量甘精胰岛素，因此具有可预见的、长效作用的、平稳、无峰值的血药浓度/时间特性，临床用于成人和儿童I型糖尿病以及成人II型糖尿病。甘精胰岛素因其长效特性，患者仅需要每天一次在固定的时间皮下注射给药。I型糖尿病患者和口服降糖药失效的II型糖尿病患者需要终身使用胰岛素类产品控制血糖，因此在有效的前提下，保证药品的安全显得尤为重要。

甘精胰岛素在接近中性的生理条件下溶解度低，溶液出现沉淀而呈浑浊状，而在酸性环境中能够完全溶解，溶液呈无色透明状。因此，现有的甘精胰岛素注射液均以酸性、均一、澄明的溶液形式注射使用。例如，美国专利US5656722公开了一种包含甘精胰岛素、等渗剂、防腐剂、缓冲剂、锌和无菌水溶液，pH为2.5～8.5的甘精胰岛素注射液。其中等渗剂选自甘油、葡萄糖、甘露醇、氯化钠、钙盐和镁盐，防腐剂选自苯酚、间甲酚、苯甲醇和/或对羟基苯甲酸酯，缓冲剂选自乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、酸(盐酸)和碱(氢氧化钠)，锌含量为1μg-2mg/mL。其制备方法是先将处方量的辅料溶于无菌溶媒中，调节pH值至4.0，再加入甘精胰岛素，得到甘精胰岛素注射液。

中国专利CN2011100562109公开了含有一种或几种表面活性的稳定性提高的酸性胰岛素制剂，其中所述酸性胰岛素制剂pH为3.5～4.5，包含40～500U/mL甘精胰岛素、100～250mM甘油和/或甘露醇、不超过150mM的氯化钠、5μg～200μg/mL选自吐温-20和吐温-80的表面活性剂、5～250mM缓冲剂、防腐剂和无菌水溶液。其中缓冲剂选自TRIS、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、N-甘氨酰甘氨酸以及酸和碱；防腐剂选自苯酚、甲酚、氯甲酚、苯甲醇和对羟基苯甲酸酯。其制备方法是将胰岛素或胰岛素类似物先混悬在一部分注射用水中，在pH3～4下使溶解，再加入吐温等其他辅料，用盐酸或氢氧化钠将pH调至4.0，并将混合物定容至终体积。所得的甘精胰岛素注射液具有优良的稳定性。但是该方法制备得到的甘精胰岛素注射液中含有表面活性剂，在注射给药时极易引起过敏反应，尤其是长期不间断给药的情况下。

因此，有必要对现有技术进行改进，获得稳定性提高，并且安全好的甘精胰岛素注射液。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种稳定性高且安全性好的甘精胰岛素注射液及其制备方法。本发明通过优化甘精胰岛素注射液的组方和制备工艺，提高制剂的稳定性，降低过敏反应的发生，达到提高甘精胰岛素注射液质量、保证患者用药安全的目的。

为了实现上述技术效果，本发明采用如下的技术方案：

一种稳定的甘精胰岛素注射液，所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌10～100μg/mL、间甲酚1.5～3.5mg/mL、苯酚0.7～1.7mg/mL、甘油15～20mg/mL、盐酸和/或氢氧化钠及注射用水，pH＝3.8～4.2。

优选的，所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚1.6mg/mL、苯酚1.2mg/mL、甘油16mg/mL，盐酸和/或氢氧化钠及注射用水，pH＝3.9～4.1。

还优选的，所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚2.0mg/mL、苯酚0.9mg/mL、甘油17mg/mL，盐酸和/或氢氧化钠及注射用水，pH＝3.9～4.1。

本发明的另一个目的，在于提供上述稳定的甘精胰岛素注射液的制备方法。所述制备方法包括如下的操作：

甘油、间甲酚、苯酚、氯化锌先用注射用水溶解，再用0.1mol/L的盐酸调节pH＝3.5～4.0，加入甘精胰岛素，搅拌使溶液澄清；用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH＝3.8～4.2，用注射用水定容至终体积，即得。

本发明还有一个目的，在于提供上述稳定的甘精胰岛素注射液的更优选的制备方法。所述制备方法包括如下的步骤：

(1)甘油用部分注射用水溶解，配制成甘油溶液；

(2)所述甘油溶液分为四份，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，混合均匀，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油溶液和氯化锌-甘油溶液；

(3)所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；

(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入盐酸溶液至pH＝3.0～3.5且溶液澄清；

(5)向步骤4中得到的溶液中加入所述氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；

(6)搅拌下，向步骤5中得到的溶液中加入氢氧化钠溶液至pH＝3.8～4.2；

(7)用注射用水定容至终体积。

优选的，所述步骤1中，注射用水的用量占所述甘精胰岛素注射液总体积的60％～80％。

优选的，所述步骤2中，用于制备所述甘精胰岛素-甘油溶液的甘油溶液不少于所述甘油溶液总体积的30％；用于制备所述间甲酚-甘油溶液的甘油溶液不少于所述甘油溶液总体积的50％；用于制备所述苯酚-甘油溶液的甘油溶液不多于所述甘油溶液总体积的10％；剩余的甘油溶液用于制备所述氯化锌-甘油溶液。

更优选的，所述步骤2中，用于制备所述甘精胰岛素-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的30％～40％。

更优选的，所述步骤2中，用于制备所述间甲酚-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的50％～60％。

更优选的，所述步骤2中，用于制备所述氯化锌-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的5％～10％。

最优选的，所述步骤2中，所述甘油溶液按照体积比3～4:5～6:0.5～1:0.5～1分为四份(四份甘油溶液的体积百分比之和为100％)，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，混合均匀，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油溶液和氯化锌-甘油溶液。

优选的，所述步骤4中，所述盐酸溶液的浓度为0.1mol/L。

还优选的，所述步骤4中，调节pH＝3.1～3.2。

优选的，所述步骤6中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。

还优选的，所述步骤6中，调节pH＝3.9～4.1。

作为一个优选的实施方式，本发明提供一种稳定的甘精胰岛素注射液的制备方法。所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌10～100μg/mL、间甲酚1.5～3.5mg/mL、苯酚0.7～1.7mg/mL、甘油15～20mg/mL、以及盐酸和氢氧化钠，pH＝3.9～4.1；所述制备方法的具体操作步骤包括：

(1)甘油用占所述甘精胰岛素注射液总体积60％～80％的注射用水溶解，配制成甘油溶液；

(2)所述甘油溶液按照体积比3～4:5～6:0.5～1:0.5～1分为四份(四份甘油溶液的体积百分比之和为100％)，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，混合均匀，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油溶液和氯化锌-甘油溶液；

(3)所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；

(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入0.1mol/L盐酸溶液至pH＝3.1～3.2且溶液澄清；

(5)向步骤4中得到的溶液中加入所述氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；

(6)搅拌下，向步骤5中得到的溶液中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液至pH＝3.9～4.1；

(7)用注射用水定容至终体积。

本发明所述制备方法，还包括过滤除菌。

本发明提供的甘精胰岛素注射液，原料中的防腐剂由间甲酚和苯酚组成。当采用现有技术的制备方法时(实施例1-3)，与采用单防腐剂的现有技术产品相比，稳定性有所提高，但不及含有表面活性剂的甘精胰岛素注射液(对比例2)。本发明的甘精胰岛素注射液处方采用优化后的制备工艺进行制备时，稳定性与对比例2相当；在加速稳定性试验中，第10天和第0天制剂的效价、高分子蛋白含量、总相关物质含量和最大相关物质含量都没有发生明显变化。说明制备方法的优化能够提高甘精胰岛素注射液的稳定性。在安全性方面，通过动物致敏试验发现本发明优化后的甘精胰岛素注射液与对比例2相比，安全性更好。

因此，本发明通过优选处方和制备方法，有效地提高了甘精胰岛素注射液的稳定性，降低了过敏反应的发生，在保证制剂安全有效的基础上，达到了提高产品质量、保证患者用药安全的目的。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

制备方法1：取1L烧杯，加入转子，置于磁力搅拌器上，加入甘油、间甲酚和/或苯酚、氯化锌和900mL注射用水，调节转速为200～400转/分钟，搅拌使溶液澄清；用0.1mol/L的盐酸调节pH＝4；加入甘精胰岛素，搅拌使溶液澄清；用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH＝4，用注射用水定容至1L，过滤除菌即得。

制备方法2(本发明提供的优选的制备方法)：(1)取1L烧杯，加入转子，置于磁力搅拌器上，加入甘油和600mL注射用水，调节转速为200～400转/分钟，搅拌使甘油溶解配制成甘油溶液；(2)步骤1得到的所述甘油溶液分为180mL、300mL、60mL和60mL四份(体积比3:5:1:1)，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，搅拌，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油注射液和氯化锌-甘油溶液；(3)步骤2得到的所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入0.1mol/L的盐酸溶液至pH＝3.0～3.1，使甘精胰岛素迅速溶解，溶液澄清；(5)再加入氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；(6)用注射用水定容至900mL，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH＝4.0；(7)用注射用水定容至1L，过滤除菌，即得。

制备方法3(本发明提供的优选的制备方法)：(1)取1L烧杯，加入转子，置于磁力搅拌器上，加入甘油和600mL注射用水，调节转速为200～400转/分钟，搅拌使甘油溶解配制成甘油溶液；(2)步骤1得到的所述甘油溶液分为180mL、360mL、30mL和30mL四份(体积比3:6:0.5:0.5)，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，搅拌，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油注射液和氯化锌-甘油溶液；(3)步骤2得到的所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入0.1mol/L的盐酸溶液至pH＝3.1～3.2，使甘精胰岛素迅速溶解，溶液澄清；(5)再加入氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；(6)用注射用水定容至900mL，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH＝3.8；(7)用注射用水定容至1L，过滤除菌，即得。

制备方法4(本发明提供的优选的制备方法)：(1)取1L烧杯，加入转子，置于磁力搅拌器上，加入甘油和600mL注射用水，调节转速为200～400转/分钟，搅拌使甘油溶解配制成甘油溶液；(2)步骤1得到的所述甘油溶液分为240mL、300mL、30mL和30mL四份(体积比4:5:0.5:0.5)，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，搅拌，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油注射液和氯化锌-甘油溶液；(3)步骤2得到的所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入0.1mol/L的盐酸溶液至pH＝3.4～3.5，使甘精胰岛素迅速溶解，溶液澄清；(5)再加入氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；(6)用注射用水定容至900mL，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH＝4.2；(7)用注射用水定容至1L，过滤除菌，即得。

制备方法5(现有技术)：取1L烧杯，加入转子，置于磁力搅拌器上，加入甘精胰岛素和900mL注射用水，调节转速为200～400转/分钟；用0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4，搅拌使溶液澄清；加入甘油、间甲酚、氯化锌，搅拌使溶液澄清；用注射用水定容至1L，过滤除菌即得。

上述制备方法中，各步搅拌时，转子的转速在200～400转/分钟范围内调节转速，以既可以搅拌均匀、产生的泡沫又可以接受为度。

上述制备方法中，制备方法1源自美国专利US5656722记载的制备方法，制备方法5源自中国专利CN2011100562109记载的制备方法。

实施例1 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚1.6mg/mL、苯酚1.2mg/mL、甘油16mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备方法1进行制备。

实施例2 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚2.0mg/mL、苯酚0.9mg/mL、甘油17mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备方法1进行制备。

实施例3 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌50μg/mL、间甲酚3.0mg/mL、苯酚0.7mg/mL、甘油20mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备方法1进行制备。

实施例4 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚1.6mg/mL、苯酚1.2mg/mL、甘油16mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备2进行制备。

实施例5 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚2.0mg/mL、苯酚0.9mg/mL、甘油17mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备方法3进行制备。

实施例6 一种稳定的甘精胰岛素注射液

本实施所述甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌50μg/mL、间甲酚3.0mg/mL、苯酚0.7mg/mL、甘油20mg/mL、盐酸、氢氧化钠及注射用水，pH＝4；通过制备方法4进行制备。

对比例1 一种甘精胰岛素注射液

本对比例的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL，甘油17mg/mL、间甲酚2.7mg/mL、锌30μg/mL，pH为4；通过制备方法1进行制备。

对比例2 一种甘精胰岛素注射液

本对比例的甘精胰岛素注射液含有100IU/mL甘精胰岛素，17mg/mL甘油、2.7mg/mL间甲酚、30μg/mL锌、20μg/mL吐温20，pH为4；通过制备方法5进行制备。

试验例1 不同甘精胰岛素注射液稳定性考察

实施例1-6，对比例1-2制得的甘精胰岛素注射液在相同条件下进行高温稳定性研究。

高温稳定性研究方法：

实施例1-6和对比例1-2制备的甘精胰岛素注射液，每10mL分别装入玻璃小瓶中，并压盖密封。八种注射液分别随机取10个样品置于40℃的稳定性试验箱中，分别于第0、5、10天取样，检测效价、高分子蛋白、总相关物质、最大相关物质，记录结果并进行比较。

检测方法：

效价、总相关物质和最大相关物质采用高效液相色谱法检测；高分子蛋白采用分子排阻色谱法检测；具体检测方法参见2010版《中国药典》附录。

高效液相色谱法检测总相关物质和最大相关物质的具体操作如下：

色谱条件：Waters高效液相色谱仪，Kromasil C4柱(柱长＝150mm，直径4.6mm；100A-3.5um)，流动相为磷酸盐缓冲液-乙腈体系，流速为每分钟1.0ml，柱温为35℃，检测波长为214nm。

流动相具体配制方法如下：

磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠20.7g，加水800ml溶解，再用85％磷酸调节pH值至2.5，加水至1L，过滤；

流动相A(25％乙腈)：取氯化钠18.4g，加上述磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈250ml，混匀后，用水稀释至1000mL，0.45μm滤膜过滤；

流动相B(65％乙腈)：取氯化钠3.2g，加上述磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈650ml，混匀后，用水稀释至1000mL，0.45μm滤膜过滤。

按下表进行梯度洗脱：

供试品的配制：精密量取5mL甘精胰岛素注射剂样品，按每1ml加9.6mol/L盐酸溶液3μl，混匀，作为供试品溶液。

测定法：精密量取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，扣除间甲酚和苯酚峰，按峰面积归一化法计算，即得总相关物质和最大相关物质含量。

分子排阻色谱法检测高分子蛋白的具体操作如下：

色谱条件：Warters高效液相色谱仪，Waters Insulin HMWP柱,流动相为冰醋酸-乙腈-水混合溶液(取冰醋酸200ml，加乙腈300ml，加水400ml，混匀后，用25％氨溶液调节pH值至3.0，加水至1000ml)，流速为每分钟0.5ml；检测波长为276nm。

供试品的配制：精密量取甘精胰岛素注射剂样品2ml，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至5ml。

测定法：取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，保留时间小于甘精胰岛素主峰的所有峰面积之和按峰面积归一化法计算，即得高分子蛋白含量

试验结果：

实施例1-6制得的甘精胰岛素注射液与对比例1-2制备的甘精胰岛素注射液，效价、高分子蛋白含量、总相关物质含量和最大相关物质含量，第0、5、10天的测定结果分别见表1、表2和表3。

表1 高温稳定性试验第0天的测定结果

表2 高温稳定性试验第5天的测定结果

表3 高温稳定性试验第10天的测定结果

实施例1-6和对比例1-2的注射液的pH值相同，但在处方组成和/或制备方法上有差异。具体而言：实施例1-6的甘精胰岛素注射液的处方为本发明提供的稳定的甘精胰岛素注射液的处方，其中实施例1和4、实施例2和5，实施例3和6的处方相同。而实施例1-3采用了传统的制备方法，实施例4-6则采用了本发明优选的制备方法。对比例1和2的处方中没有苯酚，且采用了现有技术进行制备；另外，对比例2还有表面活性剂吐温20。

从表1-表3的试验结果，可以看出：

(1)高温试验第0天的稳定性数据显示，各实施例和对比例之间效价、高分子蛋白和相关物质均无显著差异(P>0.05)。

(2)在高温试验第5、10天，实施例1-3三者之间相比，效价、高分子蛋白和相关物质均无显著差异(P>0.05)，三者稳定性相当；实施例4-6三者之间相比，效价、高分子蛋白和相关物质均无显著差异(P>0.05)，三者稳定性相当。

(3)第5天和第10天的稳定性数据显示，实施例1-6与对比例1相比具有明显优势。表现为：实施例1-6的效价显著高于对比例1(P<0.05)，而高分子蛋白和相关物质含量均显著低于对比例1(P<0.05)。说明本发明通过优化甘精胰岛素的处方组成，无论是否改进制备方法，都能够提高制剂的稳定性。

(4)第5天和第10天的稳定性数据显示，实施例4-6较实施例1-3更有优势。表现为：实施例1-3和实施例4-6的效价、高分子蛋白和总相关物质含量没有显著差异(P＞0.05)，但是实施例4-6的效价更高，且杂质含量更低。说明实施例4-6的制备方法对于提高甘精胰岛素注射液的稳定性，效果更好。

(5)实施例1-3与对比例2相比，第5天和第10天的效价和高分子蛋白无显著差异(P>0.05)，但实施例1-3的总相关物质和最大相关物质含量明显高于对比例2(P<0.05)。说明实施例1-3的稳定性略逊于对比例2。实施例4-6与对比例2相比，在各个检测时间点的效价、高分子蛋白和相关物质均无显著差异(P>0.05)，稳定性非劣于对比例2。

基于上述数据分析，可以得出如下结论：

实施例1-6和对比例1-2中，以含有表面活性剂的对比例2的甘精胰岛素注射液稳定性最好，优化处方和制备方法得到的实施例4-6的注射液稳定性与对比例2相当，其次是的优化处方的实施例1-3的注射液，最后是对比例1。

因此，本发明通过优化甘精胰岛素注射液的处方，不使用容易致敏的表面活性剂，就能够提高产品的稳定性；再结合制备方法的优化，进一步减缓了活性成分甘精胰岛素效价的降低，显著降低了降解产物高分子蛋白、相关物质的产生速率。从而更好地解决甘精胰岛素注射液稳定性问题。

试验例2 甘精胰岛素注射液的安全性考察

受试药物：

(1)实施例4制得的甘精胰岛素注射液(以下简称“实施例4”)

(2)对比例2制备的甘精胰岛素注射液(以下简称“对比例2”)

(3)牛血清蛋白：阳性对照

(4)0.9％氯化钠注射液：阴性对照

豚鼠致敏试验研究方法：

试验动物：选择4-5周龄，体重304-370g的Hartley豚鼠(雌雄各半)，随机分为4组，分别为实施例4组、对比例2组、阳性对照组和阴性对照组，每组6只。

给药途径及剂量：致敏给药为腹腔注射，连续给药7天，末次致敏后14天进行激发给药，给药方式为静脉注射。实施例4和对比例2致敏量均为1.34U/kg，激发量均为1.34U/kg；牛血清蛋白致敏量为5mg/只，激发量为10mg/只。

过敏反应症状和全身致敏性评价指标见表4和表5：

表4 过敏反应症状

0正常	5喷嚏	10流泪	15跳跃	20死亡
					1躁动	6咳嗽	11呼吸困难	16喘息
2竖毛	7呼吸急促	12哮鸣音	17痉挛
					3颤抖	8排尿	13紫癜	18旋转
4搔鼻	9排粪	14步态不稳	19潮式呼吸

表5 全身致敏性评价标准

0	-	过敏反应阴性
			1-4症状	+	过敏反应弱阳性
5-10症状	++	过敏反应阳性
			11-19症状	+++	过敏反应强阳性
20症状	++++	过敏反应极强阳性

观察指标：一般观察、体重测定和过敏反应症状观察。

试验结果如下：

一般观察：检疫期和致敏期间各组豚鼠的外观、行为、分泌物和排泄物等均未见异常。

体重测定：给药后各时间点各组豚鼠体重均呈增长趋势，经统计学分析，各时间点各剂量组豚鼠体重与阳性对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，给药前后豚鼠体重结果见表6。

表6 各组豚鼠给药前后体重结果(单位g)

过敏反应症状观察：激发给药后12分钟阳性对照组动物出现过敏反应症状，表现为自主活动降低，搔鼻，呼吸急促，咳嗽，多次排粪，喷嚏，竖毛，步态不稳，趴卧，呼吸困难等过敏反应症状。对比例2组有3只动物出现不同程度的过敏症状。实施例4组的所有动物都没有出现过敏现象。具体结果见表7。

表7 各组过敏反应症状

由表7的结果可知，相比较对比例2，本发明实施例4组的过敏反应更轻微，安全性更好。

总之，本发明提供的甘精胰岛素注射液，通过优化处方组成(防腐剂由间甲酚和苯酚构成的复合防腐剂)，稳定性显著优于仅采用单防腐剂的现有技术的注射液；同时结合制备方法的优化，得到的制剂的稳定性与含有表面活性剂吐温20的现有技术产品相当。由于没有表面活性剂，本发明的甘精胰岛素注射液的安全性更好。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (14)

1.一种甘精胰岛素注射液的制备方法，其特征在于，所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌10～100μg/mL、间甲酚1.5～3.5mg/mL、苯酚0.7～1.7mg/mL、甘油15～20mg/mL、盐酸和/或氢氧化钠及注射用水，pH＝3.8～4.2；所述制备方法的步骤为：

(1)甘油用部分注射用水溶解，配制成甘油溶液；

(2)所述甘油溶液分为四份，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，混合均匀，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油溶液和氯化锌-甘油溶液；用于制备所述甘精胰岛素-甘油溶液的甘油溶液不少于所述甘油溶液总体积的30％；用于制备所述间甲酚-甘油溶液的甘油溶液不少于所述甘油溶液总体积的50％；用于制备所述苯酚-甘油溶液的甘油溶液不多于所述甘油溶液总体积的10％；剩余的甘油溶液用于制备所述氯化锌-甘油溶液；

(3)所述甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液与苯酚-甘油溶液混合，搅拌均匀，得到混合溶液I；

(4)搅拌下，向所述混合溶液I中加入盐酸溶液至pH＝3.0～3.5且溶液澄清；

(5)向步骤4中得到的溶液中加入所述氯化锌-甘油溶液，搅拌均匀；

(6)搅拌下，向步骤5中得到的溶液中加入氢氧化钠溶液至pH＝3.8～4.2；

(7)用注射用水定容至终体积。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚1.6mg/mL、苯酚1.2mg/mL、甘油16mg/mL，pH＝3.9～4.1；或

所述的甘精胰岛素注射液含有甘精胰岛素100IU/mL、锌30μg/mL、间甲酚2.0mg/mL、苯酚0.9mg/mL、甘油17mg/mL，pH＝3.9～4.1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，注射用水的用量占所述甘精胰岛素注射液总体积的60％～80％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，用于制备所述甘精胰岛素-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的30％～40％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，用于制备所述间甲酚-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的50％～60％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，用于制备所述氯化锌-甘油溶液的甘油溶液占所述甘油溶液总体积的5％～10％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述甘油溶液按照体积比3～4:5～6:0.5～1:0.5～1分为四份，分别加入甘精胰岛素、间甲酚、苯酚和氯化锌，混合均匀，得到甘精胰岛素-甘油溶液、间甲酚-甘油溶液、苯酚-甘油溶液和氯化锌-甘油溶液。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述盐酸溶液的浓度为0.1mol/L。

9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，调节pH＝3.1～3.2。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。

11.根据权利要求1或10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，调节pH＝4.0。

12.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或10中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括定容后过滤除菌。

13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括定容后过滤除菌。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，还包括定容后过滤除菌。