PT93502B

PT93502B - Processo para a preparacao de novos derivados de insulina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT93502B
Application number: PT93502A
Authority: PT
Inventors: Per Balschmidt; Finn Benned Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1996-02-29
Also published as: CA2049961A1; DE69015811D1; EP0463072A1; AU5344890A; IL93792A0; IE66564B1; FI914419A7; JPH04503808A; DD298788A5; DE69015811T2; US5430016A; NZ232953A; FI914419A0; NO300640B1; ATE116661T1; IE901004L; ES2068384T3; ZA902086B; HUT58349A; DK0463072T3

Description

NOVO NORDISK A/S

Processo para a preparação de novos derivados de insulina e de conposicòes farmacêuticas gue os contêm

A presente invenção refere-se a novos compostos insulínicos, a um processo para a sua preparação e a preparações terapêuticas que mostram uma acção prolongada e que incluem, pelo menos, um dos novos compostos de insulina e, se apropriado, uma insulina de acção rápida.

Desde a descoberta da insulina em 1922 têm-se utilizado preparações de insulina de muitos tipos diferentes para o tratamento de Diabetes mellitus. Inicialmente, apenas se utilizavam as soluções de insulina que exibiam actividade insulínica que começava rapidamente e que cessava rapidamente, mas posteriormente desenvolveram-se preparações de insulina que exibiam um perfil mais amplo de actividade, mediante uma boa solubilidade da insulina por meio de adição de, por exemplo, sais de zinco ou protaminas. Devido à disponibilidade, a insulina então utilizada era tradicionalmente extraída do pâncreas de animais domésticos, frequentemente, do boi, porco e carneiro. Contudo, têm sido postas no mercado recentemente preparações contendo insulina humana proveniente de biotecnologia.

( A estrutura da insulina humana é representada pela geral I.

fórmula

Cadeia-A

S----s

I 7 |

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser 1 2 3 4 5 6| 8 9 10 11 12

S

I s

Cadeia-B (

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 123456789 10 11 12

Cadeia-A (cont.) 20

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

14 15 16 17 18 19 ( 21 ,-S

I

S

Cadeia-B (cont.) |

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Cadeia-B (cont.)

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr 25 26 27 28 29 30

2'

As insulinas provenientes de certos animais domésticos apresentam uma estrutura muito idêntica com a da insulina humana. A insulina de cão e de porco apenas difere da insulina humana porque contém um resíduo Ala em substituição de Thr na posição-30 da cadeia-B e a insulina de coelho apenas por conter um resíduo Ser na mesma posição. Estas insulinas podem converter-se na insulina humana por substituição do resíduo de aminoácido B30 por Thr, mediante processos semi-sintéticos, como descrito, por exemplo, por Morihara et al, Nature 280 (1979), 412-13 e Marcussen (Patente de Invenção norte americana NQ. 4

343 898).

As preparações que contêm insulina em solução apresentam, habitualmente, uma acção rápida, cessando a actividade insulínica algumas horas após a injecção. Assim, é necessário fazer várias injecções, normalmente várias vezes ao dia, para normalizar a glicémia no diabético.

A fim de suprimir esta desvantagem das preparações de insulina, têm-se preparado composições de acção prolongada de modo a que a actividade insulínica se mantenha várias horas, por vezes até horas ou ainda mais. A utilização destas preparações de acção prolongada permite que os doentes diabéticos apenas recebam um pequeno número de injecções diárias, por exemplo uma ou duas injecções durante 24 horas.

Esta acção prolongada pode obter-se por transformação da insulina num sal ligeiramente solúvel, como por exemplo a insulina-zinco ou a insulina-protamina. Os sais de insulina ligeiramente solúveis são utilizados para a formação de suspensões a partir das quais a insulina se liberta, gradualmente, após a injecção intramuscular ou subcutânea.

Recentemente, têm sido utilizados outros métodos para se obter uma acção prolongada. Um exemplo destes é a encapsulação de cristais de insulina em albumina sérica polimerizada. Outro exemplo, é a aplicação de dispositivos de perfusão de acção contínua, designados por bombas de insulina que, contudo, podem ser desconfortáveis e causar risco ao doente.

As memórias descritivas dos Pedidos de Patentes de Invenção

Europeias Publicada NQs. EP 132 770, EP 132 769 e EP 135 720 descrevem a preparação e a aplicação de derivados de insulina em que o C- -terminal da cadeia-B é prolongado com um grupo orgânico que transporta pelo menos uma carga positiva, de preferência Arg-OH ou Arg-Arg-OH. As preparações que contêm suspensões destes derivados da insulina exibem acção prolongada. No entanto, estes compostos insulínicos não são muito apropriados para a composição de novas preparações de insulina prolongada úteis, porque o grau de prolongamento se verificou ser muito limitado (J. Markussen et al.: Protein Engineering 1,

205-213 (1987).

As propriedades de derivados de insulina em que o N-terminal da cadeia-B se prolonga com o dipéptido Arg-Arg encontram-se descritas por R. Geiger & F. Enzmann em: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin e C-peptide, Tokushima 1978; Excerta, Medica, Amesterdão, págs. 306-310, 1979. A solubilidade deste composto de insulina cerca do seu ponto isoeléctrico descobriu-se ser ainda maior do que a da insulina normal.

As substituições na molécula de insulina podem introduzir-se com a finalidade de melhorar o seu perfil de actividade no tratamento de diabetes. Assim, a Patente de Invenção Europeia Publicada NQ. EP 194 864 refere que uma ou mais substituições de Glu por, por exemplo, Gin e/ou a substituição de Thr^B27 por Arg associada ao bloqueio do grupo carboxilo C-terminal na forma de éster ou de amida, provoca uma variação da zona de precipitação da insulina de forma a obter-se uma libertação lenta após a injecção.

A utilização deste tipo de compostos insulínicos, contendo substituições de aminoãcidos internos, nas preparações para o tratamento a longo prazo de diabetes comporta um risco substancial de activação do sistema imunitário do doente provocando a introdução de anticorpos de insulina no sangue.

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Nos últimos anos têm sido feitas diversas tentativas para encontrar substituições para as preparações de insulina tradicionais com acção insulínica prolongada. As razões para esta atitude provêm dos diabetologistas considerarem que as preparações de insulina prolongada tradicionais têm uma acção demasiadamente curta, especialmente após a introdução da insulina humana e de que essa introdução da chamada caneta de insulina necessita uma insulina dissolvida de acção prolongada.

objectivo da presente invenção é fornecer novos análogos de insulina que exibem uma acção de insulina prolongada e que apresentem uma antigenicidade tão baixa quanto possível.

Descobriu-se agora, surpreendentemente, que os compostos de insulina de fórmula geral II

Cadeia-A

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser0 1 2 3 4 5 6 ' 8 9 10 11 12

S

Cadeia-B

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Cadeia-A (cont.)

L

Lfcu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21

I-s

I

Cadeia-B (cont.) s ' f

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Cadeia-B (cont.)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30 na qual

E representa Glu ou um resíduo de aminoácido neutro que pode ser codificado por sequências nucleotídicas;

N	representa	um	resíduo de aminoácido	que	pode	ser
	codif içado	por	sequências nucleotídicas;
T	representa	Thr	ou Arg;
X	representa	Thr,	Ser, Ala ou OH; e
Y	ou está ausente quando X representa um	grupo OH	ou
	representa	um	grupo de fórmula geral OR	ou	NR1R2,	em
	que R, Ri	e Rs	representam, cada um, independentemente

um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior;

exibem uma acção insulínica prolongada e/ou antigenicidade apropriadas.

Assim, a presente invenção refere-se a compostos de insulina de fórmula geral II:

Cadeia-A

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser012 345 6 | 89 10 11 12

S

I

Cadeia-B

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 123456789 10 11 12

Cadeia-A (cont.)

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21

Cadeia-B (cont.)

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Cadeia-B (cont.) .

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30 na qual

N	representa	um	resíduo	de aminoácido	que	pode	ser
	codif içado	por	sequências nucleotídicas;
T	representa	Thr	ou Arg;
X	representa	Thr,	Ser, Ala	ou OH; e
Y	ou está ausente quando	X representa um	grupo OH	ou
	representa	um	grupo de	fórmula geral OR	ou	NRiRz,	em

que R, Ri e Rz representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior.

No presente contexto alquilo inferior entende-se significar grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 6 átomos de carbono.

A presente invenção relaciona-se em particular com compostos insulínicos de fórmula geral II na qual E representa Glu ou

Gin, N representa Asn, Asp, Ser ou Gly, T representa Phr ou

Arg, X representa Thr e Y representa o grupo NHz.

A presente invenção relaciona-se de preferência com compostos de insulina de fórmula geral II na qual pelo menos um de entre os símbolos Ε, N e T representa um resíduo de aminoácido diferente do resíduo correspondente da insulina humana, quando

Y representa um grupo OH.

A presente invenção refere-se especificamente a compostos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os símbolos E representam, cada um, Glu, N representa Asn, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo NH2 .

A presente invenção refere-se especificamente a compostos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os símbolos E representam Glu, N representa Ser, R e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo NH2.

A presente invenção refere-se especificamente a compostos derivados de insulina de fórmula geral II na qual o símbolo E na posição B13 representa Gin e em todas as posições restantes representa Glu, N representa Asn, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo NH2.

A presente invenção refere-se especificamente a compostos derivados de insulina de fórmula geral II na qual o símbolo E na posição A4 representa Gin, e nas posições restantes representa sempre Glu, N representa Asp, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo NH2.

A presente invenção refere-se especificamente a compostos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os grupos representados por E são Glu, N representa Asn, T representa Arg e X representa um grupo OH.

A presente invenção ainda se refere a um método para a preparação de compostos derivados de insulina de fórmula geral

II a partir do precursor de insulina de fórmula geral III:

ΙΛ

X Ο I

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na qual

Ε, N e T têm todos os significados como definidos antes;

(AA)n representa uma cadeia peptídica contendo n resíduos de aminoácido e Lys como resíduo C-terminal ou uma ligação peptídica quando n representa 0, e Z representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia peptídica de comprimento arbitrário, apresentando Lys como resíduo C-terminal que é transpeptidada ou cindida por uma endopeptidase com especificidade exclusiva para a cisão no lado carboxi do resíduo de lisina.

A presente invenção também se refere a preparações de insulina contendo pelo menos um composto de insulina de fórmula geral II e, eventualmente, uma acção insulínica rápida, tal como a insulina humana, a insulina proveniente de animais domésticos ou os seus derivados ou análogos.

Estas preparações podem apresentar-se sob a forma de uma solução pronta a usar ou de uma preparação liofilizada para se reconstituir com água estéril, antes da aplicação.

Um aspecto particularmente vantajoso das preparações de insulina da presente invenção, consiste numa preparação para administração parentérica que exibe acção insulínica prolongada e que contém uma solução de pelo menos um composto de insulina desta invenção em um meio aquoso, isosmótico com o soro de sangue, com um pH entre 4 e 5,5 e contendo, eventualmente, um agente tampão e/ou um agente conservante e, se apropriado, uma insulina de acção rápida. Os compostos de insulina da presente invenção preenchem as necessidades dos diabetologistas devido às alterações mínimas da molécula da insulina humana, sendo cada uma familiar para o organismo humano ou que comprovada através de diversos anos se verificou não desafiar uma resposta imune. 0 aspecto principal dos compostos de insulina desta invenção, consiste em poderem referir-se como insulina humana em que o resíduo de arginina foi ligado ao N-terminal e à cadeia-A e em que o grupo carboxilo C-terminal da cadeia-B foi, de preferência, bloqueado sob a forma da amida. Os compostos de insulina destinam-se a serem utilizados dissolvidos numa solução ácido fraca e, sob estas condições, pode ocorrer a desaminação substancial do resíduo asparagina na posição A21 durante o período de validade da preparação e portanto prejudicar a acção prolongada. Pela introdução de uma substituição de um ou possivelmente dois dos resíduos de ácido glutâmico com glutamina pode controlar-se este efeito.

No caso de diabetes dependente de insulina uma terapêutica, frequentemente utilizada, consiste em duas injecções diárias de uma preparação de insulina prolongada, uma de manhã e outra à noite, exactamente antes de deitar, a fim de criar uma taxa de insulina basal. Adicionalmente, são dadas 3 injecções de uma ti }

preparação de insulina de acção rápida antes das três refeições principais. A desvantagem desta terapêutica é que a última injecção da preparação prolongada pode resultar numa taxa de glucose no sangue, perigosamente baixa, durante a noite. Esta circunstância pode evitar-se injectando uma preparação mista de uma insulina de acção prolongada e uma de insulina de acção rápida antes do jantar porque, se ocorrer hipoglicémia, em absoluto, durante a noite, esta poderá ser evitada por meio de, por exemplo, uma refeição ligeira. Contudo, este tipo de terapêutica resulta frequentemente em hiperglicémia matinal uma vez que a maior parte das preparações de insulina prolongada

Insulatard<^R> e Monotard<^R> não actuam durante tempo suficiente. Portanto, existe a necessidade de proporcionar aos doentes diabéticos preparações de insulina de actuação mais prolongada do que as preparações usadas correntemente, em particular se uma injecção duma destas preparações for suficiente para um ou para vários dias. As preparações de insulina preparadas de acordo com a presente invenção exibem uma acção de insulina prolongada, de mais longa duração do que a preparação Monotard<^R> de insulina prolongada, correntemente utilizada.

Os compostos insulínicos preferidos da presente invenção são particularmente vantajosos para a preparação de soluções porque a sua solubilidade é elevada, mesmo ainda que a um pH cerca de (pH a que a desaminação é substancialmente reduzida) e ainda

porque exibem acção	prolongada	acentuada	após	inj ecção
subcutânea.
A presente invenção	refere-se em	particular	aos	compostos

específicos seguinte:

[Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) [Arg^AO,Gln^B13]-insulina humana-(B30-amida) [Arg^AO,Gln^A4,Asp^A21]-insulina humana-(B30-amida) [Arg^AO,Ser^AZ1]-insulina humana-(B30-amida) [Arg^AO,Arg^B27j-des[Thr^B30]-insulina humana.

Os compostos derivados de insulina da presente invenção podem preparar-se a partir de outras insulinas, mediante introdução de resíduo de arginina adicional no N-terminal da cadeia-A da molécula da insulina, por meio de síntese química, mas apenas com grande dificuldade. Uma via muito mais atraente é a conversão catalisada por enzimas de um precursor de cadeia simples, por exemplo, de uma pró-insulina de ocorrência natural ou de uma pré-pró-insulina ou de um precursor, preparado por meio de biossíntese, de forma geral III:

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na qual

Ε, N e T têm os significados como definidos para a fórmula geral II;

(AA)n representa uma cadeia peptídica contendo n resíduos de aminoácidos e Lys como resíduo C-terminal, ou representa uma ligação peptídica quando n representa 0;

e

Z representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia peptídica de comprimento arbitrário apresentando Lys como resíduo C-terminal.

A enzima utilizada para a transformação enzimática deve ser uma endopeptidase como a tripsina capaz de cindir uma cadeia peptídica no grupo carboxi lateral de um resíduo de lisina. A própria tripsina pode ser utilizada com frequência mas é particularmente vantajosa a utilização de uma endopeptidase que exiba especificidade para a lisiana, por exemplo endoproteinase Lys-C proveniente Lysobacter enzymogenes ou Lisil-endopeptidase proveniente de Achromobacter lyticus (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Pode realizar-se a reacção de transpeptidação utilizando-se treonina-amida sob condições idênticas às descritas, por exemplo, na Patente de Invenção Europeia Publicada N-o. EP

163 529, resultando deste modo directamente na B30-amida, mas pode ainda realizar-se uma reacção de duas fases, que se inicia com uma que pode ligação, cisão enzimática que resulta no composto des(Thr^B30) transformar-se na B30-amida por meio de uma reacção de como descrito por Morihara et al., loc. cit..

Os precursores dos compostos de insulina da presente invenção podem preparar-se por biossíntese numa levedura hospedeira que exprime uma sequência de DNA que codifica o precursor.

Para se obter a secreção num meio de crescimento, a sequência de DNA que codifica o precursor de insulina pode fundir-se com outra sequência de DNA que codifica um péptido sinal funcional na levedura.

Pode conseguir-se a secreção por inserção no plasmídeo de expressão da sequência líder MFal de Saccharomyces cerevisiae (Kurjan & Herskowitz, Cell 2J2L, 933-943 (1982)). Numa construção preferida, a sequência de DNA que codifica a sequência líder MFal completa, inclui o sítio dibásico LysArg, mas exclui a sequência peptídica GluAlaGluAla, sendo utilizado o substrato para a levedura protease DPAP (dipeptidil aminopeptidase). Deste modo consegue-se uma secreção eficiente de precursor de insulina comportando o N-terminal correcto.

As sequências de DNA codificadoras modificadas dos precursores de insulina foram construídas pela realização de mutagénese in vitro numa cassete de expressão contida no fragmento de restrição BamHI a partir do plasmídeo de expressão pYGABA como está representado na Figura 1. 0 plasmídeo contém os marcadores de selecção e os sinais de replicação funcionais na levedura e tem um comprimento de 1103 pares de bases. 0 fragmento BamHI contém o seguinte: GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase região a montante que contém as sequências do promotor desde a posição -389 até -1, de acordo com Bitter & Egan, Gene 32. 263274, (1984). A extremidade 5' da região a montante adicionaramse adaptadores BamHI. Esta sequência promotora é fundida directamente com a sequência descrita por Kurjan & Herskowitz, que codifica 85N-terminal aminoácidos da sequência líder MFal. A sequência líder MFal funde-se directamente com a sequência codificadora para o precursor de insulina de cadeia simples des[Thr^B30]-insulina humana (SCI), que é um gene construído sinteticamente com a sequência:

TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTAAGCAATTGGTTGTGAACACACCAÀGAGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACACCAPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTCTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGTTTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACAGluArgGlyPhePheTyrThrProLysGlylleValGluGlnCysCysThrSerlleCysSall

TCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAATAGCGTCG

AGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCT

SerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnEndEnd

Também é evidente que a tradução do gene precursor de insulina termina com dois codoes de paragem e, imediatamente a seguir, está situado um sítio de restrição Sall. A região de terminação é idêntica ao fragmento de restrição SalI-BamHI descrito na

Patente de Invenção Europeia Publicada NQ. 0 116 201 Al. A sequência é construída utilizando-se apenas técnicas convencionais .

método de mutagene utilizado foi a mutagénese de sítio dirigido de oligonucleótidos que está descrita por Zoller & Smith, DNA, Vol. 2., NQ. 6, 479-488 (1984). A descrição resumida do método é a que segue, mas está descrito com maior pormenor no Exemplo 1. A sequência precursora de insulina isolada do plasmídeo de expressão é inserida no vector bacteriofágico M13 circular de cadeia simples. No genoma de cadeia simples é circularizada uma cadeia de DNA complementar sintetizada por via química. A cadeia de DNA contém, no DNA circular, a sequência desejada rodeada por sequências totalmente homólogas às sequências de insulina. In vitro, o iniciador é então prolongado no comprimento completo do genoma circular, por via bioquímica, utilizando-se polimerase de Klenow. Esta cadeia originará fagos de cadeia simples que, quando se desenvolvem em E. coli, facultam a possibilidade de isolamento de DNA de cadeia dupla completando a sequência desejada. A partir deste DNA de cadeia dupla, pode ser isolado e reinserido num vector de expressão, um fragmento de restrição.

A presente invenção é explicitada com maior pormenor em seguida na referência aos desenhos em que:

Fig. 1 mostra o plasmídeo de expressão pYGABA 14276,

Fig. 2 mostra o vector de levedura pAB24, e

Fig. 3 representa graficamente a absorção de insulina a partir de um depósito subcutâneo.

A presente invenção é esclarecida melhor pelos seguintes.

exemplos

EXEMPLO I

Construção de um plasmídeo de expressão que se pode utilizar para expressar o precursor B(1-29)-AKR-A(1-21).

Isolou-se a cassete de expressão que está contida no plasmídeo de expressão pYGABA (representado na Fig. 1) em um fragmento de restrição. Incubou-se o plasmídeo de expressão com a endonuclease de restrição BamHI. As condições foram: 20 ug de plasmídeo, 50 unidades de BamHI, 100 mH de NaCl, 50 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2 e 1 mM de DTT num volume de 100 microlitros. A temperatura era de 37°C e o tempo de reacção 2 horas. Separaram-se os dois fragmentos de DNA num gel de agarose a 1% isolando-se o fragmento desejado.

Ligação ao M13 do vector M13mpl8:

fragmento de restrição isolado ligou-se ao vector bacteriofágico M13mpl8 também cortado com endonuclease de restrição BamHI na seguinte mistura reaccional: 0,2 p.g de fragmento, 0,02 ug de vector, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM de DTT e 1 mM ATP num volume de 20 microlitros. Transformaram-se 5 microlitros desta mistura na estirpe de E. coli JM101. A presença do fragmento no vector e a orientação do fragmento foi determinada por mapeação com enzima de restrição em DNA M13 de cadeia dupla, isolado das transformantes.

Isolamento de DNA de cadeia simples (ss). (matriz):

A partir das transformantes citadas anteriormente isolou-se

DNA-ss de acordo com o método descrito por Messing em Gene, 19. 269-276 (1982).

Fosforilacão 5' do iniciador de mutagenizacão:

iniciador de mutagénese com a sequência 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3' fosforilou-se na extremidade 5' numa mistura reaccional de 30 ulitros constituída por 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM de DTT, 1 mM ATP, 100 pmoles de oligonucleótido e 3,6 unidades de T4 polinucleótido-quinase.

Realizou-se a reacção durante 30 minutos à temperatura de 37°C.

Em seguida a enzima foi inactivada por incubação da mistura durante 10 minutos à temperatura de 65°C.

Circularizacão de matriz e de iniciador de mutagénese f osf orilado

A circularização da matriz e do iniciador realizou-se num volume de 10 ulitros contendo 0,5 pmole de matriz, 5 pmoles de iniciador, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl e 1 mM DTT mediante aquecimento durante 10 minutos à temperatura de

65°C e arrefecimento posterior para 0°C.

Reaccão de extensão/ligacão ·

Adicionou-se à mistura reaccional obtida anteriormente, 10 ulitros da mistura seguinte: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM

MgCl2, 10 mM DTT, 3 unidades de T4 DNA ligase e 2,5 unidades de polimerase de Klenow. Em seguida procedeu-se à reacção durante horas à temperatura de 16°C.

Transformação de JM101:

A mistura reaccional obtida anteriormente foi transformada em diferentes diluições em células E. coli JM101 tratadas com cloreto de cálcio utilizando-se técnicas convencionais e plaqueando-se em 2 x YT topagar, em placas de agar 2 x YT.

(2 x YT - 16 g de triptona/litro, 10 g de extracto de levedura/litro, 5 g de cloreto de sódio/litro. (2 x YT topagar - 2 x YT com agarose adicionada a 2,4% e autoclavada. Placas x YT de agar - 2 x YT com adição de agar a 2% e autoclavadas). Incubaram-se as placas durante a noite à temperatura de 37°C.

Identificação do clones positivos:

método utilizado foi a hibridação em placa (plaque-lift) que se descreve em seguida: colocou-se um filtro de nitrocelulose numa placa com uma densidade de placa apropriada de modo a que o filtro ficasse humidificado. Em seguida o filtro foi banhado nas solução seguintes: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH, durante 30 segundos, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 durante 1 minuto, x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M de citrato de sódio) até à sua posterior utilização. Secou-se o filtro com papel de filtro 3MM e, posteriormente, aqueceu-se durante 2 horas à temperatura de

80°C em estufa de vácuo.

iniciador da mutagénese apresentava a sequência 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3' que foi marcada com radioactividade na extremidade 5', num volume de 30 ulitros contendo 70 mM

Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmoles de

/ oligonucleótido 20 pmoles de gama-³²p-ATP e 3,5 unidades de T4 polinucleótido quinase. Incubou-se a mistura à temperatura de

37°C durante 30 minutos e em seguida à temperatura de 100°C durante 5 minutos.

filtro seco foi pré-hibridado durante 2 horas à temperatura de 65°C em 6 x SSC, 0,2% de sero-albumina bovina, 0,2% de

Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e 50 pg/ml de DNA de esperma de salmão. Em seguida, a mistura reaccional contendo a sonda marcada adicionou-se a 15 ml de mistura de pré-hibridação recente e o filtro foi banhado aí durante a noite à temperatura de 40°C sob agitação moderada. Após hibridação, lavou-se o filtro por três vezes durante 15 minutos de cada vez com 2 x SSC + 0,1% SDS e auto-radiografou-se. Após lavagem na mesma solução, mas agora à temperatura de 62°C e após outra auto-radiografia, identificaram-se as placas que continham sequências de DNA complementares ao iniciador de mutagénese.

Repetição da sondagejn.de clones positivosDevido ao clone identificado constituir um resultado de um heteroduplex, repetiu-se a plaqueação da placa. Repetiram-se a hibridação e a identificação.

Purificação de DNA fágico M13 de cadeia dupla:

clone sondado novamente utilizou-se para infecçâo da estirpe de E. coli JM101. Desenvolveu-se uma cultura contendo aproximadamente 10® fagos e 5 colónias de JM101 durante 5 horas em 5 ml de um meio 2 x YT à temperatura de 37°C. Em seguida, o DNA circular de cadeia dupla foi purificado a partir do grânulo de acordo com o método descrito por Birnboim & Doly, Nucleic

Acids Res., 2, 1513 (1979).

Isolamento de um fragmento de restrição contendo o precursor de insulina modificado.·

A preparação de DNA isolado anteriormente (aproximadamente 5

Ug) foi digerida com 10 unidades da endonuclease de restrição BamHI em 60 ulitros de 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 e 1 mM DTT durante 2 horas à temperatura de 37°C. Separaram-se os produtos de DNA em gel de agarose e purificou-se o fragmento contido no gel.

Ligação ao vector de levedura pAB24 (Figura 2):

fragmento restringido isolado, ligou-se ao vector pAB24 de levedura, digerido com a endonuclease de restrição BamHI na mistura reaccional seguinte: 0,2 ug de fragmento, 0,02 ug de ν

vector, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM

ATP num volume total de 20 qlitros. Utilizaram-se 5 ulitros desta mistura reaccional para a transformação da estirpe de E.

coli MC1061 na qual se identificou e propagou o plasmídeo de expressão modificado. 0 plasmídeo foi designado por pYGAB-AKR-A sendo idêntico a pYGABA excepto no codão adicionado.

Transformação de levedura:

A transformação do plasmídeo de expressão na levedura da estirpe Saccharomyces cerevisiae JC482/\pep/\Leu2cir⁰ (a,his4, pep4, ura3, leu2, cir⁰) realizou-se de acordo com a descrição de Ito et al., J. Bact. Vol. 153. NQ. 1, 163-168 (1983).

Plaquearam-se as células transformadas em meio SC-ura (0,7% de base azotada de levedura, 2,0% de glucose, 0,5% de casaminoácidos, 2,0% de agar) para a selecção das células contendo o plasmídeo.

EXEMPLO II

Construção de um plasmídeo de expressão que se pode utilizar para a produção do precursor B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21).

processo utilizado foi essencialmente idêntico ao descrito no exemplo 1, excepto que o iniciador de mutagénese tinha a ζ

sequência 5'-CAACAATACCTCTCTTAGAACCCTTTGGAGTG-3' que a temperatura de hibridação de 42°C e que a temperatura de lavagem após hibridação foi 64°C. 0 plasmídeo modificado apresenta uma sequência idêntica à de pYGABA com excepção dos codões adicionados .

EXEMPL.Q III

Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser utilizado para produção do precursor [Gln^E13]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21).

processo utilizado foi essencialmente idêntico ao descrito no exemplo 1 excepto que a matriz utilizada foi obtida por clonagem da cassete BamHI proveniente de pYGAB-AKR-A em M13 cujo iniciador de mutagénese apresentava a sequência 5'-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3' e que a temperatura de hibridação foi de 31°C e que a temperatura de lavagem após hibridação foi de 53°C. 0 plasmídeo modificado apresenta uma sequência idêntica a pYGABA com excepção dos codões alterados e adicionados.

EXEMPLO IV

Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser utilizado para produção do precursor [Gln^A4,Asp^A21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) .

processo utilizado foi essencialmente idêntico ao descrito no exemplo 1, excepto que a matriz utilizada foi obtida por clonagem da cassete BamHI proveniente de pYGAB-AKR-A em M13 e que a mutagénese se processou em duas fases. Na fase 1 o iniciador foi 5 '-ACAACATTGTTGAACAATACC-3' , que a temperatura de hibridaçâo foi de 27°C e a temperatura de lavagem, após hibridaçâo, foi de 49°C e, na fase 2, o iniciador foi 5'-CGCTATTAGTCACAGTAGTTT-3', que a temperatura de hibridaçâo foi de 29°C e a temperatura de lavagem, após hibridaçâo, foi de

51°C. 0 plasmídeo modificado apresenta uma sequência idêntica a pYGABA com excepção dos codões alterados e adicionados.

EXEMPLO V

Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser utilizado para produção do precursor [Ser^A21]-B(1-29 )-Ala-Lys-Arg-A(1-21).

processo utilizado foi essencialmente idêntico ao descrito no exemplo 1 excepto que a matriz utilizada foi obtida por clonagem da cassete BamHI proveniente de pYGAB-AKR-A em M13 cujo iniciador de mutagénese apresentava a sequência 5'-GACGCTATTAAGTACAGTAGT-3', a temperatura de hibridaçâo foi de 29°C e a temperatura de lavagem após hibridaçâo foi de 51°C. 0 plasmídeo modificado apresenta uma sequência idêntica a pYGABA com excepção nos codões alterados e adicionados.

c

EXEMPLO.. YI

Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser utilizado para produção do precursor [Arg^B27]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21).

processo utilizado foi essencialmente o descrito no exemplo 1 excepto que a matriz utilizada foi obtida por clonagem da cassete BamHI proveniente de pYGAB-AKR-A em M13 e do iniciador de mutagénese apresentar a sequência 5'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-3 ', a temperatura de hibridação foi de 43°C e da temperatura de lavagem após hibridação foi de 65°C. 0 plasmídeo modificado apresenta uma sequência idêntica a pYGABA com excepção nos codões alterados e adicionados.

EXEMPLO VII

Expressão do precursor e isolamento do meio de cultura.

Propagou-se a levedura transformada de acordo com o processo descrito nos exemplos I a VI, em placas de Petri contendo meio mínimo isento de uracilo, durante 48 horas à temperatura de 30°C. Frascos de agitação de 100 ml contendo meio mínimo isento de uracilo + 5 g/litro de casaminoácido + 10 g/litro de ácido succinico + 30 g/litro de glucose, a um pH de 5,0, foram

inoculados com uma colónia simples proveniente da placa de Petri. Em seguida agitaram-se os frascos à temperatura de 30°C durante 72 horas em incubador.

Após centrifugação recolheu-se 1 litro de sobrenadante que se esterilizou por filtração, e corrigiu-se para um pH de 4-4,5 e uma conductividade < 10 mS mediante, adição de ácido clorídrico 5 M e água. Com um débito de 120 ml/hora aplicou-se em seguida o sobrenadante a uma coluna de 1,6 x 6 cm de S-Sepharose<^R>FF previamente equilibrada com 50 mM de ácido acético, etanol a

50% (em volume), com um pH ajustado para 4,0 por meio de hidróxido de sódio. Lavou-se a coluna com 60 ml de tampão e eluiu-se o precursor através de um gradiente linear de cloreto de sódio de 0 até 0,35 M em 360 ml de tampão com um débito de ml/hora. Dividiu-se o eluato em fracções de 4 ml e analisou-se por absorvância no ultravioleta. Identificaram-se as fracções que continham o precursor por HPLC de fase inversa e reuniram-se. Após eliminação dos sais numa coluna de

Sephadex<^R> G25 em ácido acético 1 M, isolou-se, por liofilização, o precursor.

EXEMPLO VIII

Preparação de [Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana a partir do precursor B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21).

L

Dissolveram-se 250 mg de B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos I a VII, à temperatura de 4°C, em 25 ml de 50 mM tris-(hidroximetil>-aminometano, etanol a 20% (em volume) com um pH corrigido para com ácido clorídrico. Lavou-se a Sepharose<^R> contendo 0,8 mg de tripsina imobilizada/ml sobre um filtro de vidro com o mesmo tampão e escoou-se. Adicionou-se tampão a 40 g do gel escoado e corrigiu-se o volume para 75 ml. Adicionou-se a solução contendo o precursor à suspensão e deixou-se a mistura durante 1 hora à temperatura de 4°C, sob agitação cuidadosa, filtrando-se em seguida.

A análise por HPLC mostrou uma transformação de 61% para [Arg^AO]-des[Thr^B30J-insulina humana.

Lavou-se o gel com 50 ml de tampão (isento de etanol) e escoou-se e precipitaram-se as proteínas contidas nas fraeções filtradas reunidas por ajustamento do pH para 6. Isolou-se o precipitado por centrifugação e liofilização.

Dissolveu-se o precipitado à temperatura de 4°C em 20 ml de ureia 7M ajustando-se o pH para 8,1 e aplicou-se a solução a uma coluna de 1,6 x 20 cm de Q-Sepharose<^R>FF previamente equilibrada à temperatura de 4°C com 20 mM tris-(hidroximetil)-aminometano, ureia 7 M com um pH corrigido para 8,2 com ácido clorídrico. Aplicando-se um débito de 40 ml/hora eluiu-se a t

L i

coluna com um gradiente linear de 0 mM a 50 mM NaCl, no mesmo tampão durante 24 horas. Analisou-se o eluato por absorção no ultravioleta e recolheu-se o primeiro eluato com os dois picos principais. 0 conjunto foi desembaraçado de sais em ácido acético 1 M numa coluna de Sephadex<^R> G25 e liofilizou-se. 0 rendimento foi de 75 mg de [Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

A identificação do produto confirmou-se por análise de aminoácidos, por espectrometria de massa e por degradação sequencial de Edman das cadeias A e B vinilpiridiladas separadas.

EXEMPLO IX

Preparação de [Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana a partir do precursor B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21).

Prepararam-se 400 mg de B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21), pelos métodos descritos nos exemplos II a VII que se dissolveram em ml de 50 mM tris-(hidroximetil)-aminometano, etanol a 20% (em volume) com um pH corrigido para 10 com ácido clorídrico.

Lavou-se a Sepharose<^R> contendo 0,8 g de tripsina imobilizada/ml sobre um filtro de vidro com o mesmo tampão que se escoou. Adicionou-se o tampão a 80 g do gel drenado e corrigiu-se o volume para 150 ml. Adicionou-se a solução contendo o precursor à suspensão e deixou-se a mistura durante 30 minutos à temperatura de 20°C sob agitação cuidadosa filtrando-se em seguida.

A análise por HPLC mostrou uma transformação de 50% para [Arg^AO]-des[Thr®³⁰]-insulina humana.

Lavou-se o gel com 100 ml de tampão (isento de etanol) e drenou-se, precipitando-se as proteínas contidas nas fraeções filtradas reunidas por ajustamento do pH para 6. Isolou-se o precipitado por centrifugação e liofilização.

Dissolveu-se o precipitado à temperatura de 4°C em 20 ml de ureia 7M, ajustando-se o pH para 8,1 e aplicou-se a solução a uma coluna de 1,6 x 20 cm de Q-Sepharose<^R>FF previamente equilibrada, a essa temperatura, com 20 mM tris-(hidroximetil)-aminometano, ureia 7 M com um pH corrigido para 8,1 por adição de ácido clorídrico. Aplicando-se um débito de 40 ml/hora eluiu-se a coluna com um gradiente linear de 0 mM a 50 mH de

NaCl, no mesmo tampão, durante 24 horas. Detectou-se a absorção do eluato no ultravioleta e recolheu-se a primeira eluição dos dois picos principais. 0 conjunto foi desembaraçado de sais em ácido acético 1 M numa coluna de Sephadex<^R> G25 e liofilizou-se. 0 rendimento obtido foi de 145 mg de [Arg^AOj-des[Thr^B30]-insulina humana.

A identificação do produto confirmou-se por análise de aminoácidos, análise por HPLC e por degradação sequencial de Edman.

EXEMPLO X

Preparação de [Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana proveniente de pró-insulina porcina.

Dissolveram-se 40 mg de pró-insulina porcina em 800 plitros de ácido clorídrico 0,1 M e adicionaram-se 8 ml de 50 mM tris-(hidroximetil)-aminometano. Preparou-se uma solução de 1 unidade de endoproteinase Lys-C proveniente de Lysobacter enzymogenes (Boeheringer Mannheim) em 200 ulitros de 0,1 M tris-(hidroximetil)-aminometano com um pH corrigido para 8,5 com ácido clorídrico. Misturaram-se as duas soluções que se deixaram durante 16 horas à temperatura de 12°C.

Deteve-se a reacção por ajustamento do pH para 6,2 após adição de 1,8 ml de etanol a 96% e deixou-se a suspensão resultante durante a noite à temperatura de 4°C. Isolou-se o precipitado por centrifugação e redissolveu-se à temperatura de 4°C em 2 ml de ureia 7 M mediante correcção do pH para 8,1. Aplicou-se esta solução a uma coluna de 1,6 x 20 cm de Q-Sepharose<^R>FF previamente equilibrada, a essa temperatura, com 20 mM tris-(hidroximetil)-aminometano, ureia 7 M com um pH corrigido para

8,1 por adição de ácido clorídrico. Aplicando-se um débito de 40 ml/hora eluiu-se depois a coluna com um gradiente linear de 0 mM a 50 mM de NaCl, no mesmo tampão, durante 24 horas.

/ .ζ*

Detectou-se a absorção do eluato no ultravioleta e recolheu-se o pico principal. 0 conjunto foi desembaraçado de sais em ácido acético 1 M numa coluna de Sephadex^<R;> G25 e liofilizado.

Obtiveram-se 15 mg de [Arg^AOj-des[Thr^B30j-insu1ina humana.

EXEMPLO XI

Preparação de [Arg^AO]-insulina humana-(B30 amida).

Dissolveram-se 200 mg de [Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana, preparada de acordo com um dos métodos descritos nos exemplos de I a X, em uma mistura contendo 400 mg de amido-treonina, 2,0 ml de etanol e 0,8 ml de água. Ajustou-se o pH para 6,3 com ácido acético e adicionaram-se 4 ml (exactos) de Sepharose<^R>

contendo 3,2 mg de tripsina imobilizada. Após repouso durante 2 horas à temperatura de 20°C sob agitação moderada, retirou-se o gel por filtração e precipitaram-se as proteínas por adição de 10 volumes de propanol-2. 0 precipitado seco ao ar dissolveu-se em 20 ml de ureia 7 M ajustando-se o pH para 8,1 à temperatura de 4°C e aplicou-se a solução numa coluna de 1,6 x 20 cm de Q-Sepharose<^R>FF previamente equilibrada, a essa temperatura, com 20 mM tris-(hidroximetil)-aminometano, ureia 7 M com um pH corrigido para 8,1 por adição de ácido clorídrico. Aplicando-se um débito de 40 ml/hora eluiu-se depois a coluna com um gradiente linear de 0 mH a 50 mM de NaCl, no mesmo tampão, durante 24 horas. Detectou-se a absorção do eluato no ultravioleta e recolheu-se o pico principal. 0 conjunto foi desembaraçado de sais em ácido acético 1 M sobre uma coluna de

Sephadex<^R> G25 e liofilizado. Obtive-se um rendimento de 80 mg de [Arg^AO]-insulina humana-(B30 amida).

A identificação do produto confirmou-se por análise de aminoácidos, por espectrometria de massa e por degradação sequencial de Edman.

EXEMPLO XII

Preparação de [Gln^B13,Arg^AO]-des[Thr^B30j-insulina humana.

Trataram-se 250 mg de [Gln^B13]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos III e VII, que se trataram com tripsina imobilizada, purificando-se o produto reaccional essencialmente como descrito no Exemplo VIII. 0 rendimento foi de 60 mg de [Gln^B13,Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

Confirmou-se a identificação do produto por análise de aminoá/ eidos, por espectrometria de massa e por degradação sequencial de Edman.

EXEMPLO XIII

Preparação de [Gln^A4, Asp^AZ1, Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida).

Trataram-se 500 mg de [Gln^A4, Asp^A21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos IV e VII, com tripsina imobilizada purificando-se o produto resultante essencialmente como descrito no

Exemplo VIII. Obtiveram-se 175 mg de [Gln^A4, Asp^A21, Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

Esta converteu-se na B30-amida por ligação com amido-treonina de acordo com o método descrito no Exemplo XI. 0 rendimento em [Gln^A4, Asp^A21, Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) purificada foi de 50 mg.

Confirmou-se a identificação do produto por análise de aminoácidos, por espectrometria de massa e por degradação sequencial de Edman.

EXEMPLO XIV

Preparação de [Ser^A21, Arg^AO]-insu1ina humana-(B30-amida).

Trataram-se 400 mg de [Ser^A21]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos V e

VII, com tripsina imobilizada purificando-se o produto resultante essencialmente como descrito no Exemplo VIII. Obtiveram-se 125 mg de [Ser^A21, Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

Esta converteu-se na B30-amida por ligação com amido-treonina, de acordo com o método descrito no Exemplo XI. 0 rendimento em [Ser^A21, Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) purificada foi de mg.

Confirmou-se a identificação do produto por análise de aminoácidos, por espectrometria de massa e degradação sequencial de

Edman.

EXEMPLO XV

Preparação de [Arg^B27, Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

Trataram-se 250 mg de [Arg^B27]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), preparados de acordo com os métodos descritos nos exemplos VI e VII, com tripsina imobilizada purificando-se o produto resultante essencialmente como descrito no Exemplo VIII. Obtiveram-se 50 mg de [Arg^B27, Arg^AO]-des[Thr^B30]-insulina humana.

/

Confirmou-se a identificação do produto por análise de aminoácidos e degradação sequencial de Edman.

EXEMELQ XVI

Preparação de uma composição injectável de acção prolongada contendo dissolvida [ Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida).

Dissolveram-se 60 umoles de [Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) em 4 ml de ácido clorídrico 0,1 M e adicionaram-se 20 ml de m-cresol a 1,5%. Misturou-se a solução com 70 ml de cloreto de sódio a 1% e 3,25 ml de cloreto de zinco 0,1 M e corrigiu-se o pH para 4,0. Finalmente, ajustou-se o volume para 100 ml com água e esterilizou-se por filtração.

EXEMPLO XVII

Preparação de uma composição injectável de acção prolongada contendo uma suspensão cristalina de [Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida).

Dissolveram-se 60 umoles de [Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) em 70 ml de uma solução de cloreto de sódio a 1% contendo 0,5% de m-cresol e ajustou-se o pH para 9,7 com hidróxido de sódio 1

M adicionando-se 325 ulitros de acetato de zinco 0,1 M. Após f

t /

reajustamento do pH para 9,7 ajustou-se o volume para 80 ml com água e esterilizou-se a solução por filtração.

Esterilizou-se por filtração uma solução de 20 ml de 65 mM de di-hidrogenofosfato de sódio contendo 0,3% de m-cresol com um pH de 6,0 ajustado por hidróxido de sódio.

Misturaram-se as duas soluções sob condições estéreis e a suspensão resultante deixou-se à temperatura de 20°C durante 1 hora sob uma agitação muito cuidadosa. Corrigiu-se finalmente o pH para 7,3 com ácido clorídrico.

EXEMPLO XVIII

Demonstração do prolongamento após injecção subcutânea em ratos por contagem gama externa.

Utilizaram-se para as experiências ratos Wistar com aproximadamente 250 g de massa corporal e mais de 90 dias de vida. Aclimatizaram-se os ratos durante cerca de uma semana antes de se utilizarem, alimentados ad libitum. Quatro dias antes da experiência a água de bebida dos ratos consistia numa solução aquosa 20 mM de iodeto de potássio.

(

As preparações da prova foram:

I. Suspensão contendo [Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 17.

II. Solução contendo [Arg^AO]-insu1ina humana-(B30-amida) preparada de acordo com o método descrito no Exemplo XVI.

III. Solução de acção rápida contendo insulina humana semi-sintética (Velosulin<^R>, 100 U/ml).

Todas as três composições continham ainda 50 uCi/ml de [mono_i25j]-insulina ou [mono-¹²⁵I]-isótopo de insulina, respectivamente, preparados de acordo com métodos convencionais de introdução de iodo radioactivo.

Injectaram-se os ratos por via subcutânea no dorso com 50 ulitros de preparação contendo 3,5 nmoles do composto de insulina e 2,5 pCi de isótopo marcado com [¹²⁵I]. Durante o período dos estudos imobilizaram-se os ratos em porta-ratos.

desaparecimento do isótopo dos locais de injecção, que constituía uma medida para a absorção do composto de insulina a partir do depósito subcutâneo (C. Binder Absorption of Injected Insulin. Munksgaard, Copenhaga 1969), mediu-se

-z ί

utilizando-se 2 medidores MIP-10 estacionários e detectores

E749 com cristais de cintilação de iodeto de sódio de 3 mm com janelas circulares e colimadores com ângulo visual de 60° e 10 mm de abertura (Raytronic). Ligaram-se os medidores com Mini regist os 121N (Raytronic). Fixaram-se os detectores na pele 2 cm acima dos locais de injecção. Controlou-se a radioactividade durante um período de 5 minutos às 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3,

4, 5, 6, 8, 12 e 24 horas após a injecção da preparação. Após a subtracção das contagens de fundo, as taxas de contagem converteram-se para percentagens da taxa de contagem inicial.

Na Figura 3 representam-se os valores médios da radioactividade residual em função do tempo, para cada preparação. Tomando o tempo para a actividade residual de 50% (Tsea:), como uma medida para o prolongamento, observou-se a partir das curvas:

T 50X

Preparação I >12 horas

Preparação II ~ 8 horas

Preparação III ~ 0,5 horas

Estes resultados demonstram que as preparações que continham [Arg^AO]-insulina humana-(B30-amida) exibiram prolongamento acentuado quando comparadas com a preparação de insulina humana de acção rápida.

EXEMPLO XIX

Composição de uma preparação injectável de acção prolongada contendo uma solução de [Arg^AO, Arg^B27]-des[Thr^B30j-insulina humana.

Dissolveram-se 12 umoles de [Arg^AO, Arg^B27]-des[Thr^B30]-insulina humana em 35 ml de solução de cloreto de sódio a 1% contendo 0,5% de m-cresol, ajustando-se o pH para 3,5 com ácido clorídrico 1 M e adicionando-se 650 ulitros de acetato de zinco

0,1 M. Após reajustamento do pH para 3,5 ajustou-se o volume para 50 ml com água e esterilizou-se a solução por filtração.

EXEMPLO XX

Demonstração do efeito prolongado em coelhos após a injecção subcutânea.

De acordo com o método descrito na Farmacopeia Britânica de 1980, determinou-se no coelho o grau de prolongamento de uma preparação em solução contendo 0,24 mM de [Arg^AO, Arg^B27]-des[Thr^B30]-insulina humana preparada de acordo com o método descrito no Exemplo XIX.

i

Injectaram-se 65 nlitros de preparação por via subcutânea em 6 coelhos e recolheram-se amostras de sangue para determinação da glicémia imediatamente antes da injecção e às 1, 2, 4 e 6 horas após a injecção. Os valores da glicémia expressaram-se sob a forma de uma percentagem do valor determinado antes da injecção.

As determinações mostraram os valores médios seguintes:

Tempo após a injecção: 0h lh 2h 4h 6h % de glucose sobre o valor inicial: 100% 68,2% 65,0% 80,1% 79,4%

Na determinação do índice de prolongamento de acordo com o método descrito em J. Markussen et al: Protein Engineering vol. 1 nQ. 3 pp. 205-213 (1987), encontrou-se um valor de 42.

Por comparação com os resultados do quadro 1, ibid., verificou-se que a solução contendo [Arg^AO, Arg^B27]-des[Thr^B30]-insulina humana apresentava o mesmo prolongamento que a suspensão de insulina zinco de acção prolongada, Actrapid<^R>, humana correntemente utilizada.

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de novos derivados de na de fórmula geral II

Cadeia-A s-s insuli1 7 I

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser0 12 3 4 5 6| 0 9 10 11 12

S

I

Cadeia-B ^s

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Lcu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12'

-48₇

Cadeia-A (cont.)

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH

14 15 16 17 18 19 | 21

1-S

I

Cadeia-B (cont.) s

I

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Cadeia-B (cont.)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30 na qual

E representa Glu ou um resíduo de um aminoácido neutro que pode ser codificado por sequências nucleotídicas;

N representa um resíduo de um amido ãcido que pode ser codificado por sequências nucleotídicas;

T representa Thr ou Arg;

X representa Thr, Ser, Ala ou OH; e

Y ou estã ausente quando X representa um grupo OH ou representa um grupo de fórmula geral OR ou NR Rj, em que R, R]_ ^θ R^ representam, cada um, individualmente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior;

caracterizado pelo facto de se submeter a uma transpeptidação ou a uma cisão um composto precursor de insulina de fórmula geral

III e

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-_?0na qual

Claims

(AA) representa uma cadeia peptídica comportando n resíduos de aminoácidos em que Lys e o resíduo C-terminal ou representa uma ligação peptídica quando n representa zero;

e

Z representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia peptídica de comprimento arbitrário em que Lys é o residuo C-terminal;

mediante acção de uma endopeptidase com especificidade exclusiva para cisão no lado carboxi de um resíduo de lisina.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual cada um dos símbolos E representa, individualmente, Glu ou Gin,

N representa Asn, Asp, Ser ou Gly, T representa Thr ou Arg, X representa Thr e Y representa um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os símbolos E representam Glu, N representa Asn, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

-514, - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ração de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os símbolos E representam Glu, N representa Ser, T e X representam cada um Thr e Y representa um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5, - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual o símbolo E em posição B13 representa Gin e os restantes símbolos E representam, todos, Glu, N representa Asn, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
6, - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual o símbolo E na posição A4 representa Gin e todos os restantes símbolos E representam Glu, N representa Asp, T e X representam, cada um, Thr e Y representa um grupo amino, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
7,- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de novos derivados de insulina de fórmula geral II na qual todos os símbolos E representam Glu, N representa Asn, T representa Arg e X representa um grupo hidroxi, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
8. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas contendo insulina, caracterizado pelo facto de se incluir pelo menos um composto de insulina e, eventualmente, também uma insulina de acção rápida, tal como insulina humana, insulina proveniente de animais domésticos ou os seus derivados ou os seus análogos.
9, - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se preparar uma solução contendo pelo menos uma insulina preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 1 num meio aquoso isoosmõtico com soro sanguíneo, com um pH compreendido entre 2 e 5,5 e contendo, eventualmente, um tampão e/ou um agente de conservação e, eventualmente, uma insulina de acção rápida,

Lisboa, 19 de Marco de 1990 O Agente UiiCíCh αα Propriedade Industrial

-53RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DE INSULINA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

QUE OS CONTÊM

Descrevem-se novos compostos derivados de insulina com uma acção insulínica prolongada, de um modo desejável e/ou antigenicidade representados pela fórmula geral II,

Cadeia-A

S-S

I 7 I

K-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Sero 1 2 3 4 5 6 . I 8 9
10
11 12

S

I s

Cadeia-B |

K-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Kis-Leu-Val
1 2 2 4 5 6 7 8 5 10 11 12 « * 4

-54β ι

Cadeia-A (cont.) 20

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21 ι-s

I

S

Cadeia-B (cont.) |

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Cadeia-B (cont.)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30 assim como um processo para a preparação dos novos derivados que consiste em se submeter a uma transpeptidação ou a uma cisão um composto precursor de insulina de fórmula geral III.