JPH04503808A

JPH04503808A - 新規インシュリン化合物

Info

Publication number: JPH04503808A
Application number: JP2505142A
Authority: JP
Inventors: バルシュミット，ペル; ハンセン，フィン　ベネッド
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1992-07-09
Also published as: FI914419A0; WO1990011299A1; DE69015811D1; NO913687L; ZA902086B; DE69015811T2; GR900100206A; ATE116661T1; CA2049961A1; IE901004L; AU637365B2; US5430016A; DK134189D0; HU902706D0; CN1045793A; DD298788A5; NZ232953A; NO913687D0; EP0463072A1; KR920701250A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

新規インシュリン化合物本発明は新規インシュリン化合物、該新規インシュリン化合物の調製方法ならびに遅延作用を示しそして少なくとも１種の新規インシュリン化合物および、所望により速効性インシュリンを含む治療用製剤に関する。１９２２年にインシュリンが発見されて以来、多くの異なった型のインシュリン製剤が糖尿病の治療に使用されてきた。最初は迅速に開始し比較的迅速に停止するインシュリン活性を示すインシュリン溶液がもっばら使用されていたが、しかし後になってたとえば亜鉛塩および／またはプロタミンの添加によりインシュリンの溶解性を低下させることにより一層広い輪郭の活性を示すインシュリン製剤が開発された。入手性のゆえにこれに使用されるインシュリンは従来より通常は家畜からそれもほとんどが牛、ブタおよびヒツジからの膵臓から抽出されてきた。しかしながら、最近ではバイオテクノロジー起源のヒトインシュリンを含む製剤もまた市場に現われてきた。ヒトインシュリンの構造は式Ｉで示される。八−鎖Ｈ−Ｇｌｙ−工１ａ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−５ｉｒ−工１ｅ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−１２３４５６１ｓ　９　１ｏ　１１　１２Ｂ− 鎖　ＳＨ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−八５ｎ−Ｇｌｎ−ＨＬＳ−Ｌｅｕ−Ｃ’ｊＳ−Ｇｌｙ−５＠ｒ−ＨＬ！；−ＬＱｕ−Ｖａｌｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２八−鎖（つづき）Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−八５ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ− ＯＨ１：ｌ　１４　１５　ユ６　１７　ｘａ　１９　１　２１Ｂ−鎖（つづき）　８Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ”Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−１：］　１４　１５　１６　１７　１Ｂ　１９　２０　２１　２２　２３　２４Ｂ−鎖（つづき）Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＯＨ最近では遅延作用を達成するために他の方法が引出されである種の家畜からのインシュリンはヒトインシュリンと構造的に非常に類似している。イヌおよびブタインシュリンはＢ鎖の３０位にＴｈｒよりＡｈａを含むことがヒトインシュリンと異なるだけであり、ウサギインシュリンは同じ位置にＳｅｒを含むことだけである。これらのインシュリンは、たとえばモリハラらＭｏｒｉｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２８０（１９７９）＋　４１２−１３およびマルクッセンＭａｒｃｕｓｓｅｎ　（米国特許第４，３４３．８９８号）により記載されているような半合成手段によりＢ５０−アミノ酸残基をＴｈｒで置換することによりヒトインシュリンへ転化されうる。溶液中にインシュリンを含む製剤は通常速効性であり、インシュリン活性は注射後生しの時間で停止する。それゆえ、糖尿病において血糖レベルを正常化するためには頻発な注射、通常は１日数回の注射が必要である。この欠点を克服するために、遅延化作用のインシュリン製剤が配合されこれによりインシュリン活性は数時間、２４時間までさらにはそれ以上でさえも維持されるようになる。このような遅延化製剤を用いると糖尿病患者は１日に少ない注射回数、たとえば２４時間の間に１回か２回の注射を受けるだけである。このような遅延作用は、インシュリンをわずかに可溶性の塩たとえば亜鉛インシュリンまたはプロタミンインシュリンへ転化することにより達成される。わずかに可溶性のインシュリン塩は懸濁液の形で使用され、インシュリンはここから皮下注射または筋肉注射の後で次第に放出される。すなわち、ヨーロッパ特許公開第ＥＰ　］、９４８６４号には、エステきた。その例はインシュリン結晶の重合化血清アルブミンへのカプセル封入である。別の例は連続的に作動する注入装置いわゆるインシュリンポンプであるが、しかしながらこれは患者にとって不便でありそして危険を伴なう。ヨーロッパ特許公開第ＥＰ　１３２７７０号、第ＥＰ　１３２７６９号および第Ｅｌ’　１３５７２０号明細書には、少なくとも１つの陽電荷を有する有機基好ましくはＡｒｇ−０１１またはＡｒｇ−Ａｒｇ−ＯｔｌでＢ鎖のＣ末端が延長されたインシュリン誘導体の製剤および使用が記載されている。このようなインシュリン誘導体の懸濁液を含む製剤は遅延作用を示す。しかしながら、これらのインシュリン化合物は、遅延程度が非常に限定されていることがわかったため（ジエイ、マルクッセンら：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ土。２０５−２１３　（１９８７））、新規の有用な遅延インシュリン製剤を配合するのに非常に適するというわけではない。Ｂ鎖のＮ末端がジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇで延長されたインシュリン誘導体の特性はアール・ガイガー（Ｒ，Ｇｅｉｇｅｒ）およびエフ、エンラマン（Ｆ、Ｅｎｚｏ＋ａｎｎ）　：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｙ＋＊ｐｏｓｉｕｒｎ　ｏｎ　Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ＋　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　ａｎｄ　Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓ　徳島　１９″′Ｐ８　；Ｅｘｃｅｒｐｔａ、　Ｍｅｄｉｃａ、アムステルダム１９７９．　ｐ３０６−３１０に記載されている。その等浸透圧点付近のこのインシュリン化合物の溶解性は普通のインシュリンのものより実に高いことがわかった。インシュリン分子における置換基は、糖尿病の治遼におけるインシュリン活性の輪郭向上を目的として導入されうる。ルまたはアミドの形でのＣ末端カルボキシル基の遮断と組合せて１個以上のＧｌｕのたとえばＣ，Ｉｎによる置換および／またはＴｈｒ”７のＡｒｇによる置換が、注射後の遅い放出が得られるような方法でインシュリンの沈でんゾーンのシフトを引き起こすことが記載されている。糖尿病の長期間治療のための製剤において内部アミノ酸置換基を含むこの種のインシュリン化合物の使用は、患者の免疫系を活性化して血液におけるインシュリン抗体の導入を引き起こすという本質的危険性を含む。最後の数年間、遅延インシュリン活性を有する従来からのインシュリン製剤のために置換基を見つけるいくつかの試みが行なわれてきた。これについての理由は、糖尿病学者が従来からの遅延インシュリン製剤があまりに短かい作用、特にヒトインシュリンの導入後に短か過ぎることを見出しそしていわゆるインシュリンベンの導入が溶解した遅効性インシュリンを必要とすることである。本発明の目的は遅延されたインシュリン活性を示しそしてできるだけ低い抗原性をもたらす新規インシュリン類似物質を提供することである。驚くべきことに、ここにおいて一般式■：Ａ−鎖ＳｓＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ｅ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− ３ｅｒ−工１ｅ−Ｃｙｓ−Ｓｉｒ−０１２：３４５６１８９１０１１１２Ｂ−鎖　Ｓ

【Ｈ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｎ−Ｈｉ　ｓ　−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ −Ｓ　＠ｒ−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ａ−鎖（つづき） −−Ｓ直Ｂ−鎖（つづき）　Ｓ１３　１４　１５　１６　１７　１１３　１９２０２１　２２　２コ　２４Ｂ− 鎖（つづき）Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｅは個々にＧｌｕまたはヌクレオチド配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、Ｎはヌクレオチド配列によりコードされうるアミノ酸残基を表わし、ＴはＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、ＸはＴｈｒ、　Ｓｅｒ、　ＡｌａまたはＯＨを表わし、ＹはＯＲまたはＮＲ’　Ｒ”を表わしその際Ｒ，Ｒ’およびＲｔは個々に水素原子または低級アルキル基を表わし、しかしＸがＯＨを表わす場合存在しない）を有するインシュリン化合物が好ましい遅延インシュリン作用および／または抗原性を示すことが見出された。したがって、本発明は一般式■：八−鎖Ｓ　５０１２３４５６　１　ａ　９　ｌｏ　１１１２Ｂ−＠　Ｓ！Ｈ−Ｐｈｅ　−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｎ　−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｃｙｔｓ− Ｇｌｙ−’；ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ　−Ｖａ　ｌ−１２３４５６７８９１０ｍｌ　１２八−鎖（つづき）１３ｘ４１５１６１７　ｘｓ　１ｑ　Ｉ　２１「−−ＳＢ−鎖（つづき）　Ｓ ■ １３１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　２コ　２４Ｂ− 鎖（つづき）Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｙ２５　２６’２７　２８　２９　３０（式中、Ｅは個々にＧｌｕまたはヌクレオチド配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、Ｎはヌクレオチド配列によりコードされうるアミノ酸残基を表わし、ＴはＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、ＸはＴｈｒ、　Ｓｅｒ、　ＡｌａまたはＯＨを表わし、およびＹはＯＲまたはＮＲ’　Ｒ”を表わし、その＠Ｒ，Ｒ’およびＲ２は個々に水素原子または低級アルキル基を表わし、しかしＸがＯＨを表わす場合存在しない）を有するインク、ニリン化合物に関する。本明細書中“低級アルキル”は、炭素原子数１〜６の直鎖または枝分れ頓アルキル基からなることを意図する。本発明は特に式■中各Ｅが個々にＧｌｕまたはＧｌｎを表わし、Ｎが八５ｎ＋　Ａｓｐ、　Ｓｅｒまたはｃｔｙを表わし、ＴがＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、ＸがＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨｚを表わすインシュリン化合物に関する。本発明は好ましくは式■中記号Ｅ、　ＮおよびＴの少なくとも１個がＹがＯＨを表わす場合ヒトインシュリンの相当する残基と異なるアミノ酸残基を表わすインシュリン化合物に関する。本発明は特に式Ｈ中すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴおよびＸの両方ともがＴｈｒを表わし、そしてＹがＮＨ，を表わすインシュリン化合物に関する。本発明は特に式■中すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＳｅｒを表わし、ＲおよびＸの両方ともがＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨｚを表わすインシュリン化合物に関する。本発明は特に式■中８１３位におけるＥがＧｉｎを表わし残りのＥのすべてがＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴおよびＸの両方ともがＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わすインシュリン化合物に関する。本発明は特に式■中Ａ４位におけるＥがＧｉｎを表わし残りのＥのすべてがＧｌｕを表わし、ＮがＡ、ｓｐを表わし、ＴおよびＸの両方ともがＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わすインシュリン化合物に関する。本発明は特に式■中すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴがＡｒｇを表わしそしてＸがＯＨを表わすインシュリン化合物に関する。本発明はまた式■で表わされるインシュリン化合物の調製方法に関するものであって、該方法は一般式■：（式中、Ｅ、ＮおよびＴはすべて上記と同じ意味を有し、（ＡＡ）、はＣ末端残基としてＬｙｓを有するｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を表わすか、またはｎ＝ｏのときはペプチド結合であり、そしてＺは水素原子またはＣ末端残基としてＬｙｓを有する任意の長さのペプチド鎖を表わす）で表わされるインシュリン前駆体をペプチド転移させるかまたはりシン残基のカルボキシ側での切断に対し非常に特異的なエンドペプチダーゼにより切断することによる。本発明はまた、弐■で表わされる少なくとも１つのインシュリン化合物および場合により速効性インシュリンたとえばヒトインシュリン、家畜インシュリンまたはその誘導体もしくは類似物質とからなるインシュリン製剤に関する。このような製剤は、すぐ使用できる溶液形状でまたは使用前にたとえば滅菌水を用いて戻すことのできる凍結乾燥製剤の形状でよい。本発明インシュリン製剤の特に有利な実施態様は、遅延インシュリン作用を示すものであってそして本発明インシュリン化合物少なくとも１種が血清と等浸透圧でｐＨ２〜５．５・で場合により緩衝液および／または保存剤と所望により速効性インシュリンを含む水性媒体に溶解した溶液からなる腸管外投与用の製剤である。本発明インシュリン化合物は、ヒトインシュリン分子における最小変化によって糖尿病学者の要求を満たしており、これは各々それ自体人体に慣れ親しんでいるかまたは数年にわたって試験されそしてこの方法では免疫反応を触発しないことがわかったものである。本発明インシュリン化合物の主な特徴は、アルギニン残基がＮ末端およびＡ鎖に接続しそしてＢ鎖のＣ末端カルボキシル基が好ましくはアミド形でブロックされているヒトインシュリンとして記載されうるちのである。インシュリン化合物は弱酸性溶液中で溶解して使用することを意図するものであり、これらの条件下でＡ２１位のアスパラギン残基の実質的脱アミド化が製剤の貯蔵期間内に生じこれにより延長化作用を相殺する。１個または多分２個のグルタミン酸残基のグルタミンでの置換を導入することによりこの効果をコントロールすることができる。インシュリン依存性糖尿病の場合、しばしば使用される治療法は遅延化インシュリン製剤の朝１回と就寝直前の夜１回の毎日２回の注射であり、基礎的インシュリンレベルを作り出す。さらに、主要な食事前に速効性インシュリン製剤の３回の注射が行なわれる。この治療法の欠点は、遅延製剤の遅い注射の結果夜の間中危険な低血糖レベルとなることである。これは夕食前に遅効性および速効性インシュリンの混合製剤を注射することにより避けられるが、その際低血糖はもし起こるとしても夕方の間だけであり、これはたとえば軽食を摂ることにより避けられる。しかしながら、この種の治療法はしばしば朝方高血糖になる。というのは、最も使用される遅効性インシュリン製剤“インシュラタート（Ｉｎｓｕｌａｔａｒｄ）”（登録商標）および°°モノタート（Ｍｏｎｏｔａｒｄ）”　（登録商標）は十分に長時間作用しないからである。それゆえ、特にこのような製剤の１回の注射で１日または数日間でさえも十分な場合には、一般的に使用される製剤より長時間作用するインシュリン製剤を糖尿病患者へ提供する必要がある０本発明により作られるインシュリン製剤は一般的に作用される遅延インシュリン製剤“モノタート”　（登録商標）より長期間の遅延インシュリン活性を示す。本発明による好ましいインシュリン化合物は、ｐＨ５付近（このｐＨで脱アミド化が実質的に低下する）でさえ溶解度が高いので溶液製剤での使用に特に有利であり、そして皮下注射後もまだ著しい遅延活性を示す。本発明は特に以下の特定化合物に関する：（ＡｒｇＡｏ）−ヒトインシュリン− （Ｂ３０−アミド）ＣＡｒｇＡＯ，に１ｎ１１３　〕−〕ヒトインシュリンーＢ３０−アミド）〔４１ｇ”＋　Ｇｉｎロ　、ｑｓ、Ａ！＋　）−ヒトインシュリン−（Ｂ３０− アミド）（ＡｒｇＡＯ，５ｅｒＡＺＩ　）−ヒトインシュリン−（Ｂ３０−アミド）（ＡｒｇＡ０＋　Ａｒｇ”）〕−デス〔Ｔｈｒ！＋３０〕−ヒトインシュリン本発明インシュリン化合物は、他のインシュリンから化学的合成によりインシュリン分子のＡｔｉのＮ末端に追加のアルギニン残基を導入することにより調製されるが、しかし非常な困難を伴なう、別の興味あるルートは、一本鎖前駆体たとえば天然産生プロインシエリンもしくはプレープロインシュリンまたは一般式■ ：（式中、Ｅ、　ＮおよびＴはすべて弐■で記載したと同じ意味を有し、（ＡＡ）、はｎ個のアミノ酸残基を有しＣ末端残基としてＬｙｓを有するペプチド鎖を表わし、しかしｎ＝ｏの場合ペプチド結合であり、そしてＺは水素原子またはＣ末端残基としてＬｙｓを有する任意長さのペプチド鎖を表わす）で表わされる生合成された前駆体の酵素触媒転化である。酵素転化に使用される酵素は、ペプチド鎖をリシン残基のカルボキシ側で切断しうるトリプシン様エンドペプチダーゼである。トリプシン自体もしばしば使用されるが、リジン特異性を示すエンドペプチダーゼたとえばりソバフタ−エンザイモゲネス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙａｉｏｇｅｎｅｓ）がらのエンドペプチダ−ゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー　マンハイム）またはアクロモバクタ−リティカス（八ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｙｔｉｃｕｓ）からのリシルエンドペプチダーゼ（ワコ　ピュア　ケミカルインダストリイーズ　リミティド）が特に有利である。反応は、たとえばヨーロッパ特許公開第ＥＰ　１６３５２９号に記載されたと同じ条件下でトレオニンアミドを用いてベブチ、ド転移反応を行ないその結果直接にＢ５０−アミドを得るか、または二段階反応として酵素切断で出発してデス（Ｔｈｒ”３０）化合物を得その次にモリハラら、前出に記載されたようにカップリング反応によりＢ５０−アミドへ転化することにより実施される。本発明インシュリン化合物の前駆体は前駆体をコードするＤＮＡ配列を発現する酵母宿主中で生合成的に作られる。増殖培地への分泌を達成するために、インシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を酵母において機能的なシグナルペプチドをコードする別のＤＮＡ配列へ融合する。サツカロミセス　セレヴイシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｍ　Ｆ　ａｌ−リーダー配列の発現プラスミド中に挿入することにより分泌が達成されうる（クルシャンおよびヘルスコウィッツＫｕｒｊａｎ　＆　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ１ｌ　３０．９３３−９４３（１９８２）Ｌ好ましい構築物において、二塩基部位Ｌｙｓ　Ａｒｇを含むがしかし酵母プロテアーゼＤＰＡＰ　（ジペプチジル　アミノペプチダーゼ）に対する基質であるペプチド配列Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａを含まない全ＭＦα１−リーダー配列をコードするＤＮＡ配列が使用される。このようにして、正しいＮ末端を有するインシュリン前駆体の十分な分泌が達成される。修飾されたインシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、第１図に示すような発現プラスミドｐＹＧＡＢＡからのＢａｍＨＩ制限フラグメント中に含まれる発現カセット上でインビトロ突然変異誘発を実施することにより構築された。プラスミドは選択マーカーおよび酵母において機能的な複製シグナルを含み１１０３塩基対の長さを存する。ＢａｍＨＩフラグメントは次のものを含む：ビターおよびエガン（Ｂｉｔｔｅｒ　＆Ｅｇａｎ）、　Ｇｅｎｅ　３２（１９８４）　２６３−２７４によれば−３８９から一１位までのプロモーター配列を含むＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ）上流領域、上流領域の５′末端へＢａｍＨＩリンカ−を加えた。このプロモ一ター配列゛をＭＦα１−リーダー配列の８５Ｎ末端アミノ酸をコードするクルジャンおよびヘルスコウィッツにより記載された配列へ直接融合する。ＭＦα１−リーダー配列をインシュリン前駆体一本鎖デス（’ｌ’　ｈｒ１１３０　）一ヒトインシュリン（Ｓ（１）をコードする配列へ直接融合し、これは次の配列を有する合成的に構築された遺伝子である：ＴＴＣＧＴｒＡＡＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴｒＣＴＣＡｅｒＴ（；ＧＴＴＧＡＡＧＣ’ＩＴｒＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴ−ＡＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＡ　ＣＴＴＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＡ−ＰｈｅＶａｌＡＳｎＧ１ｎＨｉＳＬｅｕＣＹＳＧ１ｙＳＱｒＨｉＳＴＪａｕＶ＆ｌＧ１ｕＡｌａＬａｕＴ’ｆｒＬａｕＶａｌＣｙＥ−Ｇｌｙ| ＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴｒＣＴＡＣＡＣＴＣＣ八ＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＴＩ’ＧＴＡＣＴＴＣＴ八ＴｒＴＧＴ−ＣＴＩＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＧＴＩＴＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＡ−ＧｌｕＡｒｇ（ＪｙＰｈｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＧ１ｙ工１ｅＶａｌＧ１ｕＧｌｎＣｙｓＣｙｓＴｈｒＳｅｒ工１ｅＣｙｓ−またインシュリン前駆体遺伝子の翻訳が２つのストップコドンで終結し直後にＳａｌｌ制限部位が位置することもわがる．終結領域はヨーロッパ特許公開第０１１６２０１Ａ，号に記載のＳａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨ　Ｉ制限フラグメントと同一である。配列は完全に標準的技術を用いて構築される。使用される突然変異誘発法は“オリゴヌクレオチド特定部位突然変異誘発”であり、これはゾラーとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　＆Ｓｗｉｔｈ），　ＤＮＡ，νｏｌ．３．　Ｎｏ．６，　４７９−４８８（１９８４）により記載されている。この方法を以下に箇単に記載し、例１においてさらに詳細に記載する．発現ブラスミドから単離されたインシュリン前駆体配列を一本鎖の環状Ｍ！３バクテリオファージベクターへ挿入する．一本鎖ゲノムヘ、化学的に合成された相補的ＤＮＡ鎖をアニールする。ＤＮＡ鎖は環状ＤＮＡ上にインシュリン配列と完全に同じ配列により囲まれた所望の配列を含む。次いでインビトロで、タレノウボリメラーゼを用いて生化学的にプライマーを環状ゲノムの全長に延長する．このストランドは一本鎖ファージを生じ、これは大腸菌中で増殖すると所望配列を有する二本鎖ＤＮＡを単離する可能性を与える。この二本鎖ＤＮＡから、制限フラグメントを単離しそして発現ベクターへ再挿入する。本発明を図面を参照しながら以下に詳細に説明する．第１図は発現ブラスミドｐＹＧＡＢＡ　１４２７６を示し、第２図は酵母ベクターｐＡＢ２４を示し、そして第３図は皮下貯蔵部からのインシュリンの吸収の図形表示例■ 前駆体Ｂ（１−２９）−ＡＫＲ−Ａ（１−２１）を発現するために使用される発現プラスミドの構築ＢａｍＨＩ制限フラグメント上の発現ブラスミドｐＹＧＡＢＡ（第１図に示す）に含まれている発現カセットを単離した二発現ブラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとともにインキユベートした。条件は次のようであった：２０ｕｇブラスミド、５０単位Ｂ　ａ　ｍＨ　Ｌ　１　０　０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ｝リスー｝ＩＣＩ　，　ｐＨ７．　５、１　０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ　Ｉ！　、および］ｍＭ　ＤＴＴ，容量１００μ１中。温度は３７℃であり反応時間は２時間であった。２つのＤＮＡ−フラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、そして所望のフラグメントを単離した。Ｍ１３ベクターＭｌ　３ｍｐ　１　８における連結単離された制限フラグメントを、次の反応混合物中制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断されたバクテリオファージベクターＭｌ　３ｍｐ　１　８へ連結した：フラグメント０．２μｇ，ベクター０．０２９ｇ，５０ｍＭ　トリスーＨＣｌ、ｐｌ１７．４、１０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、１０ｍＭ　ＤＴＴおよび１ｍＭＡＴＰ、容量２０μ１中。この混合物５μｌを大腸菌株ＪＭ１０１へ形質転換した。ベクターにおけるフラグメントの存在およびフラグメントの配置を形質転換細胞から単離された二本鎖Ｍ１３ −ＤＮＡ上で制限酵素マッピングにより測定した。一本鎖（ｓ　ｓ）ＤＮＡ　（鋳型）の単離：上記形質転換細胞からＳＳ−ＤＮＡをメシッヒＭｅｓｓｉｎｇ　Ｇｅｎｅ，　１９，　２６９−２７６（１９８２）により記載された方法にしたがって単離した。突然変異誘発プライマーの５′ホスホリル化配列５’−ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ−３’を有する突然変異誘発化プライマーを、７０１１１ＭトリスーＨＣＬｐ｝ｌ７．０、１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１＋＋＋Ｍ　ＡＴＰ、１００ピコモルオリゴヌクレオチドおよびＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ３．６単位を含む反応混合物３０μｌ中５′末端でホスホリル化した。反応を３０分３７゜Ｃで実施した．次いで１０分間６５゛Ｃで混合物をインキユベートすることにより酵素を不活化した。鋳型およびホスホリル化突然変異誘発プライマーのア二一リング鋳型およびプライマーのア二一リングを、０．５ピコモル鋳型、５ピコモルプライマー、２０ＩＩＩＭトリスーＨＣＩ，ｐｌｌ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、５０ｏ＋Ｍ　ＮａＣ１および１＋＊ＭＤＴＴを含む１０μ１容量中で１０分間６５゜Ｃにて加熱し、その後０゜Ｃまで冷却することにより行なった。延長／連結反応：上記で得られた反応混合物へ以下の混合物１０μ１を加えた：　０．　３ｌＩＩＭ　ｄＡＴＰ，　０．　３ｒａＭｄＣＴＰ，　０．　３ｍＭｄＧＴＰ，０．３ｍＭ　ＴＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０＋Ｍ　｝リスーＨＣＬｐｌｌ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、１０ｉＭ　ＤＴＴ，Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ３単位およびクレノウポリメラーゼ２．５単位。次いで、反応を１６時間１６℃で行なった。ＪＭＩ　Ｏ　１の形質転換：上記反応混合物を標準的技術を用いてＣａＣ１ｚ処理大腸菌ＪＭ　１０１細胞へ異なった希釈率にて形質転換しそして２×ＹＴ寒天プレート上で２×ＹＴトップ寒天にプレートした（２ＸＹＴ＝トリブトン１６ｇ／Ｉ、酵母抽出物１０ｇ／１、ＮａＣｌ　５ｇ／Ｉ，２ＸＹＴ｝７プ寒天＝０．４％アガロースを加えオートクレープした２ＸＹＴ，２ＸＹＴ寒天プレート＝２％寒天を加えオートクレーブした２Ｘｙ’Ｉ’）。プレートを一晩３７°Ｃでインキュベートした。陽性クローンの同定使用される方法はブラークーリフトハイブリッド法でこれは次のように記載されている二ニトロセルロースフィルターを適当なプラーク密度を有するプレート上に置き、これによりフィルターを湿めらせた０次いでフィルターを後に使用するまで以下の溶液中に浸した：１．５Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍ　ＮａＯＨに３０秒、１．５Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０に１分間、２ＸＳＳＣ（０，３ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍ　クエン酸ナトリウム）。フィルターを３ＭＭ濾紙上で乾燥しそして減圧オーブン中８０°Ｃにて２時間焼成した。配列５’−ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ−３ ’を有する突然変異誘発化プライマーを、７０＋Ｍ）リス−ＨＣ１，，ｐＨ７゜５．１０ｄ　ＭｇＣＩｇ、５＋ａＭ　ＤＴＴ、１０ピコモルオリゴヌクレオチド、２０ピコモル　Ｔ−”Ｉ）−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３．５単位を含む３０μｌ容量中５′末端にて放射性標識化を行なった。混合物を３７°Ｃで３０分次いで１００°Ｃで５分間インキュベートした。乾燥したフィルターを、５ＸＳＳＣ，０，２％ウシ血清アルブミン、０．２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ナトリウム−ドデシル−スルフェート（ＳＤＳ）および５０Ｍｇ／ｌａｌサケ精子ＤＮＡ中にて６５°Ｃで２時間予備ハイブリッド化した０次いで、標識化されたプローブを含む反応混合物を新しい予備ハイブリッド化混合物１５ｍ１へ加え、フィルターを穏やかに振とうしなから４０”Ｃで一晩これへ浸した。ハイブリッド化後、フィルターをそれぞれ１５分間で３回　２ＸＳＳＣ＋０．１％　ＳＤＳ中で洗浄しオートラジオグラフィを行なった。同じ溶液でただし今度は６２°Ｃにて洗浄後、別にオートラジオグラフィを行ない、突然変異誘発プライマーと相補的なりＮＡ−配列含有プラークを同定した。陽性クローンの再スクリーニング同定したクローンはへテロ二重鎖の結果のため、プラークを再びプレートした。ハイブリッド化および同定をくり返した。二重鎖Ｍ１３−ファージＤＮＡの精製再スクリーンしたクローンを大腸菌株ＪＭＩＯＩの感染に使用した。約１Ｏ１１個のファージと５個のＪＭＩＯＩコロニーを含む培養物を３７°Ｃで２ＸＹＴ培地５ｍｌ中にて５時間増４　（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｊｉ　Ｄｏｌｙ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−＋２＋　１５１３（１９７９）により記載された方法にしたがってペレットから精製した。修飾したインシュリン前駆体を含む制限フラグメントの単Ｍ：上記で単離したＤＮＡ製剤（約５μｇ）を、１００ｍＭＮａｃＬ５０ａ＋Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、ｌｏｍＭＭｇＣＩ　ｚおよび１ｓ＋Ｍ’ＤＴＴの６０μ】中２時間３７°Ｃで制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１１０単位で消化させた。ＤＮＡ生成物をアガロース−ゲル上で分離しそしてフラグメントをゲルから精製した。酵母ベクターｐＡＢ２４　（第２図）への連結：単離された制限フラグメントを以下の反応混合物中で制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化された酵母ベクターｐＡＢ２４へ連結した：フラグメント０．２μｇ、ベクター０゜０２Ｍｇ、５０ＩＩＭ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４，１０ｆｆ１０ｆｆ１　＋、、１０ｔａＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ、全容量２０ｕＩ中。この反応混合物５μｌを大腸菌株ＭＣ１０６１の形質転換に使用し、修飾された発現プラスミドを同定しそして増殖した。プラスミドはｐＹＧＡＢ−ＡＫＲ−Ａと呼ばれ、これは追加されたコドン以外はｐＹＧＡＢＡと同じであった。酵母の形質転換：発現プラスミドの酵母菌株サツカロミセス　セレヴイシアエＪＣ４８２／＼ｐｅｐ／＼Ｌｅｕ　２ｃｉｒ　”　（α、ｈｉｓ４．　ｐｅｐ４．　ｕｒａ３゜１ｅｕ２．　ｃｉｒ　＠）　ヘの形質転換はイトウら（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、）によりＪ、Ｂａｃｔ、νｏ１．１５３．　Ｎｏ、１．１６３−１６８（１９８３）に記載されたように実施された。形質転換細胞は、プラスミド含有細胞を選択するために５Ｃ７ｕｒａ培地（０，７％酵母窒素塩基、２．０％グルコース、０．５％カサミノ酸、２．０％寒天）上にプレートした。例■ 前駆体Ｂ（１−２９）−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）を産生ずるために使用される発現プラスミドの構築使用した手法は例１に記載したものとほぼ同じであるが、ただし突然変異誘発プライマーは配列５’　ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ−３’であり、ハイブリッド化温度は４２°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は６４°Ｃであった。修飾したプラスミドは追加したコドン以外ｐＹＧＡＢＡと同じ配列である。例■ 前駆体（Ｇｉｎ””　）　−８（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１ −２１）の産生に使用される発現プラスミドの構築使用される手法は例Ｉに記載のものとほぼ同じであるが、ただし使用される鋳型はＭＩ３中ｐＹＧＡＢ−ＡＫＲ−ＡからのＢａｍＨｌ−カセットをクローニングすることにより得られ、突然変異誘発プライマーは配列５’　−ＧＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧ−３’を有し、ハイブリッド化温度は３１℃であり、そしてハイブリッド化後の洗浄温度は５３℃であった。修飾されたプラスミドは変更しそして追加したコドン以外はｐＹＧＡＢＡと同じ配列を存する。例■ 前駆体（Ｇｉｎ”、Ａｓｐ”’　）　−８（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）の産生に使用される発現プラスミドの構築使用される手法は例Ｉに記載のものとほぼ同じであるが１、ただし使用される鋳型はＭ１３中ｐＹＧＡＢ−ＡＫＲ−ＡからのＢａｍＨＩ−カセットをクローニングすることにより得られ、突然変異誘発は二段階で行なわれた。第１段階で、プライマーは５’− ＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣ−３’であり、ハイブリッド化温度は２７°Ｃであり、そしてハイブリッド化後の洗浄温度は４９°Ｃであり、第２段階では、プライマーは５’−ＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＧＴＴＴ −３’であり、ハイブリッド化温度は２９°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は５１°Ｃであった。修飾されたプラスミドは変更したおよび追加したコドン以外ｐＹＧＡＢＡと同じ配列である。例Ｖ前駆体（Ｓｅｒ”’　）　−Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１ −２１）の産生に使用される発現プラスミドの構築使用される手法は例Ｉに記載のものとほぼ同じであるが、ただし使用される鋳型はＭ１３中ｐＹＧＡＢ−ＡＫＲ−ＡからのＢａｍＨＩ−カセットをクローニングすることにより得られ、突然変異誘発プライマーは配列５’　−ＧＡＣＧＣＴＡＴＴＡＡＧＴＡＣＡＧＴＡＧＴ−３’を有し、ハイブリッド化温度は２９°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は５１°Ｃであった。修飾されたプラスミドは変更しおよび追加したコドン以外ｐＹＧＡＢＡと同じ配列である。例■ 前駆体（Ａｒｇｌｌｚ’　）　−Ｂ（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）の産生に使用される発現プラスミドの構築使用される手法は例■に記載のものとほぼ同じであるが、ただし使用される鋳型はＭ１３中ｐＹＧＡＢ−ＡＫＲ−ＡからのＢａｍＨＩ−カセットをクローニングすることにより得られ、突然変異誘発プライマーは配列５’　−ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡ−３’を有し、ハイブリッド化温度は４３°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は６５°Ｃであった。修飾されたプラスミドは変更しそして追加したコドン以外ｐＹＧＡＥＡと同じ配列である。例■ 前駆体の発現および培養基からの単離例１〜■に記載のように形質転換された酵母を、ウラシルを含まない最少培地を含むペトリ皿上で、３０°Ｃにて４８時間増殖した。ウラシル不含有最少培地＋５ｇ／ｌカサミノ酸＋１０ｇ／ｌコハク酸＋３０ｇ／ｌグルコース、ｐＨ５，０を含む１００ｍ１振とうビンにベトリ皿からの１個のコロニーを接種した０次いでこのビンを７２時間インキュベーター中で３０°Ｃにて振とうした。遠心分離後プールした上澄１１を濾過により滅菌し、５ＭＭＣｌと水を加えることによりｐＨ４−４，５および伝導率く１０ａ＋ｓに１！節した０次いで、流速１２０ｍ１／ｈを用いて予め５０ｍＭ酢酸、ＮａＯＨでｐＨ４，０に調整された５０％（容量）エタノールで平衡化したＳ−セファロース（登録商標）ＦＦの１．６Ｘ６ｃ＋ｗカラムへ上澄を施こした。カラムを緩衝液６０ｍ１で洗い、前駆体を緩衝液３６０＋１中ＮａＣ１０〜０゜３５Ｍ直線状勾配液を用いて流速１０ｍ１／ｈで溶出した。溶出液をフラクション４ｍｌに分け、ＵＶ吸収率について検知した。前駆体含有フラクションはＲＰ−ＨＰＬＣ分析により同定されそしてプールされた。ＩＭ酢酢酸上セファデックス登録商標）Ｇ２５のカラム上で脱塩後、前駆体を凍結乾燥により単離した。例■ 前駆体Ｂ（１−２９）　−Ａｌａ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ａ　（１−２１）からの〔ＡｒｇＡ０〕−デス（７ｈｒＩ：１０　）−ヒトインシュリンの調製例Ｉおよび ■に記載の方法により調製されたＢ（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−へｒｇ−へ（１−２１）　２５０ｍｇを、５０ｍＭ）リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＭＣＩでｐＨ１ｏに調整された２０％（容量）エタノール２５ｍ１中４° Ｃにて溶解した。固定化トリプシン０．　８ｍｇ／ｍｌを含むセファロース（登録商標）を同じ緩衝液でガラスフィルター上で洗浄しドレーンした。緩衝液をドレーンしたゲル４０ｇへ加え、容量を７５ｍ１に調整した。前駆体を含む溶液を懸濁液へ加え、混合物を穏やかに撹拌しなから４°Ｃにて１時間放置し次いで濾過した。ＨＰＬＣ分析によれば、ｒ　ＡｒｇＡｏ）−デス（Ｔｈｒｌ＋３’　）−ヒトインシュリンへの６１％転化率が示される。ゲルを緩衝液（エタノール不含有）５０ｍｌで洗浄しドレーンし、プールした濾液におけるタンパク質をｐＨ６に調節することにより沈でんさせた。遠心分離により沈でん物を単離し凍結乾燥した。沈でん物をｐＨ８，Ｉに調節することにより７Ｍ尿素２０ｍ１中４°Ｃにて溶解し、２０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＣＩでρ１１８．１に調節した７Ｍ尿素で４　’Ｃにて予め平衡化したＱ−セファロース（登録商標）ＦＦ　１゜６Ｘ２０ｃｍカラム−・溶液を施こした。次いで流速４０＋ｅｌ／ｈを用いて、２４時間かけ同じ緩衝液中ＯｍＭ〜５０＋ｏＭ　ＮａＣ１の直線状勾配液でカラムを溶出した。溶出液をＵＶ吸収率について検知し２つの主要ピークの最初の溶出を集めた。プールしたものをセファデックス（登録商標）０２５カラム上で１Ｍ酢酸中にて脱塩し、凍結乾燥した。収量は（Ａｒｇ”）−デス〔Ｔｈｒｌ′３０〕−ヒトインシュリン７５１Ｉ１ｇであった。生成物の同定は、アミノ酸分析、プラズマ肌着質量分析および別々のビニルピリジル化へ−およびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認された。例■ 前駆体Ｂ（１−２９）−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）からの（Ａｒｇ”）−デス（Ｔｈｒ”０）−ヒトインシュリンの調製例■および■に記載の方法により調製されたＢ（１−２９）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −Ａ（１−２１）　４００ａ＋ｇを、５０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）− アミノメタン、ＨＣＩでｐＨ１０に調整された２０％（容量）エタノール５０ｏ＋１に溶かした。固定化トリプシン０．８ｇ／ｍｌを含むセファロース（登録商標）を同じ緩衝液を用いてガラスフィルター上で洗浄し、ドレーンした。ドレーンしたゲル８０ｇへ緩衝液を加え、容量を１５０ｍ１に調節した。前駆体を含有する溶液を懸濁液へ加え、混合物を穏やかに撹拌しながら２０℃で３０分間放置し次いで濾過した。ＨＰＬＣ分析は、（Ａ　ｒ　ｇＡＯＥ−デス（７ｈｒｊ３１１）−ヒトインシュリンへの５０％転化率を示す。ゲルを緩衝液（エタノール不含有）１００ｍｌで洗浄し、ドレーンしそしてプールした濾液中のタンパク質をｐＨ６に調節することにより沈でんさせた。遠心分離および凍結乾燥により沈でん物を単離した。沈でん物を１））１８．１に調節することにより７Ｍ尿素２０ｍ１中４°Ｃにて溶解し、溶液を予め２０Ｉｌ１Ｍトリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＣＩでｐＨ８，１まで調節された７Ｍ尿素中４℃にて平衡化したＱ−セファロース（登録商標）ＦＦの１．６Ｘ２０ｃｍカラムへ施こした６次いで、流速４０ｍ１／ｈを用いてカラムを２４時間かけて同じ緩衝液中０＋ｍＭ〜５０ｍＭ　ＮａＣ１の直線状勾配液で溶出した。溶出液をＵＶ吸収について検知し、２つの主要ピークの最初の溶出を集めた。プールしたものをセファデックス（登録部［）Ｇ２５のカラム９１Ｍ酢酸で脱塩し、凍結乾燥した。収量は（Ａｒｇ”）−デス〔Ｔｈｒ！＋３０〕−ヒトインシュリン１４５ｍｇであった。生成物の同定は、アミノ酸分析、ＨＰＬＣ−分析および逐次エドマン分解により確認された。例Ｘブタプロインシュリンからの（Ａ　ｒ　ｇＡｏ）−デス（７’　ｈｒｌ：ｌ（＋　）−ヒトインシュリンの調製ブタプロインシュリン４０ｍｇをＯ，ＩＭ　ＨＣＩ　８００μＩに溶かし、５０ｍＭ）リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン８ｍｌを加えた。ＨＣＩでｐＨ８，５に調節された００１Ｍトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン２００ μｌ中にリソバクター　エンザイモゲネスからのＩＵエンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー　マンハイム）が？１３Ｈしている液を調製した。２つの溶液を混合しそして１２℃で１６時間放置した。反応を９６％エタノール１．８ｍｌ添加後にｐＨ６，２に調節することにより停止させ、得られた懸濁液を４°Ｃで一晩放置した。遠心分離により沈でん物を単離し、ｐＨ８，１にｆＪ節することにより７Ｍ尿素２ｍｌ中に４°Ｃにて再溶解した。この溶液を、予め２０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＣＩでｐＨ８，１まで調整した７Ｍ尿素で４°Ｃにて平衡化したＱ−セファロース（登録商標）ＦＦの１．．６Ｘ２ＯｃＤｌカラムへ施こした。次いで、流速４０＋ｏｌ／ｈを用いて同じ緩衝液中ＯｔａＭ〜５０ｍＦＩ　Ｎ　ａ　ＣＩの直線状勾配液で２４時間かけて溶出した。溶出液をＵＶ吸収により検知し、主要ピークを集めた。プールしたものをセファデックス（登録商標）Ｇ２５のカラム９１Ｍ酢酸で脱塩し、凍結乾燥した。収量は（Ａ　ｒ　ｇＡＯ）−デス（Ｔｈｒ” ’）−ヒトインシュリン１５ＩＩＩｇであった。生成物の同定はアミノ酸分析、ＨＰＬＣ−分析および逐次〕　エドマン分解により確認された。例Ｘ■ （Ａｒｇ”］−］ヒトインシュリンーＢ３０アミド）の調製例■〜Ｘに記載の方法の１つにより調製された（ＡｒｇＡｏ）−デス（Ｔｈｒｌ′３’）−ヒトインシュリン２００ａ＋ｇをトレオニンアミド４００ｍｇ、エタノール２．　０＋ｉｌおよび水０．　８ａ＋１を含む混合物中に溶かした。　ｐＨを酢酸で６．３にｌ１節し、固定化トリプシン３．２ｍｇを含むセファロース（登録商標）４ｍｌ　（沈でん）容量を加えた。穏やかに撹拌しながら２０°Ｃで２時間放置後、ゲルを濾過により除去し、２−プロパツール１０容蓋の添加によりタンパク質を沈でんさせた。風乾した沈でん物をｐ１１８．１に調節することにより７Ｍ尿素２０ａ＋１中に４°Ｃにて溶解し、溶液を予め２０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｈ（ｌでｐｉｆ８．１に調節された７Ｍ尿素で４°Ｃにて平衡化したＱ−セファロース（登録商標）ＦＦ１．６Ｘ２０ｃｍカラム上に施こした。次いで、流速４０ｍ１／ｈを用いて同じ緩衝液中ＯｍＦＩ〜５０ｔｓＭＮ　ａ　Ｃｌの直線状勾配液で２４時間かけて溶出した。溶出液をＵＶ吸収により検知し主要ピークを集めた。プールしたものをセファデックス（登録商標）Ｇ２５のカラム９１Ｍ酢酸で脱塩し、凍結乾燥した。収量は（Ａ　ｒ　ｇＡｏ）−ヒトインシュリン−（Ｂ１０−アミド）８０ｍｇであった。生成物の同定は、アミノ酸分析、プラズマ脱着質量分析および逐次エドマン分解により確認された。例Ｘ■ （Ｇ　１　ｎ　ｌ　Ｉ　３．八ｒ　ｇ　Ａ　Ｏ）−デス〔Ｔｈｒ１１″。〕−ヒトインシュリンの調製例■および■に記載の方法のように調製された（　Ｇｘｎ１１３　）−８（１− ２９）−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）　２５０　ｍｇを固定化トリプシンで処理し、反応生成物を実質的に例■に記載されたように精製した。収量は（（，１ｎ１１１３　、ＡｒｇＡＯ）−デス［Ｔ　ｈ　ｒ″３０〕−ヒトインシュリン６０ｍｇであった。生成物の同定はアミノ酸分析、プラズマ脱着質量分析および逐次エドマン分解により確認された。例Ｘ■ （に　ｌ　ｎ　Ａ　４　、　Ａｓｐ’　ｔ　Ｉ　、　ＡｒｇＡＯ：ｌ−ヒトインシュリン−（Ｂ１０−アミド）の調製例■と■に記載の方法により調製された（　Ｇｉｎ”　、　ＡＳｐＡ！＋　）− ８（１−２９）−ＡＪａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）　５００　ｒａｇを固定化トリプシンで処理し、得られた生成物を例■に実質的に記載のように精製した。収量は（Ｇｉｎ”　＋　Ａｓｐ”’＋　Ａｒｇ＾０〕−デス（７ｈｒ１１３＋１　）−ヒトインシュリン１７５Ｂであった。これは例ＸＩに記載の方法によりトレオニンアミドと結合することによりＢ５０ −アミドへ転化された。精製された［　Ｇｉｎ”　＋　Ａｓｐ”’、　Ａｒｇ＾０〕−ヒトインシュリン−（Ｂ１０−アミド）の収量は５０ｍｇであった。生成物の同定はアミノ酸分析、プラズマ脱着ｉｔ分析および逐次エドマン分解により確認された。例ＸＩＶ（Ｓｅｒ”’、　ＡｒｇＡｏ〕−ヒトインシュリン−ＣＢ３０−アミド）の調製例■および■に記載の方法で調製された。Ｃ５ｅｒＡ！＋　）　−８（１−２９）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）　４００＋ａｇを固定化トリプシンで処理し、得られた生成物を実質的に例■に記載のように精製した。収量は〔５ｅｒＡｔＩ、＾ｒ　ｇ　Ａ　１１　）−デス［Ｔｈｒ！１３°〕−ヒトインシュリン１２５ｍｇであった。これは例ＸＩに記載の方法によりトレオニンアミドと結合することによりＢ５０ −アミドへ転化された０Ｍ製した（　Ｓｅｒ”’、　Ａｒｇ”）−ヒトインシュリン−（８３０−アミド）の収量は４０ｍｇであった。生成物の同定はアミノ酸分析、プラズマ脱着質量分析および逐次エドマン分解により確認された。例ＸＶ［１ｒｇｌ！’１．　ＡｒｇＡＯ）−デス〔Ｔｈｒ１３０〕−ヒトインシュリンの調製例■および■に記載の方法で調製された（　Ａｒｇ”’　）　−８（１−２９） −八ｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）　２５０　ｍｇを固定化トリプシンで処理し、その結果得られる生成物を例■に実質的に記載のように精製した。収量は（７１ｒｇ１！？、　Ａｒ、ＡＯ）−デス〔Ｔｈｒｌ１３０〕−ヒトインシュリン５０ｍｇであった。生成物の同定はアミノ酸分析および逐次エドマン分解により確認された。例ＸＶＩ溶解した（ＡｒｇＡＯ）−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−アミド）を含む注射用遅効性製剤の配合（Ａ　ｒ　ｇＡｏ）−ヒトインシュリン−（Ｂ　３０−アミド）６０マイクロモルを０．１Ｍ　ＨＣＩ　４＋ａｌに溶かしそして１゜５％ｍ−クレゾール２０ｍ１を加えた。溶液を１％ＮａＣ１７０ｎ＋１およびＯ，ＬＭ　ＺｎＣＩｚ　３．２５ｍ１と混合し、ｐＨを４．０まで調節した。最後に容量を水で工００ｍ１までに調節し、濾過滅菌した。例Ｘ■ （Ａｒｇ＾０〕−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−アミド）の結晶性懸濁液を含む注射用遅効性製剤の配合ＣＡｒｇＡ０）−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−アミド）６０マイクロモルを１ＭＮａＯＨでｐＨ９，７に１１節することにより０．　５％ｍ−クレゾール含有１％ＮａＣｌ溶液７０−１に溶かし、０．１Ｍ酢酸亜鉛３２５μｌを加えた。ｐｌｌを再度９．７へ調節後、水で容量を８０ａ＋１に調節し溶液を濾過滅菌した。０．３％ｍ−クレゾールを含有しＮａＯＨでｐＨ６，０まで調節した６　５ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｈ！Ｐ　Ｏｓ　２０Ｉｌｌｌを濾過滅菌した。滅菌条件下で２つの溶液を混合し得られた懸濁液を非常に穏やかに撹拌しながら１時間２０°Ｃにて放置した。最後にＨＣＩでｐＨを７．３に調節した。例Ｘ■ 外部Ｔ計測によるラットにおける皮下注射後の延長化の証明実験のために体重約２５０ｇで９０日齢以上のメスのウィスタ一種ラットを使用した。ラットを使用する約１週間前に新しい環境に慣らし、任意に餌を与えた。実験前の４日間、飲み水としてラットに２０５Ｍヨウ化カリウム水溶液を与えた。試験製剤は次のようであった：１　［Ａｒｇ＾０〕−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−アミド）を含み例Ｘ■にしたがって調製された懸濁製剤■　（ＡｒｇＡｏ）−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ −アミド）を含み例ＸＶＩにしたがって調製された溶液製剤■　半合成ヒトインシュリン（ベロシュリン（登録商標）、１００　Ｕ／ｍｌ）を含む速効性溶液製剤３つの製剤すべてはさらに、標準的放射性ヨウ素同位体化法により調製された５０μＣｉ／ｒａｌ（モノ−”’Ｉ：ｌ−インシュリンまたは一インシュリン化合物トレーサーをそれぞれ含有していた。ラットに、３．５ナノモルインシュリン化合物と２．５μＣｉ（”’Ｉ）−標識化トレーサーを含む５０μｌ製剤で大腿部裏側に皮下注射した。研究期間にわたってラットはラットホルダーに固定された。注射部位からのトレーサーの消失は皮下貯蔵部からのインシュリン化合物の吸収についての尺度である（シー、バインダー　Ｃ，Ｂｉｎｄｅｒ　：八ｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ、ムンクスガード、コペンハーゲン　１９６９）が、これは２つの固定したＭＩＰ−１０レートメーターおよびＢｅ−ウィンドウを備えた３ｍ１Ｎａｌシンチレーシヨン結晶を有する検知器Ｅ７４９および６０″′視角と１０ｍＩ＋＋の開口部を有するコリメーター（レイトロニックｌ？ａｙｔｒｏｎｉｃ）を用いて測定した。レートメーターをミニレコーダー１２１Ｎ（レイトロニック）と接続した。検出器を注射箇所の皮膚上部２ｃｍのところに固定化した。放射能を製剤注射後０，０．５．ｌ、１．５，２゜２．５．３，４，５，６，８．１２および２４時間目に５分間かけてモニターした。バンクグラウンドの計数を差し引いた後で、計数率を最初の計数率のパーセントに変えた。第３図において、残留放射能の平均値を各製剤について時間の関数として示す、、５０％残留活性（Ｔ５０％）に対する時間を延長化に対する測定値として考えれば、曲線から次のことがわかる：Ｔ５０％製剤Ｉ　〉１２時間製剤■　夕　８時間製剤■　夕０．５時間これらの結果により、（Ａ　ｒ　ｇＡｏ）−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−アミド）を含む製剤は両方とも速効性ヒトインシュリン製剤と比較して著しい延長化を示すことがわかる。例ＸＩＸ（ＡｒｇＡＯ、Ａｒｇ１４７　）−デス〔Ｔｈ１ｇ３６〕ヒトインシユリン溶液を含む注射用遅効性製剤の配合（Ａｒｇ”　ｒ　Ａｒｇｌｌｚ’　）−デス〔ＴｈｒＩ′３０〕ヒトインシュリン１２マイクロモルを、ＬＭ　ＭＣＩでｐＨ３，５ニｌｉ！ｆｊすることにより０．５％ｍ−クレゾールを含む１％ＮａＣ１？ｇ液３５ｍ１に溶かしそして０．１Ｍ酢酸亜鉛６５０μｌを加えた。ｐＨ３，５に再度調節後、容量を水で５０ｍ１に調節しそして溶液を濾過滅菌した。例ＸＸ皮下注射後のウサギにおける延長効果の証明例ＸＩＸにしたがって調製された０、２４ｍＭ　ＣＡｒｇ’・。Ａｒｇ１１２７〕−デス（Ｔｈｒ”。〕ヒトインシュリンを含む溶液製剤の延長程度を英国薬局方１９８０年版に記載の方法によりウサギにおいて測定された。製剤６５μｍを６匹のウサギに皮下注射し、注射直前および注射後１．２．４および６時間目のグルコース測定のために血液サンプルを集めた。グルコース値は注射前の値のパーセントとして表わされた。測定は次の平均値を示す：注射後の時間　Ｏｈ　ｌｈ　２ｈ　４ｈ　６ｈ初期のグルコース（％）１００％　６８．２％　６５．０％　８０．１％　７９．４％ジイエ、マルクッセンら：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｖｏｌ、　１　。Ｎｏ、３．　ｐ２０５−２１３（１９Ｂ？）に記載された方法にしたがって延長化指数を測定することにより、４２の値が計算された。第１表（同書）の結果と比較して（ＡｒｇＡＯ、Ａｒｇｌｌｌ　）−デス（Ｔｈｒ”’）−ヒトインシュリンを含む溶液製剤は、一般に使用される遅効性亜鉛インシュリン懸濁製剤アクトラピッド（登録商標）ヒユーマンと同じ延長性を有することがわかる。Ｆｉｇ、１３ｊ７９Ｆｉｇ、　２Ｆｉｇ、　３補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年９月１９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．次式ＩＩ：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（つづき）【配列があります】Ｂ−鎖（つづき）【配列があります】Ｂ−鎖（つづき）【配列があります】（式中、Ｅは個々にＧｌｕまたはヌクレオチド配列によりコードされうる中性アミノ酸残基を表わし、Ｎはヌクレオチド配列によりコードされうるアミノ酸残基を表わし、ＴはＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、ＸはＴｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｌａまたはＯＨを表わし、ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２を表わしその際Ｒ１，Ｒ１およびＲ２は個々に水素原子または低級アルキル基を表わしただしＹはＸがＯＨを表わす場合存在しない）を有することを特徴とするインシュリン化合物。
２．各Ｅが個々にＧｌｕまたはＧｌｎを表わし、ＮがＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙを表わし、ＴがＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、ＸがＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わす請求の範囲第１項記載のインシュリン化合物。
３．すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴおよびＸの両方がＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わす請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物。
４．すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＳｅｒを表わし、ＴおよびＸの両方がＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わす請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物。
５．Ｂ１３位におけるＥがＧｌｎを表わし残りのＥがすべてＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴおよびＸの両方がＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わす請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物。
６．Ａ４位におけるＥがＧｌｎを表わし残りのＥがすべてＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｐを表わし、ＴおよびＸの両方がＴｈｒを表わしそしてＹがＮＨ２を表わす請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物。
７．すべてのＥがＧｌｕを表わし、ＮがＡｓｎを表わし、ＴがＡｒｇを表わしそしてＸがＯＨを表わす請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物。
８．一般式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｅ，ＮおよびＴはすべて請求の範囲第１項に定義されたと同じ意味を有し、（ＡＡ）ｎはｎ個のアミノ酸残基を有しＣ末端残基としてＬｙｓを有するペプチド鎖を表わすかまたはｎ＝０の場合ペプチド結合であり、そしてＺは水素原子を表わすかまたはＣ末端残基としてＬｙｓを有する任意の長さのペプチド鎖を表わす）で表わされるインシュリン前駆体を、ペプチド転移するかまたはリシン残基のカルボキシ側での切断に対し非常に特異的なエンドペプチダーゼを用いて切断する第１項に記載のインシュリン化合物の調製方法。
９．請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物少なくとも１種と場合により速効性インシュリンたとえばヒトインシュリン、家畜インシュリンまたはその誘導体もしくは類似物質とからなるインシュリン製剤。
１０．血清と等浸透圧であり、ｐＨ２〜５．５であり、そして場合により緩衝液および／もしくは保存剤および場合により速効性インシュリンを含む水性媒体中に請求の範囲第１項に記載のインシュリン化合物少なくとも１種が溶解した液からなる請求の範囲第９項に記載のインシュリン製剤。