DE69015811T2

DE69015811T2 - Insulinverbindungen.

Info

Publication number: DE69015811T2
Application number: DE69015811T
Authority: DE
Inventors: Per Balschmidt; Finn Hansen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2010-03-16
Also published as: AU637365B2; DE69015811D1; HU902706D0; KR920701250A; ES2068384T3; IE901004L; IL93792A0; US5430016A; YU53290A; JPH04503808A; IE66564B1; NZ232953A; DK134189D0; AU5344890A; WO1990011299A1; EP0463072A1; DK0463072T3; PT93502A; GR1002545B; NO913687L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Insulinverbindungen, ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulinverbindungen und therapeutische Zubereitungen, die verzögerte Wirkung zeigen und wenigstens eine der neuartigen Insulinverbindungen und, falls gewünscht, ein schnellwirkendes Insulin umfassen.
Seit der Entdeckung von Insulin im Jahre 1922 sind viele verschiedene Arten von Insulinzubereitungen für die Behandlung von Diabetes mellitus eingesetzt worden. Zu Beginn wurden ausschließlich Insulinlösungen verwendet, die eine schnell einsetzende und relativ schnell nachlassende Insulinaktivität zeigten, aber später wurden Insulinzubereitungen entwickelt, die ein breiteres Aktivitätsprofil zeigten, durch Senkung der Löslichkeit von Insulin mit Hilfe von Zusätzen von z. B. Zinksalz und/oder Protaminen. Wegen der Verfügbarkeit ist das hierfür verwendete Insulin traditionell normalerweise aus der Bauchspeicheldrüse von Haustieren extrahiert worden, am häutigsten Ochsen, Schweinen und Schafen. Vor kurzem sind jedoch auch Zubereitungen auf dem Markt aufgetaucht, die Humaninsulin biotechnologischer Herkunft enthalten.
Die Struktur von Humaninsulin ist in Formel I dargestellt.
Die Insuline von bestimmten Haustieren sind in ihrer Struktur sehr ähnlich zu Humaninsulin. Hunde- und Schweineinsulin unterscheiden sich von Humaninsulin nur dadurch, daß sie Ala statt Thr in Position 30 in der B-Kette enthalten, und Kanincheninsulin nur dadurch, daß es Ser in derselben Position enthält. Diese Insuline können durch Ersatz des B30-Aminosäurerestes durch Thr mit semisynthetischen Verfahren in Humaninsulin überführt werden, wie beschrieben z. B. von Morihara et al, Nature 280 (1979), 412-13 und Marcussen (US-Patent No. 4,343,898).
Zubereitungen, die Insulinlösung enthalten, sind üblicherweise schnellwirkend, wobei die Insulinaktivität einige Stunden nach Injektion nachläßt. Es ist daher notwendig, häufige Injektionen zu verabreichen, normalerweise mehrmals am Tag, um den Blutzuckerspiegel im Diabetiker zu normalisieren.
Um diesen Nachteil zu überwinden, sind Insulinzubereitungen mit verzögerter Wirkung formuliert worden, so daß Insulinaktivität für mehrere Stunden gehalten wird, sogar bis zu 24 Stunden oder noch länger. Unter Verwendung solcher verzögerten Zubereitungen müssen Diabetes-Patienten nur eine kleine Anzahl täglicher Injektionen erhalten, z. B. ein oder zwei Injektionen in 24 Stunden.
Solch eine verzögerte Wirkung kann erreicht werden, indem das Insulin in ein schwerlösliches Salz überführt wird, wie etwa Zink-Insulin oder Protamin-Insulin. Die schwerlöslichen Insulinsalze werden in der Form von Suspensionen verwendet, aus denen das Insulin nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion allmählich freigesetzt wird.
Vor Kurzem sind andere Verfahren eingeführt worden, um eine verzögerte Wirkung zu erreichen. Ein Beispiel hierfür ist die Einkapselung von Insulinkristallen in polymerisiertes Serumalbumin. Ein anderes Beispiel sind kontinuierlich wirkende Infusionseinheiten, sogenannte Insulin-Pumpen, die jedoch unbequem sein und ein Risiko für den Patienten mit sich bringen können.
Die Beschreibungen der Europäischen Patentanmeldungen EP 132770, EP 132769 und EP 135720 offenbaren die Herstellung und Verwendung von Insulin-Derivaten, in denen der C-Terminus der B-Kette mit einer organischen Gruppe verlängert ist, die wenigstens eine positive Ladung trägt, vorzugsweise Arg-OH oder Arg-Arg-OH. Zubereitungen, die Suspensionen solcher Insulin-Derivate enthalten, zeigen verzögerte Wirkung. Diese Insulinverbindungen sind jedoch zur Formulierung neuartiger brauchbarer verzögerter Insulin-Zubereitungen nicht gut geeignet, weil der Verzögerungsgrad sich als sehr begrenzt erwiesen hat (J. Markussen et al.: Protein Engineering 1, 205-213 (1987)).
Die Eigenschaften von Insulin-Derivaten in denen der N-Terminus der B-Kette mit dem Dipeptid Arg-Arg verlängert ist, sind beschrieben worden von R. Geiger & F. Enzmann in: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima 1978; Excerpta, Medica, Amsterdam 1979, S. 306-310. Die Löslichkeit dieser Insulinverbindung um ihren isoelektrischen Punkt herum erwies sich als sogar noch höher als diejenige von normalem Insulin.
Substitutionen im Insulin-Molekül können mit dem Zweck eingeführt werden, das Aktivitätsprofil des Insulins bei der Behandlung von Diabetes zu verbessern. So offenbart die europäische Patentanmeldung EP 194864, daß eine oder mehrere Substitutionen von Glu durch z. B. Gln und/oder Substitution von ThrB27 durch Arg, kombiniert mit einer Blockierung der C-terminalen Carboxylgruppe in der Form von Ester oder Amid, eine Verschiebung der Ausfällungszone des Insulins in der Art bewirkt, daß eine langsame Freisetzung nach Injektion erreicht wird.
Die Verwendung dieser Art von Insulinverbindungen, die interne Aminosäuresubstitutionen enthalten, in Zubereitungen für die lebenslange Behandlung von Diabetes bringt ein beträchtliches Risiko mit sich, das Immunsystem des Patienten zu aktivieren, was das Auftreten von Insulin-Antikörpern im Blut bewirkt.
In den letzten paar Jahren sind mehrere Versuche unternommen worden, Substitutionen für die traditionellen Insulin-Zubereitungen mit verzögerter Insulinwirkung zu finden. Die Gründe hierfür sind, daß Diabetologen festgestellt haben, daß die traditionellen verzögerten Insulinzubereitungen zu kurz wirkend sind, insbesondere nach der Einführung des Humaninsulins, und daß die Einführung des sogenannten Insulin-Stiftes nach einem gelösten, verzögert wirkenden Insulin verlangt hat.
ArgA0-Humaninsulin ist in der europäischen Patentveröffentlichung EP 195691 als ein unerwünschtes Nebenprodukt bei der Umwandlung eines Insulin-Vorläufers zu Humaninsulin beschrieben. Das ArgA0-Humaninsulin wurde identifiziert, aber nicht auf irgendeine Insulinwirkung getestet.
ArgA0-desThrB30-Humaninsulin ist in der Europäischen Patentveröffentlichung EP 376156 offenbart, die vor der vorliegenden Anmeldung eingereicht worden ist, als ein Zwischenprodukt für die Herstellung von ArgA0-Humaninsulin mit verzögerter Wirkung und geeignet zur Behandlung von Diabetes mellitus. EP 376156 schweigt sich jedoch im Hinblick auf B30-Amide oder Niederalkoxyester oder Substitutionen in den A4-, A17-, A21-, B13-, B21- oder B27-Positionen von Humaninsulin aus.
Die Aufgabe der Erfindung ist, neuartige Insulin-Analoga bereitzustellen, die eine verzögerte Insulinwirkung zeigen und die so wenig Antigenizität wie möglich zeigen.
Es ist nunmehr überraschenderweise festgestellt worden, daß Insulinverbindungen mit der allgemeinen Formel II
worin
E einzeln Glu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann, N einen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann,
T Thr oder Arg darstellt,
X Thr, Ser, Ala oder OH darstellt und
Y OR oder NR¹R² darstellt, worin R, R¹ und R² einzeln Wasserstoff oder Niederalkyl darstellen, aber nicht vorhanden ist, wenn X OH darstellt, wobei wenigstens eines der Symbole E, N und T einen von dem entsprechenden Rest von Humaninsulin verschiedenen Aminosäurerest darstellt, wenn Y OH darstellt, und wobei wenigstens eines der Symbole E in Position A4, E in Position B13, N in Position A21 und T in Position B27 Gln, Gln, Asp oder Ser bzw. Arg darstellt, wenn X OH darstellt, eine wünschenswert verzögerte Insulinwirkung und/oder Antigenizität zeigen.
Demgemäß betrifft die Erfindung Insulinverbindungen mit der allgemeinen Formel II:
worin E einzeln Glu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann, N einen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann,
T Thr oder Arg darstellt,
X Thr, Ser, Ala oder CH darstellt und
Y OR und NR¹R² darstellt, worin R, R¹ und R² einzeln Wasserstoff oder Niederalkyl darstellen, aber nicht vorhanden ist, wenn X OH darstellt, wobei wenigstens eines der Symbole E, N und T einen von dem entsprechenden Rest von Humaninsulin verschiedenen Aminosäurerest darstellt, wenn Y OH darstellt, und wobei wenigstens eines der Symbole E in Position A4, E in Position B13, N in Position A21 und T in Position B27 Gln, Gln, Asp oder Ser bzw. Arg darstellt, wenn X OH darstellt.
Im vorliegenden Zusammenhang ist beabsichtigt, daß "Niederalkyl" unverzweigte oder verzweigte Alkygruppen mit 1-6 Kohlenstoffatom umfaßt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin jedes E einzeln Glu oder Gln darstellt, N Asn, Asp, Ser oder Gly darstellt, T Thr oder Arg darstellt, X Thr darstellt und Y NH&sub2; darstellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin alle E Glu darstellen, N Asn darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin E alle Glu darstellen, N Ser darstellt, R und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin E in Position B13 Gln darstellt und die restlichen E alle Glu darstellen, N Asn darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin E in Position A4 Gln darstellt und die restlichen E alle Glu darstellen, N Asp darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere Insulinverbindungen der Formel II, worin E alle Glu darstellen, N Asn darstellt, T Arg darstellt und X OH darstellt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Insulinverbindungen der Formel II, durch das ein Insulinvorläufer der allgemeinen Formel III
worin E, N und T alle dieselbe Bedeutung haben, wie oben angegeben, (AA)n eine Peptidkette mit n Aminosäureresten mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt oder eine Peptidbindung ist, wenn n = 0, und z Wasserstoff oder eine Peptidkette beliebiger Länge mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt, einer Transpeptidation unterzogen oder durch eine Endopeptidase mit ausschließlicher Spezifizität für die Spaltung auf Carboxy-Seite eines Lysinrestes gespalten wird.
Die Erfindung betrifft auch Insulinzubereitungen, die wenigstens eine Insulinverbindung der Formel II und fakultativ auch ein schnellwirkendes Insulin, wie Humaninsulin, Haustier-Insulin oder Derivate oder Analoga derselben, umfassen. Solche Zubereitungen können in der Form einer gebrauchsfertigen Lösung oder einer unter Verwendung von z. B. sterilisiertem Wasser vor Gebrauch zu rekonstituierenden lyophilisierten Zubereitung vorliegen.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Insulinzubereitung der Erfindung ist eine Zubereitung zur parenteralen Verabreichung, die verzögerte Insulinwirkung zeigt und eine Lösung von wenigstens einer Insulinverbindung der Erfindung in einem wässrigen Medium umfaßt, das isoosmotisch mit Blutserum ist, einen pH zwischen 2 und 5,5 besitzt und fakultativ einen Puffer und/oder ein Konservierungsmittel und, falls erwünscht, ein schnellwirkendes Insulin enthält.
Die Insulinverbindungen der Erfindung erfüllen die Bedürfnisse der Diabetologen durch minimale Veränderungen im Humaninsulin- Molekül, die jede für sich entweder für den menschlichen Körper vertraut oder über mehrere Jahre getestet sind und sich auf diese Weise nicht als Auslöser einer Immunreaktion erwiesen haben. Das Hauptmerkmal der Insulinverbindungen der Erfindung ist, daß sie als Humaninsulin beschrieben werden können, in dem ein Argininrest an den N-Terminus und die A-Kette gebunden worden ist und in dem die C-terminale Carboxylgruppe der B-Kette vorzugsweise in der Form des Amids blockiert worden ist. Die Insulinverbindungen sind dazu gedacht, in einer schwach sauren Lösung gelöst verwendet zu werden, und unter diesen Bedingungen kann beträchtliche Desamidierung des Asparaginrestes in Position A21 innerhalb der Lagerzeit der Zubereitung auftreten und somit der verlängerten Wirkung entgegenwirken. Durch Einführung einer Substitution von einen oder möglicherweise zwei der Glutaminsäurereste durch Glutamin kann dieser Effekt gesteuert werden.
Im Falle von insulinabhängigem Diabetes besteht eine häufig verwendete Therapie in zwei täglichen Injektionen einer verzögerten Insulinzubereitung, eine am Morgen und eine am Abend unmittelbar vor dem Schlafengehen, um einen Basis-Insulinspiegel zu schaffen. Zusätzlich werden drei Injektionen einer schnellwirkenden Insulinzubereitung vor den Hauptmahlzeiten gegeben. Der Nachteil dieser Therapie ist, daß die späte Injektion der verzögerten Zubereitung zu einem gefährlich niedrigen Blutzuckerspiegel im Verlaufe der Nacht führen kann. Dies kann vermieden werden, indem eine Mischzubereitung aus einem verzögerten und einem schnellwirkenden Insulin vor dem Abendessen injiziert wird, wodurch Hyperglykämie, wenn überhaupt, während des Abends auftreten wird, wo sie mittels z. B. eines leichten Imbisses abgewendet werden kann. Diese Art der Therapie führt jedoch of zu Hyperglykämie am Morgen, da die am häufigsten verwendeten verzögerten Insulinzubereitungen "Insulatard" und "Monotard" nicht über eine ausreichend lange Zeit wirken. Es besteht daher ein Bedürfnis, Diabetes-Patienten Insulinzubereitungen zur Verfügung zu stellen, die länger wirken als die üblicherweise gebräuchlichen Zubereitungen, insbesondere wenn eine Injektion solch einer Zubereitung für einen oder sogar mehrere Tage ausreichen wird. Insulinzubereitungen, die gemäß der Erfindung hergestellt sind, zeigen eine verzögerte Insulinwirkung längerer Dauer als diejenige der üblicherweise verwendeten verzögerten Insulinzubereitung "Monotard" .
Die bevorzugten Insulinverbindungen der Erfindungen sind besonders vorteilhaft zur Verwendung in Lösungszubereitungen, weil die Löslichkeit hoch ist, sogar um pH 5 (wobei bei diesem pH die Desamidierung beträchtlich abgesenkt ist), und zeigt noch ausgeprägte verzögerte Wirkung nach subkutaner Injektion.
Die Erfindung betrifft insbesondere die folgenden spezifischen Verbindungen:
[ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid)
[ArgA0, GlnB13]-Humaninsulin-(B30-Amid)
[ArgA0, GlnA4, AspA21]-Humaninsulin-(B30-Amid)
[ArgA0, SerA21]-Humaninsulin-(B30-Amid)
[ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-Humaninsulin
Die Insulinverbindungen der Erfindung können aus anderen Insulinen hergestellt werden, indem der zusätzliche Argininrest am N-Terminus der A-Kette des Insulinmoleküls durch chemische Synthese eingeführt sind, aber nur mit großen Schwierigkeiten. Ein weit attraktiverer Weg ist die enzymatisch katalysierte Umwandlung eines einkettigen Vorläufers, z. B. eines natürlich auftretenden Proinsulins oder Präproinsulins oder eines biosynthetisch hergestellten Vorläufers der allgemeinen Formel III:
worin
E, N und T alle dieselbe Bedeutung besitzen, wie unter Formel II angegeben (AA)n eine Peptidkette mit n Aminosäureresten und mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt, aber eine Peptidbindung ist, wenn n = 0, und Z Wasserstoff oder eine Peptidkette beliebiger Länge mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt.
Das für die enzymatische Umwandlung verwendete Enzym sollte eine trypsinähnliche Endopeptidase sein, die in der Lage ist, eine Peptidkette auf der Carboxyseite eines Lysinrestes zu spalten. Trypsin selbst kann oft verwendet werden, aber eine Endopeptidase, die Lysin-Spezifizität zeigt, z. B. Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter-Enzymogenen (Boehringer Mannheim) or Lysyl-Endopeptidase aus Achromobacter lyticus (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ist besonders vorteilhaft.
Die Reaktion kann als eine Transpeptidation unter Verwendung von Threoninamid unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, wie in z. B. der Europäischen Patentveröffentlichung EP 163529 beschrieben, und führt so direkt zum B30-Amid, kann aber auch als eine zweistufige Reaktion durchgeführt werden, die mit einer enzymatischen Spaltung beginnt, die zur des(ThrB30)-Verbindung führt, die in das B30-Amid durch eine Kopplungsreaktion überführt werden kann, wie beschrieben bei Morihara et al., aaO..
Die Vorläufer der Insulinverbindungen der Erfindung können biosynthetisch in einem Hefewirt hergestellt werden, der eine DNA-Sequenz exprimiert, die den Vorläufer kodiert.
Um Sekretion in das Wachstumsmedium zu erreichen, kann die DNA-Sequenz, die den Insulinvorläufer kodiert, an eine andere DNA-Sequenz gebunden werden, die ein Signalpeptid kodiert, das in Hefe funktional ist. Sekretion kann durch Insertion in das Expressionsplasmid der Saccharomyces cerevisiae-MFα1-Leader- Sequenz erreicht werden (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)). In einer bevorzugten Konstruktion wird die DNA-Sequenz verwendet, die die gesamte MFα1-Leader-Sequenz kodiert, einschließlich der zweibasigen Stelle LysArg, aber ausschließlich der Peptidsequenz GluAlaGluAla, die das Substrat für die Hefeprotease DPAP (Dipeptidylaminopeptidase) ist. Auf diese Weise wird eine effiziente Sekretion von Insulinvorläufern mit dem richtigen N-Terminus erreicht.
DNA-Sequenzen, die modifizierte Insulinvorläufer kodieren, wurden konstruiert, indem in-vitro-Mutagenese auf der Expressionskassette durchgeführt wurde, die im BamHI-Restriktionsfragment aus dem Expressionsplasmid pYGABA enthalten ist, wie gezeigt in Fig. 1. Das Plasmid enthält Selektionsmarker und Replikationssignale, die in Hefe funktional sind, und hat eine Länge von 1103 Basenpaaren. Das BamHI-Fragment enthält das Folgende: die flußaufwärtige GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase)-Region, die die Promotor-Sequenzen enthält, von Position -389 bis -1, gemäß Bitter & Egan, Gene 32, (1984) 263-274. An das 5'-Ende der flußaufwärtigen Region wurden Bam-HI-Linker angefügt. Diese Promotor-Sequenz ist direkt an die von Kurjan & Herskowitz beschriebene Sequenz gebunden, die die 85 N-terminalen Aminosäuren der MFα1-Leader-Sequenz kodiert. Die MFα1-Leader-Sequenz ist direkt gebunden an die Kodierungssequenz für den Insulinvorläufer einkettiges des[ThrB30]-Humaninsulin (SCI), das ein synthetisch konstruiertes Gen mit der Sequenz ist:
Auch gezeigt ist, daß die Translation des Insulinvorläufer- Gens mit zwei Stop-Codons beendet ist und unmittelbar danach ist eine SalI-Stelle angeordnet. Die Terminatorregion ist identisch zum SalI-BamHI-Restriktionsfragment, das in der Europäischen Patentveröffentlichung 0 116 201 A1 beschrieben ist. Die Sequenz wird unter vollständiger Verwendung von Standardtechniken konstruiert.
Das verwendete Mutageneseverfahren war "ortsgerichtete Oligonucleotid-Mutagenese", die beschrieben ist von Zoller & Smith, DNA, Vol. 3, No. 6, 479-488 (1984). Das Verfahren ist kurz im folgenden beschrieben und ist detaillierter in Beispiel 1 beschrieben. Isoliert aus dem Expressionsplasmid wird die Insulinvorläufer-Sequenz in einen einzelsträngigen, zirkulären M13-Bakteriophagen-Vektor inseriert. An das einzelsträngige Genom wird ein chemisch synthetisierter komplementärer DNA- Strang anelliert. Der DNA-Strang enthält die gewünschte Sequenz, umgeben von Sequenzen, die vollständig homolog zu Insulinsequenzen auf der zirkulären DNA sind. In vitro wird dann der Primer in der gesamten Länge des zirkulären Genoms biochemisch unter Verwendung von Klenow-Polymerase verlängert. Dieser Strang wird zu einzelsträngigen Phagen führen, die, wenn sie in E. coli gezüchtet werden, die Möglichkeit geben, doppelsträngige DNA mit der gewünschten Sequenz zu isolieren. Aus dieser doppelsträngigen DNA kann ein Restriktionsfragment isoliert und in den Expressionsvektor erneut inseriert werden.
Die Erfindung wird in folgenden detaillierter unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert werden, in denen
Fig. 1 das Expressionsplasmid pYGABA 14276 zeigt,
Fig. 2 den Hefevektor pAB24 zeigt und
Fig. 3 eine graphische Darstellung der Absorption von Insulin aus einem subkutanen Depot zeigt.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das verwendet werden kann, um den Vorläufer B(1-29)-AKR-A(1-21) zu exprimieren.
Die Expressionskassette, die im Expressionsplasmid pYGABA (gezeigt in Fig. 1) auf einem BamHI-Restriktionsfragment enthalten ist, wurde isoliert: Das Expressionsplasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI inkubiert. Die Bedingungen waren: 20 ug Plasmid, 50 Einheiten BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT in einem Volumen von 100 ul. Die Temperatur betrug 37ºC und die Reaktionszeit 2 Stunden. Die zwei DNA-Fragmente wurden auf einem 1% Agarosegel getrennt und das gewünschte Fragment wurde isoliert.

Ligation auf dem M13-Vektor M13mp18:

Das isolierte Restriktionsfragment wurde an den Bacteriophagen-Vektor M13mp18, der ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten worden war, in der folgenden Reaktionsmischung ligiert: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP in einem Volumen von 20 ul. 5 ul dieser Mischung wurden in den E. coli- Stamm JM101 transformiert. Das Vorhandensein von Fragment im Vektor und die Orientierung des Fragments wurde durch Restriktionsenzymkartierung auf doppelsträngiger M13-DNA, die aus dem Transformanten isoliert worden war, bestimmt.

Isolierung von einzelsträngiger (ss) DNA (Matrize):

Aus dem oben beschriebenen Transformanten wurde ss-DNA gemäß einem Verfahren isoliert, das von Messing in Gene, 19, 269-276 (1982) beschrieben ist.

5'-Phosphorylierung des Mutagenisierungsprimers:

Der Mutagenisierungsprimer mit der Sequenz 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3' wurde im 5'-Ende in einer 30 ul-Reaktionsmischung phosphoryliert, die 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol Oligonucleotid und 3,6 Einheiten T4-Polynucleotidkinase enthielt. Die Reaktion wurde für 30 min bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde das Enzym durch Inkubieren der Mischung für 10 min bei 65ºC inaktiviert.

Anellierung der Matrize und des phosphorylierten Mutagenisierungsprimers:

Anellierung von Matrize und Primer wurde durchgeführt in einem 10 ul-Volumen, das 0,5 pmol Matrize, 5 pmol Primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT enthielt, durch Erhitzen für 10 min bei 65ºC und anschließendes Abkühlen auf 0ºC.

Extensions/Ligations-Reaktion:

Zur oben erhaltenen Reaktionsmischung wurden 10 ul der folgenden Mischung zugegeben: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Klenow- Polymerase. Dann wurde die Reaktion für 16 Stunden bei 16ºC durchgeführt.

Transformation von JM101:

Die obige Reaktionsmischung wurde in verschiedenen Verdünnungen in mit CaCl&sub2; behandelte E. coli-JM101-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken transformiert und im 2 x YT-Topagar auf 2 x YT-Agarplatten plattiert. (2 x YT = Trypton 16 g/l, Hefeextrakt 10 g/l, NaCl 5 g/l. 2 x YT-Topagar = 2 x YT mit zugesetzten 0,4 % Agarose und autoklaviert. 2 x YT-Agarplatten = 2 x YT mit zugesetzten 2 % Agar und autoklaviert). Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert.

Identifizierung Dositiver Klone:

Das verwendete Verfahren war plaque-lift-Hybridisierung, die im folgenden beschrieben ist: ein Nitrocellulose-Filter wurde auf eine Platte mit einer geeigneten plaque-Dichte gelegt, so daß der Filter benetzt wurde. Der Filter wurde dann in den folgenden Lösungen gebadet: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 30 s, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 für 1 min, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat) bis zu späterem Gebrauch. Der Filter wurde auf 3MM-Filterpapier getrocknet und für 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.
Der Mutagenisierungsprimer mit der Sequenz 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3' wurde im 5'-Ende in einem 30 ul-Volumen, das 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 10 pmol Oligonucleotid, 20 pmol Gamma-³²P-ATP und 3,5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase enthielt, radioaktiv markiert. Die Mischung wurde bei 37ºC für 30 min und dann für 5 min bei 100ºC inkubiert.
Der getrocknete Filter wurde für 2 Stunden bei 65ºC in 6 x SSC, 0,2 % Rinder-Serumalbumin, 0,2 % Ficoll, 0,2 % Polyvinylpyrrolidon, 0,2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 ug/ml Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Dann wurde die Reaktionsmischung, die die markierte Sonde enthielt, zu 15 ml frischer Vorhybridisierungsmischung zugegeben und der Filter wurde hierin über Nacht bei 40ºC unter leichtem Rütteln gebadet. Nach Hybridisierung wurde der Filter dreimal für jeweils 15 min in 2 x SSC + 0,1 % SDS gewaschen und einer Autoradiographie unterzogen. Nach Waschen in derselben Lösung, nunmehr aber bei 62ºC, und einer weiteren Autoradiographie, wurden Plaques identifiziert, die DNA-Sequenzen enthielten, die komplementär zum Mutagenisierungsprimer waren.

Erneutes Screening positiver Klone:

Weil der identifizierte Klon ein Resultat einer Heteroduplex ist, wurde die Plaque erneut plattiert. Die Hybridisierung und Identifizierung wurden wiederholt.

Reinigung doppelsträngiger M13-Phagen-DNA:

Ein erneut gescreenter Klon wurde zur Infektion eines E. coli- Stammes JM101 verwendet. Eine Kultur, die ungefähr 10&sup8; Phagen und 5 Kolonien JM101 enthielt, wurde für 5 Stunden in 5 ml 2 x YT-Medium bei 37ºC gezüchtet. Dann wurde doppelsträngige, zirkuläre DNA aus dem Pellet gereinigt, gemäß einen Verfahren, das beschrieben ist von Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2, 1513 (1979).

Isolation eines Restriktionsfragmentes, das modifizierten Insulinvorläufer enthält:

Die oben isolierte DNA-Zubereitung (ca. 5 ug) wurde mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease BamHI in 60 ul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die DNA-Produkte wurden auf einem Agarosegel getrennt und das Fragment wurde aus dem Gel gereinigt.

Ligation des Hefevektors pAB24 (Fig. 2):

Das isolierte restringierte Fragment wurde an den Hefevektor pAB24, der mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut worden war, mit der folgenden Reaktionsmischung ligiert: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 20 ul. 5 ul dieser Reaktionsmischung wurden zur Transformation des E. coli-Stammes MC1061 verwendet, in dem das modifizierte Expressionsplasmid identifiziert und vermehrt wurde. Das Plasmid wurde mit pYGAB-AKR-A bezeichnet und war identisch mit pYGABA, mit Ausnahme des hinzugefügten Codons.

Hefetransformation:

Transformationen des Expressionsplasmids in dem Hefestamm Saccharomyces cerevisiae JC482/\pep/\Leu2cir&sup0; (α, his4, pep4, ura3, leu2, cir&sup0;) wurde durchgeführt, wie beschrieben von Ito et al., J. Bact. Vol. 153, No. 1, 163-168 (1983). Die transformierten Zellen wurden auf SC-ura-Medium (0,7 % Yeast Nitrogen Base, 2,0 % Glucose, 0,5 % Casaminosäuren, 2,0 % Agar) zur Selektion auf plasmidhaltige Zellen plattiert.

BEISPIEL II

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Produktion des Vorläufers B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21) verwendet werden kann.
Die verwendete Vorgehensweise war im wesentlichen die gleiche, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß der Mutagenisierungsprimer die Sequenz 5'-CAACAATACCTCTCTTAGAACCCTTTGGAGTG-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 42ºC betrug und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 64ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besaß eine mit pYGABA Identische Sequenz mit der Ausnahme der hinzugefügten Codons.

BEISPIEL III

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Produktion des Vorläufers [GlnB13]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) verwendet werden kann.
Die verwendete Vorgehensweise war im wesentlichen die gleiche, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Ausnahme, daß die verwendete Matrize erhalten wurde, indem die BamHI-Kassette aus pYGAB-AKR-A in M13 kloniert wurde, daß der Mutagenisierungsprimer die Sequenz 5'-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 31ºC betrug und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 53ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besitzt eine mit pYGABA identische Sequenz, mit der Ausnahme der geänderten und hinzugefügten Codons.

BEISPIEL IV

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Produktion des Vorläufers [GlnA4, AspA21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) verwendet werden kann.
Die verwendete Vorgehensweise war im wesentlichen die gleiche, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Ausnahme, daß die verwendete Matrize erhalten wurden indem die BamHI-Kassette aus pYGAB-AKR-A in M13 kloniert wurde, und daß die Mutagenese in zwei Schritten durchgeführt wurde. In Schritt 1 war der Primer 5'-ACAACATTGTTGAACAATACC-3', die Hybridisierungstemperatur betrug 27ºC und die Waschtemperatur nach der Hybridisierung betrug 49ºC und in Schritt 2 war der Primer 5'-CGCTATTAGTCACAGTAGTTT--3', die Hybridisierungstemperatur betrug 29ºC und die Waschtemperatur nach der Hybridisierung betrug 51ºC. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, mit Ausnahme der geänderten und hinzugefügten Codons.

BEISPIEL V

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Produktion des Vorläufers [SerA21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) verwendet werden kann.
Die verwendete Vorgehensweise war im wesentlichen die gleiche, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die verwendeten Matrize erhalten wurde, indem die BamHI-Kassette aus pYGAB-AKR-A in M13 kloniert wurde, daß der Mutagenisierungsprimer die Sequenz 5'-GACGCTATTAAGTACAGTAGT-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 29ºC betrug und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 51ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besitzt eine mit pYGABA identische Sequenz, mit Ausnahme der geänderten und hinzugefügten Codons.

BEISPIEL VI

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Produktion des Vorläufers [ArgB27]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) verwendet werden kann.
Die verwendete Vorgehensweise war im wesentlichen die gleiche, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Ausnahme, daß die verwendete Matrize erhalten wurde, indem die BamHI-Kassette aus pYGAB-AKR-A in M13 kloniert wurde, daß der Mutagenisierungsprimer die Sequenz 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 43ºC betrug und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 65ºC betrug. Das modifizierte Plasmid besitzt eine mit pYGABA identische Sequenz, mit Ausnahme der geänderten und hinzugefügten Codons.

BEISPIEL VII

Expression des Vorläufers und Isolierung aus dem Kulturmedium.
Hefe, die transformiert worden ist, wie in den Beispielen I und VI beschrieben, wurde auf Petri-Platten, die Minimal-Medium ohne Uracil enthielten, für 48 Stunden bei 30ºC vermehrt. 100 ml-Rüttelflaschen, die Minimal-Medium ohne Uracil + 5 g/l Casaminosäuren + 10 g/l Bernsteinsäure + 30 g/l Glucose bei pH 5,0 enthielten, wurden mit einer Einzelkolonie von der Petri- Platte beimpft. Die Flaschen wurden dann bei 30ºC in einem Inkubator für 72 Stunden gerüttelt.
Nach Zentrifugation wurde 1 Liter gepoolter Überstand durch Filtration sterilisiert und auf pH 4 - 4,5 und eine Leitfähigkeit < 10 mS durch Zugabe von 5 M HCl und Wasser eingestellt. Unter Verwendung eines Durchflusses von 120 ml/Stunde wurde der Überstand dann auf eine 1,6 x 6 cm-Säule aus S-Sepharose FF aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 50 mM Essigsäure, 50 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 4,0 mit NaOH. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer gewaschen und der Vorläufer mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,35 M in 360 ml Puffer mit einem Durchfluß von 10 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml aufgeteilt und der Nachweis auf UV-Extinktion durchgeführt. Fraktionen, die Vorläufer enthielten, wurden durch RP-HPLC-Analyse identifiziert und wurden gepoolt. Nach Entsalzen auf einer Säule aus Sephadex G25 in 1 M Essigsäure wurde der Vorläufer durch Lyophilisation isoliert.

BEISPIEL VIII

Herstellung von [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin aus dem Vorläufer B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21).
250 mg B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen I und VII beschrieben sind, wurden bei 4ºC in 25 ml 50 mm Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 20 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 10 mit HCl gelöst. Sepharose , die 0,8 mg immobilisiertes Trypsin/ml enthielt, wurde auf einem Glasfilter mit demselben Puffer gewaschen und abtropfen gelassen. Puffer wurde zu 40 g abgetropftem Gel zugegeben und das Volumen wurde auf 75 ml eingestellt. Die Lösung, die den Vorläufer enthielt, wurde zu der Suspension zugegeben und die Mischung wurde für 1 Stunde bei 4ºC mit leichter Bewegung stehengelassen und wurde dann filtriert.
HPLC-Analyse zeigt 61 % Umsetzung zu [ArgA0]-des-[Thr30]-Humaninsulin.
Das Gel wurde mit 50 ml Puffer (ohne Ethanol) gewaschen und abtropfen gelassen und die Proteine in den gepoolten Filtraten wurden durch Einstellen des pHs auf 6 ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation und Lyophilisation isoliert.
Der Niederschlag wurde bei 4ºC in 20 ml 7 M Harnstoff durch Einstellen des pHs auf 8,1 gelöst und die Lösung wurde auf eine 1,6 x 20 cm-Säule aus Q-Sepharose FF aufgebracht, zuvor äquilibriert bei 4ºC in 20 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, eingestellt auf pH 8,1 mit HCl. Unter Verwendung eines Durchflusses von 40 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 50 mM NaCl im selben Puffer über 24 Stunden isoliert. Das Eluat wurde durch UV- Absorption nachgewiesen und der zuerst eluierende der zwei Hauptpeaks wurde gesammelt. Der Pool wurde in 1 M Essigsäure auf einer Säule aus Sephadex G25 entsalzt und wurde lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 75 mg [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten nachgewiesen.

BEISPIEL IX

Herstellung von [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin aus dem Vorläufer B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21).
400 mg B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen II und VII beschrieben sind, wurden gelöst in 50 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 10 mit HCl. Sepharose , die 0,8 g immobilisiertes Trypsin/ml enthielt, wurde auf einem Glasfilter mit demselben Puffer gewaschen und wurde abtropfen gelassen. Puffer wurde zu 80 g abgetropftem Gel hinzugegeben und das Volumen wurde auf 150 ml eingestellt. Die Lösung, die den Vorläufer enthielt, wurde zu der Suspension zugegeben und die Mischung wurde für 30 min bei 20ºC mit leichter Bewegung stehengelassen und wurde dann filtriert.
HPLC-Analyse zeigt 50 % Umsetzung zu [ArgA0]-des-[ThrB30]-Humaninsulin.
Das Gel wurde mit 100 ml Puffer (ohne Ethanol) gewaschen und abtropfen gelassen und die Proteine in den gepoolten Filtraten wurden durch Einstellung des pHs auf 6 ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation und Lyophilisation isoliert.
Der Niederschlag wurde bei 4ºC in 20 ml 7 M Harnstoff durch Einstellen des pHs auf 8,1 gelöst und die Lösung wurde auf eine 1,6 x 20 cm-Säule aus Q-Sepharose FF aufgebracht, zuvor äquilibriert bei 4ºC in 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, eingestellt auf pH 8,1 mit HCl. Unter Verwendung eines Durchflusses von 40 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 50 mM NaCl im selben Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV- Absorption nachgewiesen und der zuerst eluierende der zwei Hauptpeaks wurde gesammelt. Der Pool wurde in 1 M Essigsäure auf einer Säule aus Sephadex G25 entsalzt und wurde lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 145 mg [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch HPLC-Analyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL X

Herstellung von [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin aus Schweine- Proinsulin.
40 mg Schweine-Proinsulin wurden in 800 ul 0,1 M HCl gelöst und 8 ml 50 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan wurden zugegeben. Eine Lösung von 1 U Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter- Enzymogenen (Boehringer Mannheim) in 200 ul 0,1 N Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, eingestellt auf pH 8,5 mit HCl, wurde hergestellt. Die zwei Lösungen wurden vermischt und wurden für 16 Stunden bei 12ºC stehengelassen.
Die Reaktion wurde durch Einstellen des pHs auf 6,2 nach Zugabe von 1,8 ml 96 %igen Ethanol gestoppt und die resultierende Suspension wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und wurde bei 4ºC in 2 ml 7 M Harnstoff durch Einstellen des pHs auf 8,1 erneut gelöst. Diese Lösung wurde auf eine 1,6 x 20 cm-Säule aus Q-Sepharose FF aufgebracht, zuvor äquilibriert bei 4ºC in 20 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, eingestellt auf pH 8,1 mit HCl. Unter Verwendung eines Durchflusses von 40 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 50 mM NaCl im selben Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen und der Hauptpeak wurde gesammelt. Der Pool wurde in 1 M Essigsäure auf einer Säule aus Sephadex G25 entsalzt und wurde lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 15 mg [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch HPLC-Analyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XI

Herstellung von [ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid).
200 mg [ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin, hergestellt in einem der Verfahren, die in Beispiel VIII bis X beschrieben sind, wurden in einer Mischung gelöst, die 400 mg Threoninamid, 2,0 ml Ethanol und 0,8 ml wasser enthielt. Der pH wurde mit Essigsäure auf 6,3 eingestellt und 4 ml (abgesetztes) Volumen von Sepharose , die 3,2 mg immobilisiertes Trypsin enthielt, wurden zugegeben. Nach Stehenlassen für 2 Stunden bei 20ºC mit leichter Bewegung wurde das Gel durch Filtration entfernt und das Protein wurde durch Zugabe von 10 Volumina 2-Propanol ausgefällt. Der luftgetrocknete Niederschlag wurde bei 4ºC in 20 ml 7 M Harnstoff durch Einstellen des pHs auf 8,1 gelöst und die Lösung wurde auf eine 1,6 x 20 cm-Säule aus Q-Sepharose FF aufgebracht, zuvor äquilibriert bei 4ºC mit 20 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, eingestellt auf pH 8,1 mit HCl. Unter Verwendung eines Durchflusses von 40 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 50 mM NaCl im selben Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen und der Hauptpeak wurde gesammelt. Der Pool wurde in 1 M Essigsäure auf einer Säule aus Sephadex G25 entsalzt und wurde lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 80 mg [ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid).
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XII

Herstellung von [GlnB13, ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
250 mg [GlnB13]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen III und VII beschrieben sind, wurden mit immobilisiertem Trypsin behandelt und das Reaktionsprodukt im wesentlichen gereinigt, wie in Beispiel VIII beschrieben. Die Ausbeute betrug 60 mg [GlnB13, ArgA0]-des [ThrB30]-Humaninsulin.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XIII

Herstellung von [GlnA4, AspA21, ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid).
500 mg [GlnA4, AspA21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen IV und VII beschrieben sind, wurden mit immobilisiertem Trypsin behandelt und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen gereinigt, wie in Beispiel VIII beschrieben. Die Ausbeute betrug 175 ml [GlnA4, AspA21, ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Dieses wurde in das B30-Amid überführt, indem es mit Threoninamid mit dem Verfahren gekoppelt wurde, das in Beispiel XI beschrieben ist. Die Ausbeute an gereinigtem [GlnA4, AspA21, ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid) betrug 50 mg.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XIV

Herstellung von [SerA21, ArgA40]-Humaninsulin-(B30-Amid).
400 mg [SerA21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen V und VII beschrieben sind, wurden mit immobilisiertem Trypsin behandelt und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen gereinigt, wie in Beispiel VIII beschrieben. Die Ausbeute betrug 125 mg [SerA21, ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Dieses wurde in das B30-Amid überführt, indem es mit Threoninamid mit dem Verfahren gekoppelt wurde, das in Beispiel XI beschrieben ist. Die Ausbeute an gereinigtem [SerA21, ArgA0]- Humaninsulin-(B30-Amid) betrug 40 mg.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XV

Herstellung von [ArgB27, ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
250 mg [ArgB27]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), hergestellt mit den Verfahren, die in den Beispielen VI und VII beschrieben sind, wurden mit immobilisiertem Trypsin behandelt und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen gereinigt, wie in Beispiel VIII beschrieben. Die Ausbeute betrug 50 mg [ArgB27, ArgA0]-des[ThrB30]-Humaninsulin.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

BEISPIEL XVI

Formulierung einer injizierbaren, verzögert wirkenden Zubereitung, die gelöstes [ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid) enthält.
60 umol [ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid) wurden in 4 ml 0,1 M HCl gelöst und 20 ml 1,5 % m-Kresol wurden zugegeben. Die Lösung wurde mit 70 ml 1 % NaCl und 3,25 ml 0,1 M ZnCl&sub2; vermischt und der pH wurde auf 4,0 eingestellt. Das Volumen wurde schließlich mit Wasser auf 100 ml eingestellt und durch Filtration sterilisiert.

BEISPIEL XVII

Formulierung einer injizierbaren, verzögert wirkenden Zubereitung, die eine kristalline Suspension von [ArgA0]-Humaninsulin- (B30-Amid) enthält.
60 umol [ArgA0]-Humaninsulin-(B30-Amid) wurden in 70 ml 1 % NaCl-Lösung, die 0,5 % m-Kresol enthielt, durch Einstellen des pHs auf 9,7 mit 1 M NaOH gelöst und 325 ul 0,1 M Zinkacetat wurden zugegeben. Nach erneuter Einstellung des pHs auf 9,7 wurde das Volumen mit Wasser auf 80 ml eingestellt und die Lösung wurde durch Filtration sterilisiert.
20 ml 65 mM NaH&sub2;PO&sub4;, das 0,3 % m-Kresol enthielt und mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt war, wurden durch Filtration sterilisiert.
Unter sterilen Bedingungen wurden die zwei Lösungen vermischt und die resultierende Suspension wurde bei 20ºC für 1 Stunde unter sehr leichtem Rühren stehengelassen. Der pH wurde schließlich mit HCl auf 7,3 eingestellt.

BEISPIEL XVIII

Demonstration der Verzögerung nach subkutaner Injektion in Ratten durch externe Gamma-Zählung.
Für die Experimente wurden weibliche Wistar-Ratten mit ungefähr 250 g Körpergewicht und mehr als 90 Tage alt verwendet. Die Ratten wurden für etwa 1 Woche vor Verwendung akklimatisiert und wurden ad libitum gefüttert. Vier Tage lang vor den Experimenten hatten die Ratten eine 20 mM wässrige Lösung von Kaliumiodid als Trinkwasser.
Die Testzubereitungen waren:
I. Suspensionszubereitung, die [ArgA0]-Humaninsulin- (B30-Amid) enthielt und hergestellt war gemäß Beispiel XVII.
II. Lösungszubereitung, die [ArgA0]-Humaninsulin-(B30- Amid) enthielt und hergestellt war gemäß Beispiel XVI.
III. Eine schnell wirkende Lösungszubereitung, die semisynthetisches Humaninsulin enthielt (Velosulin , 100 U/ml).
Alle drei Formulierungen enthielten zusätzlich 50 uCi/ml [Mono-¹²&sup5;I]-Insulin bzw. -Insulinverbindungstracer, hergestellt mit Standard-Radioiodierungsverfahren.
Den Ratten wurden 50 ul Zubereitung, die 3,5 nmol Insulinverbindung und 2,5 uCi [¹²&sup5;I]-markierten Tracer enthielten, an der Hinterseite des Schenkel subkutan injiziert. Während des Untersuchungszeitraums wurden die Ratten in Rattenhaltern immobilisiert.
Das Verschwinden des Tracers von den Injektionsstellen, das ein Maß für die Absorption der Insulinverbindung aus dem subkutanen Depot ist (C. Binder: Absorption of Injected Insulin. Munksgaard, Copenhagen 1969), wurde unter Verwendung von zwei stationären MIP-10-Durchflußmessern und Detektoren E749 mit 3 mm NaI-Szintillationskristallen mit Be-Fenstern und Kollimatoren mit 60º Gesichtswinkel und 10 mm-Öffnungen (Raytronic) gemessen. Die Durchflußmesser wurden mit Mini-Aufzeichnungsgeräten 121N (Raytronic) verbunden. Die Detektoren wurden 2 cm oberhalb der Haut an den Injektionsstellen fixiert. Die Radioaktivität wurde über einen 5-Minuten-Zeitraum nach 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 8, 12 und 24 Stunden nach der Injektion der Zubereitung überprüft. Nach Substraktion der Hintergrundimpulse wurden die Impulsraten in Prozentanteile der anfänglichen Impulsrate umgerechnet.
In Fig. 3 sind die Mittelwerte der Restradioaktivität als Funktion der Zeit für jede Zubereitung dargestellt. Wenn man die Zeit für 50 % Restaktivität (T50%) als ein Maß für die Verzögerung nimmt, findet man aus den Kurven: T50% Zuber. I Zuber. II Zuber. III
Diese Ergebnisse zeigen, daß beide Zubereitungen, die [ArgA0]- Humaninsulin-(B30-Amid) enthalten, ausgeprägte Verzögerung zeigen, verglichen mit der schnell wirkenden Humaninsulin-Zubereitung.

BEISPIEL XIX

Formulierung einer injizierbaren, verzögert wirkenden Zubereitung, die eine Lösung von [ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-Humaninsulin enthält.
12 umol [ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-Humaninsulin wurden in 35 ml 1 % NaCl-Lösung, die 0,5 % m-Kresol enthielt, durch Einstellen des pHs aut 3,5 mit 1 M HCl gelöst und 650 ul 0,1 M Zinkacetat wurden zugegeben. Nach erneuter Einstellung des pHs auf 3,5 wurde das Volumen mit Wasser auf 50 ml eingestellt und die Lösung wurde durch Filtration sterilisiert.

BEISPIEL XX

Demonstration der Verzögerungswirkung in Kaninchen nach subkutaner Injektion.
Der Verzögerungsgrad einer Lösungszubereitung, die 0,24 mM [ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-Humaninsulin enthielt, die gemäß Beispiel XIX hergestellt war, wurde in Kaninchen gemäß dem Verfahren bestimmt, das in British Pharmocopoeia, 1980, beschrieben ist.
65 ul Zubereitung wurden subkutan in sechs Kaninchen injiziert und Blutproben wurden zur Glucosebestimmung unmittelbar vor Injektion und 1, 2, 4 und 6 Stunden nach der Injektion gesammelt. Glucosewerte wurden als Prozent des Wertes vor der Injektion ausgedrückt.
Die Bestimmung zeigte die folgenden Mittelwerte: Zeit nach Injektion: % Glucose vom Anfangswert:
Durch Bestimmung des Verzögerungsindexes gemäß dem Verfahren, das in J. Markussen et al: Protein Engineering, Vol. 1 No. 3 S. 205-213 (1987) beschrieben ist, wurde ein Wert von 42 berechnet. Durch Vergleich mit den Ergebnissen in Tabelle 1, aaO., ist festgestellt worden, daß die Lösungszubereitung, die [ArgA0, ArgB27]-des[ThrB30]-Humaninsulin enthält, dieselbe Verzögerung besitzt wie die üblicherweise verwendete, verzögert wirkende Zink-Insulin-Suspensionszubereitung Actrapid Human.

Claims

1. Insulinverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel II besitzen:

worin

E einzeln Glu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann, N einen Aminosäurerest darstellt, der durch Nucleotidsequenzen kodiert sein kann,

T Thr oder Arg darstellt,

X Thr, Ser, Ala oder OH darstellt und

Y OR oder NR¹R² darstellt, wobei R, R¹ und R² einzeln Wasserstoff oder Niederalkyl darstellen, ausgenommen, daß Y nicht vorhanden ist, wenn X OH darstellt, wobei wenigstens eines der Symbole E, N und T einen von dem entsprechenden Rest von Humaninsulin verschiedenen Aminosäurerest darstellt, wenn Y OH darstellt, und wobei wenigstens eines der Symbole E in Position A4, E in Position B13, N in Position A21 und T in Position B27 Gln, Asp oder Ser bzw. Arg darstellt, wenn X OH darstellt.

2. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes E einzeln Glu oder Gln darstellt, N Asn, Asp, Ser oder Gly darstellt, T Thr oder Arg darstellt, X Thr darstellt und Y NH&sub2; darstellt.

3. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E Glu darstellen, N Asn darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.

4. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E Glu darstellen, N Ser darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.

5. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E in Position B13 Gln darstellt und die restlichen E alle Glu darstellen, daß N Asn darstellt, daß T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.

6. Insulinverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E in Position A4 Gln darstellt und die restlichen E alle Glu darstellen, N Asp darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH&sub2; darstellt.

7. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E Glu darstellen, N Asn darstellt, T Arg darstellt und X OH darstellt.

8. Verfahren zur Herstellung von Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Insulinvorläufer der allgemeinen Formel III:

worin

E, N und T alle dieselbe Bedeutung haben, wie in Anspruch 1 angegeben, (AA)n eine Peptidkette mit n Aminosäureresten und mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt oder eine Peptidbindung ist, wenn n 0, und Z Wasserstoff oder eine Peptidkette beliebiger Länge mit Lys als dem C-terminalen Rest darstellt, einer Transpeptidation unterzogen oder durch eine Endopeptidase mit ausschließlicher Spezifizität für die Spaltung auf der Carboxyseite eines Lysinrestes gespalten wird.

9. Insulinzubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Insulinverbindung nach Anspruch 1 und fakultativ auch ein schnellwirkendes Insulin, wie etwa Humaninsulin, Haustier-Insulin oder Derivate oder Analoga derselben, umfassen.

10. Insulinzubereitungen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lösung von wenigstens einer Insulinverbindung nach Anspruch 1 in einem wässrigen Medium umfassen, das isoosmotisch mit Blutserum ist, einen pH zwischen 2 und 5,5 besitzt und fakultativ einen Puffer und/oder ein Konservierungsmittel und fakultativ ein schnellwirkendes Insulin enthält.