NO300640B1 - Fremgangsmåte ved fremstilling av nye insulinforbindelser - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for

å lage nye insulinforbindelser som viser forlenget virkning.

Helt siden oppdagelsen av insulin i 1922 har mange forskjellige typer av insulinpreparater blitt benyttet for behandlingen av Diabetes mellitus. I begynnelsen ble utelukkende insulinløsninger som viste en rask start og relativt hurtig opphør av insulinaktiviteten benyttet, men senere ble det utviklet insulinpreparater som viste en bredere aktivitetsprofil ved å senke løseligheten til insulin ved hjelp av tilsetninger, f.eks. sinksalt og/eller protaminer. På grunn av tilgjengelighet ble insulin for dette tradisjonelt vanligvis ekstrahert fra pankreas fra husdyr, hyppigst okser, griser og sau. Imidlertid, har preparater som inneholder humant insulin med bioteknologisk opprinnelse også kommet på markedet.

Strukturen til humant insulin er vist i formel I.

B-kj ede (forts.)

Insulinene fra visse husdyr er meget like i struktur til humant insulin. Hund- og griseinsulin varierer bare fra humant insulin ved å inneholde Ala istedenfor Thr i posisjon 30 i B-kjeden og kanininsulin bare ved å inneholde Ser i den samme posisjonen. Disse insulinene kan bli overført til humant insulin ved å erstatte B3O-aminosyreresten med Thr ved semisyntetiske fremgangsmåter som beskrevet f.eks. av Morihara et al, Nature 280

(1979), 412-13 og Marcussen (US patent nr. 4.343.898).

Preparater som inneholder insulin i løsning blir vanligvis hurtigvirkende, insulinaktiviteten opphører få timer etter injeksjonen. Derfor er det nødvendig å gi hyppige injeksjoner, normalt flere ganger pr. dag, for å normalisere blodglukosenivået hos diabetikeren.

For å overkomme denne ulempe er insulinpreparater med forlenget virkning blitt formulert slik at insulinaktiviteten blir opprettholdt i flere timer, endog opp til 24 timer eller lengere. Ved bruk av slike lenge-varende preparater kan noen diabetiske pasienter motta bare et lite antall av daglig injeksjoner, f.eks. en eller to injeksjoner i løpet av 24 timer.

En slik forlenget virkning kan bli oppnådd ved å overføre insulinet til et lite løselig salt, slik som sinkinsulin eller protamininsulin. De lite løselige insulinsaltene blir benyttet i form av suspensjoner fra hvilken insulinet blir gradvis frigjort etter subkutane eller intramuskulære injeksjoner.

Nylig har andre metoder blitt benyttet for å oppnå en forlenget virkning. Et eksempel på dette er innkapsling av insulin-krystaller i polymerisert serumalbumin. Et annet eksempel er kontinuerlig virkende infusjonsapparater, såkalte insulinpumper, som imidlertid kan være ukomfortable og innebære en risiko for pasienten.

Spesifikasjonene til europeisk patentpublikasjoner nr.

EP 132770, EP 132769 og EP 135720 beskriver tillagningen og bruken av insulinderivater der C-terminus til B-kjeden blir forlenget med en organisk gruppe som bærer minst en positiv ladning, fortrinnsvis Arg-OH eller Arg-Arg-OH. Preparatene som inneholder suspensjoner av slike insulinderivater viser forlenget virknig. Imidlertid er disse insulinforbindelsene ikke meget passende når det gjelder å formulere nye anvendbare langtidsvirkende insulinpreparater fordi graden av langtidsvirkning er blitt funnet å være meget begrenset (J. Markussen et al.: Protein Engineering 1, 205-213 (1987)).

Egenskapene til insulinderivatene der N-terminus til B-kjeden blir forlenget med dipeptidet Arg-Arg er blitt beskrevet av R. Geiger & F. Enzmann i: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima 1978; Excerpta, Medica, Amsterdam 1979, s. 306-310. Løseligheten til denne insulinforbindelse rundt sitt isoelektriske punkt ble funnet å være endog høyere enn det til normalt insulin.

Substitusjoner i insulinmolekylet kan bli innført med det formål å forbedre aktivitetsprofilen til insulinet i behandlingen av diabetes. Således beskriver europeisk patentpublikasjon nr.

EP 194864 at en eller flere substitusjoner av Glu med f.eks. Gin og/eller substitusjon av Thr<827> med Arg kombinert med blokkering av den C-terminale karboksylgruppen i form av en ester eller amid forårsaker et skifte i området for utfelling av insulinet på en slik måte at en langsom frigjøring etter injeksjon blir oppnådd.

Bruken av denne form for insulinforbindelser, som inneholder interne aminosyresubstitusjoner i preparater for livsvarig behandling av diabetes, innbefatter en vesentlig risiko for å aktivere immunsystemet til pasienten, hvilket vil forårsake dannelsen av insulinantistoffer i blodet.

NO 170978, EP 194864, DK 159274 og WO 88/06599 vedrører insulinanaloger hvor det ikke er knyttet noen aminosyrerest til A-kjedens N-terminale ende og WO 88/02005 og NO 172646 vedrører insulinforløpere hvori det er knyttet en lengre peptidkjede til den N-terminale enden av Al-aminosyren. Videre beskriver WO 88/06599 insulinanaloger med normal virkning og DK 159274 omhandler hurtigvirkende insulinanaloger.

Insulinanalogene fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse derimot er særpreget ved at arginin, dvs. Arg<A0> er knyttet til den N-terminale enden av A-kjeden.

Innen de siste få år har flere forsøk blitt gjort for å finne substitusjoner for de tradisjonelle insulinprepratene med forlenget insulinvirkning. Grunnene for dette er at diabetologer har funnet at de tradisjonelle lengevirkende insulinpreparater blir for kortvirkende, spesielt etter innføringen av det humane insulinet og at innføringen av den såkalte insulinpennen har påkalt behovet for en oppløst lengevirkende insulin.

Formålet for oppfinnelsen er å fremstille nye insulinanaloger som viser en forlenget insulinvirkning, og som gir en så lav antigenisitet som mulig.

Det er nå overraskende blitt funnet at insulinforbindelser som har den generelle formel II

hvor

E representerer individuelt Glu eller en nøytral aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser, N representerer en aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser,

T representerer Thr eller Arg,

X representerer Thr, Ser, Ala eller OH, og

Y representerer OR eller NR^2, hvor R, R<1> og R2 hver for seg representerer hydrogen eller lavere alkyl, bortsett fra at Y er ikke tilstede når X representerer OH,

viser en ønskelig forlenget insulinvirkning og/eller antigenisitet.

Følgelig omhandler oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av insulinforbindelser som har den generelle formel II: B-kjede (forts.) hvor E representerer individuelt Glu eller en nøytral aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser,

N representerer en aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser,

T representerer Thr eller Arg,

X representerer Thr, Ser, Ala eller OH, og

Y representerer OR eller NR1 R2, hvor R, R<1> og R<2> hver for seg representerer hydrogen eller lavere alkyl, bortsett fra at Y er ikke tilstede når X er OH, som er karakterisert ved at et insulinforstadium med generell formel III:

hvor

E, N og T har alle den samme betydning som beskrevet i krav 1, (AA)n representerer en peptidkjede som har n aminosyrerester og har Lys som den C-terminale rest, eller er en peptidbinding når n = 0, og Z representerer hydrogen eller en peptidkjede av vilkårlig lengde som har Lys som den C-terminale rest, blir transpeptidert eller spaltet ved en endopeptidase som har eksklusiv spesifisitet for kløyving på karboksysiden av en lysinrest.

I den foreliggende sammenheng blir "lavere alkyl" ment

å omfatte rette eller grenede alkylgrupper som har 1-6 karbon-atomer.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstillingen av insulinforbindelser av formel II, der hver E representerer individuelt Glu eller Gin, N representerer Asn, Asp, Ser eller Gly,

T representerer Thr eller Arg, X representerer Thr og

Y representerer NH2.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av insulinforbindelser av formel II, der alle E representerer Glu,

N representerer Ser, R og X representerer begge Thr, og

Y representerer NH2.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstillingen av insulinforbindelser av formel II, der E i posisjon B13 representerer Gin og den gjenværende E representerer alle Glu, N representerer Asn, T og X representerer begge Thr, og Y representerer NH2.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av insulinforbindelser av formel II, der E i posisjon A4 representerer Gin, og den gjenværende E representerer alle Glu, N representerer Asp, T og X representerer begge Thr og Y representerer NH2.

Oppfinnelsen omhandler spesielt fremstilling av insulinforbindelser av formel II, der E representerer alle Glu, N representerer Asn, T representerer Arg, og X representerer OH.

Insulinforbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen oppfyller kravene fra diabetologene til minimale forandringer i det humane insulinmolekylet, hver for seg er de enten kjente for den menneskelige kropp eller testet gjennom flere år og på den måte ikke funnet å utløse en immunrespons. Hovedegenskapen til insulinforbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er at de kan bli beskrevet som humant insulin der en argininrest er blitt bundet til N-terminalen og A-kjeden, og hvor den C-terminale karboksylgruppen i B-kjeden har blitt fortrinnsvis blokkert i form av amidet. Insulinforbindelsene er ment å bli benyttet som oppløst i en svak sur løsning, og under disse betingelser kan en sterk deamidering av aparaginresten i posisjon A21 opptre under opp-bevaring av preparatet og således motvirke den forlengede virkningen. Ved å innføre en substitusjon av en eller muligens to av glutaminsyrerestene med glutamin, kan denne effekten bli kontrollert.

I tilfelle med insulin-avhengig diabetes består en ofte benyttet behandling av to daglige injeksjoner med et lengevirkende insulinpreparat, en om morgenen og en om kvelden like før senge-tid, for å lage et basalt insulinnivå. I tillegg, blir tre injeksjoner av et hurtigvirkende insulinpreparat gitt før hoved-målt idene. Ulempen med denne behandling er at den sene injeksjonen med det lengevirkende preparatet kan resultere i en farlig lav blodglukosekonsentrasjon i løpet av natten. Dette kan bli unngått ved å injisere et blandingspreparat med en lengevirkende og en hurtigvirkende insulin før middag, hvorved hypo-glykemi vil, hvis i det hele tatt, opptre om kvelden, hvor det kan bli behandlet ved hjelp av f.eks. en lett godbit. Imidlertid, denne type behandling resulterer ofte i hyperglykemi om morgenen, siden de mest vanlige brukte langtidsvirkende insulinpreparater "Insultard"® og "Monotard"® virker ikke i tilstrekkelig lang tid. Derfor, er det et behov å gi diabetiske pasienter insulinpreparater som virker lengere enn preparatene som er vanlig i bruk, spesielt hvis en injeksjon av et slik preparat vil være tilstrekkelig i en til endog flere dager. Insulinpreparater fremstilt ifølge oppfinnelsen viser en forlenget insulinvirkning med lengere varighet enn det som det vanlig benyttede langtidsvirkende insulinpreparatet "Monotard"<®> gjør.

De foretrukne insulinforbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er spesielt fordelaktige for bruk i løsningspreparater, fordi løseligheten er høy, endog rundt pH 5 (ved hvilken pH deamidering blir vesentlig redusert), og viser fremdeles uttalt forlenget virkning etter subkutan injeksjon.

Oppfinnelsen omhandler spesielt de følgende spesifikke forbindelser:

[ArgA0] -humant insulin- (B3 0-amid)

[Arg<A0>,Gln<B13>]-humant insulin- (B30-amid)

[ArgA0, GlnA4,AspA21] -humant insulin- (B3 0-amid)

[Arg<A0>, Ser^21 ] -humant insulin- (B3 0-amid)

[ ArgA0, Arg827] -des [ Thr830 ] -humant insul in.

Insulinforbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli laget fra andre insuliner ved å innføre i tillegg argininresten på den N-terminale del av A-kjeden til insulinmolekylet ved hjelp av kjemisk syntese, men kun med stor vanskelighet. En langt mer tiltrekkende vei er den enzymatisk katalyserte overføring av en enkel kjede-forløper, f.eks. naturlig forekommende proinsulin eller pre-proinsulin eller en biosyntetisk laget forløper med den generelle formel III:

der

E, N og T har alle den samme betydning som beskrevet i krav 1, (AA)n representerer en peptidkjede med n aminosyrerester og har Lys som den C-terminale resten, eller er en peptidbinding når

n = 0, og

Z representerer hydrogen eller en peptidkjede av vilkårlig lengde som har Lys som den C-terminale resten.

Enzymet benyttet for den enzymatiske overføringen skulle være en trypsin-lignende endopeptidase som er i stand til å spalte en peptidkjede på karboksysiden av en lysinrest. Trypsin selv kan ofte bli benyttet, men en endopeptidase som viser lysin-spesifisitet, f.eks. endproteinase Lys-C fra Lysobacter enzymogenes (Boehringer Mannheim) eller Lysyl endopeptidase fra Achromobacter lyticus (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) er spesielt fordelaktig.

Reaksjonen kan bli utført som en transpeptidering ved bruk av treoninamid under lignende betingelser som beskrevet i f.eks. europeisk patentpublikasjon nr. EP 163529 og således resultere direkte i B3 0-amidet, men det kan også bli utført som en to-trinnsreaksjon, med å starte med en enzymatisk spaltning hvilket resulterer i des (Thr830)-forbindelsen som kan bli overført til B30-amidet ved en koplingsreaksjon som beskrevet av Morihara et al., loe. eit..

Forløperne til insulinforbindelsene i oppfinnelsen kan bli laget biosyntetisk i en gjærvert som uttrykker en DNA-sekvens som koder for forløperen.

For å oppnå sekresjon til vekstmediet, kan DNA-sekvensen som koder for insulinforløperen bli bundet til en annen DNA-sekvens som koder for et signalpeptid som er funksjonelt i gjær. Sekresjon kan bli oppnådd ved å sette inn i ekspresjonsplasmidet i Saccharomyces cerevisiae MFOl-ledersekvensen (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)). I en foretrukket konstruksjon blir DNA-sekvensen som koder for hele MOl-ledersekvensen inklusive det dibasiske LysArg benyttet, men uten peptidsekvensen GluAlaGluAla som er substratet for gjærproteasen DPAP (dipeptidyl-amino-peptidase). På den måten, oppnås en effektiv sekresjon av insulinforløperne som har den rette N-terminalen.

DNA-sekvenser som koder for modifiserte insulinforstadier ble konstruert ved å utføre in vitro-mutagenese på ekspresjonskassetten som blir oppnådd i BamHI-restriksjonsfragmentet fra ekspresjonsplasmidet pYGABA som vist i Figur 1. Plasmidet inneholder seleksjonsmarkører og replikasjonssignaler som er funk-sjonelle i gjær og har en lengde på 1103 basepar. BamHI-fragmentet inneholder det følgende: GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase) oppstrømsregion som inneholder promotor-sekvensene fra posisjon -389 til -1 ifølge Bitter & Egan, Gene 32,

(1984) 263-274. Til 5'-enden av oppstrømsregion BamHI ble linkere koblet. Denne promotorsekvens blir bundet direkte til sekvensen beskrevet av Kurjan & Herskowitz som koder for 85N-terminale aminosyrer i MFOl-ledersekvensen. MFOl-ledersekvensen blir bundet direkte til den kodende sekvensen for insulinforstadiet enkelkjede des [Thr830]-humant insulin (SCI) , som er et syntetisk konstruert gen med sekvensen:

Også vist er at translasjonen av insulinforstadiegenet blir avsluttet med to stoppkodons, og like etter, blir et Sall-restriksjonssete satt på plass. Terminatorregionen er identisk med Sall-BamHI-restriksjonsfragmentet beskrevet i europeisk patentpublikasjon nr. 0 116 201 Al. Sekvensen er konstruert fullstendig ved hjelp av standardteknikker.

Mutagenesemetoden benyttet var "oligonukleotidseterettet mutagense" som er beskrevet av Zoller & Smith, DNA, Vol. 3, nr. 6, 479-488 (1984) . Metoden er kort beskrevet i det følgende og er b beskrevet i mer detalj i Eksempel I. Etter isolering fra ekspresjonsplasmidet blir insulinforstadiesekvensen satt inn i en enkelt-trådet, sirkulær M13 bakteriofagvektor. Til det enkelt-trådede genomet, blir en kjemisyntetisert komplementær DNA-tråd bundet. DNA-tråden inneholder den ønskede sekvensen omgitt av sekvenser som er fullstendig homologe til insulinsekvensene på det sirkulære DNA. In vitro, blir "primeren" forlenget biokjemisk i hele lengden til det sirkulære genomet ved bruk av Klenow polymerase. Denne strengen vil gi opphav til enkelt-strenget fag som, når dyrket i E. coli, gir mulighet for å isolere dobbelt-strenget DNA som har den ønskede sekvensen. Fra denne dobbelt-stengede DNA, kan et restriksjonsfragment bli isolert og satt inn igjen i ekspresjonsvektoren.

Oppfinnelsen er forklart i mer detalj nedenfor med referanse til figurene der

Fig. 1 viser ekspresjonsplasmidet pYGABA 14276,

Fig. 2 viser gjærvektoren pAB2 4, og

Fig. 3 viser en grafisk representasjon av absorpsjonen av insulin fra et subkutant depot.

Oppfinnelsen blir videre illustrert av de følgende eksempler.

EKSEMPEL I

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid, som kan bli benyttet for å uttrykke forstadiet B(l-29)-AKR-A(1-21).

Ekspresjonskassetten, som er inneholdt i ekspresjonsplasmidet pYGABA (vist i fig. 1) på et BamHI-restriksjonsfragment, ble isolert: Ekspresjonsplasmidet ble inkubert med restriksjonsendonuklease BamHI. Betingelsene var: 20 jxg plasmid, 50 enheter BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et volum på 100 fil. Temperaturen var 37 °C, og reaksjons-tiden 2 timer. De to DNA-fragmentene ble adskilt på en 1% agarosegel, og det ønskede fragmentet isolert.

Liaerinq ( sammenbinding) på M13- vektor M13mpl8:

Det isolerte restriksjonsfragmentet ble bundet til bakteriofagvektoren Ml3mpl8 som også var kuttet med restriksjonsendonukleasen BamHI i den følgende reaksjonsblandingen: Fragment 0,2 ug, vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et volum på 20 /xl. 5 ^1 av denne blanding ble overført til E. coli-stammen JM101. Nærværet av fragment i vektoren og orienteringen av fragmentet ble besemt ved restriksjonsenzym-kartlegging på dobbelt-kjedet Ml3-DNA isolert fra transformantene.

Isolering av enkelt- kiedet ( ss) DNA ( templat) :

Fra transformanten beskrevet ovenfor ble ss-DNA isolert ifølge en metode beskrevet av Messing in Gene, 19, 269-276 (1982). 51- fosforylering av mutageniseringsprimeren: Mutageniserings-"primeren", som har sekvensen 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3', ble fosforylert i 5<1->enden i en 3 0 jul reaksjonsblanding som innheholdt 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonukleotid og 3,6 enheter T4-polynukleotidkinase. Reaksjonen ble utført i 3 0 min. ved 37°c. Så ble enzymet inaktivert ved å inkubere blandingen i 10 minutter ved 65°C.

Binding av templat og fosforylert mutagenisert primer:

Binding av templat og "primer" ble utført i et 10 pl volum som inneholdt 0,5 pmol templat, 5 pmol primer, 2 0 mM Tris-HCl,

pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM DTT og oppheting i 10 minutter ved 65°C og avkjøling etterpå til 0°C.

Forlengelse/ sammenbindingsreaksi on:

Til reaksjonsblandingen oppnådd ovenfor ble 10 jul av de følgende blandinger tilsatt; 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enheter T4 DNA-ligase og 2,5 enheter med Klenow polymerase. Så ble reaksjonen utført i 16 timer ved 16°C.

Transformasion av JM101:

Reaksjonsblåndingen ovenfor ble transformert i forskjellige fortynninger inn i CaCl2-behandlet E. coli JMlOl-celler ved bruk av standardteknikker og sådd ut i 2 x YT toppagar på 2 x YT agarskåler. (2 x YT = trypton 16 g/liter, gjærekstrakt 10 g/liter, NaCl 5 g/liter. 2 x YT toppagar = 2 x YT med 0,4% agarose tilsatt og autoklavert. 2 x YT agarskåler = 2 x YT med 2% agar tilsatt og autoklavert). Skålene ble inkubert ved 37°C over natt.

Identifisering av positive kloner:

Fremgangsmåten som ble benyttet var plaque-løft hybridisering som er beskrevet i det følgende: et nitrocellulosefilter ble plassert på en skål med en passende plaque-tetthet, slik at filteret ble fuktet. Filteret ble så badet i de følgende løsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 30 sekunder, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 minutt, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsirat) til senere bruk. Filteret ble tørket på 3MM filterpapir og bakt i 2 timer ved 80°C i en vakuumovn.

Mutageniserings-"primeren" som har sekvensen

5<1->CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3<1> ble merket radioaktivt i 5<1->enden i en 3 0 /xl volum som inneholdt 7 0 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonukleotid, 2 0 pmol gamma-<32>p-ATP og 3,5 enheter T4 polynukleotidkinase. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 3 0 minutter, og så i 5 minutter ved 100°C.

Det tørkede filteret ble prehybridisert i 2 timer ved 65°C i 6 x SSC, 0,2% bovint-serumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinyl-pyrrolidon, 0,2% natrium-dodecylsulfat (SDS) og 50 ug/ ml lakse-sperm-DNA. Så ble reaksjonsblandingen som inneholdt den merkede "proben" tilsatt til 15 ml av frisk prehybridiseringsblanding, og filteret ble badet her over natt ved 4 0°C med forsiktig risting. Etter hybridisering ble filteret vasket tre ganger for hvert 15 minutt i 2 x SSC + 0,1% SDS og autoradiografert. Etter vasking i den samme løsning, men nå ved 62°C, og en annen autoradiografi, ble plakkene som inneholdt DNA-sekvensene komplementære til mutageniserings-"primeren" identifisert.

Re- screening av positive kloner:

Fordi den identifiserte klonen er et resultat av en hetero-dupleks, ble plakken sådd ut igjen. Hybridiseringen og identifi-seringen ble gjentatt.

Opprensing av dobbelt- kiedet M13- faq- DNA.

En annengangs identifisert klon ble benyttet for inspeksjon av E. coli-stamme JM101. En kultur som besto av omtrent 10<8->fag og 5 kolonier av JM101 ble dyrket i 5 timer i en 5 ml 2 x YT medium ved 37°C. Så ble dobbelt-kjedet, sirkulært DNA renset fra bunnfallet ifølge metoden beskrevet av Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2, 1513, (1979).

Isolering av et restriksjonsfraqment som inneholdt modifiserte insulinforstadier: DNA-preparatet (omtrent 5 jxg) isolert ovenfor ble spaltet med 10 enheter av restriksjonsendonuklease BamHI i 60 jul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37°C. DNA-produktene ble adskilt på en agarosegel, og fragementet renset fra gelen.

Binding til gjærvektoren pAB24 ( Fig. 2 ) :

Det isolerte restriksjonsfra<g>mentet ble bundet til gjærvektoren pAB24 kløvet med restriksjonsendonukleasen BamHI i den følgende reaksjonsblandingen: fragment 0,2 jug, vektor 0,02 fig, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP i et totalvolum på 20 /ul. 5 /xl av denne reaksj onsblandingen ble benyttet for transformasjon av E. coli-stamme MC1061, der det modifiserte ekspresjonsplasmidet ble identifisert og ført videre. Plasmidet ble kalt pYGAB-AKR-A og var identisk til pYGABA, bortsett fra det adderte kodon.

Transformasjon av gjær:

Transformasjon av ekspresjonsplasmidet i gjærstammen Saccharomyces cerevisiae JC482/\pep/\Leu2cir° (6,his4, pep4, ura3, leu2, eir<0>) ble utført som beskrevet av Ito et al., J. Bact. Vol. 153, nr. 1, 163-168 (1983) . De transformerte cellene ble sådd ut på SC-ura medium (0,7% gjærnitrogenbase, 2% glukose, 0,5% kasaminosyrer, 2,% agar) for seleksjon av plasmidinneholdende celler.

EKSEMPEL II

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan bli benyttet for produksjon av forløperen B(l-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21).

Fremgangsmåten som var benyttet var hovedsakelig den samme som beskrevet i Eksempel I, bortsett fra at mutageniserings-"primeren" hadde sekvensen 5<1->CAACAATACCTCTCTTAGAACCCTTTGGAGTG-3<1>, og at hybridiseringsemperaturen var 42°C og at vasketemperaturen etter hybridisering var 64°C. Det modifiserte plasmidet har en sekvens identisk til pYGABA, bortsett fra de adderte kodons.

EKSEMPEL III

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan bli benyttet for produksjon av forstadiet [Gin813]-B (1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) .

Fremgangsmåten som ble benyttet var hovedsakelig den samme som beskrevet i Eksempel I, bortsett fra at templatet som ble brukt ble oppnådd ved å klone BamHI-kassetten fra pYGAB-AKR-A i M13, at mutageniserings-"primeren" hadde sekvensen

5<1->GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3<1>, at hybridiseringstemperaturen var 31°C, og at vasketemperaturen etter hybridiseringen var 53°C. Det modifiserte plasmidet hadde en sekvens identisk til pYGABA, bortsett fra de forandrede og tilførte kodons.

EKSEMPEL IV

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan bli benyttet for produksjon av forstadiet [Gln<M>, AspA2<1>]-B(l-29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21) .

Fremgangsmåten benyttet var hovedsakelig den samme som beskrevet i Eksempel I, bortsett fra at templatet som ble brukt ble oppnådd ved å klone BamHI-kassetten fra pYGAB-AKR-A i M13, og at mutaniseringen ble gjort i to trinn. I trinn 1 var "primeren" 5'-ACAACATTGTTGAACAATACC-3•, hybridiseringstemperaturen var 27°C og vasketemperaturen eter hybridiseringen var 49°C, og i trinn 2 var "primeren" 5<1->CGCTATTAGTCACAGTAGTTT-3<1>, hybridiseringstemperaturen var 29°C og vasketemperaturen etter hybridisering var 51"C. Det modifiserte plasmidet har en sekvens identisk til pYGABA, bortsett fra de forandrede og adderte kodons.

EKSEMPEL V

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan bli benyttet for produksjon av forstadiet [SerA21]-B( 1-29)-Ala-Lys-Arg-A( 1-21) .

Fremgangsmåten benyttet var hovedsakelig den samme som beskrevet i Eksempel I, bortsett fra at templatet som ble benyttet ble oppnådd ved å klone BamHI-kassetten fra pYGA-AKR-A i M13, at mutagenise-rings-"primeren" hadde sekvensen 51-GACGCTATTAAGTACAGTAGT-3 *, at hybridiseringstemperaturen var 29°C, og at vasketemperaturen etter hybridisering var 51°C. Det modifiserte plasmidet hadde en sekvens som var identisk til pYGABA, bortsett fra de forandrede og tilførte kodons.

EKSEMPEL VI

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan bli benyttet for produksjon av forstadiet [Arg827] -B( 1-29) -Ala-Lys-Arg-A( 1-21) .

Fremgangsmåten benyttet var hovedsakelig den samme som beskrevet i Eksempel I, bortsett fra at templatet som ble brukt ble oppnådd ved kloning av BamHI-kassetten fra pYGAB-AKR-A i M13, at mutageniserings-"primeren" hadde sekvensen

5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-3•, at hybridiseringstemperaturen var 43°C, og at vasketemperaturen etter hybridiseringen var 65°C. Det modifiserte plasmidet har en sekvens som er identisk til pYGABA, bortsett fra de forandrede og tilførte kodons.

EKSEMPEL VII

Ekspresjon av forstadium og isolering fra kulturmediet.

Gjær, transformert som beskrevet i Eksemplene I og VI, ble dyrket videre på Petri-skåler som inneholdt minimum-medium uten uracil i 48 timer ved 30°C. 100 ml risteflasker som inneholdt minimum-medium uten uracil + 5 g/liter kasaminosyrer + 10 g/liter ravsyre + 30 g/liter glukose ved pH 5,0, ble inokulert med en enkel koloni fra Petri-skålen. Flaskene ble så ristet ved 30°C i inkubator i 72 timer.

Etter sentrifugering ble 1 liter av samlet supernatant sterilisert ved filtrering og justert til pH 4-4,5 og en konduk-tivitet <10 mS ved tilsetning av 5 M HC1 og vann. Ved bruk av en strømning på 120 ml/time ble supernatanten så påsatt en 1,6 x 6 cm søyle med S-Sepharose<®> FF som på forhånd var ekvilibrert med 50 mM eddiksyre, 50% (ved volum) etanol jusert til pH 4,0 med NaOH. Søylen ble vasket med 60 ml buffer, og forstadiet ble eluert ved hjelp av en lineær gradient NaCl fra 0 til 0,35 M i 360 ml buffer med en strømhastighet på 10 ml/time. Eluatet ble delt inn i fraksjoner på 4 ml og undersøkt med hensyn på UV-absorbsjon. Fraksjoner som inneholdt forstadium ble identifisert ved RP-HPLC analyse og ble samlet. Etter avsalting på en søyle med Sephadex<® >G25 i 1 M eddiksyre ble forstadiet isolert ved lyofilisering.

EKSEMPEL VIII

Produksjon av [ArgA0] -des [Thr830] -humant insulin fra forstadium B(l-29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21).

250 mg B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), laget ved hjelp av metodene beskrevet i Eksemplene I og VII, ble løst opp i 4°C i 25 ml 50 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan, 20% (ved volum) etanol justert til pH 10 med HC1. Sepharose<®> som inneholdt 0,8 mg immobilisert trypsin/ml ble vasket på et glassfilter med den samme buffer og ble drenert. Buffer ble tilsatt 40 g drenert gel, og volumet justert til 75 ml. Løsningen som inneholdt forstadium ble tilsatt til suspensjonen, og blandingen ble stående i 1 time ved 4°C med svak omristing og ble så filtrert.

HPLC-analyse viser 61% omdannelse til [ArgA0]-des [Thr830] - humant insulin.

Gelen ble vasket med 50 ml buffer (uten etanol) og drenert,

og proteinene i de samlede filtratene ble utfelt ved justering av pH til 6. Presipitatet ble isolert ved sentrifugering og lyofilisering.

Presipitatet ble løst opp ved 4°C i 20 ml 7 M urea ved å justere pH til 8,1, og løsningen ble påsatt en 1,6 x 2 0 cm søyle Q-Sepharose<®> FF som tidligere ble ekvilibrert ved 4°C i 20 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan, 7 M urea jusert til pH 8,1 med HC1. Ved bruk av strømningshastighet på 40 ml/time ble søylen så eluert med en lineær gradient fra 0 mM til 50 mM NaCl i den samme buffer over 24 timer. Eluatet ble oppdaget ved UV-absorpsjon, og det første som eluerte at de to hovedtoppene ble samlet. Det oppsamlede ble avsaltet i 1 M eddiksyre i en søyle av Sephadex<®> G25 og ble lyofilisert. Utbytte var 75 mg [ArgA0]-des [Thr830]-humant insulin.

Identiteten av produktet ble bekreftet av aminosyreanalyse, ved plasmadesorpsjon-massespektrometri og ved sekvensiell Edman degradering av de adskilte vinylpyridylerte A- og B-kjedene.

EKSEMPEL IX

Produksjon av [ArgA0]-des [Thr830]-humant insulin fra forstadiet B(l-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(l-2l).

400 mg (B(l-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(l-21), som ble laget ved hjelp av de metoder som ble beskrevet i Eksemplene II og VII, ble løst opp i 50 ml 50 mM tris-(hydroksymetyl)-aminometan, 20% (ved volum) etanol og justert til pH 10 med HC1. Sepharose<®> som inneholder 0,8 g immobilisert trypsin/ml ble vasket på et glassfilter med den samme buffer og ble drenert. Buffer ble tilsatt til 80 g drenert gel, og volumet jusert til 150 ml. Løsningen som inneholdt forstadiet ble tilsatt suspensjonen og blandingen ble etterlatt i 3 0 minutter ved 20°C med svak omristing og så filtert.

HPLC-analyse viser 50% overføring til [ArgA0]-des [Thr830] - humant insulin.

Gelen ble vasket med 100 ml buffer (uten etanol) og drenert, og proteinene i de samlede filtratene ble utfelt ved å justere pH til 6. Presipitatet ble isolert ved sentrifugering og lyofilisering.

Presipitatet ble løst opp ved 4°C i 20 ml 7 M urea ved å justere pH til 8,1, og løsningen ble applisert på en 1,6 x 20 cm søyle Q-Sepharose<®> FF som på forhånd var ekvilibrert ved 4°C i 2 0 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan, 7 M urea jusert til pH 8,1 med HC1. Ved bruk av en strømningshastighet på 40 ml/time ble søylen så eluert med en lineær gradient fra 0 mM til 50 mM NaCl i den samme bufferen over 24 timer. Eluatet ble undersøkt ved UV-absorpsjon, og det første som eluerte av de to hovedtoppene ble samlet opp. Det oppsamlede ble avsaltet i 1 M eddiksyre på en søyle av Sephadex<®> G25 og lyofilisert. Utbyttet var 145 mg [Arg<A0>]-des [Thr830]-humant insulin.

Identiteten til produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved HPLC-analyse og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL X

Produksjon av [Arg<A0>]-des[Thr63<0>]-humant insulin fra griseproinsulin. 40 mg griseproinsulin ble løst opp 800 ul 0,1 M HC1, og 8 ml

50 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan ble tilsatt. En løsning på

1 U endoproteinase Lys-C fra Lysobacter enzymogenes (Boehringer Mannheim) i 200 jul 0,1 M tris-(hydroksymetyl) aminometan justert til pH 8,5 med HC1 ble laget. De to løsningene ble blandet og så etterlatt i 16 timer ved 12°C.

Reaksjonen ble stoppet ved justering av pH til 6,2 etter tilsetting av 1,8 ml 96% etanol, og den resulterende suspensjonen ble stående over natt ved 4°C. Presipitatet ble isolert ved sentrifugering og ble løst opp ved 4 ° C i 2 ml 7 M urea ved å justere pH til 8,1. Løsningen ble applisert til en 1,6 x 20 cm søyle på Q-Sephrose<®> FF som på forhånd var ekvilibrert ved 4°C i 20 mM tris-(hydroksymetyl)aminometan, 7 M urea justert til pH 8,1 med HC1. Ved bruk av en strømningshastighet å 40 ml/time ble søylen så eluert med en lineær gradient fra 0 mM til 50 mM NaCl i den samme buffer over 24 timer. Eluatet ble undersøkt ved UV-absorpsjon, og hovedtoppen ble samlet. Det oppsamlede ble avsaltet i 1 M eddiksyre i en søyle av Sephadex<®> G2 5 og lyofilisert. Utbyttet var 15 mg [ArgA0] - [Thr830]-humant insulin.

Identiteten til produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved HPLC-analyse og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XI

Produksjon av [Arg<A0>]-humant insulin-(B30 amid).

200 mg [ArgA0]-des [Thr630]-humant insulin fremstilt ved en av metodene beskrevet i Eksemplene VIII til X ble løst opp i en blanding som inneholdt 400 mg treoninamid, 2,0 ml etanol og 0,8 ml vann. pH ble justert til 6,3 med eddiksyre og 4 ml (henstått) volum Sepharose<®>, som inneholdt 3,2 mg immobilisert trypsin, ble satt til. Etter henstand i 2 timer ved 20°C med svak omristing,

ble gelen fjernet ved filtrering, og proteinet bunnfelt ved tilsetning av 10 volumer 2-propanol. Det luft-tørkede bunnfallet ble løst opp ved 4°Ci20ml7M urea ved å justere pH til 8,1, og løsningen ble applisert på en 1,6 x 2 0 cm søyle av Q-Sepharose<®> FF som på forhånd var ekvilibrert ved 4°C ved 20 mM tris-(hydroksy-metyl) aminometan, 7 M urea justert til pH 8,1 med HC1. Ved bruk av en strømingshastighet på 40 ml/time ble søylen så eluert med en lineær gradient fra 0 mM til 50 mM NaCl i den samme bufferen i løpet av 24 timer. Eluatet ble undersøkt ved UV-absorpsjon og hovedtoppen ble samlet. Det oppsamlede ble avsaltet i 1 M eddiksyre på en søyle av Sephadex<®> G25 og lyofilisert. Utbyttet var 80 mg [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) .

Identiteten av produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorpsjons-massespektrometri og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XII

Produksjon av [Gin81<3>, Arg<A0>]-des[Thr<830>]-humant insulin.

250 mg [GlnB13]-B(l-29)-Ala-Lys-Arg-A(l-21) , laget ved metoder som er beskrevet i Eksemplene III og VII, ble behandlet med immobilisert trypsin, og reaksjonsproduktet renset i det vesentligste som beskrevet i Eksempel VIII. Utbyttet var 60 mg [Gin<813>, ArgA0 ] -des [ Thr830 ] -humant insul in.

Identiteten til produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorpsjons-massespektrometri og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XIII

Produksjon av [GlnA\ AspA2<1>, Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) .

500 mg [GlnA4, AspA21 ] -B (1-29) -Ala-Lys-Arg-A (1-21) , som ble laget ved metoder beskrevet i Eksemplene IV og VII, ble behandlet med immobilisert trypsin, og det resulterende produktet ble renset i det vesentlige som beskrevet i Eksempel VIII. Utbyttet var 17 5 mg [Gln<A4>, Asp<A21>, Arg<A0>]-des[Thr<830>]-humant insulin.

Dette ble overført til B3 0-amidet ved å koble med treoninamid ved hjelp av metoden beskrevet i Eksempel XI. Utbyttet av renset [GlnA<4>, Asp<A21>, Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) var 50 mg.

Identiteten av produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorpsjons-massespektrometri og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XIV

Produksjon av [SerA2<1>, Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) .

400 mg [Ser^21 ]-B (1-29)-Ala-Lys-Arg-A(l-2l) , som ble laget ved hjelp av metoder beskrevet i Eksemplene V og VII, ble behandlet med immobilisert trypsin, og det resulterende produktet ble renset i det vesentligste som beskrevet i Eksempel VIII. Ubyttet var 125 mg [Ser^<21>, ArgA0]-des [Thr830]-humant insulin.

Dette ble overført til B3 0-amidet ved å koble med treoninamid ved hjelp av metoden beskrevet i Eksempel XI. Utbyttet av renset [Ser^<21>, Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) var 40 mg.

Identiteten til produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorpsjons-massespektrometri og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XV

Produksjon av [Arg<827>, ArgA0]-des [Thr830]-humant insulin.

250 mg [Arg827]-B( 1-29)-Ala-Lys-Arg-A( 1-21) , som ble laget ved metodene beskrevet i Eksemplene VI og VII, ble behandlet med immobilisert trypsin, og det resulterende poduktet ble renset i det vesentligste som beskrevet i Eksempel VIII. Utbyttet var 50 mg [Arg82<7>, ArgA0]-des [Thr830]-humant insulin.

Identiteten til produktet ble bekreftet ved aminosyreanalyse og ved sekvensiell Edman degradering.

EKSEMPEL XVI

Formulering av et injeksjonspreparat med forlenget virkning som inneholder oppløst [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) . 60 /zmol [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) ble løst opp i 4 ml 0,1 M HCl, og 2 0 ml 1,5% m-kresol ble tilsatt. Løsningen ble blandet med 70 ml 1% NaCl og 3,2 5 ml 0,1 M ZnCl2, og pH justert til 4,0. Volumet ble endelig justert til 100 ml med vann og sterilisert ved hjelp av filtrering.

EKSEMPEL XVII

Formulering av et injeksjonspreparat med forlenget virkning som inneholder en krystallinsk suspensjon av [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid). 60 juitiol [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) ble løst i 70 ml 1% NaCl-løsning som inneholdt 0,5% m-kresol ved å justere pH til 9,7 med 1 M NaOH, og 325 fil 0,1 M sinkacetat ble tilsatt. Etter rejustering av pH til 9,7, ble volumet justert til 80 ml med vann, og løsningen sterilisert ved filtrering. 2 0 ml 65 mM NaH2P04, som innheholdt 0,3% m-kresol og justert til pH 6,0 med NaOH, ble sterilisert ved filtrering.

Under sterile betingelser ble de to løsninger blandet og den resulterende suspensjon ble etterlatt ved 20°C i 1 time under meget forsiktig omrøring. pH ble endelig justert til 7,3 med HCl.

EKSEMPEL XVIII

Demonstrasjon av forlenget virkning etter subkutan injeksjon i rotter ved hjelp av ekstern gamma-telling.

For eksperimentene ble Wistar-hunnrotter med omtrent 2 50 g kroppsvekt og som var mer enn 90 dager gamle benyttet. Rottene ble akklimatisert i omtrent en uke før de ble benyttet og foret ad libitum. I fire dager før eksperimentene startet, fikk rottene en 20 mM vandig løsning av kaliumjodid som drikkevann.

Testpreparatene var:

I. Suspensjonspreparat som inneholdt [Arg<A0>]-humant insulin-(B3 0-amid) og laget ifølge Eksempel XVII. II. Løsningspreparat som inneholdt [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) og laget ifølge Eksempel XVI. III. Et hurtigvirkende løsningspreparat som inneholdt semi-syntetisk humant insulin (Velosulin<®>, 100 U/ml).

Alle tre formuleringene inneholdt i tillegg henholdsvis

50 /iCi/ml [mono-<125>I]-insulin eller -insulinsubstans-tracer som ble laget ved hjel av standard radiojoderingsfremgangsmåter.

Rottene ble injisert subkutant på baksiden av låret med 50 /il preparat som inneholdt 3,5 nmol insul insubstans og 2,5 jizCi [125I]-merket markør. Under den eksperimentelle tiden ble rottene immobilisert i rotteholdere.

Forsvinningen av markør ("tracer") fra injeksjonsstedene, som er et mål for absorpsjon av insulinsubstans fra det subkutane depot (C. Binder: Absorption of Injected Insulin. Munksgaard, København 1969), ble målt ved bruk av to stasjonære MIP-10 hastighetsmetere og detektorene E749 med 3 mm Nal scintillasjonskrystaller med Be-vinduer og kollimatorer med 60° visuell vinkel og 10 mm åpninger (Raytronic). Hastighetsmeterne ble bundet sammen med mini-skrivere 121N (Raytronic). Detektorene ble låst fast 2 cm over huden ved injeksjonsstedene. Radioaktiviteten ble målt i løpet av en 5 minutters periode ved 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 8, 12 og 24 timer etter injeksjonen av preparatet. Etter subtraksjon av bakgrunnstallene, ble tellehastighetene overført til prosenter av det opprinnelige telletall.

I Figur 3 er gjennomsnittsverdiene til restradioaktiviteten vist som en funksjon av tiden for hvert preparat. Ved å ta tiden for 50% restaktivitet (T50%) som et mål for forlengelsen, ble det funnet fra kurvene at:

Disse resultatene at begge preparatene som inneholder [Arg<A0>]-humant insulin-(B30-amid) viser uttalt forlengelse sammenlignet med det hurtigvirkende humane insulinpreparatet.

EKSEMPEL XIX

Formulering av et injeksjonspreparat med forlenget virkning som inneholder en løsning av [Arg<A0>, Arg627]-des [Thr830]-humant insulin. 12 iimol [ArgA0, Arg827]-des [Thr830]-humant insulin ble oppløst i 35 ml 1% NaCl-løsning som inneholdt 0,5% m-kresol ved å justere pH til 3,5 med 1 M HCl, og 650 /xl 0,1 M sinkacetat ble tilsatt. Etter rejustering av pH til 3,5, ble volumet justert til 50 ml med vann og løsningen sterilisrt ved filtrering.

EKSEMPEL XX

Demonstrering av forlenget virkning i kaniner etter subkutan injeksjon.

Graden av forlengelse av et løsningspreparat som inneholdt 0,24 mM [ArgA0, Arg<827>]-des[Thr<830>]-humant insulin, som ble laget ifølge Eksempel XIX, ble undersøkt i kaniner ifølge metoden beskrevet i British Pharmacopoeia, 1980. 65 jul av preparatet ble injisert subkutant i 6 kaniner, og blodprøver ble samlet for glukosebestemmelse øyeblikkelig før injeksjon og ved 1, 2, 4 og 6 timer etter injeksjonen. Glukoseverdiene ble uttrykt som prosent av verdien før injeksjonen.

Undersøkelsen viste de følgende gjennomsnittsverdier:

Ved å bestemme indeks for forlengelsen ifølge metoden beskrevet i J. Markussen et al: Protein Engineering vol. 1 nr. 3, s. 205-213 (1987) ble en verdi på 42 beregnet. Ved sammenligning med resultatene i tabell 1, ibid. ble løsningspreparatet som inneholdt [ArgA0, Arg82<7>]-des[Thr83<0>]-humant insulin funnet å ha den samme forlengelsen som det vanlig benyttede lengevirkende sink-insulinsuspensjons-preprat Actrapid<®> Human.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av insulinforbindelser med formelen II: hvor E representerer individuelt Glu eller en nøytral aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser, N representerer en aminosyrerest som kan bli kodet for av nukleotidsekvenser, T representerer Thr eller Arg, X representerer Thr, Ser, Ala eller OH, og Y representerer OR eller NR1 R2, hvor R, R<1> og R<2> hver for seg representerer hydrogen eller lavere alkyl, bortsett fra at Y er ikke tilstede når X representerer OH, karakterisert ved at et insulinforstadium med generell formel III: hvor E, N og T har alle den samme betydning som beskrevet i krav 1, (AA)n representerer en peptidkjede som har n aminosyrerester og har Lys som den C-terminale rest, eller er en peptidbinding når n = 0, og Z representerer hydrogen eller en peptidkjede av vilkårlig lengde som har Lys som den C-terminale rest, blir transpeptidert eller spaltet ved en endopeptidase som har eksklusiv spesifisitet for kløyving på karboksysiden av en lysinrest.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at hver E individuelt representerer Glu eller Gin, N representerer Asn, Asp, Ser eller Gly, T representerer Thr eller Arg, X representerer Thr, og Y representerer NH2.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at alle E representerer Glu, N representerer Asn, T og X representerer begge Thr, og Y representerer NH2.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at alle E representerer Glu, N representerer Ser, T og X representerer begge Thr, og Y representerer NH2.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at E i posisjon B13 representerer Gin, og de gjenværende E representerer alle Glu, at N representerer Asn, at T og X begge representerer Thr, og Y representerer NH2.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at E i posisjon A4 representerer Gin, og de gjenværende E representerer alle Glu, N representerer Asp, T og X representerer begge Thr, og Y representerer NH2.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at alle E representerer Glu, N representerer Asn, T representerer Arg, og X representerer OH.