FI100185B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten insuliinijohdannaisten valm istamiseksi - Google Patents

Description

100185

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten insuliini-johdannaisten valmistamiseksi

Sokeritaudin hoidossa tarvitaan tunnetusti huo-5 mättäviä määriä insuliinia ja insuliinjohdannaisia, joi ta tuotetaankin nykyään suurteknisessä mitassa. Huolimatta siitä, että on jo olemassa huomattava määrä vaikutus-profiililtaan erilaisia insuliinivalmisteita ja -johdannaisia, on jatkuva tarve saada uusia insuliinituotteita, 10 joille on edellisistä poikkeavia ominaisuuksia ja vaikutustapoja yksilöinä sisäisesti ja keskenään vaihtelevien organismien erilaisuuden vuoksi.

Hidastetusti vaikuttavia insuliinijohdannaisia on kuvattu esim. julkaisuissa EP-B-132 769 ja EP-B-15 132 770. Kyse on erityisesti insuliinin B-ketjun B31-

asemassa emäksieesti modifioiduista johdannaisista, joilla on kaava I

20 A1 f-S A21

H-Gly -1- A- ketju--Asn-OH

S S

I (I) s s : " 25 • · · • · · j.B2 810 829 30 31

: ‘ r -Vai----B-ketju-His -R -R

t V* * • · • · I · * ί · * m 30 : 30 joissa R1 on H tai H-Phe, R on neutraalin, geneettises- : *** ti koodattavissa olevan L-aminohapon tähde ja R on luonteeltaan emäksinen, fysiologisesti hyväksyttävä, enintään 50 hiiliatomia sisältävä orgaaninen ryhmä, jonka rakenteessa on 0-3 α-aminohappoa ja jonka valinnainen ter-35 minaalinen karboksyyliryhmä voi olla vapaa, esteri- tai amidiryhmä, laktoni tai pelkistetty ryhmäksi CI^OH.

2 100185 Näille insuliinijohdannaisille on tunnusomaista isoelektrinen piste 5,8 - 8,5 (mitattuna isoelektrisellä fokusoinnilla). Modifioimattoman, natiivin insuliinin tai proinsuliinin isoelektriseen pisteeseen verrattuna 5 (pHrssa 5,4) neutraalialuetta kohti siirtynyt isoelektri nen piste johtuu emäksisen modifioinnin vuoksi molekyylin pinnalla olevasta positiivisesta lisävarauksesta (-varauksista) . Siten nämä emäksisesti modifioidut insuliini-johdannaiset ovat neutraalialueella niukkaliukoisempia 10 kuin esim. natiivi insuliini tai proinsuliini, jotka normaalisti ovat liuenneina neutraalialueella.

Emäksisesti modifioitujen, kaavan I mukaisten insuliinijohdannaisten hidastettu eli depot-vaikutus johtuu niiden niukkaliukoisuudesta isoelektrisessä pis- 15 teessä. Molempien yllä mainittujen julkaisujen mukaan insuliinijohdannaiset pitäisi voida liuottaa uudelleen fysiologisissa olosuhteissa pilkkomalla emäksiset lisä- ryhmät, jolloin pilkkominen hpahtuu kustakin johdannai- : sesta riippuen trypsiinin tai trypsiiniä muistuttavan | 20 entsyymiaktiivisuuden ja/tai karboksipeptidaasi B:n tai . · · · .·, : karboksipeptidaasi B:tä muistuttavan entsyymiaktiivisuu den ja/tai esteraasiaktiivisuuden avulla. Kulloinkin ''.!/ pilkkoutuneet ryhmät ovat joko puhtaasti fysiologisia • · · I . metaboliitteja tai myös helposti metaboloituvia, fysio- • * 25 logisesti hyväksyttäviä aineita.

Yllä mainittua, insuliinin emäksisestä modifioin- « · ♦ ♦ : ** nista johtuvaa depot-periaatetta on hyödynnetty edelleen ♦ · · V * valmistamalla ja käyttämällä vastaavalla tavalla muita ^ emäksisesti modifioituja insuliinijohdannaisia, jotka .···. 30 pääasiassa kuuluvat A- ja B-Retjuihin, vrt. esim. EP-A- • · ’·' 0194 864 ja EP-A-0254 516.

• ♦ : EP-A-0194 864:n mukaisiin insuliinjohdannaisiin • « ·.*·· on liitetty B27-asemassa emäksinen aminohappo ja/tai ase missa A4, A17, B13 ja/tai B21 on neutraali aminohappo; 35 B-ketjun C-terminaalinen karboksyyliryhmä on lisäksi estetty amidi- tai esteritähteellä.

3 100185 EP-A-0254 516:n insuliinijohdannaiset muistuttavat suuresti yllä mainitun EP-Atn insuliinijohdannaisia; mutta pysyvyyden parantamiseksi lievästi happamissa pH-arvoissa vastaavien farmaseuttisten valmisteiden amino-5 happo Asn on tässä tapauksessa korvattu tai voidaan kor vata A21-asemassa muillakin happamassa väliaineessa pysy-vämmillä aminohapoilla kuten Aspraa. Xsn (= asparigiini) eroaa tunnetusti Asprstä (asparagiinihappo) siten, että amidiryhmä estää jomman kumman karboksyyliryhmän: 10

C00H COOH

?

H2N ‘ C " H H N - c - H

« 2 i 15 ch2 ch • , 2 C0NH2 cooh . . Asparagiini Asparagiinihappo ' :\ 20 Modifioimalla edelleen insuliinimolekyylin A- ja ; *: B-ketjua, erityisesti korvaamalla sinkkikempleksin muo- : dostava ja siten määrätyn hidastetun vaikutuksen aiheutta- . va aminohappo His B10-asemassa muilla vastaavilla aminoha- ··, poilla voidaan valmistaa nopeasti vaikuttavia insuliini- 25 johdannaisia, vrt. EP-A-0214 826.

.. Kolmen viimeksi mainitun julkaisun kaikki insuliini- • · johdannaiset on pääasiassa midifioitu A- ja B-ketjussa: • · * *·' ne valmistetaan geeniteknologisesti.

Pyrittäessä parantamaan alussa mainittujen EP-pa- .·*·. 30 tentti julkaisujen EP-B-0132 ja EP-B-0132 770 mukaisten • · · . *. B-ketjujen V-päässä emäksisesti muunnettujen insuliini- • · · ·” | johdannaisten pysyvyyttä happamssa väliaineessa on valin- • · · *· naisesti myös muuttamaan niiden vaikutusprofiilia, on nyt havaittu, että tämä päämäärä saavutetaan edullisesti A21 35 korvaamalla Asn muilla geneettisesti koodattavilla 4 100185 aminohapoilla, joissa ei ole amidiryhmää ja valinnai- B1 0 sesti substituoimalla His muilla geneettisesti koodattavilla aminohapoilla.

Keksinnön kohteena ovat siten insuliinijohdannai-5 set, joilla on kaava II

AI S.-S A21 l I 2

H-Gly-‘-A-ketju--!--R

i I

10 | | di) s s B2 BIO B29 ! 30 31

r -Vai -— B- ketju-X -- R -R

15 2 joissa R1 on H tai H-Phe, R on geneettisesti koodattava L-aminohappo, jossa ei ole amidiryhmää, RJ on neutraalin, ·.·. 31 • · · geneettisesti koodattavan L-aminohapon tähde, R on : : | fysiologisesti hyväksyttävä, luonteeltaan emäksinen or- : 20 gaaninen ryhmä, jossa on enintään 50 hiiliatomia, jonka • · ; rakenteessa on 0-3 α-aminohappoa ja jonka valinnainen päätekarboksyylifunktio voi olla vapaana, esterifunk-tiona, amidifunktiona, laktonina tai pelkistettynä ryh- • · · mäksi CH2OH ja X on geneettisesti koodattava L-aminohap-25 po, ja joiden isoelektrinen pisteon 5-8,5, sekä niiden « · * ** fysiologisesti hyväksyttäväst suolat.

« · · *.* * Uudet insuliini johdannaiset ja niiden fysiologises- ·*·.. ti hyväksyttävät suolat ovat vastaavien farmaseuttisten .***. valmisteiden lievästi happamissa pH-arvoissa pysyviä • · « . *. 30 pitkiäkin aikoja ja niillä on tunnettuihin, muuttamat- * · · | torniin ja emäksisesti modifioituihin, alussa kuvatun kaa- « · ♦ *. " van I mukaisiin insuliinijohdannaisiin verrattuna muut tunut (lyhyempi) vaikutuprofiili, erityisesti kun myös B10

His on vaihdettu muihin aminohappoihin 35 r1 on kaavassa II edullisesti H-Phe.

5 100185 R^:n merkityksessä geneettisesti koodattavia L-aminohappoja, joissa ei ole amidiryhmää, ovat Gly, Ala,

Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Glu, Cys, Met, Arg, Lys,

His, Tyr, Phe, Trp, Pro; edullisia ovat Gly, Ala, Ser, 5 Thr, Asp ja Glu, erityisesti Asp.

30 R :n merkityksessä neutraaleja, geneettisesti koodattavia L-aminohappoja ovat Gly, Ala, Ser, Thr, Vai,

Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe ja Pro, edullisissa ovat Ala, Thr ja Ser.

31 10 R on fysiologisesti hyväksyttävä, luonteeltaan emäksinen orgaaninen ryhmä, jossa on enintään 50 hiili- atomia, jonka rakenteessa on 0-3 α-aminohappoa. Kun 31 ryhmän R rakenteessa ei ole α-aminohappoja, tällaisessa tähteessä tulevat kysymykseen esim. seuraavat emäk-15 siset ryhmät: amino-)C2_g)-alkoksi, (C^_4)-alkyyliamino- (C2_g)-alkoksi, di-(C^ _4)-alkyyliamino-(C2_g)-alkoksi, tri- (C.j _4 ) -ammonio- (C2_g) -alkoksi, amino- (C2_g) -alkyyli-amino, /Tc.j _4)-alkyyliamino/-(C2_g)-alkyyliamino, di-; (0^_4 )-alkyyliamino-(C2_g)-alkyyliamino tai /tri-(C.j_4)- ,·, ; 20 alkyyliamino/-(C2_g)-alkyyliamino, erityisesti -0- (CH2)p-NR2, -0-(CH2)p-N+R3, -NH-(CH2)p-NR2 tai -NH-(CH2)pN+R3, joissa p on 2-6 ja R:t ovat samoja tai eri-; , laisia ja ovat kukin vety tai (C. .)-alkyyli.

;‘; 3 Ί 1—4

Kun R :n rakenteessa on enintään kolme a-aminohap-25 poa, nämä ovat ensisijaisesti neutraaleja tai emäksisiä, • · ; ’·· luonnossa esiintyviä L-aminohappo ja ja/tai näitä vastaa- * % f · via D-aminohappoja. Neutraaleja, luonnossa esiintyviä ;·. aminohappoja ovat erityisesti Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, * · > **·.. Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro ja Hyp. Emäk- t 0 '!* 30 sisiä, luonnossa esiintyviä aminohappoja ovat erityisesti • · *.· : Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit ja His. Jos vain neutraalit a-ami- • # nohapot osallistuvat, niiden terminaalinen karboksyyli-31 ryhmä, jotta R olisi luonteeltaan emäksinen, ei voi olla vapaa; tässä tapauksessa karboksyyliryhmän on oltava 35 esteröity tai amidoitu emäksisellä ryhmällä, jolloin 6 100185 tällaisina emäksisinä ryhminä tulevat kysymykseen suunnilleen samat emäksiset ryhmät, jotka mainittiin yllä 31 tapauksessa, jossa R :n rakenteessa ei ole a-aminohappoja. Nämä emäksiset esteri- tai amidiryhmät voivat 5 luonnollisesti myös estää emäksisten a-aminohappojen kar- boksyyliryhmän. Emäksisten σ-aminohappojen karboksyyli-ryhmän estossa, jos esto on toivottava, voivat kysymykseen myös tulla neutraalit esteri- tai amidiryhmät, kuten (C^gJ-alkoksi, (C3_g) -sykloalkyylioksi, NH2, (C.j_g)-10 alkyyliamino tai di- (C^gl-alkyyliamino.

Terminaalinen karboksyyliryhmä voi tietenkin olla laktoni vain siinä tapauksessa, että terminaalinen aminohappo on hydroksiaminohappo.

Terminaalinen karboksyyliryhmä voi lisäksi olla 15 pelkistetty ryhmäksi CH-OH.

31 Δ R :n muodostavat edullisesti 1, 2 tai 3 yllä mainittua emäksistä, luonnossa esiintyvää aminohappoa; 31 erityisen edullisesti R on Arg-OH tai Arg-Arg-OH.

Ryhmää X merkitsevinä geneettisesti koodattavina 20 L-aminohappoina tulevat kysymykseen samat aminohapot kuin R2:n kohdalla, mutta tässä tapauksessa ovat mahdol- i ' ! lisiä myös geneettisesti koodattavat L-aminohapot, jois- ‘ sa on amidiryhmä eli Asn ja Gin. Viimeksi mainitut - Asn ja Gin - ovat tässä tapauksessa jopa edullisia. Kun Asn 25 ja Gin ovat B10-asemassa, amidiryhmä on kaikissa tapauk- sissa pysyvä lievästi happamassa väliaineessa (päinvas-/-/; toin kuin Asn tai Gin A21-asemassa) .

4

Sekvenssit (A1-A20) ja (B1-B9, B11-B29) ovat edul- , ♦ · *0" lisesti ihmisen , sian tai naudan insuliinin sekvensse- 30 ja, erityisesti ihmisen insuliinin sekvenssejä, j Γ: Kaavan II mukaisten insuliinijohdannaisten esi- 9 ** * merkkejä ovat: 7 100185 A21 B 31

Asp - ihraisen insuliini-Arg -OH

A21

Glu - " A21

Gly - " A21

Ser - " A21 _ Thr - " 5 A21

Ala - " A21 -x. · , . . . * B31 _ B32

Asp - ihmisen insuliini-Arg -Arg -OH

A21

Glu - " A21

Gly - " 10 A21

Ser - " A21

Thr - " A21

Ala " A21 BIO ... . . . . , B31

Asp -Asn - ihmisen insuliini-Arg -OH

15 *A21

Glu - " A21

Gly - " A21

Ser - " A21 • * : Thr - " . . A21 : ; : Ala - " ·.' : 20 '· '· A21 BIO ... Ί . . . B31 B32

. .·. Asp -Asn - ihmisen msuliini-Arg -Arg -OH

: A21

Glu - " A21

Gly - " : : : A21

Ser - " 25 A21

Thr - " f. A21 : '· Ala - " • · « « · « • · « • Kaavan II mukaiset insuliinijohdannaiset valmiste- • » • · : ** taan pääasiassa geeniteknologisesti vakiomenetelmin pis- • · · 30 temutageneesin avulla.

: Tällöin muodostetaan haluttuja kaavan II mukaisia • · · : insuliinijohdannaisia koodaava geenirakenne ja ilmenne tään isäntäsolussa, edullisesti bakteerissa, kuten E.co-lissa tai hiivassa, erityisesti Saccharomyces cerevisiaes-35 sa, ja, jos geenirakenne koodaa fuusioproteiinia, vapau- 8 100185 tetaan kaavan II mukainen insuliinijohdannainen fuusio-proteiinista; analogisia menetelmiä on kuvattu esim. julkaisuissa EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 ja DE-patenttihakemus 5 P 38 21 159.9, 23.6.1988 (HOE 88/F 158).

Fuusioproteiiniosa pilkotaan solujen rikkomisen jälkeen joko kemiallisesti halogeenisyaanilla vrt.

EP-A-0 180 920, tai entsymaattisesti lysostafiinilla, vrt. DE-A37 39 347.

10 Sitten insuliinin esimuoto sulfitolysoidaan hapet- tavasti esim. menetelmän avulla, jonka ovat kuvanneet R.C. Marshall ja A.S. Inglis teoksessa "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (julkaisija A. Darbre) 1986, s. 49-53, ja tämän jälkeen renaturoidaan tiolin 15 läsnä ollessa ja oikeiden disulfidisiltojen muodostuessa esim. menetelmän avulla, jonka ovat kuvanneet Wardlow, A.C ja Dixon G.H. Nature (1960), s. 721-724.

C-peptidi poistetaan pilkkomalla trypsiinillä esim. menetelmän Kemmler ja muut, J.B.C. (1971), s. 6786-6791, . : : 20 mukaan ja kaavan II mukainen insuliinijohdannainen • puhdistetaan tunnetuin tekniikoin kuten kromatografioi- .*· j maila, vrt. esim. EP-A-0 305 760, ja kiteyttämällä.

. .·. Kaavan II mukaiset insuliini johdannaiset, joissa ·' · · 2 R on Asp ja X on His, valmistetaan sopivasti hydroly-' 25 soimalla kaavan I mukaiset tunnetut, emäksi se sti modifioi- '' dut insuliinijohdannaiset happamassa vesipitoisessa väli aineessa (koska tässä tapauksessa on hydrolysoitava vain • · • “ A21-asemassa olevan asparagiinin amidiryhmä) edullisesti • · · * pH-arvossa n. 2-4, erityisesti n. 2,5, ja lämpötilassa j*.e# 30 n. 0-40°C, edullisesti huoneen lämpötilassa.

• .···. Keksinnön mukaisia insuliini johdannaisia, joilla • « ^ on kaava II, ja/tai niiden fysiologisesti hyväksyttäviä • · · ··· *· suoloja (esim. alkali- tai ammoniumsuoloja) käytetään pääasiassa vaikuttavina aineina farmaseuttisessa valmis-35 teessä sokeritaudin hoidossa.

9 100185

Farmaseuttisena valmisteena on edullisesti ruiske-liuos, tai -suspensio, joka on tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhtä kaavan II mukaista insuliinijohdannaista ja/tai vähintään yhtä sen fysiologisesti hy-5 väksyttävää suolaa liuotetussa, amorfisessa ja/tai kiteisessä, edullisesti liuotetussa muodossa.

Valmisteen pH-arvo on edullisesti n. 2,5-8,5, erityisesti n. 4,0-8,5, se sisältää sopivaa isotonista ainetta, sopivaa säilöntäainetta ja valinnaisesti sopivaa 10 puskuria ja siinä on edullisesti myös määrätty sinkki- ionipitoisuus, kaikki tietenkin steriilissä vesiliuoksessa. Valmisteen kaikki aineosat vaikuttavaa ainetta lukuunottamatta muodostavat yhdessä valmisteen kantajan.

Sopivia isotonisia aineita ovat esim. glyseroli, 15 glukoosi, mannitoli, NaCl, kalsium- tai magnesiumyhdisteet, kuten CaC^f MgC^ jne.

Isotonisen aineen ja/tai säilöntäaineen valinnalla vaikutetaan insuliinijohdannaisen tai sen fysiologisesti vaikuttavan suolan liukoisuuteen lievästi happamissa pH- ··* 20 arvoissa.

: Sopivia säilöntäaineita ovat esim. fenoli, m-kre- : soli, bentysylialkoholi ja/tai hydroksibentsoehappoesteri.

:,· · Puskuriaineina, erityisesti pH-arvon säätämiseksi välille n. 4,0-8,5, voidaan käyttää esim. natriumasetaat- :Y: 25 tia, natriumsitraattia, natriumfosfonaattia jne. pH-arvon säätämiseksi sopivia ovat lisäksi myös fysiologisesti hy- ;·. väksyttävät laimeat hapot (tyypillisesti HCl) tai emäs- « · · liuos (tyypillisesti NaOH) .

• i ·

Kun valmiste sisältää sinkkiä, sinkin pitoisuus on • · • *·· 30 edullisesti 1 ,ug-2 mg, erityisesti 5-200 ,ug sinkkiä/ml.

• · · / ·

Keksinnön mukaisen valmisteen vaikutusprofiilin : .·. vaihtelemiseksi mukaan voidaan sekoittaa myös modifioima- • · « \ tonta insuliinia, edullisesti naudan, sian tai ihmisen ' ' insuliinia, erityisesti ihmisen insuliinia.

10 100185

Edullisia vaikuttavan aineen pitoisuuksia ovat sellaiset, jotka vastaavat n. 1-1500, edullisemmin n. 5-1000 ja erityisesti n. 40-400 kansainvälistä yksik-köä/ml.

5 Seuraavät esimerkit selventävät tarkemmin keksintöä.

A) Geeniteknologinen valmistus

Esimerkki 1

Plasmidin muodostaminen Gly(A21)-ihmisen insuliini-Arg (B31-OH):n valmistamiseksi 10 DE-patenttihakemuksessa P 38 21 159.9 (HOE 88/F 158) kuvataan plasmidi pSW3.

Plasmidi-DNA:n käsitellään restriktioentsyymeillä Pvu2 ja Sali ja sitten naudan alkalisella fosfataasilla. Molemmat muodostuneet fragmentit erotetaan toisistaan 15 geelielektroforeettisesti ja suuri fragmentti eristetään.

Tämä fragmentti liitetään T4-DNA-ligaasireaktiossa seu-raavaan synteettiseen DNA-sekvenssiin:

5’- CTG GAA AAC TAC TGT GGT TGA TAG

20 GAC CTT TTG ATG ACA CCA ACT ATC AGCT - 5' :'· : Kompetentit E. coli W3110-solut transformoidaan . ligaatioannoksella. Transformointiseos annostellaan NA- levyille, jotka sisältävät 20 ug Ap (= ampisilliini)/ml, ja inkuboidaan yli yön 37 C:ssa. Yksittäisistä pesäk-25 keistä saadaan yliyönviljelmä ja tästä saadaan plasmidi-DNA. Tämä DNA karakterisoidaan restriktioanalyysin ja • · ·φ<|* DNA-sekvenssianalyysin avulla. Oikeat plasmidit, jotka • · » *·* koodaavat muutettua A-ketjua, nimitetään pIKlOOrksi.

Ekspressio tapahtuu yllä mainitun DE-patenttihakemuksen • ·*'*: 30 p 38 21 159.9 esimerkin 3 mukaisesti. Myös modifioitu • · · . *. mono-Arg-insuliini valmistetaan tässä patenttihakemuksessa • · · *** * kuvatun modifioimattoman mono-Arg-insuliinin valmistus- ' "· menetelmän mukaisesti.

11 100185

Esimerkki 2

Plasmidin muodostaminen Ser(A21)ihmisen insuliini-(Arg B31-OH):n valmistamiseksi

Muodostaminen tapahtuu yllä olevassa esimerkissä 5 kuvattua tietä. Mutta synteettinen DNA-sekvenssi on muunnettu seuraavasti:

5'- CTG GAA AAC TAC TGT TCA TGA TAG

GAC CTT TTG ATG ACA AGT ACT ATC AGCT - 5' 10 Saadaan plasmidi pIK110, jolle on tunnusomaista

BspHl-tunnistuslisäsekvenssi.

Esimerkki 3

Plasmidin muodostaminen Gly(A21)-Asn(B10)-ihmisen insu-liini-Arg(B31-OH):n valmistamiseksi 15 Plasmidin pIKlOOtn DNA pilkotaan restriktioentsyy- meillä Hpal ja Dra3 ja käsitellään naudan alkalisella fosfataasilla. Molemmat muodostuneet fragmentit erotetaan toisistaan geelielektroforeettisesti ja suurempi . . fragmentti eristetään. Fragmentti liitetään synteetti- , 20 sen DNA-sekvenssiin 5' - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC TTG ; ;·; TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA TTG - 5' V ' ja kompetentit E. coli W3110-solut transformoidaan V/' 25 ligaatioseoksella. Muodostuneen plasmidin pIK101 muu karakterisointi tapahtuu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Esimerkki 4

Plasmidin muodostaminen Ser (A21)-Asn (B1 0)-ihmisen insu- « · · * • liinin valmistamiseksi • · • · ί ** 30 Muodostaminen vastaa esimerkissä 3 kuvattua kloo-

5,..: nausta, mutta lähtöaineena käytetään plasmidin pIKlIO

* : DNA:ta.

• * · • ♦ # ♦ .·. : Uudelleen muodostettu plasmidi saa nimen pIK111 .

12 100185

Esimerkki 5

Ekspressioplasmidin muodostaminen apinaproinsuliinia varten

Apinan proinsuliini eroaa ihmisen proinsuliinista 5 pelkästään siten, että yksi ainoa aminohappo on vaihdettu C-peptidissä (B37-Pro Leu:n asemasta ihmisen proinsu-liinin tässä asemassa).

Plasmidi pSE3 avataan entsyymeillä Hpal ja Sali ja jäännösplasmidi-DNA eristetään. EP-A-0 229 998:ssa 10 kuvatusta plasmidista pK50 eristetään Dra3-Sall- apinan proinsuliinifragmentti. Molemmat fragmentit kytketään synteettiseen DNA-fragmenttiin

5’ - AAC CAG CAC CTG TGC GGT TCT CAC CTA

TTG GTC GTG GAC ACG CCA AGA GTG - 5' 15 T4-DNA-ligaasireaktiossa. Saadaan plasmidi pSW2, jonka DNA toimii seuraavassa lähtöaineena muodostettaessa di-Arg- ihmisen insuliinijohdannaisia koodaavat ekstres-s ioplasmidit.

: 20 Esimerkki 6 ·. : : Plasmidin muodostaminen Gly (A21)-ihmisen insuliini-Arg- :'· (B31) -Arg (B32) -OH:n valmistamiseksi

Plasmidin pSW2 DNA pilkotaan kuten esimerkissä 1 , ; , entsyymeillä Pvu2 ja Sali ja liitetään esimerkin 1 syn- 25 teettisen DNArhan; näin muodostuu plasmidi pSW21.

Esimerkki 7 .. Plasmidin muodostaminen Ser (A21)-ihmisen insuliini- * ·

Arg(B31)-Arg(B32)-OH:n valmistamiseksi • ♦ · *·] ‘ Käyttäen lähtöaineena pSW2-FNA:ta muodostetaan plas- ;*· 30 midi pS22 kuten esimerkissä 2.

• j‘“; Esimerkki 8 • · t " , Plasmidin muodostaminen Gly(A21)-Asn(BIO)-ihmisen insu- « · · *“ * liini-Arg(B31)-OH:n valmistamiseksi Käyttäen lähtöaineena pSW21-DNA:ta muodostetaan 35 plasmidi pSW23 kuten esimerkissä 3.

13 100185 Tällöin käytetään synteettisenä DNA-sekvenssinä seuraavaa sekvenssiä:

5’ - AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT AAC CTA

_ TTG GTT GTG AAC ACA CAA AGA TTG - 5’ 5

Esimerkki 9

Plasmidin muodostaminen Ser(A21)-Asn(B10)-ihmisen insu-liini-B31(Arg)-B32(Arg)-OH:n valmistamiseksi Käyttäen lähtöaineena pSW22-DNA:ta muodostetaan 10 plasmidi pSW24 kuten esimerkissä 4 käyttäen esimerkissä 8 kuvattua synteettistä DNA-sekvenssiä.

A21 B31 B32 B) Asp -ihmisen insuliini-Arg -Arg -OH:n valmis- B31 332 tus ihmiseninsuliini-Arg -Arg -OH:sta hydrolysoimalla B31 332 15 Lietetään 1 g ihmisen insuliini-Arg -Arg OH:ta 100 ml:aan vettä. Lisäämällä HCltää pH säädetään arvoon 2,5 ja liuosta seisotetaan 37°C:ssa. Viikon kulut- A21 tua noin puolet materiaalista on reagoinut Asp -ihmisen B31 B32 insuliini-Arg -Arg -OH:ksi. Tuote erotetaan lähtöai- 20 neksesta tunnettuun tapaan ioninvaihtimella, saostetaan eluaatista ja kiteytetään proteiinipitoisuuden ollessa 5 g/1 pH:ssa 6,0 puskurista, jossa on litraa kohti 10,5 g sitruunahappoa, 1 g fenolia ja 5 ml 1-prosenttista sinkki- A21 . kloridiliuosta. Saanto on 390 mg Asp -ihmisen insuliini- . B31 _ B32 .

25 Arg -Arg :ta.

C) Ruiskeliuoksen valmistus * 1 «

Kohdan B mukainen insuliini johdannainen, jonka I » 4 pitoisuus on 1,4 mg/ml, liuotetaan steriiliin kantaja- • 1 : ·· 30 liuokseen, jonka koostumus on seuraava (per ml): 18 mg ··· 2 + glyserolia, 10 mg bentsyylialkoholia, 80 ug Zn , pH 4,0.

« l • ♦ i · < • » · ' »· » · 14 100185 A21 e 31 B3 2 D) Asp -ihmisen insuliini-Arg -Arg -OH-vaikutus- B Ί1 profiili koirassa verrattuna ihmisen insuliini-Arg -

ArgB32-OH:hon ja Basal-H-Insulin'iin HoechstR = NPH-val- miste (neutraali protamiini Hagedornin mukaan), jossa 2 + 5 on n. 10^,ug Zn

Verensokeri prosentteina lähtöarvosta tuntia (h)

Valmiste 1 h 2 h 3 h 5h 7h £2η--—— --

Aso -ihmisen insu-

Keksinn&i Ulni-Arg832- 10 mukainen ArgB32-OH 99 62 51 75 98

Ihmisen insuliini-doi ooo

Vertailu Arg -Arg -OH 77 52 64 85 98

Basal-H-insulin 15 Hoechst^ 71 49 59 83 100 . A21

Tama esimerkki osoittaa, että Asp -ihmisen insu- B3ί b32 liini-Arg -Arg -OH:11a on sama edullinen perusprofii-, li kuin ihmisen insuliini-ArgB31 -ArgB32-OH: 11a. Lisäksi : 20 Asp -ihmisen insuliini-Arg -Arg -OH:n edullisena ominaisuutena on yhdisteen pitkäaikaspysyvyys valituissa olosuhteissa.

* · • » i · ♦ « I : : *.

» · < * % ( * f t f * t ; r * * • • * « · · • · f • ·« · 0 m

Claims (9)

15 100185

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten insuliini johdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava II AI S --S Af H-Gly-1-A- ketju---R S s

10. I (II) s S B2 Bl° 529 30 31 R - Vai--B-ket ju -X --R ~R 15 jossa R1 on H tai H-Phe, . : : R2 on geneettisesti koodattava L-aminohappo, jossa • ei ole amidiryhmää, : 20 R30 on neutraalin, geneettisesti koodattavan L-ami- nohapon tähde, R31 on 1 - 3 a-aminohappoa, joissa mahdollisesti oleva terminaalinen karboksyyliryhmä voi olla vapaana, esteriryhmänä, amidiryhmänä, laktonina tai pelkistettynä 25 ryhmäksi CH2OH, ja • · : *’ X geneettisesti koodattava L-aminohappo, « · · V · ja joiden isoelektrinen piste on 5 - 8,5, sekä näiden in- » suliini johdannaisten fysiologisesti hyväksyttävien suolo- .···, jen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että • · ’·] 30 a) ilmennetään näitä insuliini johdannaisia koodaa- • · « ·'·! ! vat geenirakenteet isäntäsolussa, edullisesti bakteerissa • · :,’v tai hiivassa ja, jos geenirakenteet koodaavat fuusioprote- iinia, vapautetaan kulloinkin kaavan II mukainen insuliini johdannainen saadusta fuusioproteiinista, tai 16 100185 b) kaavan II mukaisten insuliinijohdannaisten valmistamiseksi, joissa R2 on Asp ja X on His, insuliinijohdannaisia, joilla on kaava I

5 AI S--S A21 H-Gly -1-A -ketju —I-Asn-OH S S I (I)

10 SS B2 BIO B29 1 30 31 R -Vai -B- ketju-His -R -R 15 jossa R1, R30 ja R31 ovat edellä kaavalle II määriteltyjä, hydrolysoidaan happamassa, vesipitoisessa väliaineessa ja mahdollisesti muutetaan näin muodostuneet kaavan II mukai- • · set insuliini johdannaiset fysiologisesti hyväksyttäviksi I I j suoloikseen. : · : 20 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukai-siä insuliinijohdannaisia, joissa R1 on H-Phe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, * t « tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukai- .. 25 siä insuliinijohdannaisia, joissa R2 on Gly, Ala, Ser, Thr, • · ·.,] Asp tai Glu, edullisesti vain Asp. • · · *·1 2 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene- telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan • II mukaisia insuliinijohdannaisia, joissa R30 on Ala, Thr ··« . 1. 30 tai Ser. • · ·

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene- • · « 2 telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukaisia insuliinijohdannaisia, joissa R31 on Arg-OH tai Arg-Arg-OH. 17 100185

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukaisia insuliinijohdannaisia, joissa X on Asn tai Gin.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukaisia insuliinijohdannaisia, joissa sekvenssit (Al-A20) ja (B1-B9, B11-B29) ovat ihmisen, sian tai naudan insuliinin sekvenssejä, erityisesti ihmisen insuliinin sekvenssejä. • · • · · • « » • · « • · · • · • · • · 1 • · 1 « · • · · • · · • · « • · · · • » • · · • · · • « 18 100185