JPS6312298A - β−ウロガストロン誘導体及びその製造、該誘導体をコ−ドするＤＮＡ塩基配列、これを含む発現ベクタ−及び該ベクタ−を保有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、β−ウロガストロン誘導体、より詳しくは、
β−ウロガストロンの２１番目及び５３番目のアミノ酸
を、特定のアミノ酸に置換させた新規な誘導体及びその
製造法、該誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列、該ＤＮ
Ａ塩基配列を含む発現ベクター及び該ベクターを保有す
る微生物に関する。

従　　来　　の　　技　　術 β−ウロガストロンは、１９７５年にグレゴリ−により
人尿から発見されたポリペプチドであり、５３個のアミ
ノ酸残基からなり、３個のジスルフィド結合を有してい
る〔ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ　）　。

２５７．３２５　（１９７５））。

そのアミノ酸配列は、次に示す通りである。

Ａｓｎ−３ｅｒ−ＡＳＤ−８ｅｒ−Ｇ　ｌｕ−Ｃｙｓ−
Ｐｒｏ−１８１１−５ｅｒ−）−１ｉｓ−Ａ　５ＩＪ−
Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ−Ｈｉｓ　ＡＳｐＧｌ
ｙ　Ｖａｔ　ＣＶＳ−Ｍｅｔ　Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇ　１
ｕ−Ａ　ｌａ−ＩＪＬＩ−ＡＳり−１ＪＳ−ＴＶｒ−Ａ
　ｌａ−ＣＶＳ−ＡＳｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　
−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｙｒ−［１ｅ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｕ−Ａ
ｒａ−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｔｙｒ−ＡｒＯ−ＡＳＤ−Ｌ
ｅｕ−Ｌ’／５−Ｔｒり−Ｔｒｌ）−Ｇｌｕ−１ｅｕ−
Ａｒｇ上記β−ウロガストロンは、また多様な生物活性
、例えば胃酸分泌抑制作用、細胞増殖促進作用、新生仔
マウスの眼瞼開裂作用、切歯閉出促進作用等を有するも
のとして知られている。一方、マウス顎下腺より得られ
るマウス上皮細胞成長因子（ｍＥ　Ｇ　Ｆ　：　ｍｏｕ
ｓｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ａｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏ
ｒ　）は、上記β−ウロガストロンと同等の生物活性を
有しており、しかもそのアミノ酸配列も上記β−ウロガ
ストロンのそれと相同性が高い。この点より、β−ウロ
ガストロンは、またヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）
であるとも考えられている（Ｇ、　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ
　ａｎｄ　　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４８．　１９３−２１６　（１９７
９）　　）。

しかして、従来知られているβ−ウロガストロンの製造
単離方法、例えば上記グレゴリ−の方法によれば、人尿
に僅か数μ（Ｊ　／Ｑ　Ｌ／か含まれていないβ−ウロ
ガストロンを、複雑な工程を経て精製する必要があり、
その量産は不可能に近い。

本発明者らは、上記方法に代り、遺伝子組換え技術を応
用して、上記β−ウロガストロンを微生物より大量に生
産する方法を先に研究開発した〔特開昭６１−１５６９
１号公報参照〕。この方法の確立により、高純度のβ−
ウロガストロンが大量に供給可能となり、かくして得ら
れたβ−ウロガストロンを利用して、従来困難であった
各種の動物実験、細胞レベルでの研究等が実施可能とな
り、徐々にβ−ウロガストロンについての実験データー
も蓄積され、その医薬用途への適用可能性も広がりつつ
ある。

しかしながら、β−ウロガストロンを医薬品として実用
するには、例えばその安定性の而等において多くの問題
点が残されている。上記安定性に関して、一般にポリペ
プチド中のＭｅｔ残基が酸化変性を受けやすいことはよ
く知られており、本発明者らも先に開発した方法の実施
の際に、β−ウロガストロンの精製途中で、その酸化変
性物が生成する場合のあることを確認している。

また、人尿から抽出単離されたβ−ウロガストロンには
、多様性が認められており、これは主としてβ−ウロガ
ストロンのカルボキシル末端アミノ酸配列部分の加水分
解による欠失に起因すると考えられている。本発明者ら
が先に開発した遺伝子組換え技術に従う場合にも、この
加水分解による欠失と考えられるカルボキシル末端から
２個のアミノ酸配列の欠失したポリペプチドの生じるこ
とが報告されている〔北沢ら、第５８回生化学会大会抄
録、第８５３頁（１９８５年）〕。上記カルボキシル末
端の欠失には、トリプシン様プロテアーゼが関与してい
る可能性が強いと考えられており、β−ウロガストロン
を医薬品として生体に投与する場合、血中に存在する各
種プロテアーゼによる分解、失活の可能性は高い。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記β−ウロガストロンのアミノ酸配
列を改変し、これにより医薬用途等への適用に好適な新
しいβ−ウロガストロン誘導体及びその製造技術を提供
することにある。

また、本発明の目的は、上記新規なβ−ウロガストロン
誘導体を遺伝子組換え技術により製造する方法、特に該
方法の実施のための上記誘導体をコードするＤＮＡ塩基
配列、これを含む発現ベクター及び該ベクターにより形
質転換された微生物及び之等の製造技術を提供すること
にある。

Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−ＡＳＤ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ｘ’　−Ｔｙｒ−１Ｉｅ−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ　−Ｃ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−Ｔｙｒ−Ａｒり−ＡＳｐ−ＬｅｌＪ−Ｌｌ／５−Ｔｒ
ｌ）−Ｔｒｌ）−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ２〔式中ｘ１はＶ
ａｌ、ｌｅｕ又はＭｅｔを、×２はＡｒａ又はＧｌｎを
示す。但し×２がＡｒｃの場合、×１はＶａｌを示すも
のとする。〕 で表わされるβ−ウロガストロン誘導体が提供される。

尚、上記及び以下の本明ＩＩＡ書におけるアミノ酸、核
酸塩基、その他に関する略号は、ＩＵＰＡＣ。

ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもの
とする。その例は次の通りである。

Ａｌａ・・・アラニン　　　Ａｒｇ・・・アルギニンＡ
Ｓｎ・・・アスパラギン　ＡＳＩ）・・・アスパラギン
酸Ｃｙｓ・・・システィン　　Ｇｌｎ・・・グルタミン
Ｇｌｕ・・・グルタミン酸ＧＩｙ・・・グリシンＨｉｓ
・・・ヒスチジン　　Ｉｌｅ・・・イソロイシンｌｅｕ
・・・ロイシン　　　ＬＶＳ・・・リジン１ｙｌｅｔ・
・・メチオニン　　Ｐｈｅ・・・フェニルアラニンＰｒ
ｏ・・・プロリン　　　３ｅｒ・・・セリンＴｈｒ・・
・スレオニン　　Ｔｒｐ・・・トリプトファンＴｙｒ・
・・チロシン　　　Ｖａｌ・・・バリンＡ・・・アデニ
ン　　　　Ｔ・・・チミンＧ・・・グアニン　　　　Ｃ
・・・シトシンまた、本発明誘導体その他のポリペプチ
ドにおけるアミノ酸番号は、上記式（１）に示す通り、
そのアミン末ｍ（ＡＳｎ）を１として付したものである
。

本発明の上記式（１）で表わされるβ−ウロガストロン
誘導体には、より詳しくは以下の各ポリペプチドが包含
される。

＜Ｉ＞式（１）中×１がｖａｌであり且つ×２がＡｒ１
ｊであるポリペプチド、 ＜ｎ＞式（１）中ｘ１がｖｅｔであり且つ×２がＧｌｎ
であるポリペプチド、 ＜ｍ＞式（１）中Ｘ言がＶａｔであり且つｘ２がＱｌｎ
であるポリペプチド、及び く■〉式（１）中×１が１−ｅｕであり且つ×２がＧｌ
ｎであるポリペプチド。

本発明誘導体は、いずれもβ−ウロガストロンと同一の
生物活性乃至生理活性もしくは薬理活性を有し、且つそ
の活性の程度は同等であるかもしくはこれを上回ってい
る。即ち、β−ウロガストロンと共通する高次構造を保
有している。しかもこの誘導体は、酸化変性を受けにく
く化学的安定性において優れている特徴及び／又はトリ
プシン様プロテアーゼ等の蛋白質分解醇素の攻撃を受は
易い特異点を有さず安定である特徴を具備している。従
って、本発明誘導体は、その医薬分野での応用に際し有
利であり、また製剤化等の加工面、保存面等でも優れた
利点を有している。加えて、本発明誘導体は、その製造
も比較的容易である利点がある。

以下、本発明のβ−ウロガストロン誘導体の製造方法に
つき詳述する。

本発明誘導体は、代表的には該誘導体のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ塩基配列（遺伝子）を利用して、遺伝
子組換え技術に従い、即ち、上記遺伝子を微生物のベク
ターに組込んで該微生物細胞内で、複製、転写、翻訳さ
せることにより、製造することができる。この方法によ
れば特に大量生産が可能である。また本発明誘導体は、
上記遺伝子組換え技術によらずとも、例えばそのアミノ
酸配列に従い、通常のペプチド合成法により化学的に合
成することもできる。

一上記遺伝子組換え技術に従う本発明β−ウロガストロ
ン誘導体の製造に利用される遺伝子は、本発明誘導体＜
Ｉ＞〜＜　ＩＶ　＞のアミノ酸配列のそれぞれをコード
するものであり、之等は各アミノ酸配列に応じて、それ
らを構成するアミノ酸に対応した遺伝暗号を任意に選択
組合せることができる。

上記各アミノ酸配列と之等をコードする各遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列の一例を下記に示す。

本発明誘導体＜Ｄ　（（ＶａＩ２　＋　）−β−ウロガ
ストロン）１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｉ。

ＡＳｎ−Ｓｅｒ　−ＡＳＩ）−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｃ
ＹＳ　−Ｐ　ｒＯ−Ｌｅｕ　−５ｅｒ−Ｈｉ　Ｓ−Ａｓ
ｐ−ＡＡＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴ
ＧＴＣＴＣＡＣＧＡＴＴＴＡＴＣＧＣＴＡＡＧＡＣＴＣ
ＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＧ　ｌｙ　−Ｔ
ｙｒ　−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｈ１ｓ−Ａｓｐ−Ｇ　ｈｌ
　−Ｖａｔ　−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−ＧＧＣＴＡ
ＴＴＧＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴ
ＴＡＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣ
ＡＡＡＣＧＣＡＡＡＴＧＩ　Ｉｅ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　
ｌａ　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　−Ａ　Ｉ
ａ　−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−ＡＴＴＧＡＡＧ
ＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧ
ＴＴＡＡＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＣ
ＡＣＡＴＴＧＡＣＡＶａｌ　−Ｖａｔ−Ｇ　＋ｙ−Ｔｙ
ｒ−１１ｅ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　１ｕ−ＡｒＣＩ　−Ｃｙｓ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｙｒ　−ＧＴＡＧＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴ
ＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣ
ＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＡＧＴＴＡ
ＴＧＡｒＯ−ＡＳＩ）−Ｌｅｕ−ＩＪＳ−Ｔｒｌ）−Ｔ
ｒｌ）−Ｇｌｔｌ−Ｌｅｄ−Ａｒ＋ＩｔＣＧＴＧＡＴＣ
ＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＣＡＣＴ
ＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣＧＣＡ本発明
誘導体＜ＩＩ＞　（（Ｇｌｎ５３　）−β−ウロガスト
ロン）Ａｓｎ　−３ｅｒ−Ａｓｐ　−５ｅｒ−Ｇ　ｌｕ
　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−１ｅｕ　−３ｅｒ　−）１　ｉ
ｓ　−Ａｓｐ　−ＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧ
ＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＡ
ＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＧ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−ＨｉＳ−ＡＳＩ）−Ｇ
ｌｙ−ＶａＩ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ＧＧＣＴＡＴ
ＴＧＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＧＴ
ＡＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡ
ＡＡＣＧＴＡＣＡＴＧ１　ｌｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｌａ−
Ｌｅｕ−ＡＳＩＩ−ＬＶＳ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ−Ｃｙｓ
−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−ＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴＡ
ＡＡＴＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＣＧ
ＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡ
Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＧＩｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−ＧＩｙ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−ＧＴＡＧＴＧ
ＧＧＴＴＡＴＡＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＡＴ
ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣ
ＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡｒＱ−ＡＳＩ）−Ｌｅｕ−ＬＪ
ｓ−Ｔｒｌ）−ＴｒＤ−Ｇｌｕ−Ｌｅｌｌ−ＧｌｎＣＧ
ＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧ
ＧＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＧ
ＴＣ本発明誘導体＜Ｉ［［＞　（（ＶａＩ２１．Ｇ１ｎ
５３）−β−ウロガストロン）Ａｓｎ　−Ｓｅｒ　−Ａ
ｓｐ−８ｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ　−５ｅｒ−Ｈ１ｓ−Ａｓｐ−ＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴ
ＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＴＴＴ
ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡ
ＧＴＧＣＴＡＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
−Ａｓｐ−ＧＩｙ−Ｖａｔ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
ＧＧＣＴＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴ
ＧＣＧＴＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴ
ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＡＴＧ１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａ
Ｉａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−ＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴ
ＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＣ
ＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣ
ＡＶａｌ　−Ｖａｌ　−Ｇ　ｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇ
　Ｉｙ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｙｒ
−ＧＴＡＧＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣ
ＴＧＴＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣ
ＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡｒａ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｎＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴ
ＧＣＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴ
ＧＡＣＧＴＣ本発明誘導体＜ＴＶ＞　（（Ｌｅｕ２１．
　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロン）Ａｓｎ−５ｅｒ
−ＡＳＤ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｌ　ｅｕ　−５ｅｒ−Ｈｉｓ　−Ａｓｐ　−ＡＡ
ＣＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴ
ＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧ
ＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＧｌｙ−Ｔｙｒ−ＣｙＳ
−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＧＧＣＴＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＣＧＡ
ＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡ
ＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＴＧＩ
　１ｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｌａ　−１，−ｅｕ−ＡＳＩ）
−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ　−ｃｙｓ−Ａｓｎ　−
Ｃ１／Ｓ　−ＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴ
ＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＣＧＡＡＡ
ＣＣＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＶａｌ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＩＩｅ−Ｇｌｙ−ＧＩｕ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−ＧＴＡＧＴＧＧＧＴ
ＴＡＴＡＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＡＴＡＣＣ
ＡＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣ
ＡＧＴＴＡＴＧＡｒｇ−ＡＳＤ　−１−ｅｕ　−１−ｙ
ｓ　−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＧＩＬＩ　−ｌｅｕ−ＧｌｎＣ
ＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡ
ＧＧＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣ
ＧＴＣ本発明β−ウロガストロン誘導体のアミノ酸配列
は、自然界では知られていない新規なものであり、従っ
て該誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列も新規であり、
本発明はかかるβ−ウロガストロン誘導体をコードする
新しい遺伝子（以下、これを「本発明遺伝子」という。

また個々の本発明遺伝子は、対応する本発明誘導体と同
一記号＜Ｉ＞〜〈■〉をけして示すものとする）及びこ
れを含み本発明誘導体を発現するベクターをも提供する
ものである。

本発明遺伝子は、通常の方法、例えばホスファイト　ト
リエステル法〔ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ　）　。

３１０．１０５　（１９８４））等の常法に従い、核酸
の化学合成により全合成することもできるが、本発明者
らが先に確立した天然型β−ウロガストロンをコードす
る合成遺伝子を利用して、これを例えばインビトロ点突
然変異法（Ｍ、Ｊ。

Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　ｌｙｌ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ　　、　　１０
０．４６８−５００等の通常の方法によりその一部を改
変させて合成するのが有利である。上記天然型β−ウロ
ガストロンをコードする合成遺伝子は、該β−ウロガス
トロンの前半部及び後半部のそれぞれに対応する２つの
ＤＮＡ塩基配列（サブユニットＡ及びサブユニットＢ）
に分けられ、各々クローニングベクターｐＢＲ３２２に
組込まれて、プラスミドｐＵＧ１及びプラスミドｐ　Ｕ
Ｏ３として確立されており、之等を結合させたβ−ウロ
ガストロンをコードする完全ＤＮＡ塩基配列を含むプラ
スミドｐＵＧ３を保有する大腸菌Ｈ８１０１株は、通商
産業省工業技術院微生物工業研究所にｒＨＢｌｏｌ（ｐ
ＵＧ３）Ｊなる表示で微工研条寄第５４３号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−５４３）ｊとして寄託されている〔特開昭６
１−１５６９１号公報寺照〕。

２１位がＶａｌである本発明β−ウロガストロン誘導体
＜Ｉ＞に対応する本発明遺伝子（遺伝子〈工〉）の製造
につき詳述すれば、この遺伝子＜Ｉ＞は、これを含むプ
ラスミドｐ　ＵＯ３−Ｖとして調製される。該１）ＬＩ
Ｇ３−Ｖは、上記公知のプラスミドｐＵＧ１に含まれる
サブユニットＡの作成に当り、まずその２１位の置換ア
ミノ酸（Ｖａｌ）に対応するコドンを有するオリゴヌク
レオチドを化学合成後、これをその他のサブユニットＡ
を構成するオリゴヌクレオチドと結合させてサブユニッ
トＡの誘導体とし、このサブユニットＡＩ導体をプラス
ミドｐＢＲ３２２に組込んでプラスミドｐＬＩＧ１−Ｖ
を作成し、次いで得られるｐＵＧｌ−ＶをプラスミドＩ
）ｔＪＧ２と結合させることにより製造することができ
る。

また、かくして得られるプラスミドｐ　ＵＯ３−■を利
用して、本発明β−ウロガストロン誘導体＜Ｉ＞の発現
ベクターを製造する方法としては、特に制限はなく、従
来よりこの種遺伝子組換え技術に慣用されている各種方
法に従うことができる。

例えば上記本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できるよう
に目的とする誘導体をコードするＤＮＡ塩基配列と、こ
れを発現させるための例えばプロモーター、リボゾーム
結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号等の各種調
節因子等とを結合させて組換えＤＮＡベクターを創製す
ればよい。

上記プロモーター等の各種因子を含み目的遺伝子を発現
させ得る組換えＤＮＡを作成するための起源ベクターと
しては、従来より外来遺伝子のクローニングに用いられ
ている各種のもの、例えばプラスミド、バクテリオファ
ージ、ウィルスＤＮＡ、コスミド等のいずれでもよい。

之等の組換えＤＮＡは、その開始コドン（ＡＴＧ＞の上
流にプロモーターを有しているのが好ましく、該プロモ
ーターは、形質転換体の製造に利用する宿主細胞に対し
て適切な各種のもの、例えば大腸菌（Ｅ　５ｃｅｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｔ　ｉ　）に対してはｔｒｐプロモー
ター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ　Ａプロモーター、
λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等を、枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に対しては５
ｐｏｉプロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ　
ｐプロモーター等を、酵母（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｎｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）に対してはＰＨ０５プロモ
ーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、Ａ
ＤＨプロモーター等を、動物ＩＩＩ胞に対してはＳＶ４
０由来のプロモーター等を例示できる。

また、本発明のβ−ウロガストロン誘導体は、シグナル
ペプチドとの融合蛋白質としてこれを発現させることも
でき、この場合上記組換えＤＮＡとしては、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列と目的遺伝子とを直
接連結させた融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列を有している必要がある。このシグナルペプチド及
びこれをコードするＤＮＡ塩基配列としては、アルカリ
性ホスファターゼ由来のもの、β−ラクタマーゼ由来の
もの等の任意のものを利用でき、之等は天然から収得し
てもよく、またそのアミノ酸に対応するコドンを適宜選
択して合成してもよい。大腸菌β−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドとしては、以下のものを例示できる。

Ｍｅｔ−８ｅｒ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ　−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ　−ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣ
ＣＧＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＡＶ
ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ　−ＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣ
ＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＡＡ
ＡＡＡＡ　ｌａ　−Ａ　ｌａ　−Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｔ　−ＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧ
ＧＡＡＧＧＡＣＡＧｐｈｅ−Ａｌａ ＴＣＧＣＧ ＡＧＣＧＣ 及び Ｍｅｔ−８ｅｒ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−ＡＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＧ
ＴＴＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＧＣＡＶａｌ
　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−１１ｅ−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ　−ＧＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣＧＴＴ
ＣＴＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＴＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧ
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−ＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣ
ＧＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡｐｈｅ−Ａ
ｌａ ＴＣＧＣＣ ＡＧＣＧＧ 上記組換えＤＮＡとしては、特に本発明者らが先に確立
したｐＢＲ３２２を起源ベクターとして構築されたｐ　
ＧＨ５４、ｐ　ＧＨ５５及び之等に由来する。　ＵＧ２
０１、ｐ　ＵＧＴｌ　５０等が好ましく利用できる。

上記ｐＧＨ５４は、β−ラクタマーゼのプロモーター及
びリボゾーム結合部位に続いてβ−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、この
塩基配列の３′末端にＮｒｕ■及びｐｖｕｌＩの制限酵
素認識配列を有するものであり、その特性は、その製造
概略操作と共に第１図に示す通りであり、図示された制
限酵素開裂地図により特徴付けられ、大きさく１．０％
アガロースゲル電気泳動による、以下同じ）は約３．９
ｋｂである。このプラスミドＤ　ＧＨ５４を保有する大
腸菌Ｈ８１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、ｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　ＧＨ５４〕］なる
表示で、微工研条奇第６７９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６
７９）として寄託されている。

ｐＧＨ５５は、上記ｐＧＨ５４における第２のｐｖｕ［
制限サイトを含む６３７塩基のＤＮＡを欠失し、第１の
ＰｖｕＩｒ制限サイトをシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列の３′末端付近に有する以外は、該ｐＧ
Ｈ５４と共通しており、その特性は、その製造概略操作
と共に第２図に示すた通り、図示された制限酵素開裂地
図により特徴付けられ、大きさは約３．３ｋｂである。

このプラスミドｐＧ）−１５５を保有する大腸菌Ｈ８１
０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
にｒＨＢｌｏｌ　（１）Ｇ）−１５５）Ｊなる表示で、
微工研条寄第６８０号（ＦＥＲ，Ｍ　　ＢＰ−６８０）
として寄託されている。

ｐ　ＵＧ２０１は、大きさ約３，７ｋｂであり、β−ラ
クタマーゼのプロモーター、リボゾーム結合部位、開始
コドンを含むβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドのＤ
ＮＡ塩基配列、β−ウロガストロンのＤＮＡ塩基配列、
その停止コドン及び転写終結信号が正確にこの順序で配
列されたＤＮＡ塩基配列を有している。その配列は、後
記第４表に示す通りである。該プラスミドｐ　ＵＧ２０
１を保有する大腸菌Ｈ８１０１株は、ｒＨＢｌｏｌ（ｐ
　ＵＧ２０１　）Ｊなる表示で、微工研条寄第６８１号
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８１）として寄託されている。

１）ＵＧＴＩ　５０は、大きさ約３．９ｋｂであり、ｏ
　ＩＪＧ２０１の配列から、β−ラクタマーゼのプロモ
ーター及びリボゾーム結合部位を除き、代りにベクター
ｐ　ＤＲ５４０（Ｄ、Ｒ，Ｒｕ５ｓｅｌｌとＧ。

Ｎ、　Ｂｅｎｎｅｔｔ、、Ｇｅｎｅ　、　２０．２３１
−２４３（１９８２））に含まれるｔａｃブＯモーター
と、これに付属するＩａｃオペレーター及びリボゾーム
結合部位が挿入されたベクターである。該ベクター構築
の詳細は、後記参考例に述べる通りであり、またその概
略図を第５図に示す。該ｐＵＧ１５０を保有する大腸菌
ＪＭ１０３株は、ｒＪＭ１０３（Ｄ　ＩＪＧＴＩ　５０
）Ｊなる表示で、微工研条寄第９７４号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−９７４）として寄託されている。

上記ｐ　ＵＧ２０１、ｏ　ＵＧＴＩ　５０においては、
之等各ベクターにより生成されるｒｇ　ＲＮＡは、β−
ラクタマーゼのシグナルペプチドのＮ端アミノ酸に相当
する、メチオニン（Ｍｅｔ）をコードする開始コドンの
上流から転写が開始され、シグナルペプチド部分、β−
ウＯガストロン部分を経て、更にその下流へと転写がな
され、転写の終結は、２等ベクターの起源ベクターであ
るｐＢＲ３２２におけるβ−ラクタマーゼの遺伝子の転
写終結信号によりなされる。その位置は、β−ウロガス
トロンをコードするＤＮＡ塩基配列末端の停止コドンの
下流的０．６ｋｂ付近であると考えられる。

ｍ　ＲＮＡは転写が終結して始めて機能すると考えられ
るため、遺伝子の下流に転写終結信号を有することは該
遺伝子の発現にとり必須であり、上記１）ＵＧ２０１等
ではこの転写終結信号としてβ−ラクタマーゼの発現に
関するＩＩ　ＲＮＡ転写の終結のための信号を利用して
いるが、これは同様の機能を有する他の公知のＤＮＡ塩
基配列、例えばλファージのＬｌや大腸菌のｔｒｐＡ転
写終結信号等に代替することができる。

上記各種の起源ベクターを利用して本発明誘導体発現ベ
クターを創製する方法は、より具体的には、例えば以下
のごとくして実施される。

即ち、本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜Ｉ＞発現ベ
クターｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖは、例えば前記プラスミ
ドｐＵＧ３−■と上記１）ＵＧＴ１５０等とから、常法
に従い、制限酵素を用いる酵素反応やＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いる酵素反応等を利用して有利に製造することが
できる。また上記プラスミドｐ　ＵＯ３−Ｖは、本発明
遺伝子＜Ｉ＞の５′末端に開始コドンとなり得るＭｅｔ
のコドン（ＡＴＧ）が付加されているため、その上流に
前記特開昭６１−１４５９１号公報に記載の方法に従い
、λＰＬプロモーター等のプロモーター及びリボゾーム
結合部位等を有するＤＮＡ塩基配列を結合させることに
よっても、本発明の誘導体＜Ｉ＞発現ベクターを製造す
ることができる。更に本発明誘導体＜Ｉ＞発現ベクター
は、遺伝子＜Ｉ＞と他の適当な蛋白質のＤＮＡ塩基配列
とを結合させた融合蛋白をコードするＤＮＡ塩基配列を
調製して、融合蛋白発現ベクターとしてもよい。

上記本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜Ｉ＞発現ベク
ターの構築の具体例は、後記実施例に示す通りであり、
これにより得られたベクターは、ｒＪＭｌ　０３　（ｐ
　ＵＧＴｌ　５Ｏ−Ｖ）Ｊなる表示で、微工研条寄第１
０８３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８３）として寄託さ
れている。

本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜ｎ＞をコードする
遺伝子＜ｍ＞及びこれを有する発現ベクターは、例えば
以下の如くして製造することができる。即ち、上記Ｅ）
ｔＪＧ３．１）ＵＧ２０１、ｐ　ＵＧＴＩ　５０等にお
いては、β−ウロガストロンのＤＮＡ塩基配列の３′末
端側に制限酵素５ａｕ３ＡＩの切断部位があり、またこ
の３′末端の下流に制限酵素Ｂ！１ｌＩＩ［等の切断部
位がある。従って、之等の制限酵素切断部位を利用して
、同制限酵素で各々切断され且つ誘導体＜ｍ＞をコード
し得るように設計及び化学合成したＤＮＡ断片を、上記
各プラスミドの酵素による切断個所に挿入することによ
り、容易に一工程で所望の遺伝子＜ｎ＞を有し且つ誘導
体＜ｎ＞を発現できるベクター、即ちｏ　ＵＧＴｌ　５
０−Ｇを収得することができる。

この誘導体＜Ｕ＞発現ベクターは、ｒＪＭｌ　０３（１
）ＵＧＴｌ　５Ｏ−Ｇ）Ｊなる表示で、微工研条寄第１
０８４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８４）として寄託さ
れている。

本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜ｍ＞をコードする
遺伝子＜ｍ＞及びこれを有する発現ベクターは、例えば
上記で各々調製されたベクターｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖ
とｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇとを利用して、以下の如くし
て製造することができる。

即ち、ｐ　ｔＪＧＴｌ　５０−Ｖ及びｐ　ＵＧＴｌ　５
０−Ｇは、互いに殆んどのＤＮＡ塩基配列が共通であり
、ただｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖにおいて２１位のＭｅｔ
がＶａｌに置き換えられた部分（■ａ１２１領域）と、
ｐ　ｔＪＧＴｌ　５０−Ｇにおいて５３位のＡｒａがＧ
ｌｎに置き換えられた部分（Ｇｌｎ５３領域）が異なる
のみである。しかして、上記２つの領域間には、制限酵
素Ｈｉｎｄｌ［［、ＭＩｕＩ等の切断点が共通して存在
している。従って、ｐ　ＵＧＴＩ　５０−Ｖとｐ　ＬＩ
ＧＴｌ　５０−Ｇとのそれぞれを、例えばＣ１ａ工で切
断して得られるＤＮＡ断片のうち、Ｖａ１２１領域を含
むＤＮＡ断片と、Ｑｌｎ５３領域を含むＤＮＡ断片とを
結合させれば、所望の誘導体＜ｍ＞発現ベクターが得ら
れる。かくして得られる誘導体＜ｍ＞発現ベクターは、
ｒＪＭ１０３（ｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧ）Ｊなる表示
で、微工研条寄第１０８５号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０
８５）として寄託されている。

更に、本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜　ＩＶ　＞
をコードする遺伝子＜ＩＶ＞及びこれを有する発現ベク
ターは、例えばまず前記ｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖの調製
と同様にして、２１位が１−ｅｕであるβ−ウロガスト
ロン誘導体をコードする遺伝子を含むベクターｐ　ＬＩ
ＧＴｌ　５０−Ｌを作成し、該ベクターと上記ｏ　ＵＧ
Ｔｌ・５０−Ｇとを利用して、上記誘導体＜ｍ＞発現ベ
クターの製造と同様にして製造することができる。即ち
、ｐ　ｔＪＧＴｌ　５０−Ｌとｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇ
とは、ｌｅｕ”領域とＧ１ｎ５３領域とが互いに異なる
以外は、共通したＤＮＡ塩基配列を有し、２つの領域間
には、ＭＩｕＩ、）−１ｉｎｄｌ１等の制限酵素による
切断点が共通に存在しているため、之等をそれぞれ例え
ばＭｌｕＩで切断し、更に例えばＣｌａ工で切断して得
られるＤＮＡ断片のうち１６ｇ２＋領域とＧ１ｎ５３領
域を含むＤＮＡ断片を結合させれば、所望の誘導体＜　
ＩＶ　＞をコードする遺伝子＜ＩＶ＞が得られ、同時に
該遺伝子を発現するベクター９１ＪＧＴ１５０−ＬＧが
得られる。このベクターは、ｒＪＭｌ　０３　（ｐ　Ｕ
ＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧ）Ｊなる表示で、微■研条奇第１０
８６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８６）として寄託され
ている。

上記のごとくして得られる本発明誘導体をコードする遺
伝子を含有する発現ベクターは、之等を適当な宿主細胞
に導入して、該宿主細胞を形質転換させることにより、
本発明誘導体産生能を付与することができる。ここで用
いられる宿主＠胞としては、特に限定はなく、公知の各
種のもの、例えば大腸菌等のダラム陰性細菌、枯草菌等
のグラム陽性細菌、放線菌、酵母、！ｌＪ植物細胞等の
いずれでもよいが、特に大腸菌に１２株由来のＨ８１０
１株（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　　Ｄ、　Ｒｏｕ
ｌｌａｎｄ−Ｕ３ｕＳＳＯｉＸ、、ｔＪ、　Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、、　４１　、４５９−４７２　＜１９６９）
）及びＪＭ１０３株（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎａｅｔａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、、９゜３０９（１９８１））は好まし
い。

上記宿主細胞への本発明ベクターの導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法例
えば宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で
処理し、該溶液中にベクターを添加する方法（Ｅ、　ｌ
−ｅｄｅｒｂｅｒｇ　　ａｎｄ　３．　Ｃｏｈｅｎ、　
Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．１０７２（１
９７４））等を例示できる。

上記のようにして、本発明ベクターの導入により形質転
換したｉｌｌ胞を収得することができ、本発明は、かか
る形質転換された宿主細胞をも提供するものである。

本発明の上記ベクターにより形質転換された細胞は、通
常の細胞を培養するために用いられる適当な培地を用い
て培養することができ、該培養により所望のβ−ウロガ
ストロン誘導体が生産、蓄積される。上記培養に利用で
きる培地としては、例えばし培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、
Ｍ６３培地等の各種の培地を好ましく用いることができ
る。また之等の培地には、更に通常知られている各種の
炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天然物抽出物、
生理活性物質等を添加することもでき、かかる培地も好
ましく利用できる。培養は、前記宿主細胞の生育に適し
たｐ　Ｈ，ｍ度、通気、撹拌等の条件を採用した各種の
方法により実施できる。

例えば大腸菌の場合に°は、ｐＨ約５〜８の範囲、特に
ｐＨ７が適当であり、約２０〜４３℃の温度で、通気撹
拌条件で培養することが望ましく、培養のスケールには
特に限定はない。更に目的とするβ−ウロガストロン誘
導体の発現量乃至分泌量を高めるため、また菌体外への
目的誘導体の排出を促進乃至抑制する目的等に応じて上
記培地組成や培養条件等は適宜変更設定することもでき
る。

上記培養により、例えばシグナルペプチドとβ−ウロガ
ストロン誘導体との融合ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含有させた本発明ベクターで形質転換した
細胞では、細胞質内で融合ポリペプチドが生産され、続
いて細胞外又はペリプラズムに目的のβ−ウロガストロ
ン誘導体が成熟ポリペプチドの形で分泌蓄積される。即
ち、まず、ベクター中の融合ポリペプチドをコードする
遺伝子から、ベクター中の転写調節因子並びに宿主細胞
中の諸因子の作用でｍ　ＲＮＡが生産される。

次いで、ｍ　ＲＮＡから翻訳調節因子並びに宿主細胞中
の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産される。更
にここで生産される融合ポリペプチドは、シグナルペプ
チドの作用により、ｌ！ｌＩ胞外又はペリプラズムに分
泌され、同時にシグナルペプチダーゼの作用により、融
合ポリペプチドからシグナルペプチドが切り離されるの
である。その結果、シグナルペプチドも、また他の如何
なる不要なアミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチド
が細胞外又はペリプラズムに分泌、蓄積される。またシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有さない
本発明ベクターで形質転換した細胞では、通常目的のβ
−ウロガストロン誘導体は細胞内に生産、蓄積さる。

かくして、宿主細胞の細胞膜、ペリプラズム等の内部又
は培養上澄等に蓄積された目的誘導体は、これを常法に
従い分離することができ、また精製することができる。

この分離、精製操作は、例えば培養上澄、浸透圧ショッ
ク法により調製したペリプラズム画分、超音波破砕によ
り調製した細胞内両分等につき、ゲルか過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー等を適宜組合せる方法により実施
することができる。特にペリプラズム中又は培養上澄に
分泌されるものは、上記分離、精製が比較的容易である
利点がある。

かくして、本発明によれば、遺伝子組換え技術により、
β−ウロガストロン誘導体を製造できる。

得られるβ−ウロガストロン誘導体の確認は、該誘導体
が免疫学的に、また生物化学的に天然型β−ウロガスト
ロンと略々同一の挙動を示すものであるため、β−ウロ
ガストロン特異ラジオイムノ７ツセイ（ＲＩＡ）、β−
ウロガストロン特異エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ
）、ラジオリセブターアッセイ（ＲＲ）等の手法による
ことができる。

また、本発明誘導体が高純度に精製されたことは、例え
ば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単
一ピークになること、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ＰＡＧＥ）で単一バンドになること等を指標として
容易に確認することができる。該高純度精製β−ウロガ
ストロン誘導体の同定は、また通常のポリペプチド乃至
は蛋白質の構造解析手段と同様の手段により実施できる
。即ち本発明誘導体は、５Ｏ８−ＰＡＧＥによる分子量
分析、等電点電気泳動による等電点測定、アミノ酸分析
機によるアミノ酸組成の測定、アミノ酸シークエンサー
によるアミノ酸配列の解析等により同定することができ
る。

さらに、本発明β−ウロガストロン誘導体の生物活性は
、例えば以下の方法により天然型β−ウロガストロンと
対比することができる。

■　細胞増殖促進活性 ＢへＬＢ／ｃ３Ｔ３等の培養細胞又は成熟ラット肝臓細
胞等の初代環Ｎ細胞等を、無血清条件下にβ−ウロガス
トロン誘導体又は天然型β−ウロガストロンを添加して
培養し、培養液中に標識さ−れたチミジン−５′−三リ
ン酸等を加えることにより、新たに合成されたＤＮＡ中
に取込まれるラジオアイソトープの量を測定する。この
ラジオアイソトープ量に比例して、新たなりＮＡ合成が
行なわれたこと、即ち細胞の増殖が促進されたことが判
る。

■　新生仔マウス眼瞼開裂及び切歯萌出促進活性新生仔
マウスに、β−ウロガストロン誘導体又は天然型β−ウ
ロガストロンを２４時間毎に皮下注射し、各被検動物の
眼瞼が開裂する日及び切歯の出現する日を記録する。β
−ウロガストロン（ヒトＥＧＦ）、マウスＥＧＦ等は、
之等に要する日数を短縮できることが知られている（Ｓ
。

Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、、　２
３７．１５５５−１５６２　（１９６２））。

また、本発明β−ウロガストロン誘導体と、天然型β−
ウロガストロンとの安定性の対比は、例えば人、ラット
等の動物の血清に、一定量の被検物質を添加し、一定温
度で一定時間放置した後、ＨＰＬＣ，ＰＴＡ等の手法を
用いて血清中の被検物質の残存量の測定により実施でき
る。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考例及び実施
例を挙げる。尚、各側において用いられる各方法及び操
作は、特に明記しない限り、以下の通り行なわれたもの
とする。

１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第１表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、３７℃の水浴中で３時間静置して反
応させる。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μＱに
対して１ユニツトであり、最終液量は１０μＱ以上とな
るようにする。

第　　１　　表 組　　成　　　低塩濃度　生塩濃度　高塩濃度（ＩＭ）
　　　緩衝液　　緩衝液　　緩衝液塩化ナトリウム　　
　　０　　　５０　　１００トリス塩酸 （ｐＨ７，５）　　　　　ｉｏ　　　　ｉｏ　　　　５
０塩化マグネシウム　　１０　　１０　　１０ジチオス
レイトール　　１　　　１　　　１２、フェノール抽出
法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭトリス塩酸（Ｄ　Ｈ８，０）緩衝液をフ
ェノールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、
同じく半固のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで
遠心分離してＤＮＡの含まれる緩衝液層を取る。更に０
．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）と
２倍量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０℃で
１時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収することに
よりフェノールを完全に除去する。

３、ＴＡＤＮＡリガーゼによるＤＩ’ＪＡ断片の結合（
環状化）操作 ６６ＩＩＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ７，５）　、６．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１１０ｌ１１ジチオスレイトール及
びＩＩＩＩＭ　　ＡＴＰにｏ、ｏｉ％の牛血清アルブミ
ンを添加した水溶液中で、ＤＮＡ断片と、その１μｇ当
り３ユニツトとなる量のＴｚＤＮＡリガーゼ（宝酒造■
製）とを、１２℃で５時間以上反応させることによりＤ
ＮＡを結合（環状化）させる。

４、ＤＮＡＩｆｌ！酵素の使用方法 （１）ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー断片によるＤＮ
Ａのプラントエンド化 ４０ａＭリン酸カリウム（ｐＨ７，４）、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、１１ＩＩＭ　β−メルカプトエタノール、
１ｍＭ　　ＡＴＰ及び各１＋Ｍのｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴ
Ｐ、ｄ　ＧＴＰ及びｄ　ＴＴＰを含む水溶液中に、ＤＮ
Ａを溶かし、ＤＮＡ１μｇに対して１ユニツトとなる量
のＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー断片、宝酒造■製）
を加え、１２℃で３０分間反応させ、必要に応じてフェ
ノール抽出を行なう。

（２）８１ヌクレアーゼによるＤＮＡのプラントエンド
化 ＤＮＡ１μｇにつき、６ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｆｆ
１Ｍ塩化ナトリウム及び１ｎ＋Ｍ硫酸亜鉛を含む緩衝液
（ｐ　Ｈ４，５）１００μＱを用いて、上記ＤＮＡの緩
衝液溶液を作成し、これに２０００ユニツトの８１ヌク
レアーゼ（ＢＲＬ社製）を加えて２０℃で３０分間反応
させ、反応終了後、フェノール抽出を行ない酵素を完全
に失活させる。

（３）ＴムボリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ５’
　端のリン酸化 １〜１０μ９のＤＮＡを、１０１０Ｍ塩化マグネシウム
、５ｍＭジチオスレイトール、１ｉＭＡＴＰを含む５０
ＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）５０μＱに溶
かし、これにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５ユニット
を加え、３７℃で３０分間反応させ、次いでフェノール
抽出により酵素を失活させる。

５、形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌に１２株由来の８８１０１株
又はＪＭ１０３株を用いる。

宿主細胞株を、ＬＢ培地（１％バクトドリプトン、０．
５％バクトイ−ストエキス、０．５％塩化ナトリウム）
で、３７℃下、６１０ｎ−の吸光度が０．２５になるま
で増殖させる。この培養液４０鶴を遠心力１１　（６０
００回転／分×１０分）して国体を回収し、次いで氷冷
する。これを０．１Ｍ塩化マグネシウム２０戒で洗浄し
、続いて氷冷した０、１Ｍｎ化カルシウム及び０．０５
Ｍ塩化マグネシウム溶液２０噌に懸濁させ、１時間氷冷
する。遠心力１　（６０００回転／分×１０分）後、菌
体を氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ塩
化マグネシウム溶液２ｍ１２に再懸濁させる。この懸濁
液０．２１１１２に、ＴｔＤＮＡリガーゼを用いて結合
させたＤＮＡ断片の反応組成液ｏ、Ｏ１ｍｏを加え、１
時間氷冷する。次いで４２．５℃の水浴で９０秒間加温
し、ＬＢ培地２．８−を加え、これを３７℃の水浴中で
１時間静置する。

次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選択
する。即ち、１．５％寒天を含むＬＢ培地にアンピシリ
ン５０μ（］／ＩＱ又はテトラサイクリン２０μｇ／−
を添加して調製した平板培地に、上記で得た反応組成液
の溶液各０．３ｍＱずつを拡げ、これを３７℃で一晩培
養し、生育する大腸菌コロニーを分離する。

６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０μｇ／
−又はテトラサイクリン２０μｇ／ｍＱを添加したＬＢ
培地５００舖で、６１０ｎｍでの吸光度が約０．６にな
るまで３７℃で振盪培養する。

次いでクロラムフェニコール８０１１１ｇを加え、３７
℃で１２〜１６時間振盪培養する。これを遠心力ｌｉｔ
　（６０００回転／分ＸＩＯ分）して菌体を集め、０．
８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。菌体を２０％
蔗糖を含む５０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液２
．５−に懸濁させ、次に１％リゾチームを含む０．２５
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液０．５ｍ１２を加え
、１０分間氷冷する。更に０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（
ｐ　Ｈ８，０）１鵬を加え、１０分間氷冷する。次に６
ＩＩＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、６０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液４−を加える
。

これを超遠心（２５０００回転／分×９０分）して上清
を採取する。この上清８．２−に塩化セシウム９．０ｇ
を加えて溶かし、次いで１％エチジウムブロマイド溶液
０．８−を加える。これを遠心分離（２０００回転／分
Ｘ１０分）して浮遊物を除き、溶液を超遠心（５０００
０回転／分×１５時間）する。次いで紫外線照射により
螢光を発するプラスミド部分を分離する。これを５Ｍ塩
化ナトリウム溶液で飽和したイソプロパツールで５〜６
回抽出してこれからエチジウムブロマイドを除去する。

最後に１．ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸
（ｐ　Ｈ８，０）　ＭＩｆｉ液に対して透析して塩化セ
シウムを除去する。

７、オリゴヌクレオチドの合成 下記に示す固相合成法（固相リン酸トリエステル法）に
より行なった（Ｈ，Ｉｔｏ　　ｅｔ　　ａｌ。

Ｎｅｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１０．１７５５−１７６９　（１９８２））。

即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂Ｓ−Ｘ　１（２０
０〜４００メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）
をアミノメチル化したものと、５′−〇−ジメトキシト
リチルヌクレオシドのモノコハク酸エステルとを反応さ
せて、ヌクレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム
社ｌＤＮＡ合成礪を用いて以下の操作を行なう。

上記樹脂４０＋ｎｏを反応管に入れ、１Ｍ臭化亜鉛のジ
クロロメタン−イソプロパツール（８５：１５）溶液を
用いて５′位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次
に完全に保護されたジヌクレオチドＣＣ，Ｂｒｏｋａ　
　ｅｔ　　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、８．５４６１−５４７１　（１９８０）
の方法により調製した〕のトリエチルアンモニウム塩５
０ｍ（ｌを加え、縮合剤（メシチレンスルホニル−５−
ニトロトリアゾール）を用いて縮合させる。以上の操作
を繰返して、順次鎖長をのばして、保護されたオリゴヌ
クレオチドを担持した樹脂を得る。尚、最後の縮合工程
では、必要に応じてジヌクレオチドの代りに、前記文献
に記載の方法により調製されるモノヌクレオチドのトリ
エチルアンモニウム塩２５ｍｃ＋を使用する。

次に０．５Ｍビリジン力ルドキシメートのピリジン−水
（１：１）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチ
ドを樹脂から脱離させる。これをセファデックスＧ−５
０カラム（ファルマシア社製、２ｘ１００ｃｍ＞で、更
に高速液体クロマトグラフィー（ポンプ；ウォーターズ
社製６０００Ａ型、検出器；４４０型デイテクター、カ
ラム；マイクロボンダーバックＣ１８、溶出溶媒；〈５
→４０％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム水溶液）で精製する。次に８０％酢酸により
脱保護反応を行ない、再度高速液体クロマトグラフィー
により単一ピークになるまで精製する。この高速液体ク
ロマトグラフィーの条件は、溶出溶媒として（５→２５
％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウム水溶液を用いる以外は、上記と同一とする。

８、ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ
）の方法（Ｍ２Ｓ法、Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　Ｅ　ｎｚｙ
ｍｏｌ、、　１Ｑ　１゜２０　（１９８３））に従い、
以下のように行なった。即ち、まずＤＮＡ断片を制限酵
素により切り出し、１％アガロースゲル雷気気泳動より
分離する。このＤＮＡ断片をＭ１３ｎｐ８ＲＦ（アマ−
ジャム社製）をベクターとしてクローニングする。

得られる組換えファージＤＮＡをマンデル（Ｍ　ａｎｄ
ｅｌ　）とヒガ（ＨｉＯａ）の方法（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　５３．１５４　（１９７０）　）により
、大腸菌ＪＭ１０７株へ形質導入する。この菌体懸濁液
０．２鵬に、２５　ｍｇ／鵬のイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（以下ｒ　Ｉ　ＰＴＧＪという）２５
ｔｌＱ及び２０＋０１：Ｉ／鵬の５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド４０μＱを
加えた。次いでこの菌体懸濁液に、予め加熱溶解させ次
いで５０℃で保温したＨ−トップアガー液（１％バタト
トリブトン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５％寒天
）３鵬を加え、１．５％寒天を加えて固化させた２ＸＹ
Ｔ培地（１，６％バタトトリブトン、１％酵母エキス及
び０．５％塩化ナトリウム）の平板に重層し、３７℃で
一晩培養する。ＤＮＡ断片の挿入された組換えファージ
は無色のプラークを生じるのに対し、親株のＭ１３１１
１Ｄ８は青色のプラークを生じるので、目的の組換えフ
ァージは容易に選別できる。

次に単一の無色プラークをパスツールピペットにて取り
出し、これとＪＭ１０３株の培養液０．０１ｍ１２とを
２ＸＹＴ培地１戒に加え、約５時間、３７℃で振盪培養
して組換えファージを増殖させる。培養後、遠心にて菌
体を除き、上溝に２０％ポリエチレングリコール６００
０の０．２噌を混合し、室温で１５分以上静置した後、
遠心にて沈澱するファージを集め、フェノール抽出によ
って、ファージから一本鎖ＤＮＡを抽出し、これを鋳型
−重鎖ＤＮＡとして用いる。

鋳型−重鎖ＤＮＡと、プライマー（宝酒造■製、Ｍ１３
の１５塩基ブライマー（５’　ＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
ＴＧＴＡ　３’　）’）との各々０．５ｐｍｏｌずつを
混合し、６０℃で２０分間熱処理後、徐冷する。次にこ
の混合液にα３２Ｐ−ｄ　ＣＴＰ（アマジャム社製、４
００Ｃｉ　／１０１０１　）２ｕＱとＤＮＡポリメラー
ゼエ（クレノー、宝酒造■製）２ユニツトとを加え、充
分に混合した後、その３．２μＱずつを、下記第２表に
示した４種のｄＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液のそれぞれ２
μＱを含む反応管に加える。室温で２０分間反応させた
後、チェース反応液（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ、ｄ　Ｇ
ＴＰ及びｄ　ＴＴＰの各１＋Ｍ）の１μＱをそれぞれに
加え、更に２０分間反応させる。ホルムアミド停止液（
９５％Ｖ／Ｖホルムアミド、０．１％キシレンシアツー
ル及び０．１％ブロムフェノールブルー）を６μＱずつ
加え、９５℃で３分間加熱した後、急冷する。次にサン
プル２μＱずつを６％又は８％ポリアクリルアミドゲル
により電気泳動（１８００Ｖ、３０ｎ＋　Ａ、２〜３時
間）を行なう。

泳動後、ゲルを濾紙（ワットマン３ＭＭ）に移し、ゲル
乾燥器にて乾燥し、オートラジオグラムをとり、ＤＮＡ
塩基配列を解読する。

第　　２　　表 （単位二μＱ） 但し第２表中、ｄｄＡはジデオキシアデノシンを、ｄｄ
Ｃはジデオキシシチジンを、ｄｄＧはジデオキシグアノ
シンを、またｄｄＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示
す。

９、アガロースゲル電気泳動 シュライフ（Ｓ　ｃｈｌｅｉｆ）とウエンシンク（Ｗｅ
ｎｓｉｎｋ）の手引書〔“Ｐ　ｒａｃｔｔｃａ＋　　Ｍ
　ｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂ　ｉ
ｏｌｏｇｙ”　（１９８１）　。

３　ｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖ　ｅｒｌａｇ社、ｐｐＨ４−
１２５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気泳
動及び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。

泳動用電源としては、アトー社製フンスターパワー５Ｊ
１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５ｃｎ＋のプラ
スチック製水槽（白金型極付）を、アガロースとしては
アガロースエ（同位化学研究所製）を、また泳動用緩衝
液としては４０ＩＩＩＭトリス塩酸（５ｍ　Ｍ酢酸ナト
リウム及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有、ｐＨ７，９）をそ
れぞれ用いる。

１０、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上記手引書の第
７８−８７頁及び第１１４−１２５頁に記載の方法に従
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動用電源としては
、アトー社製コンスターパワー５Ｊ１０６５型を、泳動
槽としてはアトー社ＩＳＪ　１０６０ＳＤ型を用いる。

アクリルアミド溶液として、アクリルアミドとＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：１）との水
溶液を、重合促進剤としてＮ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
して過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。

また泳動用緩衝液として２．５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含有
する９０ＩＩＩＭトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３）を
用いる。

参考例１ ■）ベクタープラスミドｐＧＨ５４及びｐＧＨ５５の構
築 （Ａ）　　中間体プラスミドｐＧＨ５３の構築■　大腸
菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一部をコー
ドするＤＮＡＪ！！基配列を有するオリゴヌクレオチド
の合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオリゴ
ヌクレオチドのそれぞれを、前記した同相リン酸トリエ
ステル法により合成した。

＜１＞　　　（５’　　）ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧ
ＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣ（３’　） ＜２＞　　　　　　ＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡＧＣＧＣ
Ａ ＜３＞　　　　　　ＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣ
ＡＧ ＜４　＞　　　　　　　　ＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣ
ＣＧＣＧＡＴ 上記オリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉の５′端をそ
れぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ＜ＢＲＬ社製）を
用いてリン酸化した。

■　クローニングベクターとして、プラスミドｐ　ＢＲ
３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｇｅｎｅ
　、　２゜９５−１１３　（１９７７））を利用した。

該プラスミドｐ　ＢＲ３２２の１０μ０を、制限酵素ｐ
ｓｔＩ　（宝酒造謹製）とＰｖｕＩ（ＮＥＢ社製）とを
用いて高塩濃度緩衝液中で切断し、１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行ない、約４．２４ｋｂのＤＮＡ断片を
分離した。

■　上記■で得たＤＮＡ断片を、上記■で調製されたリ
ン酸化したオリゴヌクレオチドく２〉及び〈４〉並びに
リン酸化していないオリゴヌクレオチド〈１〉及び〈３
〉のそれぞれ約１μＱずつと合せて、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼで結合反応させた。

反応終了後、この反応組成液で大腸菌に一１２株由来の
Ｈ８１０１株を形質転換させた。得られたテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から１株を選び、これか
らプラスミドを単離し、目的のｐ　ＧＨ５３を得た。

一連の操作の概略は第１図に示す通りである。

得られたｐ　ＧＨ５３は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、４，３ｋｂの大きさを有しており、そのＤ
ＮＡ塩基配列をＭ２Ｓ法により分析した結果、ｐＢＲ３
２２のＰＳｔ工及びｐ　ｖｕ　ｌ：の両制限サイト間が
欠失し、代りに次に示すように、オリゴヌクレオチド〈
１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉が挿入されていること
が確認された。

該ｐＧＨ５３を保有する）−１８１０１株は、通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所にｒＨＢｌ　０１　
（ｐ　ＧＨ５３）Ｊなる表示で微工研条奇第６７８号（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６７８）として寄託されている。

（Ｂ）　　ベクタープラスミドｐＧＨ５４の構築■　上
記（Ａ＞で得たｐＧＨ５３の１０μｇを制限酵素Ｎａｅ
Ｉ＜ＮＥＢ社製）及びＡＶａＩ（宝酒造■製）を用いて
中地濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行なって、約２．２２ｋｂのＤＮＡ断片
＜Ａ）を分離した。

この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のＤＮＡ配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。

■　ｐＢＲ３２２を制限酵素ＡＶａＩ及び）ｌｉｎｄＩ
［［くいずれも宝酒造■製）で、中温濃度緩衝液を用い
て切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって
、約１．４０ｋｂのＤＮＡ断片＜８＞を得た。

この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部及びその構造遺伝子の全てが含まれている。

■　ｐＢＲ３２２の２０ｔＩＱを制限酵素１：ｎｕ４Ｈ
Ｉ　（ＮＥＢ社製）で低塩濃度緩衝液を用いて切断し、
次いでＳ１ヌクレアーゼによりＤＮＡ断片末端の突出塩
基を分解除去した。次いで、得られたＤＮＡを制限酵素
Ｈｉｎｄｌｌｒを用いて中地濃度緩衝液中にて切断し、
６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約０．
２８ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ＞を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝子
の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ーの一部が含まれている。

■　上記で得た３つの断片（Ａ＞、＜８＞及び（Ｃ）を
、Ｔｔ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、
この反応組成液で８８１０１株を形質転換した。得られ
たテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株
を選びプラスミドを単離した。かくして１）ＧＨ５４を
得た。

ｐＧＨ５４は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、β
−ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位
に続いてシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
を有し、この塩基配列の３′末端の上流側にＮｒｕ工及
び下流側にｐｖｕ■のそれぞれの制限酵素認識配列を有
していることが確認された。

一連の操作の概略は、第２図に示される通りである。

ｐ　ＧＨ５４は、前記した通り約３．９ｋｂの大きさ及
び第２図に示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、
またＭ１３法による塩基配列分析の結果、下式（２）に
示した塩基配列によりコードされるβ−ラクタマーゼシ
グナルペブチドの遺伝子を有することが確認された。

ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＣＴＧ　　（２）（Ｃ）　　ベクタープラスミドｐＧ
Ｈ５５の構築■　ｐ　ＢＲ３２２のＡＶａＩ及びｐｖｕ
■制限サイト間の塩基配列を欠失させたプラスミドであ
るｐ　ＢＲＨＯ２を次の操作により作成した。即ちｐＢ
Ｒ３２２の５μ０を、中地濃度緩衝液中で、制限酵素Ａ
ｖａＩ及びＰＶＬＩＩＩ（いずれも宝酒造■製）で切断
し、フェノール抽出後、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノ
ー断片（宝酒造■製）で切断断片をプラントエンド化し
た。次に１．０％アガロースゲル電気泳動で約３．７２
ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、この断片をＴＬ　ＤＮＡリ
ガーゼで環状化させた。反応終了後、この反応組成液で
Ｈ８１０１株を形質転換し、得られるアンピシリン耐性
及びテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から一
株を選択してプラスミドを単離しｐ　ＢＲＨＯ２を得た
。得られたρＢＲＨＯ２はｐ　ＢＲ３２２とは異なって
、ＡｖａＩでもｐｖｕ［でも切断されなかった。

■　上記■で得たｐ　ＢＲＨ０２の５μｇを制限醇素Ｐ
ＳｔＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造側製）を用いて
生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行なって、約２．６０ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｄ）を分離した。

この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及びプ
ラスミドの複製開始領域を含んでいる。

■　ｐＧＨ５４の１０μｇを制限酵素ＰＳｔＩ及びＢａ
ｎＨＩを用いて生塩濃度緩衝液中にて切断し、次いで１
．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．６６ｋ
ｂ（７）ＤＮＡ断片（Ｅ）を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。

■　上記で得た２つの断片（Ｄ）及び（Ｅ）を、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応
組成液でＨ８１０１株を形質転換した。

得られたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中か
ら１株を選びプラスミドを単離した。かくしてＩ）ＧＨ
５５を得た。

一連の操作の概略は、第３図に示される通りである。

ｐＧＨ５５は、上記第３図に示される制限酵素開裂地図
により特徴付けられ、１．０％アガロースゲル電気泳動
の結果、約３，３ｋｂの大きさを有していた。また該ｐ
ＧＨ５５は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、ｐＧ
Ｈ５４における第２のｐｖｕ［制限サイトを含む約０．
６４ｋｂのＤＮＡを欠く以外は、該１）ＧＨ５４と同様
であり、その第１のｐｖＪ制限サイトは、シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列の３′末端の近傍に存
在していることが確認された。

■）β−ウロガストロン発現ベクターの構築有するベク
ターの構築 （Ａ）　　β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基
配列の合成 グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ）により報告されたア
ミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、２５７．３２５−３２７（
１９７５））を参考にして、β−ウロガストロンをコー
ドするＤＮＡ塩基配列の前後に開始コドン、終止コドン
及び制限酵素認識部位を付加してなる所望のＤＮＡ塩基
配列を構築した。このＤＮＡ塩基配列は、本発明者らに
より既に特許出願されている（特開昭６１−１５６９１
号公報参照〕。

（Ｂ）　　β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基
配列を保有するプラスミドの構築 ■　１）ＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩ及びＢａ１ｌ）ＩＩ制
限サイト間に、上記（Ａ）で得たβ−ウロガストロンを
コードするＤＮＡ塩基配列を挿入することにより、所望
のプラスミドＯＵＯ３を得た（特開昭６１−１５６９１
号公報参照）。

このプラスミドＤ　ＵＯ３を保有するＨ８１０１株は、
ｒＨ８１０１（ｐ　ＵＯ３）Ｊなる表示で微工研菌条第
５４３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４３）として寄託され
ている。

（Ｃ）　　Ｉ）ＵＧ２０１の構築 この操作の概略は、第４図に示す通りである。

上記（Ｂ）で得たＩ）ＵＯ３を制限酵素ＨｉｎｆＩで切
断して得られるＤＮＡ断片を、ｐＧＨ５５のＰｖｕＩ［
制限サイトに挿入して、シグナルペプチド−β−ウロガ
ストロン融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
を含むベクターであるｌ］ＵＧ２０１を、以下の方法に
より構築した。

■　１）ＵＯ３の１５μ９を、高塩濃度緩衝液中でＨｉ
ｎｒ　Ｉ　（宝酒造■製）で切断し、フェノール抽出後
、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片で切断断片をプ
ラントエンド化した。次いで６％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、約０．４３ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｆ
＞を単離した。

この断片には、β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ
塩基配列（ｔｌ！訳停止コドンを含む）のうち５′端の
７塩基を除く塩基配列が含まれていた。

■　ｐＧＨ５５は、β−ラクタマーゼのシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列の後に、β−ウロガスト
ロンのＮ端領域をコードする最初の７個のＤＮＡ塩基配
列が直結し、且つその直後で制限酵素ＰｖｕｌＩにより
切断されるように構成されたＤＮＡ塩基配列を有するも
のであり、該ｐＧＨ５５の５μＱを中温濃度緩衝液中で
、ｐｖｕ■で切断して、約３．２６ｋｂのＤＮＡ断片（
Ｇ）を得た。

この断片は、ｐＧＨ５５の全ての遺伝情報を有している
。

■　上記■で得た断片（Ｆ）の約１μｇと上記■で得た
断片（Ｇ）の約０．５μｑとをＴｔ　ＤＮＡリガーゼで
結合させた。反応後、この反応組成液でＨ８１０１株を
形質転換し、得られるテトラサイタリン耐性の形質転換
株の中から一株を運び、プラスミドｐ　ＵＧ２０１を単
離した。

ｐ　ＵＧ２０１は、１．０％アガロースゲル電気泳動の
結果、約３．８ｋｂの大きさを有していた。

これをＢａ１ＤＨＩ又はｌ−１ｉｎｄｌｌ［で切断する
と、それぞれ２種類のＤＮＡ断片が得られることから、
該ｐ　ＵＧ２０１にはβ−ウロガストロン遺伝子が含ま
れていることが判り、また該断片の大きさを調べた結果
より、目的のプラスミドであることが判った。更に、Ｄ
　ＬＩＧ２０１について、β−ラクタマーゼのプロモー
タ一部分からβ−ウロガストロン遺伝子までを含むＤＮ
Ａ断片の塩基配列を、Ｍ１３法による塩基配列分析によ
り調べた。その結果、該ＤＮＡ塩基配列は下記第３表の
通りであり、ｐ　ＵＧ２０１がプロモーター、リボゾー
ム結合部位並びにβ−ラクタマーゼのシグナルペプチド
をコードする塩基配列及びβ−ウロガストロンをコード
する塩基配列が、正確にこの順序で配列されていること
が確認された。また第３表にはＤＮＡ塩基配列に対応す
るアミノ酸配列も併記する。

上記ｐ　ＵＧ２０１を保有する大腸菌ＨＢ１０１は、ｒ
ＨＢ　１０１　（Ｄ　ＧＨ２０１）　Ｊ　ナル表示テ通
商産業省工業技術院微生物工業研究所に寄託されている
。その寄託番号は、微工研条寄第６８１号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−６８１）である。

第　　３　　表 ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧ
ＡＴＡＣＧＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣ
ＣＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡ
ＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴ
ＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴ
ＡＴＴＡＣＣＡＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧ
ＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣ
ＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＣ
ＡＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡ
ＡＡＡＧＡＴ□　プ　　　ロ　　　モ　　　−　　　タ
　　　−ＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣ
ＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡ
ＴＡＣＡＴＡＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧ
ＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣ
ＴＴＴ／リボゾーム結合部位 ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴ　　ＡＴＧ　　ＡＧＴ　　ＡＴＴ
　　ＣＡＡ　　ＣＡＴＴＴＣＣＧＴ　　ＧＴＣＧＣＣＣ
ＴＴ　　ＡＴＴ　　ＣＣＣＴＴＴＴＴＴ　　ＧＣＧ　　
ＧＣＣＴＴＴ　　ＴＧＣＣＴＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣＴ
ＴＣＧＣＧ　　ＡＡＣＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＴＣＴ　　
ＧＡＧ　　ＴＧＣＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＡ
ＣＧＡＴ　　ＧＧＣＴＡＴ　　ＴＧＴＣＴＧ　　ＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＴ　　ＧＴＴ　　ＴＧＣＡＴＧ　　ＴＡＣＧ
ＡＣＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＣＡ　　ＣＡＡ　　ＡＣＧ
　　ＴＡＣＡＴＧｌｅｕ　　　Ｈｉｓ　　　ＡＳＥ）　
　　Ｇｌｙ　　　Ｖａｔ　　　ｃｙｓ　　　Ｍｅｔ　　
　ＴｙｒＡＴＣＧＡＡ　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　、ＧＡ
Ｔ　　ＡＡＡ　　ＴＡＣＧＣＧβ−ウロガストロンのポ
リペプチド ＴＧＴ　　ＡＡＣＴＧＴ　　ＧＴＡ　　ＧＴＧ　　ＧＧ
Ｔ　　ＴＡＴ　　ＡＴＣＧＧＴ　　ＧＡＡ　　ＣＧＣＴ
ＧＴ　　ＣＡＡ　　ＴＡＣＣＧＴ　　ＧＡＴＣＴＧ　　
ＡＡＡ　　ＴＧＧ　　ＴＧＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＧ　　
ＧＧＴ　　ＴＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣ ＡＴＣＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧ （Ｄ）　　１１　ＵＧＴｌ　５０の構築■　この例に従
うｐ　ＬＩＧＴＩ　５０構築の概略図を第５図に示す。

ｔａｃプロモーターの起源ベクターとして１）ＤＲ５４
０（ファルマシア社製）を選択した。

該ｐ　ＤＲ５４０の１５μ９を、制限酵素ＢａＩＩＩＨ
１を用い、中温濃度緩衝液中で切断後、得られたＤＮＡ
断片の末端を８１ヌクレアーゼにより平滑末端とし、次
いで制限酵素ＥＣ０ＲＩを用いて、高塩濃度緩衝液中で
切断した。次に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、約０．３８ｋｂのＤＮＡ断片（Ｈ）を得た。こ
の断片にはｔａｃプロモーター及びＳＤ配列が含まれて
いる。

■　Ｄ　ＵＧ２０１の２２μｇを、制限酵素ＰＳｔＩ及
びＥＣ０ＲＩを用いて、それぞれ中温濃度緩衝液中及び
高塩濃度緩衝液中で切断した。得られたＤＮＡ断片のう
ち、２μり相当分から、０．９％アガロースゲル電気泳
動により約２．９７ｋｂのＤＮＡ断片（１）を得た。こ
の断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子及びベクター
の複製開始領域が含まれている。

■　上記ｐ　ＵＧ２０１をｐｓｔＩ及びＥＣ０ＲＩで切
断して得たＤＮＡ断片の残り２０μｇ相当分を、制限酵
素Ｍｂｏ［を用いて低塩濃度緩衝液中で部分切断した。

即ち、ＭｂｏＩ［（ＮＥＢ社製）の１０ユニツトを反応
液中に加え、３７℃で３０分間反応させることにより、
上記部分切断を行なった。次いで５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない、約０．４９ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｊ）を得た。この断片にはβ−ラクタマーゼのシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列のうち、５′末
端の６塩基を欠く部分配列の３′末端にβ−ウロガスト
ロンをコードするＤＮＡ塩基配列が連なった配列を含ん
でいる。

■　上記ＤＮＡ断片（Ｊ）において不足するβ−ラクタ
マーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
の５′末端より６塩基を含み、且つＤＮＡ断片（Ｈ）と
（Ｊ）との接続の役割を果たす下記オリゴヌクレオチド
Ｉ−３及びＩ−４を、固相リン酸トリエステル法に従い
合成した。

１−３　　　５’ＴＣＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴ　　　　３
’Ｉ−４３’ＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＣ５’上記の通りオ
リゴヌクレオチドＩ−３及びＩ−４は、互いに相補的で
あり、これらがＤＮＡ断片（Ｈ）と正しく結合されると
きには、この結合領域で、制限酵素５ａｌＩによる認識
配列が新たに形成される。

■　上記で得た断片（Ｈ）、（１）及び（Ｊ）並びにオ
リゴヌクレオチドＩ−３及びＩ−４の各々１μＱを混合
して、５０μＱの反応溶液中にて、ＴＡＤＮＡリガーゼ
を用いて連結させた。次いでこの反応組成液で大腸菌Ｊ
ＭＩ　０３株を形質転換させ、テトラサイクリン耐性を
示す形質転換体を得た。かくして得られた形質転換体か
ら一株を選び、該株からプラスミドｐ　ｔＪＧＴｌ　５
０を単離した。

該ｐ　ＵＧＴＩ　５０は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、約３，９ｋｂの大きさを有していた。また
このものの５ａｌＩ、ＨｉｎｄＩ［［等の制限酵素によ
る切断パターンを調べた結果、該１）　ＵＧＴ１５０は
、テトラサイクリン耐性遺伝子の他、ｐ　ＤＲ５４０の
有するｔａｃプロモーター及びその下流のＳＤ配列、ｐ
　ＵＧ２０１の有するβ−ラクタマーゼのシグナルペプ
チドとβ−ウロガストロンとが直接結合した融合ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列及びβ−ラクタマー
ゼの転写終結信号をこの順序で含むものであり、上記Ｓ
Ｄ配列と融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
との間には、５ａｌＩサイトを有することが確認された
。

このプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０のＤＮＡ塩基配列を
、Ｍ１３法に従い分析した結果を下記第４表に示す。

該ｏ　ＬＩＧＴｌ　５０を保有する大腸菌ＪＭ１０３株
は、ｒＪＭｌ　０３　（ｐ　ＵＧＴｌ　５０）Ｊなる表
示で、微工研菌寄第９７４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ９７４
）として寄託されている。

第　　４　　表 Ｈ’ｉｎｄ　ｍ ＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡ
ＴＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡ
ＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＡＴＧ　ＡＧＴ　Ａ
ＴＴ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＣＣＧＴ　ＧＴＣＧＣＣＣ
ＴＴ　ＡＴＴ　ＣＣＣＴＴＴ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣ
ＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＧ　　ＴＧＣＣＣ
Ａ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴＣＡＣＧＡＴ　　ＧＧＣＴＡＴ
　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣＧＡＣβ−ウロガスト
ロンのポリペプチド ＧＩＶ　　　Ｖａｌ　　　ｃｙｓ　　　Ｍｅｔ　　　Ｔ
ｙｒ　　　［ｌｅ　　　Ｇｌｕ　　　ＡｌａＧＴＡ　　
ＧＴＧ　　ＧＧＴ　　ＴＡＴ　　ＡＴＣＧＧＴ　　ＧＡ
Ａ　　ＣＧＣＴＧＴ　　ＣＡＡ　　ＴＡＣＣＧＴ　　Ｇ
ＡＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＴＧＧＡＣＡ　　ＧＴＴ
　　ＡＴＧ　　ＧＣＡ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＴＴＴ　　
ＡＣＣＣＶＳ　　　Ｇｌｎ　　　Ｔｙｒ　　　ＡｒＯＡ
ｓｐ　　　ｌｅｕ　　　ｉｓ　　　Ｔｒｐ参考例２ Ｉ）　　（Ｌ４Ｕ２　’　）−β−ウロガストロン遺伝
子及びこれを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第６図に示す。

（Ａ）　　ＤＮＡフラグメントの製造 ■　まず、以下の１６種のオリゴヌクレオチドＡ−１〜
Ａ−６、Ａ−７−Ｌ、Ａ−８−２、Ａ−９、Ａ−１０−
Ｌ及びＡ−１１〜Ａ−１６を、前記固相リン酸トリエス
テル法により合成した。

（Ａ−１＞　　　　　　　　　　（Ａ−２）５’　ＡＡ
ＴＴＣＧＡＡＧＡＴ　　ＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣ３
’３’　　　　　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡ　　ＣＴ
ＴＡ丁ＣＧＣＴＡＡ　　５’（Ａ−１６）　　　　　　
　　（Ａ−１５）（Ａ−３）　　　　　　　　　（Ａ−
４）５’　ＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧ　　ＣＣＣＡＣＴＧ
ＴＣＴＣＡＣ３’３’　　　　　ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧ
ＴＧＡ　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣ５’（Ａ−１４）　
　　　　　　　（Ａ−１３＞（Ａ−５＞　　　　　　　
　　（Ａ−６）５’　ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧ　　ＴＣ
ＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴ　　　　　３’３’　　　　　
ＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴ　　ＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡ
Ａ　　５’（Ａ−１２）　　　　　　　　　（Ａ−１１
）（Ａ−７−１）　　　　　　　（Ａ−８−２）５’　
ＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＡ　　ＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣ
Ｇ　　　　　３’３’　　　　　ＣＧＧＡＣＡＴＧＴＡ
ＡＣＴ　　ＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＧ　　５’（Ａ−１０
−１）　　　　　　　（Ａ−９）次いで、之等のうち、
Ａ−１及びＡ−９以外の１４種の各５′端を３２ｐラベ
ル化及びリン酸化した。これは各オリゴヌクレオチド０
．０５μｇを、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０１１
Ｍβ−メルカプトエタノールを含む５０ｆｆ１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）４８．５μＱに溶解後、こ
れにγ−３２Ｐ−ＡＴＰ　（５μＣ１、アマ−ジャム社
製）０．５μＱ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（０
，５ユニツト、宝酒造社製）１μｅを加え、３７℃で２
時間反応させ、次いで３０ｍＭＡＴＰ水溶液２μＱを加
えて更に１時間同温度で反応させた後、７５℃の水浴で
５分間加温して反応を停止させることにより実施した。

上記で３２ｐラベル化及びリン酸化したオリゴヌクレオ
チド１４種並びにリン酸化していない八−１及びＡ−９
のそれぞれ０．００５μｇ相当づつを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて、４℃で２日間反応させて連結させ
た。

別に分子量マーカーとして、プラスミドｐＢＲ３２２を
、制限酵素ＨａｐｌＩ（宝酒造社製）で切断して得たＤ
ＮＡ断片の５′端を、３２ｐラベルしたものを作成し、
上記連結物とこれとを８％ポリアクリルアミドゲル用い
て電気泳動させた後、オートラジオグラフィーを行ない
、分子量マーカーより得られる情報に基づいて、１６種
のオリゴヌクレオチドが正しく連結されたＤＮＡフラグ
メント（９６ｂｐ）に相当する位置を定め、当該位置の
ポリアクリルアミドゲルを切り出して、これから所望の
ＤＮＡフラグメントを抽出、単離した。

■　プラスミドｐＢＲ３２２の５μｇを、高塩濃度緩衝
液中にて、制限酵素Ｂａ１ｌＨＩ及びＥＣ０ＲＩ（共に
宝酒造社製）を用いて同時に切断後、０．９％アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約３．９９ｋｂのベクターＤ
ＮＡフラグメント（Ｋ＞を得た。

■　次いで、上記■で得た１６種のオリゴヌクレオチド
連結物からなるＤＮＡフラグメントと■で得たベクター
ＤＮＡフラグメント＜Ｋ）の１μｇ相当分とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させ、この連結物で８８１０１株を
形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感
受性を示すコロニーを得た。之等のコロニーより一株を
選び、培養してプラスミドｐ　ＵＧｌ−Ｌを単離した。

得られたプラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳
動の結果、約４．０８ｋｂの大きさを有していた。また
、このもののＥＣ０ＲＩ、）−１ｉｎｄｌ、Ｂａ１ｌＨ
Ｉ等の制限酵素による切断パターンを調べた結果、該ｐ
ＬＩＧ１−Ｌには、上記１６種のオリゴヌクレオチドが
正しく連結されてなるＤＮＡフラグメントが含まれてい
ることが確認された。更にこれはＭ１３法によるＤＮＡ
塩基配列の分析の結果からも確認された。確認された上
記１６種のオリゴヌクレオチドの連結状態を下記第５表
に示す。

ＥＣ０ＲＩ ＡＧＣＧＡＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＧ　　ＴＧＣＣＣＡ　
　ＣＴＧ　　ＴＣＴＴＣＧ　　ＣＴＡ　　ＡＧＡ　　Ｃ
ＴＣＡＣＧ　　ＧＧＴ　　ＧＡＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴ　
　ＧＧＣＴＡＴ　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣＧＡＣ
ＧＴＧ　　ＣＴＡ　　ＣＣＧ　　ＡＴＡ　　ＡＣＡ　　
ＧＡＣＧＴＧ　　ＣＴＧ上記ＤＮＡ塩基配列は、（Ｌｅ
！ＬＩ２　’　）−β−ウロガストロンの前半部に対応
するものである。

■　（Ｌｅｔｌ”）−β−ウロガストロンの後半部に対
応するＤＮＡ塩基配列としては、プラスミドｐ　ＵＧ２
に含まれるものを利用した。該ｐ　ＵＧ２は、本発明者
らにより既に確立されている〔特開昭、６１−１５６９
１号公報参照〕。

そのＤＮＡ塩基配列は下記第６表に示す通りである。

ＡＡＣＴＧＴ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＡＴ
ＣＧＧＴＴＴＧ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＣＡＣＣＣＡ　ＡＴ
Ａ　ＴＡＧ　ＣＣＡＧＡＡ　ＣＧＣＴＧＴ　ＣＡＡ　Ｔ
ＡＣＣＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧＣＴＴ　ＧＣＧ　ＡＣＡ　
ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＧ
Ｇ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＣＧＴ　ＴＡＡ　ＴＡＧ
ＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＣＣＴＴ　ＡＡＣＧＣＡ　ＡＴＴ　
ＡＴＣ■　上記■で得たＩ）ＵＧＩ−Ｌの１０μｇを、
中温濃度緩衝液中で、制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［及びＰＳ
ｔＩ（共に宝酒造社製）を用いて切断した後、１．０％
アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．８５ｋｂのＤ
ＮＡフラグメント（Ｌ）を得た。

また、上記■のｐ　ＵＧ２の５μｇを、同様に制限酵素
Ｈｉｎｄｌ［［及びＰＳｔＩを用いて切断した後、１．
０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約３．３４ｋ
ｂのＤＮＡフラグメント（Ｍ）を得た。

之等各フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、連結物でＨ８１０１株を形質転換し、得られるア
ンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を示すコロ
ニーの中から一株を選び、これを培養して、プラスミド
ｏ　ＩＪＧ３−Ｌを単離した。

該プラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約４．１８ｋｂの大きさを有していた。

また、マキサム・ギルバート法により、塩基配列を分析
した結果、（Ｌｅｕ”）−β−ウロガストロンをコード
する下記第７表に記載のＤＮＡ塩基配列を含むことが明
らかにされた。

第　　７　　表 ＧＡＴ　ＧＧＣＴＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣＧＡＣ
ＧＧＴＣＴＡ　ＣＣＧ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＧＡＣＧＴＧ
　ＣＴＧ　ＣＣＡＧＴＧ　　ＧＧＴ　　ＴＡＴ　　ＡＴ
ＣＧＧＴ　　ＧＡＡ　　ＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＡ　　
ＡＴＡ　　ＴＡＧ　　ＣＣＡ　　ＣＴＴ　　ＧＣＧ　　
ＡＣＡｇｌＩＩ （Ｓａｕ３ＡＩ） ａｍＨＩ Ｉｆ）（Ｌｅｄ２１）−β−ウロガストロン発現ベクタ
ーの構築 この構築の概略図を第７図に示す。

■　プラスミドＩ）ＵＯ３−Ｌの２０μＱを、高塩濃度
緩衝液中にて、制限酵素ＢｇｌＩ［及びＨｉｎｆＩ（い
ずれも宝酒造社製）を用いて、同時に切断した後、５％
アクリルアミドグル電気泳動を行なって、約０．１６ｋ
ｂのＤＮＡ断片＜Ｎ＞を得た。

■　別にプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０の３０μｇを、
中温濃度緩衝液中で、制限酵素１−１ｉｎｄｌｌ［（宝
酒造社製）を用いて切断した後、これを２０μＱ相当分
と１０μ９相当分の２つに分け、その２０μｇ相当分を
高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素１−１ｉｎｆＩを用い
て切断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動ヲ行すｉ　
Ｔ、約０．１７ｋｂ（７）ＤＮＡ断片＜０）を得た。ま
た上記１０μｇ相当分を高塩濃度緩衝液中にて、制限酵
素ＥＣ０ＲＩを用いて切断した後、５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なって、約０．３０ｋｂのＤＮＡ
断片（Ｐ）を得た。

更に、プラスミドｐ　ＬＩＧＴｌ　５０の２μｇを、高
塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＢｏｌＩＩ及びＥＣ０Ｒ
Ｉを用いて、同時に切断した後、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約３．２４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｑ
＞を得た。

■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片＜Ｎ＞、（○
）、＜Ｐ）及び（Ｑ＞を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示すコロニーを分離し
た。そのうちの１コロニーを選び、これからプラスミド
ｐＵＧＴ１５０−Ｌを単離した。

得られたｐＬＩＧＴｌ　５０−Ｌは、１．０％アガロー
スゲル電気泳動の結果、約３．８７ｋｂの太きさを有し
ていた。また、ＨｉｎｆＩ、ＴａｑＩ等の制限酵素によ
る切断パターンを解析した結果、テトラサイクリン耐性
遺伝子の他に、（Ｌｅｄ”　）−β−ウロガストロンを
コードするＤＮＡ塩基配列を有し、且つその５′端に直
接β−ラクタマーゼシグナルペブチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列が連結されており、その上流にはｔａｃプロ
モーター等が連結されていることが確認された。

実施例１ １）　　（Ｖａ１２１　）−β−ウロガストロン遺伝子
及びこれを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第８図に示す。

（Ａ＞　　ＤＮＡフラグメントの製造 ■　まず、以下の１６種のオリゴヌクレオチド八−１〜
Ａ−６、Ａ−７−Ｖ、Ａ−８−２、Ａ−９、Ａ−１０−
Ｖ及びＡ−１１〜Ａ−１６を、前記固相リン酸トリエス
テル法により合成した。

（Ａ−１）　　　　　　　　　（Ａ−２）５’　ＡＡＴ
ＴＣＧＡＡＧＡＴ　　ＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣ３’
３’　　　　　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡ　　ＣＴＴ
ＡＴＣＧＣＴＡＡ　　５’（Ａ−１６）　　　　　　　
　（Ａ−１５）（Ａ−３＞　　　　　　　　　（Ａ−４
）５’　ＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧ　　ＣＣＣＡＣＴＧＴ
ＣＴＣＡＣ３’３’　　　　　ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴ
ＧＡ　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣ５’（Ａ−１４＞　　
　　　　　　（Ａ−１３）（Ａ−５）　　　　　　　　
　（Ａ−６）５’　ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧ　　ＴＣＴ
ＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴ　　　　　　３’３’　　　　　
ＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴ　　ＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡ
Ａ　　５’（Ａ−１２）　　　　　　　　　（Ａ−１１
）（Ａ−７−Ｖ）　　　　　　　＜Ａ−８−２）５’　
ＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡ　　ＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣ
Ｇ　　　　　　３’３’　　　　　ＣＧＣＡＡＡＴＧＴ
ＡＡＣＴ　　ＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＧ　　５’（Ａ−１
０−Ｖ）　　　　　　　（Ａ−９）次いで、之等のうち
、Ａ−１及びＡ−９以外の１４種の各５′端を３２ｐラ
ベル化及びリン酸化した。これは各オリゴヌクレオチド
０．０５μＱを、１０１Ｍ塩化マグネシウム及び１０ｍ
Ｍβ−メルカ、ブトエタノールを含む５０ｍＭトリス塩
酸ｍ衝液（ｐ　Ｈ７，６）４８．５μＱに溶解後、これ
にγ−３２Ｐ−ＡＴＰ　（５μＣ１１アマ−ジャム社製
）０．５μＱ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（０，
５ユニツト、宝酒造社製）１μＱを加え、３７℃で２時
間反応させ、次いで３０ｍＭＡＴＰ水溶液２μＱを加え
て更に１時間同温度で反応させた後、７５℃の水浴で５
分間加温して反応を停止させることにより実施した。

上記で３２ｐラベル化及びリン酸化したオリゴヌクレオ
チド１４種並びにリン酸化していないＡ−１及びＡ−９
のそれぞれ０．００５μｇ相当づつを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて、４℃で２日間反応させて連結させ
た。

別に分子量マーカーとして、プラスミドｐＢＲ３２２を
、制限酵素）−１ａｐＩＩ（宝酒造社製）で切断して得
たＤＮＡ断片の５′端を、３２ｐラベルしたものを作成
し、上記連結物とこれとを８％ポリアクリルアミドゲル
用いて電気泳動させた後、オートラジオグラフィーを行
ない、分子量マーカーより得られる情報に基づいて、１
６種のオリゴヌクレオチドが正しく連結されたＤＮＡフ
ラグメント（９６ｂｐ）に相当する位置を定め、当該位
置のポリアクリルアミドゲルを切り出して、これから所
望のＤＮＡフラグメントを抽出、単離した。

■　プラスミドＩ）ＢＲ３２２の５μｇを、高塩濃度緩
衝液中にて、制限酵素Ｂａ１ＨＩ及びＥＣ０ＲＩ（共に
宝酒造社製）を用いて同時に切断後、０．９％アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約３．９９ｋｂのベクターＤ
ＮＡフラグメント（Ｋ＞を得た。

■　次いで、上記■で得た１６種のオリゴヌクレオチド
連結物からなるＤＮＡフラグメントと■で得たベクター
ＤＮＡフラグメント（Ｋ）の１μＱ相当分とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させ、この連結物でＨ８１０１株を
形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感
受性を示すコロニーを得た。之等のコロニーより一株を
選び、培養してプラスミドｌ］ｔＪＧ１”−Ｖを単離し
た。

得られたプラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳
動の結果、約４．０８ｋｂの大きさを有していた。また
、このもののＥＣ０ＲＩ、ＢｇｌＩ［，１−１ｉｎｄｌ
［［、Ｂａ１ｌＨＩ等の制限酵素による切断パターンを
調べた結果、該ｐＵＧＩ−Ｖには、上記１６種のオリゴ
ヌクレオチドが正しく連結されてなるＤＮＡフラグメン
トが含まれていることが確認された。更にこれはＭ１３
法によるＤＮＡ塩基配列の分析の結果からも確認された
。確認された上記１６種のオリゴヌクレオチドの連結状
態を下記第８表に示す。

第　　８　　表 ＡＧＣＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣＣＣＡ　ＣＴＧ
　ＴＣＴＴＣＧ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＣＴＣＡＣＧ　ＧＧ
Ｔ　ＧＡＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴ　ＧＧＣＴＡＴ　ＴＧＴ
　ＣＴＧ　ＣＡＣＧＡＣＧＴＧ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＡＴ
Ａ　ＡＣＡ　ＧＡＣＧＴＧ　ＣＴＧ上記ＤＮＡ塩基配列
は、（Ｖａｔ２＋　）−β−ウロガストロンの前半部に
対応するものである。

■　（Ｖ　ａ１２　＋　）−β−ウロガストロンの後半
部に対応するＤＮＡ塩基配列としては、プラスミドＯＵ
Ｇ２に含まれるものを利用した。該１）　ＵＧ２は、本
発明者らにより既に確立されている〔特開昭６１−１５
６９１号公報参照〕。

そのＤＮＡ塩基配列は前記第６表に示した通りである。

■　上記■で得たｐＬＩＧｌ−Ｖの１０μＱを、生塩ｍ
度緩衝液中で、制限酵素Ｈｉｎｄｆ［及びＰＳｔＩ（共
に宝酒造社製）を用いて切断した後、１．０％アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約０．８５ｋｂのＤＮＡフラ
グメント（Ｒ）を得た。

また、上記■のｐ　ＵＧ２の５μＱを、同様に制限酵素
Ｈｉｎｄｌ［及びＰＳｔＩを用いて切断した後、１．０
％アガロースゲル電気泳動を行なって、約３．３４ｋｂ
のＤＮＡフラグメント＜Ｍ＞を得た。

之等各フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、連結物で８８１０１株を形質転換し、得られるア
ンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を示すコロ
ニーの中から一株を選び、これを培養して、プラスミド
１）ＵＧ３−Ｖを単離した。

該プラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約４．１８ｋｂの大きさを有していた。

また、マキサム・ギルバート法により、塩基配列を分析
した結果、（Ｖａ１２１）−β−ウロガストロンをコー
ドする下記第９表に記載のＤＮＡ塩基配列を含むことが
明らかにされた。

第　　９　　表 ＋１１ｎＴ　　１ ＧＡＴ　　ＧＧＣＴＡＴ　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　　ＣＡ
ＣＧＡＣＧＧＴＣＴＡ　　ＣＣＧ　　ＡＴＡ　　ＡＣＡ
　　ＧＡＣＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＣＡＧＴＧ　　ＧＧ
Ｔ　　ＴＡＴ　　ＡＴＣＧＧＴ　　ＧＡＡ　　ＣＧＣＴ
ＧＴＣＡＣＣＣＡ　　ＡＴＡ　　ＴＡＧ　　ＣＣＡ　　
ＣＴＴ　　ＧＣＧ　　ＡＣＡａｕ３ＡＩ ＢａｍＨＩ ＩＩ）　　（Ｖａ１２　＋　）−β−ウロガストロン発
現ベクターの構築 この構築の概略図を第９図に示す。

■　プラスミドｐ　ＵＧ３−Ｖの２０μ９を、高塩濃度
緩衝液中にて、制限酵素Ｂ！ＩＩＩＩＩ及び）ｌｉｎｆ
Ｉ（いずれも宝酒造社製）を用いて、同時に切断した後
、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０．
１６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｓ）を得た。

■　別にプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０の３０μ９を、
生塩濃度緩衝液中で、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ（宝酒造
社製）を用いて切断した後、これを２０μｑ相当分と１
０μ９相当分の２つに分け、その２０μＱ相当分を高塩
濃度緩衝液中にて、制限酵素）−１ｉｎｆ工を用いて切
断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約
０．１７ｋｂのＤＮＡ断片（０＞を得た。また上記１０
μＱ相当分を高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＥＯＯＲ
Ｉを用いて切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行なって、約０．’３０ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ
＞を得た。

更に、プラスミドｐ　ＬＩＧＴｌ　５０の２μ９を、高
塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＢｑｌＩＩ及びＥＯＯＲ
Ｉを用いて、同時に切断した後、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約３．２４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｑ
＞を得た。

■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片＜Ｓ＞、（０
）、（Ｐ）及び＜Ｑ＞を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示すコロニーを分離し
た。そのうちの１コロニーを選び、これからプラスミド
ｐ　ＬＩＧＴＩ　５０−■を単離した。

得られたｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖは、１．０％アガロー
スゲル電気泳動の結果、約３．８７ｋｂの大きさを有し
ていた。また、ｌ−１ｉｎｆＩ、ＴａｑＩ等の制限酵素
による切断パターンを解析した結果、テトラサイクリン
耐性遺伝子の他に、（Ｖａ１２　’　）　−β−ウロガ
ストロンをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、且つその
５′端に直接β−ラクタマーゼシグナルベブチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列が連結されており、その上流には
ｔａｃプロモーター等が連結されていることが確認され
た。

実施例２ Ｉ）（Ｇｌｎ５３）−β−ウロガストロン遺伝子及びこ
れを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第１０図に示す。

■　次に示すオリゴヌクレオチドＧＬＮ−１及びＧＬＮ
−２を、固相リン酸トリエステル法により合成した。

ＧＬＮ−１５’　　−ＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡ　　−３’ＧＬＮ−２３’　　
−ＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴ　　
−５’■　別にプラスミド１）ＵＧＴＩ　５０の５μＱ
を、高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＢｏｌＩＩ　（宝
酒造社製）を用いて切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ■
のクレノー断片を用いて平滑末端とし、高塩濃度緩衝液
中にて、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて切
断し、０．９％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって
、約３．３ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｔ＞を得た。また同様に
、ｐ　ＵＧＴＩ　５０の５μｇを高１！濃度緩衝液中に
て、制限酵素ＥＣ０ＲＩ及び５ａｌＩを用いて同時に切
断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
って、約０．３９ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｕ＞を得た。更に
、ｐ　ＵＧＴ１５０の３２μｇを、高塩濃度緩衝液中に
て、制限酵素Ｂ（ＩＩＩＩ及び５ａｌＩを用いて、同時
に切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、約０．２４ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、これを
続いて生塩濃度緩衝液中にて、制限酵素５ａｕ３ＡＩ（
宝酒造社製）を用いて切断した後、５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なって、約０．２１ｋｂのＤＮＡ
断片＜Ｖ＞を得た。

■　上記■で得られたオリゴヌクレオチドＧＬＮ−１及
びＧＬＮ−２の各１μｇと、■で得られた各ＤＮＡ断片
＜Ｔ）、（Ｕ）及び（Ｖ）とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを加えて１２℃で１６時間連結反応させ、連結物で
大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換させ、テトラサイクリン
耐性を示す多数のコロニーを得た。そのうちの１コロニ
ーを選び、これからプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇ
を単離した。

得られたｐ　ＬＩＧＴｌ　５０−Ｇは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの太きさを有
していた。また、ＰＳｔＩ、）−１ｉｎｄＩＩ［等の制
限酵素による切断パターンを解析した結果、テトラサイ
クリン耐性遺伝子の他に、（Ｇｌｎ５３）−β−ウロガ
ストロンをコードする遺伝子構造の存在が推定された。

次いで上記１）ｔＪＧＴｌ　５０−Ｇにつき、Ｍ１３法
によるＤＮＡ塩基配列の確認を行なった結果、（Ｇｌｎ
５３）−β−ウロガストロンをコードするＤＮＡｊ１基
配列を含み、その５′端には、β−ラクタマーゼシグナ
ルベブチドをコードするＤＮＡ塩基配列が直結し、その
上流にはｔａｃプロモーターが連結されていることが確
認された。

実施例３ Ｉ）（Ｌｅｕ２１．Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロン
遺伝子及びこれを含む発現ベクターの構築この構築の概
略図を第１１図に示す。

■　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｌの１０μすを、
生塩濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｃ１ａＩ（ＮＥＢ社製
）及びＭｌｔｌＩ（宝酒造社製）を用いて、同時に切断
した後、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、
約０．４９ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｗ＞を得た。

■　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇの５μｇを、上
記■と同様にしてＣＩａＩ及びＭＩｕＩで切断後、０．
９％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約３．３
９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘ）を得た。

■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片＜Ｗ＞及び（
ｘ）を、Ｔ４ＤＮＡｌ、ｌガーゼを用いて１２℃で１６
時間、連結反応させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形
質転換し、テトラサイクリン耐性を示す多数のコロニー
を分離した。そのうちの１コロニーを選び、これからプ
ラスミドｐ　ＬＩＧＴ１５０−ＬＧを単離した。

得られたｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの大きさを有
していた。また、Ｐ３を工、Ｈｉｎｄｌ、ＴａｑＩ等の
制限酵素による切断パターンを解析した結果、テトラサ
イクリン耐性遺伝子の他に、（Ｌｅｕ２１．　Ｇ１１５
３　）−β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列を有し、且つその５′端に直接β−ラクタマーゼシグ
ナルペブチドをコードするＤＮＡ塩基配列が連結され、
その上流にｔａｃプロモーターを含むことが確認された
。

実施例４ Ｉ　＞（Ｖａｔ２１．Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロ
ン遺伝子及びこれを含む発現ベクターの構築この構築の
概略図を第１２図に示す。

■　プラスミドｐＵＧＴ１５０−■の１０μｇを、生塩
濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｃ１ａＩ（ＮＥＢ社製）及
びＭＩＵＩ（宝酒造社製）を用いて、同時に切断した後
、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０．
４９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｙ）を得た。

■　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇの５μｇを、上
記■と同様にしてＣ１ａ■及びＭｌｕＩで切断後、０．
９％アクリルアミドゲル電気泳肋を行なって、約３．３
９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘ＞を得た。

■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片（Ｙ＞及び＜
Ｘ＞を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃で１６時間
、連結反応させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換し、テトラサイクリン耐性を示す多数のコロニーを分
離した。そのうちの１コロニーを選び、これからプラス
ミドｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧを単離した。

得られたＩ）ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの大きさを有
していた。また、ｐｓｔ■、ＨｉｎｄＩ［［、ＴａｑＩ
等の制限酵素による切断パターンを解析した結果、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の他に、（Ｖａｌ”　、Ｇｌｎ
”　）−β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列を有し、且つその５′端に直接β−ラクタマーゼシグ
ナルベブチドをコードするＤＮＡ塩基配列が連結され、
その上流にｔａｃプロモーターを含むことが確認された
。

実施例５ ■）　本発明組換え微生物の培養及びこれによるβ−ウ
ロガストロン誘導体の製造 ■　菌の培養 実施例１〜４のそれぞれで得た各ベクター（ｐ　ＵＧＴ
ｌ　５０−Ｖ、ｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇ。

Ｄ　ＵＧＴＩ　５Ｏ−ＶＧ及ｆｆｐ　ＵＧＴＩ　５Ｏ−
ＬＧ）を保有する大腸菌ＪＭ１０３株を、以下の通り培
養した。

培地としては、グルコース、カザミノ酸、プロリン、サ
イアミン、及びテトラサイクリンを添加したＭ９培地を
用いた。その組成は下記の通りである。

リン酸二ナトリウム・１２水１１３．４ｇリン酸−カリ
ウム　　　　　　　　３．○ｇ塩化ナトナトリウム　　
　　　　　０．５ｇ塩化アンモニウム　　　　　　　　
１．０ｇ塩化カルシウム・２水塩　　　　１４．７Ｇ塩
化マグネシウム・６水塩　　　２０３　＋１０グルコー
ス　　　　　　　　　　　　５．０ｇカザミノ酸　　　
　　　　　　　　　５．ＯｇＬ−プロリン　　　　　　
　　　　　５０１１１！Ｉ＋サイアミン・塩酸塩　　　
　　　　　１ｍｇテトラサイクリン　　　　　　　　　
１５ｍａＱ 上記培地２００ｍＱを含むフラスコに菌を接種して、３
７℃にて４［培養を行なった。培養開始５時間後に、Ｉ
　ＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して培養を継続し、
その３２０時間後に、一定量（１０ｍＧ）を採取して、
６１０ｎｌｌｌでの吸光度を測定し、次いで遠心分離（
６０００回転／分ＸＩＯ分、４℃）により、菌体と培養
上澄とを分離した。

得られた培養上澄を菌体外画分とする。

また菌体を、ＰＢＳ　（１５０ｍ　Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０１１Ｍリン酸ナトリウム、ｐ　Ｈ７，０）１０
＋ｌ１１２に懸濁させ、超音波破砕Ｉａ（大岳製作所製
５２０２型）を用いて出力１００〜■にて、３０秒ずつ
３回破砕処理し、遠心弁ｊｉｆｆ　（１８０００回転／
分Ｘ２０分、４℃）して上澄を得た。これを菌体内画分
とする。

■　ＲＩＡによるβ−ウロガストロン誘導体の測定 上記■で得たそれぞれの両分につき、以下の通りβ−ウ
ロガストロン誘導体の存在を、β−ウロガストロン特異
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により検討した。ＲＩ
Ａの方法は次の通りである。

即ち、精製ヒトβ−ウロガストロンを抗原として、家兎
を免疫し抗血清を作成した。即ち、β−ウロガストロン
３００μｇを蒸留水０．２ｍＱに溶解後、５０％ポリビ
ニルピロリドン液１．５−を加え室温で２時間撹拌した
。コンプリート・フロイント・アジュバント２．０却を
加えて乳化し、家兎３匹の胸部に皮下注射した。２週間
毎に免疫を４回くり返した後、さらに５０μＱの抗原を
静注し、３０侵に全採血を行ない、血清を分離した。

次にアッセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイト
レージョンカーブ、アッセイ条件を最適化するためイン
キュベーション時間、抗体結合標識抗原（バウンド）と
遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、下
記測定条件を設定した。

即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ二ナトジナ
トリウム１０＋＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を希釈
液として用い、該希釈液４００μＱ、測定試料又は標準
ヒトβ−ウロガストロン１００μＱ及び抗ヒトβ−ウロ
ガストロン血清１００ｕＱを加えて４℃にて２４時間イ
ンキュベートした後、１２５■標識ヒトβ−ウロガスト
ロン１００．ｃｌ　（約５０００ＣＩ）ｌ）を加えた。

更に４℃にて４８時間インキュベートした後、第２抗体
（抗家兎γ−グロブリンヤギ血清）（１：２０＞１００
μ（！、正常家兎血清（１：　２００）１００μＱ及び
５％ポリエチレングリコールを含む１０ｍＭ　　ＰＢＳ
液９００μＱを加えて４℃にて３時間インキュベートし
た。次に３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清
を除き沈澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウロガスト
ロンより得られた標準曲線より試料中のヒトβ−ウロガ
ストロン免疫活性物の含量を求めた。

上記ＲＩＡの結果（単位：μｇ／Ｑ　）を、下記第１０
表に示す。

第　　１０　　表 供試菌　　　　β−ウロガストロン免疫活性（ベクター
）　　菌体内　　菌体外　　合　計　ＵＧＴ １５０−Ｖ　　　４２８　　１７６　　６０４１）ＵＧ
Ｔ １５０−Ｇ　　　３００　　　５２　　３５２　ＵＧＴ １５０−ＶＧ　　２８０　　　５６　　３３６　ＵＧＴ １５０−ＬＧ　　１９２　　　５６　　２４８上記第１
０表より、本発明ベクターｐ　ＬＩＧＴ１５０−Ｖ、ｐ
　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＧｌｐＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧ及びｐ
　ＵＧＴＩ　５Ｏ−ＬＧのそれぞれを保有する菌株は、
いずれも、β−ウロガストロン免疫活性物を菌体内及び
菌体外に産生ずることが明らかである。

■）　本発明β−ウロガストロン誘導体の精製及び同定 ■　　精　　製 本発明β−ウロガストロン誘導体の精製を以下の方法に
より実施した。即ち、上記■）で得た菌体内画分及び菌
体外画分中のβ−ウロガストロン免疫活性物質を、ブチ
ルトヨパール６５０Ｃ（東、洋曹達社製）を用いた吸着
クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（
同上社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、
ＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（同上社製）を用いた陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、ＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２
０Ｔカラム（同上社製）を用いた高速液体クロマトグラ
フィー及びセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製
）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー操作を順次行な
って、それぞれ純度９９％以上の単一のポリペプチドと
して精製した。

■　逆相高速液体クロマトグラフィー 得られた各β−ウロガストロン誘導体及び天然型β−ウ
ロガストロンのそれぞれの逆相高速液体クロマトグラフ
ィーによる溶出パターンを第１３−１図〜第１３−５図
に示す。第１３−１図は天然型β−ウロガストロンを、
第１３−２図は（Ｖａｔ２１）−β−ウロガストロンを
、第１３−３図は（Ｇｌｎ７”）−β−ウロガストロン
を、第１３−４図は（Ｌｅｕ２　＋　、　（３１ｎ５３
　）−β−ウロガストロンを、及び第１３−５図は（■
ａ１２＋。

Ｇ１ｎ５３　）−β−ウロガストロンをそれぞれ示して
いる。また、各図は２２％アセトニトリルを含む５０１
ｎＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，３）により、毎分１．０
纜の流速で溶出させた結果であり、各図において縦軸は
２８０ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を示す
。

上記各図より、本発明の各誘導体の保持時間は、（Ｖａ
１２Ｉ）−β−ウロガストロンでは１４．４２分、（Ｇ
ｌｎ５Ｇ）−β−ウロガストロンでは１１．０３分、（
Ｌｅｕ”　、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロンでは
１５．１２分及び（Ｖａ１２１．　Ｇｌｎ５３　）−β
−ウロカストロンテは１０．６７分であることが判る。

また、各図より本発明β−ウロガストロン誘導体は、い
ずれも高純度に精製されていることが判る。

■、雷気気泳 動いで、第１４図に、本発明β−ウロガストロン誘導体
及び対照とする天然型β−ウロガストロンのそれぞれの
電気泳動の結果を示す。各被検標品の使用量は１０μｇ
であり、之等をトリス・グリシン緩衝液（ｐ　Ｈ８，３
）を用いて２５ｍＡにて、２．５時間泳動させた後、ク
マーシーブリリアントブルー・Ｒにより染色を行なった
。

第１４図においてレーン■は天然型β−ウロガストロン
、レーン■は（Ｖａｔ２１　）−β−ウロガストロンを
、レーン■は（Ｇｌｎ５３）−β−ウロガストロンを、
レーン■は（ＶａＮ　’　、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロ
ガストロンを、レーン■は（Ｌｅｕ”。

Ｑ　ｌｎ５３　）−β−ウロガストロンをそれぞれ示し
ている。

上記図より本発明β−ウロガストロン誘導体は、いずれ
も高純度であることが判ると共に、ＣＧ１ｎ５３）−β
−ウロガストロン、（Ｖａ１２Ｉ。

Ｇ１ｎ５３　）−β−ウロガストロン及び（Ｌ　ｅｕ２
　＋。

Ｑ　ｌｎ５３　）−β−ウロガストロンは、５３位のＡ
ｒ（Ｉが中性アミノ酸（Ｇｌｎ）に置換されたことに基
づいて、それらの等電点が酸性側に移動していることが
判る。

■　アミノ酸分析 本発明β−ウロガストロン誘導体につき、４Ｍメタンス
ルホン酸により加水分解し、日立アミノ酸分析機を用い
て、オルトフタルアルデヒド法によりアミノ酸分析を行
なった。結果を下記第１１表〜第１４表に示す。

第１１表 （Ｖａ１２＋　）−β−ウロガストロンア　ミ　ノ　酸
　　　　実温残基数　　　理論残基数Ａｓｘ　　　　　
　　　　６．５　　　　　　　７Ｔｈｒ　　　　　　　
　　検出されず　　　　　０８ｅｒ　　　　　　　　　
２，９　　　　　　　３Ｇｌｘ　　　　　　　　　５．
０　　　　　　　５Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１Ｇｌｙ　　　　　　　　　４．０　　　
　　　　４Ａｌａ　　　　　　　　　２．０　　　　　
　　２１／２Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　
６Ｖａｌ　　　　　　　　　３．４　　　　　　　４Ｍ
ｅｔ　　　　　　　　　検出されず　　　　　０１１ｅ
　　　　　　　　　２．０　　　　　　　２Ｌｅｕ　　
　　　　　　　５．０　　　　　　　５Ｔｙｒ　　　　
　　　　　４．５　　　　　　　５Ｐｈｅ　　　　　　
　　　検出されず　　　　　０Ｌｙｓ　　　　　　　　
　２．０　　　　　　　２Ｈｉｓ　　　　　　　　　２
．２　　　　　　　２Ｔｒｐ　　　　　　　　　２．１
　　　　　　　２Ａｒｃ＋　　　　　　　　　２．０　
　　　　　　３第１２表 （Ｇｌｎ５３）−β−ウロガストロン ア　ミ　ノ　酸　　　　実測残基数　　　理論残基数Ａ
ｓｘ　　　　　　　　　６．３　　　　　　　７Ｔｈｒ
　　　　　　　　　検出されず　　　　　０８ｅｒ　　
　　　　　　　２．８　　　　　　　３Ｇｌｘ　　　　
　　　　　５，７　　　　　　　６Ｐｒｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＩＧｌｙ　　　　　　　　
　４．０　　　　　　　４Ａｌａ　　　　　　　　　２
．０　　　　　　　２１／２Ｃｙｓ　　　　　　　　　
　　　　　　　６Ｖａｌ　　　　　　　　　２．４　　
　　　　　３Ｖａｔ　　　　　　　　　Ｏ，５１ １１ｅ　　　　　　　　　１．９　　　　　　　２しｅ
ｕ　　　　　　　　　　４．８　　　　　　　　５Ｔｙ
ｒ　　　　　　　　　４．４　　　　　　　５Ｐｈｅ　
　　　　　　　　検出されず　　　　　０Ｌｙｓ　　　
　　　　　　１．９　　　　　　　２Ｈｉｓ　　　　　
　　　　２．１　　　　　　　２Ｔｒｐ　　　　　　　
　　２．２　　　　　　　２Ａｒｑ　　　　　　　　　
１．９　　　　　　　２第１３表 （Ｖａｔ２１．Ｇ１ｎ５３）−８−ウロｎスＭ］ンア　
ミ　ノ　酸　　　　実測残基数　　　理論　基数ＡＳＸ
　　　　　　　　　６．３　　　　　　　７７ｈｒ　　
　　　　　　　検出されず　　　　　０３ｅｒ　　　　
　　　　　２．７　　　　　　　３Ｑｌｘ　　　　　　
　　　５．８　　　　　　　５Ｐｒｏ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１Ｇｌｙ　　　　　　　　　
４．０　　　　　　　４Ａｌａ　　　　　　　　　２．
０　　　　　　　２１／２ＣＶＳ　　　　　　　　　　
　　　　　　６Ｖａｔ　　　　　　　　　３．６　　　
　　　　４Ｖａｔ　　　　　　　　　検出されず　　　
　　０Ｉｌｅ　　　　　　　　　１．９　　　　　　　
２しｅｕ　　　　　　　　　　４．９　　　　　　　　
５Ｔｙｒ　　　　　　　　　４．３　　　　　　　５ｐ
ｈｅ　　　　　　　　　検出されず　　　　　０Ｌｙｓ
　　　　　　　　　２．０　　　　　　　２Ｈｉｓ　　
　　　　　　　２．３　　　　　　　２Ｔｒｉ）　　　
　　　　　　２．１　　　　　　　２Ａｒ０　　　　　
　　　１・９２ 第１４表 （ｌｅｕ２Ｉ、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロンア
　ミ　ノ　酸　　　　実測残基数　　　理論残基数Ａｓ
ｘ　　　　　　　　　６．５　　　　　　　７Ｔｈｒ　
　　　　　　　　検出されず　　　　　○Ｓｅｒ　　　
　　　　　　２．９　　　　　　　３Ｇｌｘ　　　　　
　　　　５．９　　　　　　　６Ｐ、。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１Ｇ＋’／　　　　　　　　　
３・９４ Ａｌａ　　　　　　　　　２．０　　　　　　　２１／
２Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　６Ｖａｔ　
　　　　　　　　２．６　　　　　　　３Ｖａｔ　　　
　　　　　　検出されず　　　　　０１１ｅ　　　　　
　　　　１．９　　　　　　　２Ｌｅｕ　　　　　　　
　　６．０　　　　　　　６Ｔｙｒ　　　　　　　　　
４．７　　　　　　　５Ｐｈｅ　　　　　　　　　検出
されず　　　　　０Ｌｙｓ　　　　　　　　　１．９　
　　　　　　２Ｈｉｓ　　　　　　　　　２．０　　　
　　　　２Ｔｒｐ　　　　　　　　２．１　　　　　　
２Ａｒ！］　　　　　　　　　２．０　　　　　　　２
上記各表より、本発明Ｂ−ウロガストロン誘導体は、い
ずれもそのアミノ酸の実測残基数が理論残基数と良好に
一致していることが判る。

実施例６ 生物活性の測定 ■　細胞増殖促進活性 本発明β−ウロガストロン誘導体の細胞増殖促進活性を
、成熟ラット初代培養肝臓細胞（Ｔａｎａｋａ　、　Ｋ
、ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、８４
　。

９３７−９４６　（１９７８））を用いて、標識チミジ
ンのＤＮＡへの取り込みを指標として測定した（Ｎａｋ
ａｍｕｒａ　、　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂ、　Ｂ、　
Ｒ，Ｃ，。

１３３．１０４２−１０５０（１９８５）及びＮａｋａ
＋１ｌｕｒａ　、　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８止、７２２９−７２３３＜１９８
３））。

即ち、体重的２００ｇのウィスター系雄ラットにネンプ
タール０．４ｍ１２を腹腔内投与して麻酔後、開腹し門
脈を露出させた。門脈の切開面からカニユーレを挿入し
、３７℃に保温した前潅流用緩衝液を流した。また、右
心房を切開し、ここから別のカニユーレを上大静脈に挿
入した。次いで、前潅流用緩衝液に代えて、３７℃に保
温したコラ−ゲナーゼ溶液を用いて、１０〜２０分間潅
流を行なった。次いで、肝臓多葉を切り離し、シャーレ
に移してカルシウムを含まないハンクス液を加えて、メ
スで細分し、更にピペットで細胞を分散させた。次いで
１５０メツシユを通過する細胞を集め、これを遠心分離
（６０００ｒｐｍ　、１分間）し、沈降した肝実質細胞
を、５％仔好手清１０−”Ｍインスリン、１０−９Ｍデ
キサメサゾン、５Ｕ／噌アプロチニンを含むウィリアム
Ｅ培地に懸濁させた。その一部を用いトリパンブルー法
で染色後、血球計算盤で生細胞数を計測した。

尚、用いた前潅流用緩衝液及びコラ−ゲナーゼ溶液組成
（ｇ／Ｑ　）は次の通りである。

成　分　（ｇ／Ｑ　’）　　　前潅流用　コラーゲナ緩
衝液　　ナーゼ溶液 塩化ナトリウム　　　　　　８８ 塩化カリウム　　　　　　　０．４　　　０．９４塩化
カルシウム　　　　　　　　　　　０．１リン酸−ナト
リウム ・２水塩　　　　　　　　　０，０７８　　０，０７８
リン酸二ナトリウム ・１２水塩　　　　　　　　０．１５１　　０，１５１
ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　　　　　　　　　　２．３８　　　
２．３８フエノールレツド　　　　　　０．００６　　
０．００６コラーゲナーゼ　　　　　　　　　　　０．
５トリプシンインヒビター　　　　　　　　０．０５Ｅ
ＧＴＡ　　　　　　　　　　　Ｏ，１９−炭酸水素ナト
リウム　　　　０．３５　　　０．３５グルコース　　
　　　　　　０．９− ｐＨ７，２７，５ 上記肝実質Ｉｌｌ胞を１２穴のプラスチック製ディツシ
ュに０．５×１０５個／ウェルとなるように分注し、−
夜培養した後、培地を捨てて、種々の濃度のβ−ウロガ
ストロン誘導体又は天然型β−ウロガストロン及び１０
−９Ｍインスリン、１０−９Ｍデキサメサゾン及び５Ｕ
／−アプロチニンを含むウィリアムスＥ培地１戒を加え
た。これを１２ＦＲ間３７℃に保った後、１．２５μＣ
１の（３Ｈ）−チミジン（０，３Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　
）を加え、３７℃で更に２４時間培養した。次いで細胞
をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＴＣＡを加え、４℃で一
夜放置することにより固定した。固定された細胞に１　
Ｎ−Ｎａ　ＣＱ　０．５ｎ１２を加え、３７℃にて３０
分間保温して溶解させ、これを試料液とした。

試料液４７５μＱに、１００％（Ｗ／Ｖ）ＴＣＡ１５０
μＱを加え、４℃で２時間放置した後、遠心分離（３０
００ｒｐｍ　、１５分間）し、高分子ＤＮＡを沈澱させ
た。次いでこれに１０％ＴＣＡ０．５ｍＱを加え、沸騰
水浴中で１５分間加熱し、ＤＮＡを加水分解した。水冷
後、遠心分離（３０００ｒｐｍ　、１５分間）して上澄
を分離し、液体シンチレーションカウンターで放射能を
測定した。別に、試料液２５μＱ中の蛋白量を、フォー
リン・ローリ−法により定量し、之等の結果から、蛋白
り当りの放射能を求めた。

結果を第１５図に示す。図において横軸は本発明β−ウ
ロガストロン誘導体又は天然型β−ウロガストロンのそ
れぞれの濃度（ｎｇ／　噌）を、縦軸は蛋白吊当りの放
射能（ｔｉｐｍ　Ｘ　１０’　／ｍｇ蛋白）を示す。ま
た図において（１）は天然型β−ウロガストロンを、（
２）は（Ｖａ１２１　）−β−ウロガストロンを、（３
）は（ＧＩ０５３〕−β−ウロガストロンを、（４）は
（Ｖ　ａ１２　＋　、　Ｑ　Ｉｎ５３　）−β−ウロガ
ストロンを、（５）は（ｌｅｕ２１　。

Ｑ　１ｎ５３　）−β−ウロガストロンをそれぞれ示す
。

上記第１５図から、本発明のβ−ウロガストロン誘導体
は、いずれも天然型β−ウロガストロンと比較して、約
１／２の濃度で、同等又はそれ以上のチミジン取り込み
促進効果を奏し、細胞増殖促進活性の高いことが判る。

本発明誘導体が、かかる細胞増殖促進活性を奏する事実
は、今だβ−ウロガストロン自体の構造活性相関が解明
されていないために明らかではないが、この活性より本
発明誘導体が各種細胞培養等の分野で有効であることは
明らかである。また上記活性より、本発明誘導体が医薬
品分野においても、天然型β−ウロガストロンに比較し
てより強力な生物活性を奏することも充分に推測できる
。

■　新生仔マウスの眼瞼開裂活性及び切歯閉出促進活性 この試験は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）における代表
的なＥＧＦの生物検定法であるり、コーエン（Ｓ。

Ｃｏｈｅｎ）の方法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２３７，１５５５
（１９６２））を参考として次の通り行なった。

即ち、ＩＣＲ系マウスの新生仔（体重１．６〜１．８ｇ
）の各群６匹を試験動物として、生後１８時間以内に、
β−ウロガストロン誘導体又は対照として天然型β−ウ
ロガストロンのそれぞれを生理食塩水溶液形態で０．３
μ（＋、０．６μＱ又は１．２μｇ／１０μＱ／（Ｊと
なるように、各供試動物の背部に皮下投与した。以後２
４時間毎に投与を繰返し、同時に眼瞼開裂及び切歯閉出
の観察を行なった。尚、上記投与及び観察は、全ての個
体につき眼瞼開裂及び切歯閉出が起るまで継続した。

得られた結果を下記第１５表に示す。第１５表には、何
らの供試薬剤をも投与しなかったコントロール群につい
ての結果も併記する。表中の各数値は１群６匹の眼瞼開
裂又は切歯閉出に要した日数の平均値である。

第　　１５　表 上記表より、本発明誘導体及び天然型β−ウロガストロ
ンはいずれも新生仔マウスの眼瞼開裂及び切歯閉出を促
進しており、これは用量依存的であることが判る。また
は、（Ｇｌｎ”）−β−ウロガストロン、（Ｌｅｕ２Ｉ
、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロン及び（■ａ１２
　＋　、　Ｇ１ｎ５　Ｇ　）−β−ウロガストロンは、
明らかに天然型β−ウロガストロンよりも強い上記眼瞼
開裂及び切歯閉出促進活性を奏することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターｐ　ＢＲ３２２に合成オリゴヌクレオ
チドく１〉〜く４〉をクローニングしてプラスミドｐＧ
Ｉ−１５３を得る工程及び得られるプラスミドＩ）ＧＨ
５３の特徴を示す図であり、図中口は合成オリゴヌクレ
オチド由来の塩基配列を示し、Ａｐはアンピシリン耐性
遺伝子を、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子を示し、
以下の図でも同様とする。 第２図はｐＧＨ５３とｐ　ＢＲ３２２とからベクターｐ
ＧＨ５４を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す
図であり、図中−はシグナルペプチドをコードする塩基
配列を示す。図中（Ｆ）はＦ　ｎｎ４　ＨＩサイトを示
し、この括弧を付して示した制限酵素サイトはベクター
上に複数個存在する制限酵素サイトのうちの該当するサ
イトを示し、以下の図でも同様である。 第３図はｐ　ＢＲ３２２から１）ＢＲＨＯ２を得、該ｐ
　ＢＲＨＯ２とｐＧＨ５４とからベクターｐＧＩ−１５
５を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す図であ
る。 第４図はｐＧＨ５５とｐ　ＵＯ３とからベクターｐＵＧ
２０１を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す図
である。図中臼ヌキの矢印はβ−ウロガストロンの遺伝
子を示す。 第５図はｐ　ＤＲ５４０，ｐ　ＵＧ２０１並びにオリゴ
ヌクレオチドＩ−３及びＩ−４からベクターｐ　ＵＧＴ
Ｉ　５０を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す
図である。図の中黒ヌリの矢印はβ−ラクタマーゼのプ
ロモーターを、斜線を入れた矢印はｔａｃプロモーター
を、Ｑｒｉは複製開始領域を示し、以下の図でも同様と
する。 第６図は合成オリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−１６とｐ
ＢＲ３２２とからｐＵＧＩ−Ｌを得、これとｐ　ＵＯ２
とからｐ　ＵＯ３−Ｌを得る各工程及び得られるｐＵＧ
ｌ−Ｌ及びｐＵＧ３−Ｌの特徴を示す図である。 第７図はｐ　ＵＯ３−ＬとｐＵＧＴ１５０とからｐ　Ｕ
ＧＴＩ　５０−Ｌを得る工程及び得られるｐＵＧＴ１５
０−Ｌの特徴を示す図である。 第８図は合成オリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−１６とｐ
ＢＲ３２２とからｐＵＧｌ−Ｖを得、これとｐ　ＵＯ２
とからｐ　ＵＯ３−ひを得る各工程及び得られるｐＵＧ
ｌ−Ｖ及び１）ＵＯ３−Ｖの特徴を示す図である。 第９図はｐ　ＵＯ３−Ｖとｐ　ＵＧＴｌ　５０とからｐ
　ＵＧＴｌ　５０−Ｖを得る工程及び得られるｐＵＧＴ
１５０−Ｖの特徴を示す図である。 第１０図はｐ　ＵＧＴｌ　５０、オリゴヌクレオチドＧ
ＬＮ−１及びＧＬＮ−２からｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇを
得る工程及び得られるｐＵＧＴｌ　５０−Ｇの特徴を示
す図である。 第１１図はｐＵＧＴ１５０−Ｌとｏ　ＵＧＴ１５０−Ｇ
とからｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧを得る工程及び得られ
るｐ　ｔＪＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧの特徴を示す図である。 第１２図はｐＵＧＴＩ　５０−Ｖとｌ）　ＵＧＴｌ　５
０−Ｇとからｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧを得ル工程及び
得られるｐＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧの特徴を示す図である
。 第１３−１図〜第１３−５図は、本発明β−ウロガスト
ロン誘導体及び天然型β−ウロガストロンの逆相高速液
体クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すグラフ
である。 第１４図は本発明β−ウロガストロン誘導体及び天然型
β−ウロガストロンの電気泳動の結果を示す図である。 第１５図は標識チミジンのＤＮＡへの取り込みを指標と
して、本発明β−ウロガストロン誘導体及び天然型β−
ウロガストロンの細胞増殖促進活性を調べたグラフであ
る。 （以　上） 第１０図 第１１図 ｓｔｒ 第１５図 ００．６２５１．２５　２．５　　　５β−ウロガスト
ロン又１よ／３−ウロガストロンが１専イｆ’−（ｎｇ
／ｍｌ）手続補正書（方式） 昭和６１年１０月２７日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １　事件の表示 β−ウロガストロン誘導体及びその製造、該誘導体をコ
ードするＤＮＡ塩基配列、これを含む発現ベクター及び
該ベクターを保アース製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル昭和６１年９月
３０日 ６　補正の対象 明細山中図面の簡単な説明の項及び図面７　補正の内容 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書中東１３８頁第２〜４行に「第１４図は・・
・である。」と必るを次の通り訂正する。 「　第１４図は、１５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡ
ＧＥ）を用いた本発明β−ウロガストロン誘導体及び天
然型β−ウロガストロンの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）の結果を示す図である。」 ２　第１４図を別紙添附の通り訂正する。 （以　上） 手続補正書（自発） 昭和６１年１１月５日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １　事件の表示 昭和６１年特許願第１５３７８３＠　　７４２　発明の
名称 β−ウロガストロン誘導体及びその製造、該誘導体をコ
ードするＤＮＡ塩基配列、これを含む発現ベクター及び
該ベクターを保有する微生物 ３　補正をする者　　　　　　　　　　　　　、′イ′
−２工事件との関係　　特許出願人　　　　　“°１託
２アース製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル自　　　発 別紙添附の通り ａ〜、 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書全文を別紙の通り訂正します。 ２　第１３図〜第１５図を別紙添附の通り訂正します。 （以　上） 訂正明細書 発明の名称　β−ウロガストロン誘導体及びその製造、
該誘導体をコードするＤＮＡ 塩基配列、これを含む発現ベクター 及び該ベクターを保有する微生物 特許請求の範囲 ０式 ％式％ （式中×１はＶａｌ、１−ｅｕ又はＭ　ｅｔ翌ｑす。）
で表わされることを特徴とするβ−ウロガストロン誘導
体。 ■式 ％式％ 〔式中Ｘ１はＶａ＋、１−ｅｕ又はＭｅｔを示す。〕で
表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含有することを特徴とするβ−ウロガスト
ロン誘導体発現ベクター。 ■　プラスミドｆ）ＵＧＴｌ　５０−Ｇである特許請求
の範囲第２項に記載の発現ベクター。 Ｑ　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧである特許請
求の範囲第２項に記載の発現ベクター。 Ｑ　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧである特許請
求の範囲第２項に記載の発現ベクター。 ９式 ％式％ （式中Ｘ１はＶａｌ、ｌｅｕ又はＭｅｔを示す。〕で表
わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤＮＡ
塩基配列を含有するβ−ウロガストロン誘導体発現ベク
ターで形質転換されたことを特徴とする形質転換微生物
。 Ｑ式 ％式％ （式中×１はＶａｌ、１−ｅｕ又はＭｅｔを示す。〕で
表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含有するβ−ウロガストロン誘導体発現ベ
クターで形質転換された微生物を培養して目的誘導体を
採取することを特徴とするβ−ウロガストロン誘導体の
製造法。 ０式 ％式％ ］ 〔式中Ｘ′はＶａｌ、１−ｅｕ又はＭｅｔを示す。〕で
表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤＮ
Ａ塩基配列。 発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は、β−ウロガストロン誘導体、より詳しくは、
β−ウロガストロンの５３番目のアミン狼配列を、又は
これと２１番目のアミノ酸とを、特定のアミノ酸に置換
させたｖｆｒ規な誘導体及びその製造法、該誘導体をコ
ードするＤＮＡ塩基配列、該ＤＮＡ塩基配列を含む発現
ベクター及び該ベクターを保有する微生物に関する。 従来の技術 β−ウロガストロンは、１９７５年にグレゴリ−により
人尿から発見されたポリペプチドであり、５３個のアミ
ノ酸残基からなり、３個のジスルフィド結合を有してい
る〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　。 ２５７．３２５　（１９７５））。 そのアミノ酸配列は、次に示す通りでおる。 Ａｓｐ　Ｇｌ’／−Ｔｙｒ　ｃｙｓ　　ｌｅｕ　Ｈ！Ｓ
　Ａ、５ｐＧｌ”ｌ／　％／ａｌ　　ｃｙｓ−Ｍｅｔ−
丁ｙｒ　−Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ
−ＡＳＩ）−ｔ−ｙｓ−ＴＶｒ−Ａ　ｌａ　−Ｃｙｓ−
Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇ！ｙ−Ｔｙｒ−Ｉ
　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ　−Ａｒ！：Ｉ−ＣＶＳ−Ｇｌ
ｎ−ＴＶｒ−Ａｒ！ｌ］−ＡＳｆ）−ＬｅｌＪ−ＩＪｓ
−Ｔｒｔ）−乍ｒｐ−Ｇｌｕ−１−ｅｕ−Ａｒｇ 上記β−ウロガストロンは、また多様な生物活性、例え
ば胃酸分泌抑制作用、細胞増殖促進作用、新生仔マウス
の眼瞼開裂作用、切歯閉出促准作用等を有するものとし
て知られている。一方、マウス顎下腺より得られるマウ
ス上皮細胞成長因子（ｍＥ　Ｇ　Ｆ　：　ｍｏｕｓｅ　
ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａＣｔｏｒ　）
は、上記β−ウロガストロンと同等の生物活性を有して
おり、しかもそのアミノ酸配列も上記β−ウロガストロ
ンのそれと相同性が高い。この点より、β−ウロガスト
ロンは、またヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）である
とも考えられている（Ｇ、　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　ａｎ
ｄ　　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。 ［３ｉｏｃｈｅｍ、　、　４旦、１９３−２１６　（１
９７９））。 しかして、従来知られているβ−ウロガストロンの製造
単離方法、例えば上記グレゴリ−の方法によれば、人尿
に僅か数μｇ／Ｑ　Ｌか含まれていないβ−ウロガスト
ロンを、複雑な工程を経て精製する必要があり、その量
産は不可能に近い。 本発明者らは、上記方法に代り、遺伝子組換え技術を応
用して、上記β−ウロガストロンを微生物より大量に生
産する方法を先に研究開発した〔特開昭６１−１５６９
１号公報参照〕。この方法の確立により、高純度のβ−
ウロガストロンが大量に供給可能となり、かくして得ら
れたβ−ウロガストロンを利用して、従来困難でめった
各種の動物実験、細胞レベルでの研究等が実施可能とな
り、徐々にβ−ウロガストロンについての実験データー
も蓄積され、その医薬用途への適用可能性も広がりつつ
ある。 しかしながら、β−ウロガストロンを医薬品として実用
するには、例えばその安定性の面等において多くの問題
点が残されている。上記安定性に関して、一般にポリペ
プチド中のＭｅｔ残基が酸化変性を受けやすいことはよ
く知られてあり、本発明者らも先に開発した方法の実施
の際に、β−ウロガストロンの精製途中で、その酸化変
性物が生成する場合のめることを確認している。 また、人尿から抽出単離されたβ−ウロガストロンには
、多様性が認められており、これは主としてβ−ウロガ
ストロンのカルボキシル末端アミノ酸配列部分の加水分
解による欠失に起因すると考えられている。本発明者ら
が先に開発した遺伝子組換え技術に従う場合にも、この
加水分解による欠失と考えられるカルボキシル末端から
２個のアミノ酸配列の欠失したポリペプチドの生じるこ
とが報告されている〔北沢ら、第５８回生化学会大会抄
録、第８５３頁（１９８５年）〕。上記カルボキシル末
端の欠失には、トリプシン様プロテアーゼが関与してい
る可能性が強いと考えられてあり、β−ウロガストロン
を医薬品として生体に投与する場合、血中に存在する各
種プロテアーゼによる分解、失活の可能性は高い。 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記β−ウロガストロンのアミノ酸配
列を改変し、これにより医薬用途等への適用に好適な新
しいβ−ウロガストロン誘導体及びその製造技術を提供
することにおる。 また、本発明の目的は、上記１なβ−ウロガストロン誘
導体を遺伝子組換え技術により製造する方法、特に該方
法の実施のための上記誘導体をコードするＤＮＡ塩基配
列、これを含む発現ベクター及び該ベクターにより形質
転換された微生物及び之等の製造技術を提供することに
ある。 本発明によれば、式 ％式％ 〔式中Ｘ１はＶａｌ、ｌｅｕ又はＭｅｔを示す。〕で表
わされるβ−ウロガストロン誘導体が提供される。 尚、上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸、核酸塩
基、その他に関する略号は、ＩＵＰＡＣ。 ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもの
とする。その例は次の通りでおる。 Ａｌａ・・・アラニン　　　Ａｒｃ＋・・・アルギニン
ＡＳｎ・・・アスパラギン　Ａｓｐ・・・アスパラギン
酸Ｃｙｓ・・・システィン　　Ｇｌｎ・・・グルタミン
Ｇｌｕ・・・グルタミンｍ　　Ｇｌｙ・・・グリシン）
−１ｉｓ・・・ヒスチジン　　Ｉｌｅ・・・イソロイシ
ン１−ｅｕ・・・ロイシン　　　Ｌｙｓ・・・リジンＭ
ｅｔ・・・メチオニン　　Ｐｈｅ・・・フェニルアラニ
ンＰｒｏ・・・プロリン　　　Ｓｅｐ・・・セリンＴｈ
ｒ・・・スレオニン　　Ｔｒｐ・・・トリプトファンＴ
ｙｒ・・・チロシン　　　Ｖａｌ・・・バリンＡ・・・
アデニン　　　　Ｔ・・・チミンＧ・・・グアニン　　
　　Ｃ・・・シトシンまた、本発明誘導体その他のポリ
ペプチドにあけるアミノ酸番号は、上記式（１）に示す
通り、そのアミン末端（ＡＳｎ＞を１として付したもの
である。 本発明の上記式（１）で表わされるβ−ウロガストロン
誘導体には、より詳しくは以下の各ポリペプチドが包含
される。 ＜Ｉ＞式（１）中Ｘ１がＭｅｔで市るポリペプチド、＜
ｎ＞式（１）中Ｘ１がＶａｌであるポリペプチド、及び ＜ｍ＞式（１）中ｘ１がｌｅｕであるポリペプチド。 本発明誘導体は、いずれもβ−ウロガストロンと同一の
生物活性乃至生理活性もしくは薬理活性を有し、且つそ
の活性の程度は同等であるかもしくはこれを上回ってい
る。即ち、β−ウロガストロンと共通する高次構造を保
有している。しかもこの誘導体は、酸化変性を受けにく
く化学的安定性において優れている特徴及び／又はトリ
プシン様プロテアーゼ等の蛋白質分解酵素の攻撃を受は
易い特異点を有ざず安定でおる特徴を具備している。従
って、本発明誘導体は、その医薬分野での応用に際し有
利であり、また製剤化等の加工面、保存面等でも優れた
利点を有している。加えて、本発明誘導体は、その製造
も比較的容易である利点がある。 以下、本発明のβ−ウロガストロン誘導体の製造方法に
つき詳述する。 本発明誘導体は、代表的には該誘導体のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ塩基配列（遺伝子）を利用して、遺伝
子組換え技術に従い、即ち、上記遺伝子を微生物のベク
ターに組込んで該微生物細胞内で、復製、転写、翻訳さ
せることにより、製造することができる。この方法によ
れば特に大量生産が可能である。また本発明誘導体は、
上記遺伝子組換え技術によらずとも、例えばそのアミノ
酸配列に従い、通常のペプチド合成法により化学的に合
成することもできる。 上記遺伝子組換え技術に従う本発明β−ウロガストロン
誘導体の製造に利用される遺伝子は、本発明誘導体〈■
〉〜＜Ｉ＞のアミノ酸配列のそれぞれをコードするもの
であり、２答は各アミノ酸配列に応じて、それらを溝成
するアミノ酸に対応した遺伝暗号を任意に遍択組合せる
ことができる。 上記各アミノ酸配列と之等をコードする各遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列の一例を下記に示す。 本発明誘導体＜１＞　（（Ｇｉｎ”３）−β−ラウロガ
ス１−ＤンＣＴ　ＩＧＡＧ（ｊｌ　Ｕ 本発明誘導体＜ＩＩ＞　　（（Ｖａ！２１．　Ｑｌｎ５
３）−β−ウロガストロン）本発明誘導体＜ＩＩＩ＞　
　（（Ｌｅｕ”１．　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロ
ン）Ｃ）ｔ　Ｉ　！　ＧＡにｕ　ｌ　’、；本発明β−
ウロガストロン誘導体のアミノ酸配列は、自然界では知
られていない新規なものであり、従って該誘導体をコー
ドするＤＮＡ塩基配列も新規であり、本発明はかかるβ
−ウロガストロン誘導体をコードする新しい遺伝子（以
下、これを１本発明遺伝子」という。また個々の本発明
遺伝子は、対応する本発明誘導体と同一記号＜Ｉ＞〜＜
Ｉ＞を付して示すものとする）及びこれを含み本発明誘
導体を発現するベクターをも提供するものである。 本発明遺伝子は、通常の方法、例えばホスファイト　ト
リエステル法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　。 ３１０．１０５　（１９８４））等の常法に従い、核酸
の化学合成により全合成することもできるが、本発明者
らが先に確立した天然型β−ウロガストロンをコードす
る合成遺伝子を利用して、これを例えばインビトロ点突
然変異法ＣＭ、Ｊ。 Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、３ｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　　１００．　４
６８−５００（１９８３））等の通常の方法により、そ
の一部を改変させて合成するのが有利で必る。上記天然
型β−ウロガストロンをコードする合成遺伝子は、該β
−ウロガストロンの前半部及び後半部のそれぞれに対応
する２つのＤＮＡ塩基配列（サブユニットＡ及びサブユ
ニットＢ）に分けられ、各々クローニングベクターｐ　
ＢＲ３２２に組込まれて、プラスミド１）ＵＧｌ及びプ
ラスミド１）ＵＯ３として確立されており、之等を結合
させたβ−ウロガストロンをコードする完全ＤＮＡ塩基
配列を含むプラスミドＩ）ＵＯ３を保有する大腸菌Ｈ８
１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所に
ｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　ＵＯ３）Ｊなる表示で微工研条奇
第５４３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４３）Ｊとして寄託
されている〔特開昭６１−１５６９１号公報参照〕。 本発明β−ウロガストロン誘導体に対応する本発明遺伝
子の製造につき詳）ホすれば、該遺伝子はこれを含むプ
ラスミドとして調製される。この遺伝子＜工＞を含み且
つこれを発現するプラスミドの製造方法は、特に制限は
なく、従来よりこの種遺伝子組換え技術に慣用されてい
る各種方法に従うことができる。例えば上記本発明遺伝
子が宿主細胞中で発現できるように目的とする誘導体を
コードするＤＮＡ塩基配列と、これを発現させるための
例えばプロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳停止シ
グナル、転写終結信号等の各種調節因子等とを結合させ
て組換えＤＮＡベクターを創製すればよい。 上記プロモーター等の各種因子を含み目的遺伝子を発現
させ得る組換えＤＮＡを作成するための起源ベクターと
しては、従来より外来遺伝子のクローニングに用いられ
ている各種のもの、例えばプラスミド、バクテリオファ
ージ、ウィルスＤＮＡ、コスミド等のいずれでもよい。 之等の組換え、Ｄ　Ｎ　Ａは、その開始コドン（ＡＴＧ
＞の上流にプロモーターを有しているのが好ましく、該
プロモーターは、形質転換体の製造に利用する宿主細胞
に対して洒切な各種のもの、例えば大腸菌（Ｅ　５ｃｅ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）に対してはｔｒｐプ
ロモーター、Ｉａｃプロモーター、ｒｅｃ　Ａプロモー
ター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等を、
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に対し
ては５ＰＯ１プロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐ
ｅｎ　ｐプロモーター等を、酵母（３ａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）に対してはＰＨ０５プ
ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター
、ＡＤＨプロモーター等を、動物細胞に対してはＳＶ４
０由来のプロモーター等を例示できる。 また、本発明のβ−ウロガストロン誘導体は、シグナル
ペプチドとの融合蛋白質としてこれを発現させることも
でき、この場合上記組換えＤＮＡとしでは、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列と目的遺伝子とを直
接連結させた融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列を有している必要がある。このシグナルペプチド及
びこれをコードするＤＮＡ塩基配列としては、アルカリ
性ホスファターゼ由来のもの、β−ラクタマーゼ由来の
もの等の任意のものを利用でき、之等は天然から収得し
てもよく、またそのアミノ酸に対応するコドンを適宜選
択して合成してもよい。大腸菌β−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドとしては、以下のものを例示できる。 及び 上記組換えＤＮＡとしては、特に本発明者らが先に確立
したｐ　ＢＲ３２２を起源ベクターとして構築されたｐ
ＧＨ５４、ｐＧＨ５５及び之等に由来するｐＵＧ２０１
　、ｏ　ＬＩＧＴｌ　５０等が好ましく利用できる。 上記ｐＧＨ５４は、β−ラクタマーゼのプロモーター及
びリボゾーム結合部位に続いてβ−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、この
塩基配列の３′末端にＮｒｕ■及びｐ　ｖｕ　■の制限
酵素認識配列を有するものでおり、その特性は、その製
造概略操作と共に第１図に示す通りでおり、図示された
制限酵素開裂地図により特徴付けられ、大きさく１．０
％アガロースゲル電気泳動による、以下同じ）は約３．
９ｋｂで必る。このプラスミドｐＧＨ５４を保有する大
腸菌８８１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、ｒＨＢｌ　０１　（ｐ　ＧＨ５４〕」な
る表示で、微工研条奇第６７９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
６７９）として寄託されている。 １）ＧＨ５５は、上記ＤＧＨ５４における第２のｐ　ｖ
ｕ　ｆｌ制限サイトを含む６３７塩基のＤＮＡを欠失し
、第１のｐｖｕ［制限サイトをシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列の３′末端付近に有する以外は、
該１）ＧＨ５４と共通しており、その特性は、その製造
概略操作と共に第２図に示すた通り、図示された制限酵
素開裂地図により特徴付けられ、大きさは約３．３ｋｂ
である。このプラスミドｐＧＨ５５を保有する大腸菌８
８１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所にｌｔ−ｌＢ１０１　（ｐ　ＧＨ５５）Ｊなる表示
で、微工研条奇第６８０号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８０
＞として寄託されている。 １）ＵＧ２０１は、大きさ約３．７ｋｂであり、β−ラ
クタマーゼのプロモーター、リボゾーム結合部位、開始
コドンを含むβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドのＤ
ＮＡ塩基配列、β−ウロガストロンのＤＮＡ塩基配列、
その停止コドン及び転写終結信号が正確にこの順序で配
列されたＤＮＡ塩基配列を有している。その配列は、後
記第４表に示す通りである。該プラスミド１）ＵＧ２０
１を保有する大腸菌Ｈ８１０１株は、ｒＨＢｌｏｌ（ｐ
　ＵＧ２０１　）Ｊなる表示で、微工研条奇第６８１号
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−６８１＞として寄託されている。 ｐＵＧＴ１５０は、大きざ約３，９ｋｂであり、１）Ｕ
Ｇ２０１の配列から、β−ラクタマーゼのプロモーター
及びリポゾーム結合部位を除き、代りにベクターｐ　Ｄ
Ｒ５４０（Ｄ、Ｒ，Ｒｕ５ｓｅｌｌとＧ。 Ｎ、　Ｂｅｎｎｅｔｔ、、Ｇｅｎｅ　、　２０．２３１
−２４３（１９８′２））に含まれるｔａｃプロモータ
ーと、これに付属するｌａｃオペレーター及びリボゾー
ム結合部位が挿入されたベクターでおる。該ベクター構
築の詳細は、後記参考例に述べる通りでおり、またその
概略図を第５図に示す。該Ｃ）ＵＧ１５０を保有する大
腸菌ＪＭ１０３株は、ｒＪＭ１０３（ｐ　ＵＧＴｌ　５
０）Ｊなる表示で、微工研条奇第９７４号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−９７４）として寄託されている。 上記Ｉ）ＵＧ２０１　、ｐＵＧＴｌ　５０においては、
之等各ベクターにより生成されるｍ　ＲＮＡは、β−ラ
クタマーゼのシグナルペプチドのＮ端アミノ酸に相当す
る、メチオニン（Ｍｅｔ）をコードする開始コドンの上
流から転写が開始され、シグナルペプチド部分、β−ウ
ロガストロン部分を経て、更にその下流へと転写がなさ
れ、転写の終結は、２等ベクターの起源ベクターである
１）ＢＲ３２２におけるβ−ラクタマーゼの遺伝子の転
写終結信号によりなされる。その位置は、β−ウロガス
トロンをコードするＤＮＡ塩基配列末端の停止コドンの
下流的０．６ｋｂ付近であると考えられる。 ｍ　ＲＮＡは転写が終結して始めて機能すると考えられ
るため、遺伝子の下流に転写終結信号を有することは該
遺伝子の発現にとり必須で必り、上記ｐ　ＵＧ２０１等
ではこの転写終結信号としてβ−ラクタマーゼの発現に
関するｍ　ＲＮＡ転写の終結のための信号を利用してい
るが、これは同様の機能を有する他の公知のＤＮＡ塩基
配列、例えばλファージのＬｌや大腸菌のｔｒｐＡ転写
終結信号　　　。 等に代替することができる。 上記各種の起源ベクターを利用して本発明誘導体発現ベ
クターを創製する方法は、より具体的には、例えば以下
のごとくして実施される。 即ち、本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜工＞発現ベ
クターｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇは、例えば上記プラスミ
ドｐＵＧＴ１５０から、常法に従い、制限酵素を用いる
酵素反応やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる酵素反応等を利
用して有利に製造することができる。より詳しくは、上
記Ｄ　ＵＯ３、ｐＵＧ２０１．１）ＵＧＴｌ　５０等に
おいては、β−ウロガストロンのＤＮＡ塩基配列の３′
末端側に制限酵素５ａｕ３ＡＩの切断部位があり、また
この３′末端の下流に制限酵素ＢＣｉＩｎ等の切断部位
がある。 従って、之等の制限酵素切断部位を利用して、同制限酵
素で各々切断され且つ誘導体＜Ｉ＞をコードし得るよう
に設計及び化学合成したＤＮＡ断片を、上記各プラスミ
ドの酵素による切断個所に挿入することにより、容易に
一工程で所望の遺伝子（Ｉ＞を有し且つ誘導体＜Ｉ＞を
発現できるベクター、即ちｐｌＪＧＴ１５０　　Ｇを収
得することができる。更に本発明誘導体〈■〉発現ベク
ターは、遺伝子＜Ｉ＞と他の適当な蛋白質のＤＮＡ塩基
配列とを結合させた融合蛋白をコードするＤＮＡ塩基配
列を調製して、融合蛋白発現ベクターとしてもよい。 上記本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜工＞発現ベク
ターの溝築の具体例は、後記実施例に示す通りであり、
これにより得られたベクターは、ｒＪＭ１０３　（ｐ　
ｔＪＧＴｌ　５Ｏ−Ｇ）Ｊなる表示で、微工研条奇第１
０８４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８４）として寄託さ
れている。 本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜ｎ＞をコードする
遺伝子＜ｎ＞及びこれを有する発現ベクターは、例えば
上記で調製されたベクター０ＵＧＴ１５０−Ｇと、別個
に同様にして調製される１）ＵＧＴ１５０−■とを利用
して製造することができる。 ここでプラスミドｐ　ｔＪＧＴｌ　５０−Ｖの調製につ
き詳述すれば、該プラスミドは、公知のプラスミドｐ　
ＵＧｌに含まれるサブユニットＡの作成に当り、まずそ
の２１位の置換アミノ酸（Ｖａ！＞に対応するコドンを
有するオリゴヌクレオチドを化学合成後、これをその他
のサブユニット八を構成するオリゴヌクレオチドと結合
させてサブユニットへの誘導体とし、このサブユニット
Ａ誘導体をプラスミドｐ　ＢＲ３２２に組込んでプラス
ミド１）ＵＧｌ−Ｖを作成し、次いで得られるｐＬＩＧ
ｌ−■をプラスミドｐ　ＵＧ２と結合させることにより
製造されるプラスミドＩ）ＵＧ３−Ｖと、前記プラスミ
ドＩ）ＵＧＴｌ　５０とを用いて、前記した遺伝子組換
え技術における常法に従い製造される。 また上記プラスミドｐＵＧ３−Ｖは、目的遺伝子配列の
５′末端に開始コドンとなり得るＭｅｔのコドン（ＡＴ
Ｇ＞が付加されているため、その上流に前記特開昭６１
−１４５９１号公報に記載の方法に従い、λＰＬプロモ
ーター等のプロモーター及びリボゾーム結合部位等を有
するＤＮＡ塩基配列を結合させることによっても、上記
１）ＵＧ丁１５０−Ｖと同等の発現ベクターとすること
ができる。 上記のごとくして得られるプラスミドｏ　ＵＧＴ１５０
−Ｖと前記１）’ＵＧＴ１５０−Ｇは、互いに殆んどの
ＤＮＡ塩基配列が共通であり、ただ１）ＵＧＴｌ　５０
−Ｖにおいて２１位のＭｅｔがＶａｔに置き換えられた
部分（■ａ１２１領域）と、Ｄ　ＵＧＴ’＋　５０−Ｇ
において５３位のＡｒ（］が（３Ｉｎに置き換えられた
部分（Ｑｌｎ５３領域）が異なるのみでおる。しかして
、上記２つの領域間には、制限酵素１−１ｉｎｄＩ［１
、ＭＩＬＩＩ等の切断点が共通して存在している。従っ
て、１）ＵＧＴＩ　５０−■とｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇ
とのそれぞれを、例えばＣ１ａ工で切断して得られるＤ
ＮＡ断片の内、■ａ１２１領域を含むＤＮＡ断片と、Ｑ
ｌｎ５３領域を含むＤＮＡ断片とを結合させれば、所望
の誘導体＜ｎ＞発現ベクターが得られる。かくして得ら
れる誘導体＜ｎ＞発現ベクターは、ｒＪＭｌ　０３　（
ｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧ）Ｊなる表示で、微工研条寄
第１０８５号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８５＞として寄
託されている。 更に、本発明のβ−ウロガストロン誘導体＜ｍ＞をコー
トする遺伝子＜ｍ＞及びこれを有する発現ベクターは、
例えばまず前記ｏＵＧＴ１５０−Ｖの調製と同様にして
、２１位が１−ｅｕでめるβ−ウロガストロン誘導体を
コードする遺伝子を含むベクターｏ　ＵＧＴｌ　５０−
Ｌを作成し、該ベクターと上記ｐＵＧＴ１５０−Ｇとを
利用して、上記誘導体＜ｎ＞発現ベクターの製造と同様
にして製造することができる。即ち、ｐＵＧＴＩ　５０
−ＬとＤ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇとは、１−ｅｕ２”領域
とＱｌｎ５３領域とが互いに異なる以外は、共通したＤ
ＮＡ塩基配列を有し、２つの領域間には、ＭＩｕＩ、）
−１ｉｎｄｌＩＩ等の制限酵素による切断点が共通に存
在しているため、之等をそれぞれ例えばＭＩｕＩで切断
し、更に例えばＣ１ａ■で切断して得られるＤＮＡ断片
のうちｊ−ｅｃ＋”領域とＱｌｎ５３領域を含むＤＮＡ
断片を結合させれば、所望の誘導体＜ｍ＞をコードする
遺伝子＜ｍ＞が得られ、同時に該遺伝子を発現するベク
ター１）　ＵＧＴ１５０−ＬＧが得られる。このベクタ
ーは、ｒＪＭ１０３　（ｐ　ＵＧＴ１５０−ＬＧ）Ｊな
る表示で、微工研条奇第１０８６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１０８６＞として寄託されている。 上記のごとくして得られる本発明誘導体をコードする遺
伝子を含有する発現ベクターは、之等を適当な宿主細胞
に導入して、該宿主細胞を形質転換させることにより、
本発明誘導体産生能を付与することができる。ここで用
いられる宿主細胞としては、特に限定はなく、公知の各
種のもの、例えば大腸菌等のグラム陽性細菌、枯草菌等
のグラム陽性細菌、放線菌、酵母、動植物細胞等のいず
れでもよいが、特に大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株
（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　　Ｄ、　Ｒｏｕｌｌ
ａｎｄ−［）ｕｓｓｏｉｘ、、Ｊ、　ＭＯ＋、　１３ｉ
ｏ１．、旦、　４５９−４７２　（１９６９））及びＪ
Ｍ１０３株（Ｊ。 ＭｅＳＳｉｎｇｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　ＡＣ
ｉｄＳ　　Ｒｅｓ、、９゜３０９　（１９８１））は好
ましい。 上記宿主細胞への本発明ベクターの導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法例
えば宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で
処理し、該溶液中にベクターを添加する方法（Ｅ、　ｌ
−ｅｄｅｒｂｅｒｇ　　ａｎｄ　Ｓ。 Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．
１０７２（１９７４））等を例示できる。 上記のようにして、本発明ベクターの導入により形質転
換した細胞を収得することができ、本発明は、かかる形
質転換された宿主細胞をも提供するものでおる。 本発明の上記ベクターにより形質転換された細胞は、通
常の細胞を培養するために用いられる適当な培地を用い
て培養することができ、該培養により所望のβ−ウロガ
ストロン誘導体が生産、蓄積される。上記培養に利用で
きる培地としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、
Ｍ６３培地等の各種の培地を好ましく用いることができ
る。また之等の培地には、更に通常知られている各種の
炭素源、窒素源、無懇塩、ビタミン類、天然物抽出物、
生理活性物質等を添加することもでき、かかる培地も好
ましく利用できる。培養は、前記宿主細胞の生育に適し
たｐＨ，温度、通気、撹拌等の条件を採用した各種の方
法により実施できる。 例えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜８の範囲、特にｐ
Ｈ７が適当であり、約２０〜４３℃の温度で、通気撹拌
条件で培養することが望ましく、培養のスケールには特
に限定はない。更に目的とするβ−ウロガストロン誘導
体の発現口乃至分泌量を高めるため、また菌体外への目
的誘導体の排出を促進乃至抑制する目的等に応じて上記
培地組成や培養条件等は適宜変更設定することもできる
。 上記培養により、例えばシグナルペプチドとβ−ウロガ
ストロン誘導体との融合ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含有させた本発明ベクターで形質転換した
細胞では、細胞質内で融合ポリペプチドが生産され、続
いて細胞外又はペリプラズムに目的のβ−ウロガストロ
ン誘導体が成熟ポリペプチドの形で分泌蓄積される。即
ち、まず、ベクター中の融合ポリペプチドをコードする
遺伝子から、ベクター中の転写調節因子並びに宿主細胞
中の諸因子の作用でｍ　ＲＮＡが生産される。 次いで、ｍ　ＲＮＡから翻訳調節因子並びに宿主細胞中
の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産される。更
にここで生産される融合ポリペプチドは、シグナルペプ
チドの作用により、細胞外又はペリプラズムに分泌され
、同時にシグナルペプチダーゼの作用により、融合ポリ
ペプチドからシグナルペプチドが切り離されるのである
。その結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不
要なアミノ酸配列をも含まない成熟ポリペプチドが細胞
外又はへりブラズムに分泌、蓄積される。またシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を付さない本発明
ベクターで形質転換した細胞では、通常目的のβ−ウロ
ガストロン誘導体は細胞内に生産、蓄積さる。 かくして、宿主細胞の細胞膜、ペリプラズム等の内部又
は培養上澄等に蓄積された目的誘導体は、これを常法に
従い分離することができ、また精製することができる。 この分離、精製操作は、例えば培養上澄、浸透圧ショッ
ク法により調製したペリプラズム画分、超音波破砕によ
り調製した細胞内画分等につき、ゲル済過、吸着クロマ
トグラフイー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー等を適宜組合せる方法により実施
することができる。特にペリプラズム中又は培養上澄に
分泌されるものは、上記分離、精製が比較的容易で必る
利点がある。 かくして、本発明によれば、遺伝子組換え技術により、
β−ウロガストロン誘導体を製造できる。 得られるβ−ウロガストロン誘導体の確認は、該誘導体
が免疫学的に、また生物化学的に天然型β−ウロガスト
ロンと略々同一の挙動を示すものであるため、β−ウロ
ガストロン特異ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、β−
ウロガストロン特異エンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ
）、ラジオリセプターアッセイ（ＲＲ）等の手法による
ことができる。 また、本発明誘導体が高純度に精製されたことは、例え
ば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単
一ピークになること、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（ＰＡＧＥ）で単一バンドになること等を指標として
容易に確認することができる。該高純度精製β−ウロガ
ストロン誘導体の同定は、また通常のポリペプチド乃至
は蛋白質の構造解析手段と同様の手段により実施できる
。即ち本発明誘導体は、ＳＤ、５−ＰＡＧＥによる分子
量分析、等電点電気泳動による等電点測定、アミノ酸分
析機によるアミノ酸組成の測定、アミノ酸シークエンサ
ーによるアミノ酸配列の解析等により同定することがで
きる。 ざらに、本発明β−ウロガストロン誘導体の生物活性は
、例えば以下の方法により天然型β−ウロガストロンと
対比することができる。 ■　細胞増殖促進活性 ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３等の培養細胞又は成熟ラット肝臓
細胞等の初代培養細胞等を、無血清条件下にβ−ウロガ
ストロン誘導体又は天然型β−ウロガストロンを添加し
て培養し、培養液中に標識されだチミジン−５′−三リ
ン酸等を加えることにより、新たに合成されたＤＮＡ中
に取込まれるラジオアイソトープの量を測定する。この
ラジオアイソトープ量に比例して、新たなりＮＡ合成が
行なわれたこと、即ち細胞の増殖が促進されたことが判
る。 ■　新生仔マウス眼瞼開裂及び切歯閉出促進活性新生仔
マウスに、β−ウロガストロン誘導体又は天然型β−ウ
ロガストロンを２４時間毎に皮下注射し、各被検動物の
眼瞼が開裂する日及び切歯の出現する日を記録する。β
−ウロガストロン（ヒトＥＧＦ）　、マウスＥＧＦ等は
、之等に要する日数を短縮できることが知られている（
Ｓ。 Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、、　　
２３７．１５５５−１５６２　（１９６２））。 また、本発明β−ウロガストロン誘導体と、天然型β−
ウロガストロンとの安定性の対比は、例えば人、ラット
等の動物の血清に、一定量の被検物質を添加し、一定温
度で一定時間放置した後、ＨＰＬＣ，ＲＩＡ等の手法を
用いて血清中の被検物質の残存量の測定により実施でき
る。 実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考例及び実施
例を挙げる。尚、８例において用いられる各方法及び操
作は、特に明記しない限り、以下の通り行なわれたもの
とする。 １、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第１表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、３７℃の水浴中で３時間静置して反
応させる。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μｇに
対して１ユニツトであり、最終液量は１０μＱ以上とな
るようにする。 第１表 組　　成　　　低塩濃度　生塩濃度　高塩濃度（ｍＭ）
　　　　緩衝液　　緩衝液　　緩衝液塩化ナトリウム　
　　　０　　　５０　　１００トリス塩酸 （１）Ｈ７，５）　　　　　１０　　　１０　　　５０
塩化マグネシウム　　１０　　　１０　　　１０ジチオ
スレイトール　　１　　　１　　　１２、フェノール抽
出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０＞緩衝液をフェ
ノールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、同
じく半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで遠
心分離してＤＮＡの含まれる緩衝液層を取る。更に０．
１倍量の３Ｍｒ！！￥酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０
）と２倍量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０
℃で１時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収するこ
とによりフェノールを完全に除去する。 ３、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合（環
状化）操作 ６６ＩＩＩＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ７，５＞、６．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１
ｍＭ　　ＡＴＰに０．０１％の牛血清アルブミンを添加
した水溶液中で、ＤＮＡ断片と、その１μｇ当り３ユニ
ツトとなる量のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造■製）とを
、１２°Ｃで５時間以上反応させることによりＤＮＡを
結合（環状化）させる。 ４、ＤＮＡ修飾酵素の使用方法 （１）ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片によるＤＮ
Ａのプラントエンド化 ４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，４）、ｅｍＭＪｉ化
マグネシウム、１ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、
１ｍＭ　　ＡＴＰ及び各１ｍＭのｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴ
Ｐ、ｄ　ＧＴＰ及びｄ　ＴＴＰを含む水溶液中に、ＤＮ
Ａを溶かし、ＤＮＡ１μｇに対して１ユニツトとなる量
のＤＮＡポリメラーゼ工（クレノー断片、宝酒造■製）
を加え、１２°Ｃで３０分間反応させ、必要に応じてフ
ェノール抽出を行なう。 （２）３１ヌクレアーゼによるＤＮＡのプラントエンド
化 ＤＮＡ１μ９につき、６ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ
塩化ナトリウム及び１ｍＭ硫酸亜鉛を含む緩衝液（ｐ　
Ｈ４，５＞１００μＱを用いて、上記ＤＮＡの緩衝液溶
液を作成し、これに２０００ユニツトの８１ヌクレアー
ゼ（ＢＲＬ社製）を加えて２０’Ｃで３０分間反応させ
、反応終了後、フェノール抽出を行ない酵素を完全に失
活させる。 （３）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ５’
端のリン酸化 １〜１０μｇのＤＮＡを、１０ｍ　Ｍ塩化マグネシウム
、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰを含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，５＞５０μＱに溶かし
、これにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５ユニットを加
え、３７℃で３０分間反応させ、次いでフェノール抽出
により酵素を失活させる。 ５、形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌に１２株由来の８８１０１株
又はＪＭ１０３株を用いる。 宿主細胞株を、［Ｂ培地（１％バクトドリプトン、０．
５％バクトイ−ストエキス、０．５％塩化ナトリウム）
で、３７°Ｃ下、６１０ｎｍの吸光度が０．２５になる
まで増殖させる。この培養液４０ｍ１２を遠心分離（６
０００回転／分Ｘ１０分）して菌体を回収し、次いで氷
冷する。これを０．１Ｍ塩化マグネシウム２０ｍＱで洗
浄し、続いて氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．
０５Ｍ塩化マグネシウム溶液２０舶に懸濁させ、１時間
氷冷する。遠心分！　（６０００回転／分Ｘ１０分）後
、菌体を氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５
Ｍ塩化マグネシウム溶液２ｍｆ２に再懸濁させる。この
懸濁液０．２ｍ１２に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させたＤＮＡ断片の反応組成液０．０１ｍｆ２を加え
、１時間氷冷する。次いで４２．５℃の水浴で９０秒間
加温し、ＬＢ培地２．１を加え、これを３７℃の水浴中
で１時間静置する。 次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選択
する。即ち、１．５％寒天を含むＬＢ培地にアンピシリ
ン５０μ９７ｍＱ又はテトラサイクリン２０μｇ／ｍＱ
を添加して調製した平板培地に、上記で得た反応組成液
の溶液各０．３１１１１２ずつを拡げ、これを３７℃で
二晩培養し、生育する大腸菌コロニーを分離する。 ６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０μｇ／
ｒｒ、Ｑ又はテトラサイクリン２０μｇ／＋ｒ４を添加
したＬＢ培地５００−で、６１０ｎｍでの吸光度が約０
．６になるまで３７°Ｃで振盪培養する。 次いでクロラムフェニコール８０ｍｇを加え、３７℃で
１２〜１６時間振盪培養する。これを遠心分！！！　（
６０００回転／分Ｘ１０分）して菌体を集め、０．８５
％塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。菌体を２０％蔗糖
を含む５０ｍＭトリス塩！１（ｐＨ８，０）緩衝液２．
５謂に懸濁させ、次に１％リゾチームを含む０．２５Ｍ
トリス塩酸（ｔ）　Ｈ８、Ｏ）緩衝液０．５ｍ１２を加
え、１０分間氷冷する。更に０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　
（ｐ　Ｈ８，０）１回を加え、１０分間氷冷する。次に
６ｍＭトリス塩酸（Ｄ　Ｈ８，０）　、６０ｍ　Ｍ　　
ＥＤＴＡ及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液４戒を
加える。 これを超遠心（２５０００回転／分Ｘ９０分）して上清
を採取する。この上清８．２１１＋１２に塩化セシウム
９．○Ｑを加えて溶かし、次いで１％エチジウムブロマ
イド溶液０．８ｍＱを加える。これを遠心分離（２００
０回転／分Ｘ１０分）して浮遊物を除き、溶液を超遠心
（５００００回転／分Ｘ１５時間）する。次いで紫外線
照射により螢光を発するプラスミド部分を分離する。こ
れを５Ｍ塩化ナトリウム溶液で飽和したイソプロパツー
ルで５〜６回抽出してこれからエチジウムブロマイドを
除去する。最後に１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス塩酸（ｐ　Ｈ８，０＞緩衝液に対して透析して塩化
セシウムを除去する。 ７、オリゴヌクレオチドの合成 下記に示す同相合成法（固相リン酸トリエステル法）ニ
ヨリ行なった（Ｈ，Ｉｔｏ　　ｅｔ　　ａｌ。 Ｎｅｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１０．１７５５−１７６９　（１９８２））。 即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂５−Ｘｌ（２００
〜４００メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）を
アミノメチル化したものと、５′−〇−ジメトキシトリ
チルヌクレオシドのモノコハク酸エステルとを反応させ
て、ヌクレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社
製ＤＮＡ合成殿を用いて以下の操作を行なう。 上記樹脂４０ｍ（］を反応管に入れ、１Ｍ臭化亜鉛のジ
クロロメタン−イソプロパツール（８５：１５）溶液を
用いて５′位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次
に完全に保護されたジヌクレオチド（Ｃ，Ｂｒｏｋａ　
　ｅｔ　　ａｔ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、旦、５４６１−５４７１　（１９８０）
の方法により調製した〕のトリエチルアンモニウム塩５
０ｍＣｌを加え、縮合剤（メシチレンスルホニル−５−
ニトロトリアゾール）を用いて縮合させる。以上の操作
を繰返して、順次鎖長をのばして、保護されたオリゴヌ
クレオチドを担持した樹脂を得る。尚、最後の縮合工程
では、必要に応じてジヌクレオチドの代りに、前記文献
に記載の方法により調製されるモノヌクレオチドのトリ
エチルアンモニウム塩２５ｍｇを使用する。 次に０．５Ｍピリジンカルドキシメートのピリジン−水
（１：１）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチ
ドを樹脂から脱離させる。これをセファデックスＧ−５
０カラム（ファルマシア社製、２Ｘ１００Ｃｍ）で、更
に高速液体クロマトグラフィー（ポンプ；ウォーターズ
社１６０００Ａ型、検出器；４４０型デイテクター、カ
ラム；マイクロボンダーパックＣ１８、溶出溶媒；（５
→４０％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム水溶液）で精製する。次に８０％酢酸により
脱保護反応を行ない、再度高速液体クロマトグラフィー
により単一ピークになるまで精製する。この高速液体ク
ロマトグラフィーの条件は、溶出溶媒として（５→２５
％）アセトニトリル−０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウム水溶液を用いる以外は、上記と同一とする。 ８、ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
の方法（Ｍ２Ｓ法、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｌ：ｎｚｙｍｏ
ｌ、、１０１゜２０（１９８３＞）に従い、以下のよう
に行なった。即ち、まずＤＮＡ断片を制限酵素により切
り出し、１％アガロースゲル電気泳動により分難する。 このＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ８ＲＦ（アマ−ジャム社製
）をベクターとしてクローニングする。 得られる組換えファージＤＮＡをマンデル（Ｍａｎｄｅ
ｌ　）とヒガ（Ｈｉｇａ）の方法（Ｊ、　Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、、５３，１５４　（１９７０））により、大
腸菌ＪＭ１０７株へ形質導入する。この菌体懸濁液０．
２ｍ１２に、２５ｍ（］／ｍ１２のイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド（以下ｒＩ　ＰＴＧＪという）２
５ｔｌＱ及び２０ｍＭｍ１２の５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド４０μＱを加
えた。次いでこの菌体懸濁液に、予め加熱溶解させ次い
で５０’Ｃで保温したＨ−トップアガー液（１％バクト
ドリプトン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５％寒天
）３鵬を加え、１．５％寒天を加えて固化させた２ＸＹ
下培地（１，６％バクトドリプトン、１％酵母エキス及
び０．５％塩化ナトリウム）の平板に重層し、３７°Ｃ
で一晩培養する。ＤＮＡ断片の挿入された組換えファー
ジは無色のプラークを生じるのに対し、親株のＭ１３ｍ
ｌ）８は青色のプラークを生じるので、目的の組換えフ
ァージは容易に選別できる。 次に単一の無色プラークをパスツールピペットにて取り
出し、これとＪＭＩ０３株の培養液０．０１ｍ（２とを
２ＸＹＴ培地１噌に加え、約５時間、３７°Ｃで撮ｆｉ
培養して組換えファージを増殖させる。培養後、遠心に
て菌体を除き、上清に２０％ポリエチレングリコール６
０００の０．２鵬を混合し、室温で１５分以上静置した
復、遠心にて沈澱するファージを集め、フェノール抽出
によって、ファージから一本鎖ＤＮＡを抽出し、これを
鋳型−重鎖ＤＮＡとして用いる。 鋳型−重鎖ＤＮＡと、ブライマー（宝酒造■製、Ｍ１３
の１５塩基プライマー（５’　ＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
ＴＧＴＡ　３’　　））との各々０．５ｐ　ｍｏｌずつ
を混合し、６０’Ｃで２０分間熱処理後、徐冷する。次
にこの混合液にα３２Ｐ−ｄ　ＣＴＰ（アマジャム社製
、４００Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　＞　２ｕＱとＤＮＡポリ
メラーゼ■（クレノー、宝酒造■製）２ユニツトとを加
え、充分に混合した後、その３．２μＱずつを、下記第
２表に示した４種のｄ　ＮＴＰ−ｄｄＮＴＰ混合液のそ
れぞれ２μＱを含む反応管に加える。室温で２０分間反
応させた後、チェース反応液（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＣＴＰ
、ｄ　ＧＴＰ及びｄ　ＴＴＰの各１ｍＭ）の１μＱをそ
れぞれに加え、更に２０分間反応させる。ホルムアミド
停止液（９５％Ｖ／Ｖホルムアミド、０．１％キシレン
シアノール及び０．１％ブロムフェノールブルー）を６
μＱずつ加え、９５°Ｃで３分間加熱した後、急冷する
。次にサンプル２μＱずつを６％又は８％ポリアクリル
アミドゲルにより電気泳動（１８００Ｖ、３０ｍＡ、２
〜３時間〉を行なう。 泳動後、ゲルを濾紙（ワットマン３ＭＭ＞に移し、ゲル
乾燥器にて乾燥し、オートラジオグラムをとり、ＤＮＡ
塩基配列を解読する。 第　　２　　表 （単位：μＱ） 但し第２表中、ｄｄＡはジデオキシアデノシンを、ｄｄ
ｅはジデオキシシチジンを、ｄｄＧはジデオキシグアノ
シンを、またｄｄＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示
す。 ９、アガロースゲル電気泳動 シュライフ（Ｓｃｈｌｅｉｆ）とウエンシンク（Ｗ　ｅ
ｎｓ　ｉ　ｎｋ　＞の手引書（”　ｐｒａｃｔｉｃａｌ
　　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ”　　（１９８１）　。 ３ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ｐｐ１１４−１２
５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気泳動及
び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。 泳動用電源としては、アトー社製コンスターパワー５Ｊ
１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５ｃｍのプラス
チック製水槽（白金型極付）を、アガロースとしてはア
ガロース■（聞伝化学研究所製）を、また泳動用緩衝液
としては４０ｍＭトリス塩酸（５ｍＭ酢酸ナトリウム及
び１ｍＭ　　ＥＤ丁Ａ含有、ｐＨ７，９）をそれぞれ用
いる。 １０、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上記手引書の第
７８−８７頁及び第１１４−１２５頁に記載の方法に従
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び泳動後のゲル
からのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動用電源としては
、アトー社製コンスターパワー５Ｊ１０６５型を、泳動
槽としてはアト−社製５Ｊ１０６０ＳＤ型を用いる。 アクリルアミド溶液として、アクリルアミドとＮ。 Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：１）との水
溶液を、重合促進剤としてＮ、Ｎ、Ｎ’　。 Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
して過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。 また泳動用緩衝液として２．５ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡを含
有する９０ｍＭトリスホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，３）を
用いる。 参考例１ ■）ベクタープラスミドＤＧＨ５４及びＤＧＨ５５の構
築 （Ａ＞　　中間体プラスミドｐＧｌ−１５３の構築■　
大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドの一部を
コードするＤＮＡ塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
の合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオリゴ
ヌクレオチドのそれぞれを、前記した固相リン酸トリエ
ステル法により合成した。 ＜１＞　　　（５’　　＞ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧ
ＣＣＴ丁ＣＣＴＧＴＣ（３’　＞ ＜２＞　　　　　　　　ＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡＧＣ
ＧＣＡ ＜３＞　　　　　　ＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡＡＣ
ＡＧ ＜４＞　　　　　　ＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＴ 上記オリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉の５′端をそ
れぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーピ（ＢＲＬ社製）を
用いてリン酸化した。 ■　クローニングベクターとして、プラスミドＤ　ＢＲ
３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ｇｅｎｅ
　、　２゜９５−１１３　（１９７７））を利用した。 該プラスミドｐＢＲ３２２の１０μＱを、制限酵素ＰＳ
ｔＩ　（宝酒造■製）とＰｖｕＩ（ＮＥＢ社製）とを用
いて高塩濃度綴衝液中で切断し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約４．２４ｋｂのＤＮＡ断片を分
離した。 ■　上記■で得たＤＮＡ断片を、上記■で調製されたリ
ン酸化したオリゴヌクレオチド〈２〉及び〈４〉並びに
リン酸化していないオリゴヌクレオチド〈１〉及び〈３
〉のそれぞれ約１μｇずつと合せて、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合反応させた。 反応終了後、この反応組成液で大腸菌に一１２株由来の
Ｈ８１０１株を形質転換させた。得られたテトラサイク
リン耐性を示す形質転換株の中から１株を選び、これか
らプラスミドを単離し、目的のｐＧＨ５３を得た。 一連の操作の概略は第１図に示す通りでおる。 得られたｐ　ＧＨ５３は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、４，３ｋｂの大きざを有しており、そのＤ
ＮＡ塩基配列をＭ１３法により分析した結果、１）ＢＲ
３２２のｐＳｔＩ及びＰｖｕＩの両制限サイト間が欠失
し、代りに次に示すように、オリゴヌクレオチド〈１〉
、〈２〉、〈３〉及びく４〉が挿入されていることが確
認された。 該ｐＧＨ５３を保有するＨ８１０１株は、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所にｒＨＢｌｏｌ　（ｐ　
ＧＨ５３）Ｊなる表示で微工研条寄第６７８号（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−６７８＞として寄託されている。 （Ｂ）　　ベクタープラスミドｐＧＨ５４の構築■　上
記（Ａ）で得たＩ）ＧＨ５３の１０μｇを制限酵素Ｎａ
ｅＩ＜ＮＥＢ社製）及びＡＶａＩ（宝酒造■製）を用い
て生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロー
スゲル電気泳動を行なって、約２．２２ｋｂのＤＮＡ断
片＜Ａ＞を分離した。 この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のＤＮＡ配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。 ■　ｐＢＲ３２２を制限酵素Ａｖａ■及びｌ−１ｉｎｄ
Ｉｌｌ（いずれも蜜酒造（ｉＩ製）で、生塩濃度緩衝液
を用いて切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行
なって、約１．４０ｋｂのＤＮＡ断片＜８＞を得た。 この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部及びその構造遺伝子の全てが含まれている。 ■　１）ＢＲ３２２の２０ｉを制限酵素ＦｎＬＩ４ＨＩ
　（ＮＥＢ社製）で低塩濃度緩衝液を用いて切断し、次
いでＳ１ヌクレアーゼによりＤＮＡ断片末端の突出塩基
を分解除去した。次いで、得られたＤＮＡを制限酵素）
−１ｉｎｄＩ［［を用いて生塩濃度緩衝液中にて切断し
、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約０
．２８ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｃ＞を得た。 この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝子
の一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ーの一部が含まれている。 ■　上記で得た３つの断片＜Ａ＞、（Ｂ＞及び（Ｃ）を
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、こ
の反応組成液でＨ８１０１株を形質転換した。得られた
テトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を
選びプラスミドを単離した。かくしてｐＧＨ５４を得た
。 ｐＧＨ５４は、Ｍ　１３法による塩基配列分析の結果、
β−ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部
位に続いてシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列を有し、この塩基配列の３′末端の上流側にＮｒｕｌ
：及び下流側にＰ　ｖｕ　ＩＩのそれぞれの制限酵素認
識配列を有していることが確認された。 一連の操作の概略は、第２図に示される通りである。 Ｅ）ＧＨ５４は、前記した通り約３，９ｋｂの大きざ及
び第２図に示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、
またＭ　１３法による塩基配列分析の結果、下式（２）
に示した塩基配列によりコードされるβ−ラクタマーゼ
シグナルペプチドの遺伝子を有することが確認された。 ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＣＴＧ　　（２＞（Ｃ）　　ベクタープラスミドｐＧ
Ｈ５５の構築■　ｐＢＲ３２２のＡＶａＩ及びｐｖｕｌ
制限サイト間の塩基配列を欠失させたプラスミドである
ｆ）ＢＲＨＯ２を次の操作により作成した。即ちｔ）Ｂ
Ｒ３２２の５μｇを、生塩濃度緩衝液中で、制限酵素Ａ
ＶａＩ及びＰＶｕＩＩ（いずれも宝酒造■製）で切断し
、フェノール抽出後、ＤＮＡポリメラーｔＸのクレノー
断片（宝酒造■製）で切断断片をプラントエンド化した
。次に１．０％アガロースゲル電気泳動で約３．７２ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分離し、この断片をＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼで環状化させた。反応終了後、この反応組成液で８
８１０１株を形質転換し、得られるアンピシリン耐性及
びテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から一株
を選択してプラスミドを単離しｐ　ＢＲＨ０２を得た。 得られたｐ　ＢＲＨＯ２はｐＢＲ３２２とは異なって、
ＡＶａＩでもＰＶＩＪＩＩでも切断されなかった。 ■　上記■で得たｐ　ＢＲＨ０２の５μｇを制限酵素ｐ
ｓｔ■及びＢａｍＨＩ（いずれも宝酒造■製）を用いて
生塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行なって、約２．６０ｋｂのＤＮＡ断片
＜Ｄ＞を分離した。 この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及びプ
ラスミドの複製開始領域を含んでいる。 ■　Ｉ）ＧＨ５４の１０μＱを制限酵素ｐｓｔ工及びＢ
ａｍＨＩを用いて生塩濃度緩衝液中にて切断し、次いで
１．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．６６
ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｅ＞を得た。 この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。 ■　上記で得た２つの断片＜Ｄ＞及び（Ｅ）を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応組
成液で８８１０１株を形質転換した。 得られたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中か
ら１株を選びプラスミドを単離した。かくしてｐＧＨ５
５を得た。 一連の操作の概略は、第３図に示される通りである。 ｐＧＨ５５は、上記第３図に示される制限酵素開裂地図
により特徴付（ブられ、１．０％アガロースゲル電気泳
動の結果、約３，３ｋｂの大きざを有していた。また該
ｐＧＨ５５は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、ｐ
ＧＨ５４における第２のｐｖｕ［制限サイトを含む約０
．６４ｋｂのＤＮＡを欠く以外は、該１）ＧＨ５４と同
様であり、その第１のｐｖｕ■制限サイトは、シグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列の３′末端の近傍
に存在していることが確認された。 ■）β−ウロガストロン発現ベクターの構築（Ａ）　　
β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列の合成 グレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ）により報告されたア
ミノ酸配列（Ｎａｔｕｒｅ、２５７．３２５−３２７（
１９７５））を参考にして、β−ウロガストロンをコー
ドするＤＮＡ塩基配列の前後に開始コドン、終止コドン
及び制限酵素認識部位を付加してなる所望のＤＮＡ塩基
配列を構築した。このＤＮＡ塩基配列は、本発明者らに
より既に特許出願されている〔特開昭６１−１５６９１
号公報参照〕。 （Ｂ）　　β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基
配列を保有するプラスミドの構築 ■　ｐＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩ制限サイ
ト間に、上記（Ａ）で得たβ−ウロガストロンをコード
するＤＮＡ塩基配列を挿入することにより、所望のプラ
スミドｐＵＧ３を得た（特開昭６１−１５６９１号公報
参照）。 このプラスミド１）ＵＯ３を保有するＨ８１０１株は、
ｒＨＢｌｏｌ　（１）ＵＯ３）ｊなる表示で微工研菌条
第５４３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５４３）として寄託さ
れている。 （Ｃ）　　１）ＵＧ２０１の構築 この操作の概略は、第４図に示す通りである。 上記（Ｂ）で得た１）ｔＪＧ３を制限酵素）１ｉｎｆＩ
Ｔ”切断して得られるＤＮＡ断片を、ｐＧＨ５５のｐ　
ｖｕ　ｆｌ制限サイトに挿入して、シグナルペプチド−
β−ウロガストロン融合ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を含むベクターで必るＩ）ＵＧ２０１を、以
下の方法により構築した。 ■　ｏ　ＵＯ３の１５μｇを、高塩濃度緩衝液中でＨｉ
ｎｆＩ　（蜜酒造は木製）で切断し、フェノール抽出後
、ＤＮＡボリメラーＬ’Ｈのクレノー断片で切断断片を
プラントエンド化した。次いで６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行ない、約０．４３ｋｂのＤＮＡ断片（
Ｆ）を単離した。 この断片には、β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ
塩基配列（翻訳停止コドンを含む）のうち５′端の７塩
基を除く塩基配列が含まれていた。 ■　ＤＧＨ５５は、β−ラクタマーゼのシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列の後に、β−ウロガスト
ロンのＮ端領域をコードする最初の７個のＤＮＡ塩基配
列が直結し、且つその直後で制限酵素ｐｖｕ［により切
断されるように構成されたＤＮＡ塩基配列を有するもの
であり、該ｐＧＨ５５の５μｇを生塩濃度緩衝液中で、
ｐ　ｖｕ　ｆｌで切断して、約３．２６ｋｂのＤＮＡ断
片＜Ｇ＞を得た。 この断片は、ｐＧＨ５５の全ての遺伝情報を有している
。 ■　上記■で得た断片（Ｆ）の約１μＱと上記■で得た
断片＜Ｇ＞の約０．５μＱとをＴｔ　ＤＮＡリガーゼで
結合させた。反応後、この反応組成液でトｌＢ１０１株
を形質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転
換株の中から一株を選び、プラスミド１）ＵＧ２０１を
単離した。 ｐ　ＵＧ２０１は、１．０％アガロースゲル電気泳動の
結果、約３，８ｋｂの大きさを有していた。 これをＢａｍＨＩ又は）−１ｉｎｄＩ［Ｉで切断すると
、それぞれ２種類のＤＮＡ断片が得られることから、該
ｐ　ＵＧ２０１にはβ−ウロガストロン遺伝子が含まれ
ていることが判り、また該断片の大きざを調べた結果よ
り、目的のプラスミドであることが判った。更に、ｐＵ
Ｇ２０１について、β−ラクタマーゼのプロモータ一部
分からβ−ウロガストロン遺伝子までを含むＤＮＡ断片
の塩基配列を、Ｍ１３法による塩基配列分析により調べ
た。その結果、該ＤＮＡ塩基配列は下記第３表の通りで
あり、ｐ　ＵＧ２０１がプロモーター、リポゾーム結合
部位並びにβ−ラクタマーゼのシグナルペプチドをコー
ドする塩基配列及びβ−ウロガストロンをコードする塩
基配列が、正確にこの順序で配列されていることが確認
された。また第３表にはＤＮＡ塩基配列に対応するアミ
ノ酸配列も併記する。 上記ｐ　ＵＧ２０１を保有する大腸菌ＨＢＩ　０１は、
ｒＨＢｌｏｌ　（ｔ）ＧＨ２０１）Ｊなる表示で通商産
業省工業技術院微生物工業研究所に寄託されている。そ
の寄託番号は、微工研条奇第６８１号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−６８１）でのる。 第　　３　　表 ＡＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴ
ＡＴＴＴＡ／リボゾーム結合部位 ＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡ下ＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧ
ＡＧ下ＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣ
ＴＴＣＴＣＡＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＡＣＧ
ＣＧ　　ＴＧＴ　　ＡＡＣＴＧＴＣＴＡＧ （Ｄ）　　ｐ　ＵＧＴｌ　５０の構築 ■　この例に従うＩ）ＵＧＴｌ　５０構築の概略図を第
５図に示す。ｔａｃプロモーターの起源ベクターとして
ｐ　ＤＲ５４０（ファルマシア社製〉を選択した。 該ｐ　ＤＲ５４０の１５μ９を、制限酵素Ｂａｍ）ｌ工
を用い、生塩濃度緩衝液中で切断後、得られたＤＮＡ断
片の末端を８１ヌクレアーゼにより平滑末端とし、次い
で制限酵素ＥＣＯＲ工を用いて、高塩濃度緩衝液中で切
断した。次に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、約０，３８ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｈ＞を得た。この
断片にはｔａｃプロモーター及びＳＤ配列が含まれてい
る。 ■　ｐＵＧ２０１の２２μｇを、制限酵素ＰＳｔＩ及び
ＥＣ０ＲＩを用いて、それぞれ生塩濃度緩衝液中及び高
塩濃度緩衝液中で切断した。得られたＤＮＡ断片のうち
、２μｇ相当分から、０．９％アガロースゲル電気泳動
により約２．９７ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｉ＞を得た。この
断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子及びベクターの
複製開始領域が含まれている。 ■　上記ＯＵＧ２０１をＰＳｔＩ及びＥＣ０ＲＩで切断
して得たＤＮＡ断片の残り２Ｑμｇ相当分を、制限酵素
ＭｂｏＩＩを用いて低塩濃度緩衝液中で部分切断した。 即ち、ＭｂｏＩＩＣＮＥＢ社製〉の１０ユニツトを反応
液中に加え、３７°Ｃで３０分間反応させることにより
、上記部分切断を行なった。次いで５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行ない、約０．４９ｋｂのＤＮＡ断
片（Ｊ）を得た。この断片にはβ−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列のうち、５′
末端の６塩基を欠く部分配列の３′末端にβ−ウロガス
トロンをコードするＤＮＡ塩基配列が連なった配列を含
んでいる。 ■　上記ＤＮＡ断片＜Ｊ＞において不足するβ−ラクタ
マーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
の５′末端より６塩基を含み、且つＤＮＡ断片＜Ｈ＞と
＜Ｊ＞どの接続の役割を果たす下記オリゴヌクレオチド
Ｉ−３及びＩ−４を、固相リン酸トリエステル法に従い
合成した。 １−３　５’丁ＣＧＡＣＡＡＴＧＡＧＴ　　３’Ｉ−４
３’ＡＧＣＴＧＴＴＡＣ丁Ｃ５’上記の通りオリゴヌク
レオチドＩ−３及び■−４は、互いに相補的であり、こ
れらがＤＮＡ断片＜Ｈ＞と正しく結合されるときには、
この結合領域で、制限酵素３ａｌＩによる認識配列が新
たに形成される。 ■　上記で得た断片＜）−（）、ＣＩ＞及び（ＬＪ＞並
びにオリゴヌクレオチドＩ−３及びＩ−４の各々１μｇ
を混合して、５０μＱの反応溶液中にて、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結させた。次いでこの反応組成液で大
腸菌ＪＭ１０３株を形質転換させ、テトラサイクリン耐
性を示す形質転換体を得た。かくして得られた形質転換
体から一株を選び、該株からプラスミドＤ　ＵＧＴｌ　
５０を単離した。 該ｏ　ＵＧＴｌ　５０は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、約３．９ｋｂの大きざを有していた。また
このものの３ａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の制限酵素によ
る切断パターンを調べた結果、該１）　ＵＧＴ１５０は
、テトラサイクリン耐性遺伝子の他、ｐＤＲ５４０の有
するｔａｃプロモーター及びその下流のＳＤ配列、ｐ　
ＵＧ２０１の有するβ−ラクタマーゼのシグナルペプチ
ドとβ−ウロガストロンとが直接結合した融合ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列及びβ−ラクタマーゼ
の転写終結信号をこの順序で含むものであり、上記ＳＤ
配列と融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列と
の間には、３ａｌ］：サイトを有することが確認された
。 このプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０のＤＮＡ塩基配列を
、Ｍ１３法に従い分析した結果を下記第４表に示す。 該１）ＵＧＴＩ　５０を保有する大腸菌ＪＭ１０３株は
、ｒＪＭ１０３　（ｐ　ＵＧＴｌ　５０）Ｊなる表示で
、微工研菌奇第９７４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ９７４）と
して寄託されている。 第　　４　　表 ＡＡＴＣＡ丁ＣＧＧＣＴＣＧＴＡ”、ＡＡ”、ＧＴＧＴ
ＧＧＡＡＴ丁ＧＴＴＡＧＴＡＧＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴ
ＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣリポソーム ／　　結合部位 ＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
ＡＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧ丁ＴＡＡＡＧＴＧ
ＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＴ　　ＧＴＣＧＣＣＣＴＴ　
　ＡＴＴ　　ＣＣＣＴＴＴ　　Ｔ丁丁シ　　グ　　す　
　ル　　ペ　　プ　　チ　　ドＧＣＧ　　ＧＣＣＴＴＴ
　　ＴＧＣＣＴＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＣＴ丁ＣＧＩＬＩ
　　　ＡｒＣｌ　　　ＣＶＳ　　　Ｇｌｎ　　　Ｔｒ　
　　Ａｒ（］　　　ＡＳＤ　　　ＬｅｔＪＡＡＡ　　下
ＧＧ　　ＴＧＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＧ　　ＧＧ丁　ＴＡ
ＡＴＡＧ参考例２ ■）（Ｌｅｄ２’　）−β−ウロガストロン遺伝子及び
これを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第６図に示す。 （Ａ）　　ＤＮＡフラグメントの製造 ■　まず、以下の１６種のオリゴヌクレオチドＡ−１〜
Ａ−６、Ａ−７−Ｌ、Ａ−８−２、Ａ−９、Ａ−１０−
り及びＡ−１１〜Ａ−１６を、前記固相リン酸トリエス
テル法により合成した。 （Ａ−１）　　　　　　　　　（Ａ−２）５’　ＡＡＴ
ＴＣＧＡＡＧＡＴ　　ＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣ３’
３’　　　　　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡ　　ＣＴＴ
ＡＴＣＧＣＴＡＡ　　５’（Ａ−１６）　　　　　　　
　（Ａ−１５）（Ａ−３）　　　　　　　　　（Ａ−４
）５’　ＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧ　　ＣＣＣＡＣＴＧＴ
ＣＴＣＡＣ３’３’　　　　　　ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧ
ＴＧＡ　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣ５’（Ａ−１４）　
　　　　　　　（Ａ−１３＞（Ａ−５）　　　　　　　
　　　（Ａ−６）５’　ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧ　　Ｔ
ＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴ　　　　　　３’３’　　　
　　　ＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴ　　ＧＣＴＧＣ：Ｃ
ＡＣＡＡＡ　　５’（Ａ−１２）　　　　　　　　　　
（Ａ−１１）（Ａ−７−Ｌ）　　　　　　　　（Ａ、８
−２）５’　ＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＡ　　ＣＡＴＴＧＡ
ＡＧＣＴＴＣＧ　　　　　　３’３’　　　　　　ＣＧ
ＧＡＣＡＴＧＴＡＡＣＴ　　ＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＧ　
　５’（Ａ−１０−Ｌ）　　　　　　　　（Ａ−９）次
いで、之等のうち、Ａ−１及び△−９以外の１４種の各
５′端を３２ｐラベル化及びリン酸化した。これは各オ
リゴヌクレオチド０．０５μｇを、１０ｍＭｊ＝化マグ
ネシウム及び１０ｍ　Ｍβ−メルカプトエタノールを含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６＞４８．５μ
Ｑに溶解後、これにγ−”　２Ｐ−ＡＴＰ　（５μＣ１
、アマ−ジャム社製＞０．５μＱ及びＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（０，５ユニツト、宝酒造社製）１μＱを
加え、３７℃で２時間反応させ、次いで３０ｍＭＡＴＰ
水溶液２μＱを加えて更に１時間同温度で反応させた後
、７５℃の水浴で５分間加温して反応を停止させること
により実施した。 上記で３２ｐラベル化及びリン酸化したオリゴヌクレオ
チド１４種並びにリン酸化していないＡ−１及びＡ−９
のそれぞれ０．００５μｇ相当づつを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて、４℃で２日間反応ざぜて連結ざぜ
た。 別に分子量マーカーとして、プラスミドＩ）ＢＲ３２２
を、制限酵素ＨａｐＩＩ　（宝酒造社製）で切断して得
たＤＮＡ断片の５′端を、３２ｐラベルしたものを作成
し、上記連結物とこれとを８％ポリアクリルアミドゲル
用いて電気泳動させた後、オートラジオグラフィーを行
ない、分子量マーカーより得られる情報に基づいて、１
６種のオリゴヌクレオチドが正しく連結されたＤＮＡフ
ラグメント（９６ｂＤ）に相当する位置を定め、当該位
置のポリアクリルアミドゲルを切り出して、これから所
望のＤＮＡフラグメントを抽出、単離した。 ■　プラスミド１）ＢＲ３２２の５μＱを、高塩濃度緩
衝液中にて、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥＣ０ＲＩ（共に
宝酒造社製）を用いて同時に切断後、０．９％アガロー
スゲル電気泳動を行ない、約３．９９ｋｂのベクターＤ
ＮＡフラグメント＜Ｋ＞を得た。 ■　次いで、上記■で得た１６種のオリゴヌクレオチド
連結物からなるＤＮＡフラグメントと■で得たベクター
ＤＮＡフラグメント（Ｋ）の１μｇ相当分とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させ、この連結物でＨ８１０１株を
形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感
受性を示すコロニーを得た。之等のコロニーより一株を
選び、培養してプラスミド１）ＵＧｌ−Ｌを単離した。 得られたプラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳
動の結果、約４．０８ｋｂの大きさを有していた。また
、このもののＥＣ０ＲＩ、Ｈｉｎｄｌ、ＢａｍＨＩ等の
制限酵素による切断パターンを調べた結果、該ｐＵＧ１
−１には、上記１６種のオリゴヌクレオチドが正しく連
結されてなるＤＮＡフラグメントが含まれていることが
確認された。更にこれはＭ１３法によるＤＮＡ１基配列
の分析の結果からも確認された。確ル２された上記１６
種のオリゴヌクレオチドの連結状態を下記第５表に示す
。 第　　５　　表 、ＡＧＣＧ、Ａ、’、　ＴＣ’、　Ｇ、Ａ、Ｇ　ＴＧＣ
ＣＧＡＣＴＧ　ＴＣ”。 ＴＣＧ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＣＴＣＡＣＧ　ＧＧＴ　ＧＡ
ＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴ　ＧＧＣＴＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＧ
　ＣＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧ　、Ａ、ＴＡＡＣ，
Ａ、　Ｇ、Ａ、ＣＧＴＧ　ＣＴＧ上記ＤＮＡ塩基配列は
、（ＬｅｔＪ２１）−β−ウロガストロンの前半部に対
応するものである。 ■　（ＬｅｔＪ２１）−β−ウロガストロンの後半部に
対応するＤＮＡ塩基配列としては、プラスミドＯＵＯ３
に含まれるものを利用した。該ｐ　ＵＯ３は、本発明者
らにより既に確立されている〔特開昭６１−１５６９１
号公報参照〕。 そのＤＮＡ塩基配列は下記第６表に示す通りでおる。 ／４＃１ ＡＡＣＴＧＴ　　ＧＴＡ　ＧＴＧ　　ＧＧ”、”、Ａ”
、、Ａ、ＴＣＧＧ”。 ＴＴＧ　ＡＧＡ　　ＣＡＴ　　ＣＡＣＣＣＡ　Ａ、ＴＡ
、”、、ＡＧ　　ＣＣＡＧＡＡ　　ＣＧＣＴＧＴ　　Ｃ
ＡＡ　　ＴＡＣＣＧＴ　ＧＡＴ　　ＣＴＧＣＴＴ　ＧＣ
Ｇ　ＡＣＡ　　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　　ＣＴＡ　　
ＧＡＣＡＡＡ　　ＴＧＧ　ＴＧＧ　　ＧＡＡ　ＴＴＧ　
　ＣＧＴ　　ＴＡＡ　　ＴＡＧＴＴＴ　ＡＣＣＡＣＣＣ
ＴＴ　ＡＡＣＧＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＣ■　上記■で得た
Ｉ）ＵＧｌ−Ｌの１０μ９を、生塩濃度緩衝液中で、制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びｐＳｔ工（共に宝酒造社製）
を用いて切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動
を行ない、約０．８５ｋｂのＤＮＡフラグメント（Ｌ）
を得た。 また、上記■のｐＵＧ２の５μｇを、同様に！′ｌ］限
酵素）１ｉｎｄＩ［Ｉ及びＰＳｔＩを用いて切断した後
、１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約３．
３４ｋｂのＤＮＡフラグメント＜Ｍ＞を得た。 之等各フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、連結物でｈｌＢ１０１株を形質転換し、得られる
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を示すコ
ロニーの中から一株を選び、これを培養して、プラスミ
ドｔ）ＵＯ３−Ｌを単離した。 該プラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約４．１８ｋｂの大きざを有していた。 また、マキサム・ギルバート法により、塩基配列を分析
した結果、（ＬｅｔＪ２１）−β−ウロガストロンをコ
ードする下記第７表に記載のＤＮＡ塩基配列を含むこと
が明らかにされた。 第　　７　　表 ／Ｖ々Ｉ＜ｒ勿ｈ ＜　、５’／久ヱ、’ｔ１′） ＩＩ＞ＣＬｅｌＪ２１）−β−ウロガストロン発現ベク
ターの構築 この構築の概略図を第７図に示す。 ■　プラスミド１）ＵＧ３−Ｌの２０μｇを、高塩濃度
緩衝液中にて、制限酵素ＢｇｌＩＩ及び）−１ｉｎｆＩ
（いずれも宝酒造社製）を用いて、同時に切断した後、
５％アクリルアミドグル電気泳動を行なって、約０．１
６ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｎ＞を得た。 ■　別にプラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０の３０ｔ１ｇを
、生塩濃度緩衝液中で、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒
造社製）を用いて切断した後、これを２０μｇ相当分と
１０μ９相当分の２つに分け、その２０μｇ相当分を高
塩濃度緩衝液中にて、制限酵素）−１ｉｎｆ工を用いて
切断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、
約０．１７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｏ）を得た。また上記１
０μｇ相当分を高塩濃度１援衝液中にて、制限酵素ＥＣ
ＯＲ工を用いて切断した後、５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行なって、約０．３０ｋｂのＤＮＡ断片Ｃ
Ｐ＞を得た。 更に、プラスミドＤＵＧＴ”＋５０の２μｇを、高塩濃
度緩衝液中にて、制限酵素Ｂ！；ＩＩＩＩ及びＥＣ０Ｒ
Ｉを用いて、同時に切断した後、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約３．２４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｑ
）を得た。 ■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片（Ｎ）、（Ｏ
）、＜Ｐ＞及び（Ｑ）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示すコロニーを分離し
た。そのうちの１コロニーを選び、これからプラスミド
ｏ　ＵＧＴｌ　５０−Ｌを単離した。 得られたｏ　ｔＪＧＴｌ　５０−Ｌは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８７ｋｂの大きざを有
していた。また、Ｈｉｎｆ工、ＴａｑＩ等の制限酵素に
よる切断パターンを解析した結果、テトラサイクリン耐
性遺伝子の他に、（Ｌｅｄ２１）−β−ウロガストロン
をコードするＤＮＡ塩基配列を有し、且つその５′端に
直接β−ラクタマーゼシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ塩基配列が連結されており、その上流にはｔａｃプ
ロモーター等が連結されていることが確認された。 参考例３ Ｉ）（Ｖａｔ２”　）−β−ウロガストロン遺伝子及び
これを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第８図に示す。 （Ａ＞　　ＤＮＡフラグメントの製造 ■　まず、以下の１６種のオリゴヌクレオチド八−１〜
Ａ−６、Ａ−７−Ｖ、Ａ−８−２、Ａ−９、Ａ−１Ｃ）
−Ｖ及びＡ−１１〜Ａ−１６を、前記固相リン醒トリエ
ステル法により合成した。 ＜Ａ−１）　　　　　　　　　（△−２）５’　ＡＡＴ
ＴＣＧＡＡＧＡＴ　　ＣＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣ３’
３’　　　　　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡ　　ＣＴＴ
ＡＴＣＧＣＴＡＡ　　５’（Ａ−１６）　　　　　　　
　（Ａ−１５）（Ａ−３）　　　　　　　　　（Ａ−４
）５’　ＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧ　　ＣＣＣＡＣＴＧＴ
ＣＴＣＡＣ３’３’　　　　　ＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴ
ＧＡ　　ＣＡＧＡＧＴＧＣＴＡＣ５’（Ａ−１４）　　
　　　　　　（Ａ−１３）（Ａ−５）　　　　　　　　
　（Ａ−６）５’　ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧ　　ＴＣＴ
ＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴ　　　　　３’３’　　　　　Ｃ
ＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＴ　　ＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡ
　　５’（Ａ−１２）　　　　　　　　　（Ａ−１１）
（Ａ−７−Ｖ）　　　　　　　（Ａ−８−２）５’　Ｇ
ＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡ　　ＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＧ
　　　　　３’３’　　　　　ＣＧＣＡＡΔＴＧＴＡＡ
ＣＴ　　ＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＧ　　５’（Ａ−１０−
Ｖ）　　　　　　　（Ａ−９）次いで、之等のうち、Ａ
−１及びＡ−９以外の１４種の各５′☆Ｊを３２２ラベ
ル化及びリン酸化した。これは各オリゴヌクレオチド０
．０５μｇを、１０ｍ　Ｍ塩化マグネシウム及び１０ｍ
　Ｍβ−メルカプトエタノール 緩衝液（Ｄ　Ｈ７．６）４８．５μＱに溶解後、これに
γー３２ＰーＡＴＰ　（５μＣｉ、アマ−ジャム社製＞
０．５μＱ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（０．５
ユニツト、宝酒造社製）１μＱを加え、３７°Ｃで２時
間反応させ、次いで３０ｍＭＡＴＰ水溶液２μＱを加え
て更に１時間同温度で反応させた後、７５°Ｃの水浴で
５分間加温して反応を停止させることにより実施した。 上記で３２ｐラベル化及びリン酸化したオリゴヌクレオ
チド１４種並びにリン酸化していない八−１及びＡ−９
のそれぞれ○．００５μｇ相当づつを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて、４°Ｃで２日間反応ざぜて連結さ
せた。 別に分子量マーカーとして、プラスミドｐＢＲ３２２を
、制限酵素ＨａｐＩ　（蜜酒造社製）で切断して得たＤ
ＮＡ断片の５′端を、３２ｐラベルしたものを作成し、
上記連結物とこれとを８％ポリアクリルアミドゲル用い
て電気泳動させた後、オートラジオグラフィーを行ない
、分子量マーカーより得られる情報に基づいて、１６種
のオリゴヌクレオチドが正しく連結されたＤＮＡフラグ
メント（９６ｂｐ）に相当する位置を定め、当該位置の
ポリアクリルアミドゲルを切り出して、これから所望の
ＤＮＡフラグメントを抽出、単離した。 ■　プラスミドｐＢＲ３２２の５μ９を、高塩濃度緩衝
液中にて、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥＣＯＲＩ（共に宝
酒造社製）を用いて同時に切断後、０、９％アガロース
ゲル電気泳動を行ない、約３、９９ｋｂのベクターＤＮ
Ａフラグメント（Ｋ）を得た。 ■　次いで、上記■で得た１６種のオリゴヌクレオチド
連結物からなるＤＮＡフラグメントと■で得たベクター
ＤＮＡフラグメント＜Ｋ＞の１μｇ相当分とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させ、この連結物でＨ８１０１株を
形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感
受性を示すコロ　′ニーを得た。２笠のコロニーより一
株を選び、培養してプラスミドｐＵＧ１−Ｖを単離した
。 得られたプラスミドは、１．０％アガロ−スゲ　１ル電
気泳動の結果、約４．０８ｋｂの大きざを有していた。 また、このもののＥＣＯＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＢａｍＨ王等の制限酵素による切断パターンを調
べた結果、該ｐＵＧ１−Ｖには、上記１６種のオリゴヌ
クレオチドが正しく連結されてなるＤＮＡフラグメント
が含まれていることが確認された。更にこれはＭ１３法
によるＤＮＡ塩基配列の分析の結果からも確認された。 確認された上記１６種のオリゴヌクレオチドの連結状態
を下記第８表に示す。 第　　８　　表 へＧＣ　　ＧＡＴ　　ＴＣＴ　　ＧＡＧ　　ＴＧＣ　　
ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＴＴＣＧ　　ＣＴＡ　　ＡＧ
Ａ　　Ｃ丁Ｃ　　ＡＣＧ　　ＧＧＴ　　ＧＡＣ　　ＡＧ
Ａ○ＡＣ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　
ＣＡＣ　ＧＡＣ３ＴＧ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＡＴＡ　ＡＣ
Ａ　ＧＡＣ　ＧＴＧ　ＣＴＧロガストロンの前半部に対
応するもので必る。 ■　（Ｖａｔ２１）−βーウロ力ストロンの後半部に対
応するＤＮＡ塩基配列としては、プラスミドｐ　ＵＯ３
に含まれるものを利用した。該１）　ＵＯ３は、本発明
者らにより既に確立されている〔特開昭６１−１５６９
１号公報参照〕。 そのＤＮＡＦ基配列基油列第６表に示した通りである。 ■　上記■で得たＤＵＧｌ−Ｖの１０ｔＪ、ｇを、生塩
濃度緩衝液中で、制限酵素）−（ｉｎｄＩ［Ｉ及びＰｓ
ｔ工（共に宝酒造社製）を用いて切断した後、１．０％
アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．８５ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントＣＲ＞を得た。 また、上記■の１）ＵＯ３の５μ９を、同様に制限酵素
１−１ｉｎｄＩ［Ｉ及びｐｓｔＩを用いて切断した後、
１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約３．３
４ｋｂのＤＮＡフラグメントＣＭ＞を得た。 之等各フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、連結物でＨ８１０１株を形質転換し、得られるア
ンピシリン耐性及びテトラサイクｌノン感受性を示すコ
ロニーの中から一株を選び、これを培養して、プラスミ
ドｐ　ＵＯ３−Ｖを単離した。 該プラスミドは、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約４．１８ｋｂの大きざを有していた。 また、マキサム・ギルバート法により、塩基配列を分析
した結果、（Ｖａ１２’　）−β−ウロガストロンをコ
ードする下記第９表に記載のＤＮＡ塩基配列を含むこと
が明らかにされた。 第　　９　　表 ＡＧＡ　　Ｇ王ＧＣ丁Ａ　　ＣＣＧ　　ＡＩＡ　　ＡＣ
；Ａ　　ＧＡＣ；Ｓ、ｙｔｙ３Ａ　Ｉ ＩＩ＞　　（Ｖａｔ２’　）−β−ウロガストロン発現
ベクターの構築 この構築の概略図を第９図に示す。 ■　プラスミド１）ＵＯ３−Ｖの２０μｇを、高塩濃度
緩衝液中にて、制限酵素ＢｇＩＩＩ及びＨｉｎｆ’Ｉ（
いずれも宝酒造社製）を用いて、同時に切断した後、５
％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０１６ｋ
ｂのＤＮＡ断片＜８＞を得た。 ■　別にプラスミド１）ＵＧＴｌ　５０の３０！ｉ０を
、生塩濃度緩衝液中で、制限酵素ＨｉｎｄＩ１１（宝酒
造社製）を用いて切断した後、これを２０μｇ相当分と
１０μＱ相当分の２つに分け、その２０μｑ相当分を高
塩濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｈｉｎｆ■を用いて切断
し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０
．１７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｏ）を得た。また上記１０μ
ｇ相当分を高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素ＥＣ０ＲＩ
を用いて切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行なって、約０．３０ｋｂ（７）ＤＮＡｒＪｆＴ
片ＣＰ＞’得た。 更に、プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５００２μｇを、高塩
濃度緩衝液中にて、制限酵素ＢＱＩＩ及びＥＣ０ＲＩを
用いて、同時に切断した後、１．０％アガロースゲル電
気泳動を行ない、約３．２４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｑ）を
得た。 ■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片（Ｓ）、（Ｏ
）、＜Ｐ＞及び＜Ｑ＞を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換させ、テトラサイクリン耐性を示すコロニーを分離し
た。そのうちの１コロニーを選び、これからプラスミド
ｐ　ＵＧＴｌ　５０−■を単離した。 得られたｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖは、１．０％アガロー
スゲル電気泳動の結果、約３．８７ｋｂの大きざを有し
ていた。また、１−（ｉｎｆ工、ＴａＱ王等の制限酵素
による切断パターンを解析した結果、テトラサイクリン
耐性遺伝子の他に、（Ｖａ１２１）−β−ウロガストロ
ンをコードするＤＮＡ塩基配列を有し、且つその５′端
に直接β−ラクタマーゼシグナルペプチドをコードする
ＤＮ、’ｌ基配列が連結されており、その上流にはｔａ
ｃプロモーター等が連結されていることが確認された。 実施例１ １）（Ｇｌｎ５３）−β−ウロガストロン遺伝子及びこ
れを含むベクターの構築 上記構築の概略図を第１０図に示す。 ■　次に示すオリゴヌクレオチドＧＬＮ−１及びＧＬＮ
−２を、同相リン酸トリエステル法により合成した。 ＧＬＮ−１５’　　−ＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡ　　−３’ＧＬＮ−２３’　　
−ＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＣＡ下　−
５′ ■　別にプラスミドｐＵＧＴ１５０の５μ９を、高塩濃
度１援衝液中にて、制限酵素ＢｇｌＩｆ　（蜜酒造社製
）を用いて切断した後、ＤＮＡポリメラーゼ工のクレノ
ー断片を用いて平滑末端とし、高塩濃度緩衝液中にて、
制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて切断し、０
．９％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約３，
３ｋｂのＤＮＡ断片（丁）を得た。また同様に、ｐＵＧ
Ｔ１５０の５μｇを高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｅ
Ｃ０ＲＩ及び３ａｌ工を用いて同時に切断した後、５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０．３
９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｕ）を得た。更に、ｐ　ＵＧＴ１
５０の３２μｇを、高塩濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ及び５ａｌＩを用いて、同時に切断した後、５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、約０．２
４ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、これを続いて生塩濃度緩
衝液中に−Ｃ１制限酵素５ａＵ３Ａ工（宝酒造社製）を
用いて切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行なって、約０．２１ｋｂのＤＮＡ断片＜Ｖ＞を得
た。 ■　上記■で得られたオリゴヌクレオチドＧＬＮ−１及
びＧＬＮ−２の各１μｑと、■で得られた各ＤＮＡ断片
（Ｔ）、ＣＵ＞及び（Ｖ）とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを加えて１２°Ｃで１６時間連結反応させ、連結物
で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換させ、テトラサイクリ
ン耐性を示す多数のコロニーを得た。そのうちの１コロ
ニーを選び、これからプラスミドｐＵＧ丁１５０−Ｇを
単離した。 得られたｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇは、１．０％アガロー
スゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの大きざを有し
ていた。また、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩ［１等の制限酵素
による切断パターンを解析した結果、テトラサイクリン
耐性遺伝子の他に、（Ｇｌｎ”　３　）　−β−ウロガ
ストロンをコードする遺伝子構造の存在が推定された。 次いで上記ｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇにつき、Ｍ１３法に
よるＤＮＡ塩基配列のｉ認を行なった結果、ＣＧ１ｎ５
３）−β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列
を含み、その５′端には、β−ラクタマーぜシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列か直結し、その上流
にはｔａｃプロモーターが連結されていることが確認さ
れた。 実施例２ 工）　　（ＬｅｌＪ２　’　、　Ｑｌｎ５３）−β−ウ
ロガストロン遺伝子及びこれを含む発現ベクターの構築
この構築の概略図を第１１図に示す。 ■　プラスミドＯＵＧＴｌ　５０−Ｌの１０μＱを、生
塩濶度援百液中にて、制限酵素ＣＩａ工（ＮＥＢ社製）
及びＭｌｕ工（宝酒造社製）を用いて、同時に切断した
後、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約０
．４９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｗ）を得た。 ？　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇの５μＱを、上
記■と同様にしてＣ１ａＩ及びＭｌｕ工で切断後、０．
９％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約３．３
９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘ）を得た。 ■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片＜Ｗ＞及び（
Ｘ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２°Ｃで１６時
間、連結反応させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質
転換し、テトラサイクリン耐性を示す多数のコロニーを
分離した。そのうちの１コロニーを選び、これからプラ
スミドｐＵＧＴ１５Ｏ−ＬＧを単離した。 得られたｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＬＧは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの大きざを有
していた。また、ｐｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ
等の制限酵素による切断パターンを解析した結果、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の他に、（Ｌ　ｅｕ２．　＋　
、　Ｑ　ｌｎ５３　）−β−ウロガストロンをコードす
るＤＮＡ塩基配列を有し、且つその５′端に直接β−ラ
クタマーゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列が連結され、その上流にｔａｃプロモーターを含むこ
とが確竪された。 実施例３ Ｉ）ＣＶａ１２’　、Ｑｌｎ”　３）−β−ウロガスト
ロン遺伝子及びこれを含む発現ベクターの構築この構築
の概略図を第１２図に示す。 ■　プラスミドｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖの１０μｑを、
生塩濃度緩衝液中にて、制限酵素Ｃ１ａＩ　（ＮＥＢ社
製）及びＭｌｕ工（宝酒造社製）を用いて、同時に切断
した後、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、
約０．４９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｙ）を得た。 ■　プラスミドＤ　ＵＧＴｌ　５０−Ｇの５μｑを、上
記■と同様にしてＣ１８工及びＭＩＩＪＩで切断後、０
．９％アクリルアミドゲル電気泳動を行なって、約３．
３９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘ）を得た。 ■　上記■及び■で得られた各ＤＮＡ断片＜Ｙ＞及び（
×）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２°Ｃで１６時
間、連結反応させ、連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質
転換し、テトラサイクリン耐性を示す多数のコロニーを
分離した。そのうちの１コロニーを選び、これからプラ
スミドＩ）ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧを単離した。 得られたｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧは、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動の結果、約３．８６ｋｂの大きざを有
していた。また、ＰｓｔＩ、）−１ｉｒｌｄｌｌ、Ｔａ
ｑＩ等の制限酵素による切断パターンを解析した結果、
テトラサイクリン耐性遺伝子の他に、（Ｖａ１２１．　
Ｑｌｎ５３　）−β−ウロガスト０ンをコードするＤＮ
Ａ塩基配列を有し、且つその５′端に直接β−ラクタマ
ーゼシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列が連
結され、その上流にｔａｃプロモーターを含むことが確
認された。 実施例４ ■）　本発明組換え微生物の培養及びこれによるβ−ウ
ロガストロン誘導体の製造 ■　菌の培養 実施例１〜３のそれぞれで得た各ベクター（ｐＵＧ丁１
５０−Ｇ、ｏ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧ及びｐ　ＵＧＴｌ
　５Ｏ−ＬＧ）を保有する大腸菌ＪＭ１０３株を、以下
の通り培養した。 培地としては、グルコース、カザミノ酸、プロリン、サ
イアミン、及びテトラサイクワンを添加したＭ９培地を
用いた。その組成は下記の通りでおる。 リン酸二ナトリウム・１２水塩　１３．４（１リン酸−
カリウム　　　　　　　　３．０ＣＩ塩化ナトリウム　
　　　　　　　　０．５（１塩化アンモニウム　　　　
　　　　１．０ｇ塩化カルシウム・２水塩　　　　１４
．７ｍ（１塩化マグネシウム・６水塩　　　２０３ｍｇ
グルコース　　　　　　　　　　　５．０ｇカザミノ酸
　　　　　　　　　　　　５．（］］ＩＬ−プロリン　
　　　　　　　　５０ｍｇサイアミン・塩駿塩　　　　
　　　　１ｍｇテトラサイクリン　　　　　　　　　１
５ｍ（１Ｑ 上記培地２００ｍ１２を含むフラスコに菌を接種して、
３７°Ｃにて振盪培養を行なった。培養開始５時間後に
、Ｉ　ＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して培養を継続
し、その３２０時間後に、一定量（１０脱）を採取して
、６１０ｎｍでの吸光度を測定し、次いで遠心分離（６
０００回転／分Ｘ１０分、４°Ｃ）により、菌体と培養
上澄とを分離した。 得られた培養上澄を菌体外画分とする。 また菌体を、ＰＢＳ　（１５０ｍ　Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０＞１０鵬に
懸濁させ、超音波破砕殿（大量製作所製５２０２型）を
用いて出力１００Ｗにて、３０秒ずつ３回破砕処理し、
遠心分離（１８０００回転／分Ｘ２０分、４°Ｃ）して
上澄を得た。これを菌体内画分とする。 ■　ＲＩＡによるβ−ウロガストロン誘導体の測定 上記■で得たそれぞれの両分につき、以下の通りβ−ウ
ロガストロン誘導体の存在を、β−ウロガストロン特異
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により検討した。ＲＩ
Ａの方法は次の通りである。 即ち、精製ヒトβ−ウロガストロンを抗原として、家兎
を免疫し抗血清を作成した。即ち、β−ウロガストロン
３００μｇを蒸留水０．２＋ｎＩ２に溶解後、５０％ポ
リビニルピロリドン液１．５１１ＩＩ２を加え空温で２
時間撹拌した。コンプリート・フロイント・アジュバン
ト２．０ＩＴｌｆ２を加えて乳化し、家兎３匹の胸部に
皮下注射した。２週間毎に免疫を４回くり返した後、さ
らに５０μｇの抗原を静注し、３日後に全採血を行ない
、血清を分離した。 次にアツ゛ロイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイ
トレージョンカーブ、アッセイ条件を最適化するためイ
ンキュベーション時間、抗体結合標識抗原（バウンド）
と遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、
下記測定条件を設定した。 即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ二ナトツナ
トリウム１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）を希釈
液として用い、該希釈液４００μＱ、測定試料又は標準
ヒトβ−ウロガストロン１００μＱ及び抗ヒトβ−ウロ
ガストロン血清１００μＱを加えて４℃にて２４時間イ
ンキュベートした後、′２５■標識ヒトβ−ウロガスト
ロンｌ０Ｃ）ｌ　（約５０００ｃｐｍ）を加えた。更に
４℃にて４８時間インキュベートした後、第２抗体（抗
家兎γ−グロブリンヤギ血清＞（１：２０＞１００μＱ
１正常家兎血清（１：　２００）１００μＱ及び５％ポ
リエチレングリコールを含む１０ｍＭ　　ＰＢＳ液９０
０μＱを加えて４℃にて３時間インキュベートした。次
に３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清を除き
沈澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウロガストロンよ
り得られた標準曲線より試料中のヒトβ−ウロガストロ
ン免疫活性物の含♀を求めた。 上記ＲＩＡの結果（単位二μｇ／Ｑ）を、下記第１０表
に示す。 第１０表 洪試菌　　　　β−ウロガストロン免疫活性（ベクター
）　　菌体内　　菌体外　　合　計ｐＵＧ下 １５０−Ｇ　　　３００　　　５２　　３５２１）　Ｕ
ＧＴ １５０−ＶＧ　　２８０　　　５６　　３３６ＵＧＴ １５Ｃ）−ＬＧ　　１９２　　　５６　　２４８上記第
１０表より、本発明ベクターＤ　ＵＧＴｌ　５Ｃ）−Ｇ
、１）ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧ及びｐＵＧＴ１５０−ＬＧ
のそれぞれを保有する菌株は、いずれも、β−ウロガス
トロン免疫活性物を菌体内及び菌体外に産生ずることが
明らかである。 ■）　本発明β−ウロガストロン誘導体の精製及び同定 ■精製 本発明β−ウロガストロン誘導体の精製を以下の方法に
より実施した。即ち、上記■）で得た菌体内画分及び菌
体外画分中のβ−ウロガストロン免疫活性物質を、ブチ
ルトヨパール６５０Ｃ（東洋曹達社製）を用いた吸着ク
ロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（同
上社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｃ
Ｍ−トヨパール６５０Ｍ（同上社製）を用いた陽イオン
交換クロマトグラフィー、ＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２０
Ｔカラム（同上社製）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィー及びセファ１デックスＧ−２５（ファルマシア社製
）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー操作を順次行な
って、それぞれ純度９９％以上の単一のポリペプチドと
して精製した。 ■　逆相高速液体クロマトグラフィー 得られた各β−ウロガストロン誘導体及び天然型β−ウ
ロガストロンのそれぞれの逆相高速液体クロマトグラフ
ィーによる溶出パターンを第１３−１図〜第１３−４図
に示す。第１３−１図は天然型β−ウロガストロンを、
第１３−２図はＣＧＩｎ”　”　）−β−ウロガストロ
ンを、第１３−３図は（ｌ　ｅｕ２　＋　、　ＧＩｎ”
　３　）−β−ウロガストロンを及び第１３−４図は（
Ｖａｔ２’　、　Ｇｌｎ”’　３）−β−ウロガストロ
ンをそれぞれ示している。また、各図は２２％アセトニ
トリルを含む５０ｍＭ１リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，３＞
により、毎分１．０−の流速で溶出させた結果であり、
各図において縦軸は２８０ｎｍでの吸光度を、横軸は保
持時間（分）を示す。 上記各図より、本発明の各誘導体の保持時間は、（ＧＩ
ｎ５”）−β−ウロガストロンでは１１．０３分、（Ｌ
　ｅｕ２　＋　、　Ｑ　ｌｎ５３　）−β−ウロガスト
ロンでは１５．１２分及び（Ｖａ１２ｔ。 Ｑ　ｌｎ５３　）−β−ウロガストロンでは１０．６７
分であることが判る。また、各図より本発明β−ウロガ
ストロン誘導体は、いずれも高純度に精製されているこ
とが判る。 ■　電気泳動 次いで、第１４図に、本発明β−ウロガストロン誘導体
及び対照とする天然型β−ウロガストロンのそれぞれの
電気泳動の結果を示す。各被検標品の使用量は１０μＱ
であり、之等をトリス・グリシン緩衝液（ｐ　Ｈ８，３
＞を用いて２５ｍＡにて、２．５時間泳動させた後、ク
マーシーブリリアントブルー・Ｒにより染色を行なった
。 第１４図においてレーン■は天然型β−ウロガストロン
、レーン■は（ＧＩｎ５３）−β−ウロガストロンを、
レーン■は（Ｖａ１２”　、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロ
ガストロンを、レーン■は（１−ｅ１２１゜（３Ｉｎ”
　３　）−β−ウロガストロンをそれぞれ示している。 上記図より本発明β−ウロガストロン誘導体は、いずれ
も高純度であることが判ると共に、いずれも５３位のＡ
ｒｇが中性アミノ酸（Ｇｌｎ）に置換されたことに基づ
いて、それらの等電点が酸性側に移動していることが判
る。 ■　アミノ酸分析 本発明β−ウロガストロン誘導体につき、４Ｍメタンス
ルホン酸により加水分解し、日立アミノ酸分析機を用い
て、オルトフクルアルデヒド法によりアミノ酸分析を行
なった。結果を下記第１１表〜第１３表に示す。 第１１表 （Ｇｌｎ”　３）−β−ウロガストロン第１２表 （Ｖａ１２１．Ｇｌｎ”　３）−β−ウロガストロン第
１３表 （ｌｅｕ２　＋　、　Ｇｌｎ５３　）−β−ウロガスト
ロン上記各式より、本発明β−ウロガストロン誘導体は
、いずれもそのアミノ酸の実測残基数が理論残基数と良
好に一致していることが判る。 実施例５ 生物活性の測定 ■　細胞増殖促進活性 本発明β−ウロガストロン誘導体の細胞増殖促進活性を
、成熟ラット初代培養肝細胞 （Ｔａｎａｋａ　、　Ｋ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　［
３ｉｏｃｈｅｍ、、８４゜９３７−９４６　（１９７８
））を用いて、標識チミジンのＤＮＡへの取り込みを指
標として測定した［Ｎａｋａｍｕｒａ　、　Ｔ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｂ、　Ｂ、　Ｒ，Ｃ，。 １３３．１０４２−１０５０　（１９８５）及びＮａｋ
ａｍｕｒａ　、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ。 ３ｃｉ、、ＵＳＡ、旦０，７２２９−７２３３（１９８
３））。 即ち、体重約２０（］］のウィスター系雄ラットうネン
ブタール０．４ＴＩＩＧを腹腔内投与して麻酔後、開腹
し門脈を露出させた。門脈の切開面からカニユーレを挿
入し、３７°Ｃに保温した前潅流用緩衝液を流した。ま
た、右心房を切開し、ここから別のカニユーレを工大静
脈に挿入した。次いで、前潅流用緩衝液に代えて、３７
°Ｃに保温したコラ−ゲナーゼ溶液を用いて、１０〜２
０分間潅流を行なった。次いで、肝臓名菓を切り離し、
シャーレに移してカルシウムを含まないハンクス液を加
えて、メスで細分し、更にピペットで細胞を分散させた
。次いで１５０メツシユを通過する細胞を集め、これを
遠心力＠　（６０００ｐｐｍ　、１分間）し、沈降した
肝実質細胞を、５％仔牛血清、１０−９Ｍインスリン、
１０−９Ｍデキサメサゾン、５Ｕ／ｍ１２アプロチニン
を含むウィリアムＥ培地に懸濁させた。その一部を用い
トリパンブルー法で染色後、血球計算盤で生細胞数を計
測した。 尚、用いた前潅流用緩衝液及びコラ−ゲナーゼ溶液組成
（ＩＪ　／Ｑ　＞は次の通りである。 成　分　（ｇ／Ｑ　）　　　前潅流用　コラーゲナ緩衝
液　　ナーゼ溶液 塩化ナトリウム　　　　　　　８８ 塩化カリウム　　　　　　　　０．４　　　０．９４塩
化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１リン酸−ナ
トリウム ・２水塩　　　　　　　　　０．０７８　　０．０７Ｂ
リン酸ニナトリウム ・１２水塩　　　　　　　　０．１５１　　０．１５１
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　２．３８　　　２．３
８フエノールレツド　　　　　　Ｏ，ＯＯＢ　　　０．
００６コラーゲナーゼ　　　　　　　　　　　０．５ト
リプシンインヒビター　　　　　　　　０．０５ＥＧＴ
Ａ　　　　　　　　　　　Ｏ，１９−炭酸水素ナトリウ
ム　　　　０．３５　　　０．３５グルコース　　　　
　　　　　０．９ ｐＨ７，２７，５ 上記肝実質細胞を１２穴のプラスチック製ディツシュに
０．５Ｘ１０”個／ウェルとなるように分注し、−夜培
養した後、培地を捨てて、種々の濃度のβ−ウロガスト
ロン誘導体又は天然型β−ウロガストロン及び１０−９
Ｍインスリン、１０−９Ｍデキサメサゾン及び５Ｕ／＋
＋＋Ｃ！アプロチニンを含むウィリアムスＥ培地１　！
ｒ１２を加えた。これを１２時間３７°Ｃに保った後、
１．２５μＱｉの〔３Ｈ〕−チミジン（０，３Ｃｉ　／
ｍ　ｍｏｌ　＞　ヲ加え、３７℃で更に２４時間培養し
た。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＴＣＡを
加え、４°Ｃで一夜放置することにより固定した。固定
された細胞に１Ｎ−Ｎａ　ＣＱ　０．５ｍＧを加え、３
７°Ｃにて３０分間保温して溶解させ、これを試料液と
した。 試料液４７５μＱに、１００％（Ｗ　／Ｖ　）ＴＣＡ１
５０μＱを加え、４°Ｃで２時間放置した後、遠心分離
（３０００ｐｐｍ　、１５分間）し、高分子ＤＮＡを沈
澱させた。次いでこれに１０％ＴＣＡ０．５ｍＱを加え
、沸騰水浴中で１５分間加熱し、ＤＮＡを加水分解した
。水冷後、遠心分離（３０００ｒｐｍ　、１５分間）し
て上澄を分離し、液体シンチレーションカウンターで放
射能を測定した。別に、試料液２５μＱ中の蛋白量を、
フォーリン・ローリ−法により定量し、之等の結果から
、蛋白量当りの放射能を求めた。 結果を第１５図に示す。図において横軸は本発明β−ウ
ロガストロン誘導体又は天然型β−ウロガストロンのそ
れぞれの濃度（ｎＭ鵬）を、縦軸は蛋白量当りの放射能
（ｄｐｍ　Ｘ　１　Ｑ’　７ｍｇ蛋白）を示す。また図
において（１）は天然型β−ウロガストロンを、（２）
はＣＧＩｎ５３）　−８−ウロガストロンを、（３）は
（Ｖａｔ２’　、　Ｇ１ｎ５３）−β−ウロガストロン
を、（４）は（ｔ−ｅｕ２’　＊Ｇ１ｎ５３　）−β−
ウロガストロンをそれぞれ示す。 上記第１５図から、本発明のβ−ウロガストロン誘導体
は、いずれも天然型β−ウロガストロンと比較して、約
１／２の濃度で、同等又はそれ以上のチミジン取り込み
促進効果を秦し、細胞増殖促進活性の高いことが判る。 本発明誘導体が、かかる細胞増殖促進活性を奏する事実
は、今だβ−ウロガストロン自体の構造活性相関が解明
されていないために明らかではないが、この活性より本
発明誘導体が各種細胞培養等の分野で有効でおることは
明らかである。また上記活性より、本発明誘導体が医薬
品分野においても、天然型β−ウロガストロンに比較し
てより強力な生物活性を奏することも充分に推測できる
。 ■　新生仔マウスの眼瞼開裂活性及び切歯開田促進活性 この試験は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）における代表
的なＥＧＦの生物検定法であるり、コーエン（Ｓ。 Ｃｏｈｅｎ　）の方法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２３７，１５５
５（１９６２）、）を参考として次の通り行なった。 即ち、ＩＣＲ系マウスの新生仔（体重１．６〜１．８ｑ
）の各群６匹を試験動物として、生後１８時間以内に、
β−ウロガストロン誘導体又は対照として天然型β−ウ
ロガストロンのそれぞれを生理食塩水溶液形態で０．３
μｇ、０．６μｇ又は１．２μ！；Ｉ／１０μＱ／ＩＪ
となるように、各供試動物の背部に皮下投与した。以後
２４時間毎に投与を繰返し、同時に眼瞼開裂及び切歯閉
出の観察を行なった。尚、上記投与及び観察は、全ての
固体につき眼瞼開裂及び切歯閉出が起るまで継続した。 得られた結果を下記第１４表に示す。第１４表には、何
らの供試薬剤をも投与しなかったコントロール群につい
ての結果も併記する。表中の各数値は１群６匹の眼瞼開
裂又は切歯閉出に要した日数の平均値でおる。 第１４表 上記表より、本発明誘導体及び天然型β−ウロガストロ
ンはいずれも新生仔マウスの眼＠開裂及び切歯開田を促
進しており、これは用且依存的で必ることが判ると共に
、本発明誘導体はいずれも、明らかに天然型β−ウロガ
ストロンよりも強い上記眼瞼開裂及び切歯閉出促進活性
を奏することが判る。 図面の簡単な説明 第１図はベクターｐＢＲ３２２に合成オリゴヌクレオチ
ド〈１〉〜〈４〉をクローニングしてプラスミド１）Ｇ
Ｈ５３を得る工程及び得られるプラスミドｐＧＨ５３の
特徴を示す図でおり、図中口は合成オリゴヌクレオチド
由来の塩基配列を示し、ＡＩ）　　はアンピシリン耐性
遺伝子を示し、ＴＣｒはテトラサイクリン耐性遺伝子を
示し、以下の図でも同様とする。 第２図は１）ＧＨ５３とＤＢＲ３２２とからベクターｐ
　ＧＨ５４を得る工程及び得ら、れるベクターの特徴を
示す図であり、図中１はシグナルペプチドをコードする
塩基配列を示す。図中（Ｆ）はＦｎｎ４Ｈエサイトを示
し、この括弧を付して示した制限酵素サイトはベクター
上に複数個存在する制限酵素サイトのうちの該当するサ
イトを示し、以下の図でも同様である。 第３図はｐＢＲ３２２からｐ　ＢＲＨＯ２を得、該ｐ　
ＢＲＨＯ２とｐＧＨ５４とからベクターｐＧＨ５５を得
る工程及び得られるベクターの特徴を示す図である。 第４図はｐＧＨ５５とｌ）、ＵＯ３とからベクターＤ　
ＵＧ２０１を得る工程及び得られるベクターの特徴を示
す図でおる。図中口ヌキの矢印はβ−ウロガストロンの
遺伝子を示す。 第５図はｐＤＲ５４０，１）ＵＧ２０１並びにオリゴヌ
クレオチドニー３及びＩ−４からベクターｏ　ＵＧＴｌ
　５０を得る工程及び得られるベクターの特徴を示す図
である。図の中黒ヌリの矢印はβ−ラクタマーゼのプロ
モーターを、斜線を入れた矢印はｔａｃプロモーターを
、Ｑｒｉは複製開始領域を示し、以下の図でも同様とす
る。 第６図は合成オリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−１６とｔ
）ＢＲ３２２とからｐＵＧｌ−１を得、これとＤ　ＵＯ
２とから１）ＵＯ３−Ｌを得る各工程及び得られるｐＵ
Ｇｌ−Ｌ及びｐ　ＵＯ３−Ｌの特徴を示す図である。 第７図はｐＵＧ３−Ｌとｐ　ＵＧＴｌ　５０とからｐＵ
ＧＴｌ　５０−Ｌを１ｑる工程及び得られるｏ　ＵＧＴ
ｌ　５０−Ｌの特徴を示す図である。 第８図は合成オリゴヌクレオチド△−１〜Ａ−１６とＩ
）ＢＲ３２２とからＩ）ＵＧｌ−Ｖを１ｑ、これと１Ｊ
Ｇ２とからｔ）ＵＯ３−ひを得る各工程及び得られるｐ
ＵＧｌ−Ｖ及びｐＵＧ３−Ｖの特徴を示す図でおる。 第９図はｐＵＧ３−ＶとρＵＧＴ１５０とからＤ　ＵＧ
Ｔｌ　５０−Ｖを得る工程及び得られる１）ＵＧＴｌ　
５０−Ｖの特徴を示す図で市る。 第１０図は１）ＵＧ丁１５０、オリゴヌクレオチドＧＬ
Ｎ−１及びＧＬＮ−２からｐ　ＵＧＴＩ　５０−Ｇを得
る工程及び得られる０００丁１５０−Ｇの特徴を示す図
でおる。 第１１図は１）ＵＧＴＩ　５０−Ｌとｐ　ＵＧＴ１５０
−Ｇとからｏ　ＵＧＴＩ　５Ｏ−ＬＧを得る工程及び得
られるｐＵＧＴＩ　５Ｏ−ＬＧの特徴を示す図である。 第１２図はｐ　ＵＧＴｌ　５０−Ｖとｐ　ＵＧＴ１５０
−Ｇとからｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧを得る工程及び得
られるｐ　ＵＧＴｌ　５Ｏ−ＶＧの特徴を示す図でおる
。 第１３−１図〜第１３−４図は、本発明β−ウロガスト
ロン誘導体及び天然型β−ウロガストロンの逆相高速液
体クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すグラフ
である。 第１４図は１５％ポリアクリルアミドゲルを用いた本発
明β−ウロガストロン誘導体及び天然型β−ウロガスト
ロンの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す図で
ある。 第１５図は標識チミジンのＤＮＡへの取り込みを指標と
して、本発明β−ウロガストロン誘導体及び天然型β−
ウロガストロンの細胞増殖促進活性を調べたグラフであ
る。 （以　上） 第１３し １１．０３ 第１３−３図　　　　剰５−４図 １０．６７ 第１５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］式 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＾１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを、Ｘ＾２は
   Ａｒｇ又はＧｌｎを示す。但しＸ＾２がＡｒｇの場合、
   Ｘ＾１はＶａｌを示すものとする。〕 で表わされることを特徴とするβ−ウロガストロン誘導
   体。 ［２］式 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＾１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを、Ｘ＾２は
   Ａｒｇ又はＧｌｎを示す。但しＸ＾２がＡｒｇの場合、
   Ｘ＾１はＶａｌを示すものとする。〕 で表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列を含有することを特徴とするβ−ウロガス
   トロン誘導体発現ベクター。 ［３］プラスミドｐＵＧＴ１５０−Ｖである特許請求の
   範囲第２項に記載の発現ベクター。 ［４］プラスミドｐＵＧＴ１５０−Ｇである特許請求の
   範囲第２項に記載の発現ベクター。 ［５］プラスミドｐＵＧＴ１５０−ＶＧである特許請求
   の範囲第２項に記載の発現ベクター。 ［６］プラスミドｐＵＧＴ１５０−ＬＧである特許請求
   の範囲第２項に記載の発現ベクター。 ［７］式 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＾１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを、Ｘ＾２は
   Ａｒｇ又はＧｌｎを示す。但しＸ＾２がＡｒｇの場合、
   Ｘ＾１はＶａｌを示すものとする。〕 で表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列を含有するβ−ウロガストロン誘導体発現
   ベクターで形質転換されたことを特徴とする形質転換微
   生物。 ［８］式 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＾１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを、Ｘ＾２は
   Ａｒｇ又はＧｌｎを示す。但しＸ＾２がＡｒｇの場合、
   Ｘ＾１はＶａｌを示すものとする。〕 で表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列を含有するβ−ウロガストロン誘導体発現
   ベクターで形質転換された微生物を培養して目的誘導体
   を採取することを特徴とするβ−ウロガストロン誘導体
   の製造法。 ［９］式 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘ＾１はＶａｌ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを、Ｘ＾２は
   Ａｒｇ又はＧｌｎを示す。但しＸ＾２がＡｒｇの場合、
   Ｘ＾１はＶａｌを示すものとする。） で表わされるβ−ウロガストロン誘導体をコードするＤ
   ＮＡ塩基配列。