FI80277B

FI80277B - Foerfarande foer framstaellning av en kristallsuspension av insulinderivat.

Info

Publication number: FI80277B
Application number: FI842981A
Authority: FI
Inventors: Ulrich Grau
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-07-29
Filing date: 1984-07-26
Publication date: 1990-01-31
Also published as: JPH0764876B2; JPS6051118A; KR910009344B1; FI842981A0; ATE32729T1; EP0133285B1; PH22649A; GR82438B; IE841947L; NO843048L; IE57711B1; PT78980A; US4959351A; NO167207C; ES534684A0; DK172241B1; DK368884A; NO167207B; FI80277C; DE3469535D1

Description

1 80277

Menetelmä insuliinijohdannaisten kldesuspension valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä insuliinijohdan-5 naisten kldesuspension valmistamiseksi.

Insuliinin kiteytyminen on sekä rakenneanalyyttiset työt [Adams et ai., Nature 224 (1969) 491, The Peking Insulin Structure Research Group, Sc. Sinica XVII, 152-218 (1974)] että farmaseuttiset sovellutukset [Schlichtkrull, 10 Insulin-Kristalle (1961)] huomioonottaen intensiivisesti tutkittu alue. Mitä tulee terapeuttiseen käyttöön hitaasti vaputuvana insuliinimuotona, etualalla on tällöin mahdollisimman tarkasti rajattu kidekoko, jonka ei yleensä tulisi ylittää noin 30 pm:ä, jotta pinta riippuu suoraan ja 15 toistettavalla tavalla insuliinin absoluuttisesta määrästä. Sellaisten ns. monodisperssien suspensioiden yhteydessä on odotettavissa määrätty takaisinliukenemiskinetiikka.

Esimerkkejä terapeuttisesti käytetyistä insuliini-kidesuspensioista, joilla on tällaiset ominaisuudet, ovat 20 suspensiot, jotka sisältävät kooltaan noin 25 pm:n rom-boedrisiä sinkki-insuliinikiteitä, jotka ovat stabiileja neutraalissa pH:ssa, kun mukana on 0,8-2,5 % sinkkiä (insuliinin massasta laskettuna) ja joilla on hidastunut vaikutus, ja isofaani-insuliini-protamiinikiteitä, joilla on 25 noin 10 pm pitkinä ja noin 1 pm paksuina sauvoina käyttöä hitaasti insuliinia vapauttavissa valmisteissa.

Lisäksi tunnetaan joitakin muita insuliinin kide-muunnoksia, jotka ovat toistaiseksi olleet kiinnostavia ainoastaan rakenteen röntgenanalyysin kannalta. Happamissa 30 olosuhteissa on saatu sinkittömiä ortorombisia ja monok-liinisiä kiteitä [Einstein & Low, Actga Cryst, 15 (1962) 32-34]. Isoelektrisessä pisteessä on saatu, samoin ilman sinkin mukanaoloa, pienempiä rombododekaedrejä, jotka ovat järjestyneet kuutioineeksi avaruusryhmäksi 35 [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle (1961)]. Schlichtkrull 2 80277 on kuvannut vielä myös erästä insuliinin monoklilnista kidemuotoa, joka saadaan isoelektrisen pisteen yläpuolella sinkin ja fenolin tai fenolijohdannaisten ollessa mukana. Nämä kiteet kasvavat muutamassa päivässä huomattavan suu-5 riksi (jopa 3 mm:n kokoisiksi) ja ovat teräväsärmäisiä. Kiinnostavaa kyllä, näitä kiteitä löydettiin ainoastaan lasipinnalta mutta ei liuoksen vapaalta pinnalta [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle, s. 57-60 (1961)].

Insuliiniin tai proinsuliiniin verrattuna erilainen 10 kiteytymiskäyttäytyminen havaitaan sellaisilla insuliini- johdannaisilla, joilla on nettovarauksessaan vähintään yksi positiivinen varaus enemmän ja joiden isoelektrinen piste on siten siirtynyt korkeampaan pH-arvoon. Niihin kuuluvat erityisesti sellaiset johdannaiset, jotka sisäl-15 tävät B-ketjun C-pääteasemassa luonteeltaan emäksisen li-säryhmän, kuten esimerkiksi haimauutteista tunnetusti pieninä määrinä löytyvät proinsuliinin hajoamistuotteet in-suliini-ArgB31-OH ja insuliini-ArgB3 1-ArgB32-OH. Muita ominaisuuksiltaan samankaltaisia johdannaisia on saatavis-20 sa puolisynteettisesti. Sellaisia insuliinijohdannaisia, menetelmiä niiden valmistamiseksi, niitä sisältäviä aineita sekä niiden käyttöä käsittelevät DE-patenttihakemukset P 33 26 672.4 (HOE 83/F 141) ja P 33 26 473.2 (HOE 83/F 142).

25 Ne sisältävät esimerkiksi muita emäksisiä aminohap poja tai emäksisiä aminohappojohdannaisia (esim. D-amino-happoja, ornitiinia, hydroksilysiiniä tai argininolia) arginiinin tilalla tai sen lisäksi tai C-pääteasemassa yksinkertaisten alkoholien tai amiinien muodostaman esteri-30 tai amidiryhmän. Alkoholi tai amiini voi tällöin tuoda mukanaan ylimääräisen positiivisen varauksen, kuten esimerkiksi insuliini-(B30)-kolinesterissä.

Nyt on yllättäen todettu, että nämä johdannaiset voidaan kiteyttää isoelektrisen pisteensä läheisyydessä 35 il 3 80277 vesiväliaineesta ja jonkin aromaattisen hydroksiyhdisteen ollessa mukana muodoltaan hyvin homogeenisena prismoina, joiden koko on noin 10 pm.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää yhden tai 5 useamman kaavan I mukaisen insuliinijohdannaisen kidesus-pension valmistamiseksi, jolloin kiteiden koko on noin 10 pm, AI ;— S-S- A21 10 _1_

H- Gly A-ketju Asn [-0H

I I

s s s s (I) 15 B2_ B29 r1~ Vai_B-ketju_| -R^®R^ 4 80277 suliinijohdannainen tai -johdannaiset kiteytetään väliaineesta lähellä johdannaisen tai johdannaisten isoelektris-tä pistettä isotoniseksi tekevän glyserolin ja vähintään yhden fenolin läsnäollessa.

5 Erityisen edullisia insuliinijohdannaisia ovat sel laiset, joilla on kaava I, jossa R1 on H-Phe ja/tai R30 on Ala, Thr tai Ser ja/tai X merkitsee luonnossa esiintyvän emäksisen L-aminohapon, kuten Arg:n, Lys:n, Orn:n, Cit:n, Hyi:n tai His:n, tai sitä vastaavan D-aminohpaon 10 tähdettä.

Edullisia ovat lisäksi sellaiset peptidit, joiden rsi-ryhmä sisältäessään aminohappotähteitä tai aminohappo johdannaisista (esim. vastaavista alkoholeista tai lak-toneista) peräisin olevia ryhmiä sisältää sellaisia yksin-15 omaan L-muodossa.

Neutraaleilla, luonnossa esiintyvillä aminohapoilla tarkoitetaan erityisesti aminohappoja Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro ja Hyp. Emäksisillä luonnossa esiintyvillä aminohapoilla tarkoite-20 taan erityisesti aminohappoja Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit ja His.

Kysymykseen tulevat erityisesti myös sellaiset kaavaa I vastaavat peptidit, joiden C-pääteasemassa on jokin karboksyyliryhmää suojaavista ryhmistä Cx_6-alkoksyyli, 25 C3.6-sykloalkoksyyli, NH2, C3. 6-alkyyliamino, di-C3_6-al-kyyliamino, amino-C1_6-alkoksyyli, Cx. 4-alkyyliamino-C2.6-alkoksyyli, di-C^ . 4-alkyyliammonium-C2.6-alkoksyyli, tri-C^ _ 4 -alkyyliammonium-C2 _ 6 -alkoksyyli, amino-C2.6 -al-: : kyyliamino, (Cj. 4-alkyyliamino)-C2.6-alkyyliamino, (di- ’.· 30 Cx _ 4 -alkyyliamino)-C2.6 -alkyyliamino ja (tri-C^ _4-alkyyli- ammonium)-C2_6-alkyyliamino.

Il 5 80277

Karboksyyliryhmää suojaavia emäksisiä ryhmiä ovat erityisesti -O-(CH_) -NR„, -O- (CH„) -NR-,, -NH-(CH_) -NR~

@ Z p Z ZpJ Z p Z

ja -NH-(CH2)p-NR3, joissa p on 2-6 ja R:t voivat olla samoja tai eri ryhmiä ja merkitsevät vetyä tai C^_^-al-5 kyyliä.

Kaavan I mukaiset insuliinijohdannaiset sisältävät edullisesti ihmis-/ sika- tai nautainsuliinijakson.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan saada esimerkiksi seuraavien insuliinijohdannaisten kidesus- 10 pensioita (keksinnön rajoittumatta näihin).

31

Ihmisinsuliini-Arg -OH

OI DOO

Ihmisinsuliini-Arg -Ala -OH

B31

Sikainsuliini-Arg -OH

Dll Dll

Sikainsuliini-Arg -Ala -OH

B31

15 Nautainsuliini-Arg -OH

nOI dOO

Nautainsuliini-Arg -Arg -OH

Bi B21

Des-Phe -sikainsuliini-Arg -OH

Bl B31

Des-Phe -ihmisinsuliini-Arg -OH

Rl R^l r> } o

Des-Phe -sikainsuliini-Arg -Arg -OH

Bl B31 B32

20 Des-Phe -ihmisinsuliini-Arg -Arg -OH

B31

Sikainsuliini-Arg -OCH~ B31 ^

Ihmisinsuliini-Arg -OCH..

B31 ^

Nautainsuliini-Arg -OCH,

DO1 DOO

Sikainsuliini-Arg -Arg -OCH..

B31 B32 ^ 25 Ihmisinsuliini-Arg -Arg -OCH^

Des-ThrB3^-ihmisinsuliini-ValB3^-ArgB3^-OH

Des-ThrB30-ihmisinsuliini-ValB30-AlaB31-ArgB32-OH

B31

Ihmisinsuliini-Lys -OH

B31

Ihmisinsuliini-D-Arg -OH

B31 B32

30 Ihmisinsuliini-D-Arg -Arg -OH

B31 B32

Ihmisinsuliini-Arg -D-Arg -OH

Ihmisinsuliini-LysB31-ArgB32-OH

. . . . . _ B31 _ B32

Ihmisinsulnni-Arg -Lys -OH

Ihmisinsuliini-argininoliB3^ R 31 R 3 2

35 Ihmisinsuliini-Val -Arg -OH

T. . . „ . B31 . B32 _ B33 λτι

Ihmisxnsulnni-Val -Arg -Arg -OH

6 80277 B31 ES 2

Ihmisinsuliini-Arg -argininoli . . . . . . τ B31 _ B3 2 B33

Ihmismsuliini-Lys -Arg -Arg -OH

B 31

Ihmisinsuliini-Arg -NH _.

5 B31 R39

Ihmisinsuliini-Arg -Arg -NH — -- B31

Ihmisinsuliini-Arg -NH- d*31 10 Ihmisinsuliini-Arg -Arg -NH- B 31 ^

Ihmisinsuliini-Orn -OH

B31 B32

Ihmisinsuliini-Leu -Cit -OH

Ihmisinsuliini-(B30)-0-CH2-CH2-NH2

Ihmisinsuliini-(B30)-NH-CH--CH--NH- B31 ^ ^ ^ 15 Ihmisinsuliini-Arg -0-CH--CH--NH- B 31 ^ ^ ^

Ihmisinsuliini-Arg -CH-.-CH-.-N(CH.,)- Δ ^ (X) Ο Δ

Ihmisinsuliini-(B30)-0-CH--CH-N(CH-) - 2 2 φ 3 3

Ihmisinsuliini- (B30) -NH-CH--CH--N (CH3) -,

D3I i Z Ä J

Ihmisinsuliini-Leu -0-CH--CH--CH--N(C-H-)_ B31 2 mo 2 5 3 φ 20 Ihmisinsuliini-Trp -TrpBJ^-TrpBJJ-NH-(CH2)g-N(n-Bu)3

Kaavan I mukaisia insuliinijohdannaisia valmistetaan a) kondensoimalla des-oktapeptidi(B23-30)-insuliini, jolla on kaava II, 25 AI rS-S-η_A21

S^- | Gly A-ketju Asn -OH

S (II)

30 SS

B2 I | B22

S1-R1- Vai B-ketju Arg] -OH

jossa R merkitsee Phe:a tai suoraa sidosta ja S merkitsee 35 protonisolvolyysillä tai /S-eliminaatiolla lohkaistavissa olevaa aminoryhmän suojausryhmää, kuten t-butyloksikarbonyy- 7 80277

li- (Boc), t-amyloksikarbonyyli- (Aoc) tai metyylisulfonyyli-etyloksikarbonyyliryhmää (Msc), peptidin kanssa, jolla on kaava III

5 H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S2)-Thr(S2)-Pro-Lys(S3)-R30-R31 (III) jossa R30:llä ja R3^:llä on edellä esitetyt merkitykset, 2 3 S merkitsee vetyä, Bzl:ä tai t-butyyliä ja S merkitsee uretaaniryhmää suojaavaa ryhmää, kuten ryhmää Bos, Moc, Fmoc 10 tai Z, jolloin ryhmiin R3^ ja R3^ mahdollisesti sisältyvät vapaat COOH-, OH-, SO-, 6J-NH2-, guanidiini- ja/tai imidatso-liryhmät ovat tarvittaessa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuja, ja poistamalla sen jälkeen mahdolliset suojausryh-mät sinänsä tunnetulla tavalla, 15 b) antamalla des-B30-insuliinin, jolla on kaava I, jossa r"* on H tai H-Phe ja C-terminaaliset R3® ja R31 merkitsevät yhdessä OH-ryhmää, reagoida trypsiinin tai trypsii-niä vastaavan endopeptidaasin läsnäollessa yhdisteen kanssa, jolla on kaava IV, 20 H-R30-R31 (IV) jossa R3^:llä ja R3^:llä on edellä esitetyt merkitykset ja jossa esiintyvät vapaat funktionaaliset COOH-, OH-, SH-, £o-NH2-, guanidiini- ja/tai imidatsoliryhmät ovat tarvittaessa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuja, ja poistamalla 25 sen jälkeen mahdolliset suojausryhmät sinänsä tunnetulla tavalla tai siten, että c) sellaisen insuliinijohdannaisen, joka sisältää 31 ryhmässä R L-konfiguraation omaavia aminohappotähteitä, valmistamiseksi proinsuliini, proinsuliinijohdannainen 30 preproinsuliini tai preproinsuliinijohdannainen tai näiden yhdisteiden välituote hajotetaan kemiallisesti ja/tai entsymaattisesti.

B1 Lähtöaineyhdisteinä käytettäviä des-Phe -insuliineja tunnetaan esimerkiksi DE-patenttijulkaisusta 20 05 658 tai 35 EP-hakemusjulkaisusta 46 979.

Menetelmävaihtoehdossa b) lähtöaineyhdisteinä käytet- 8 80277 täviä des-B30-insuliineja tunnetaan esimerkiksi EP-hakemus-julkaisusta 46 979 tai artikkelista Hoppe-Seyler, Z. Physiol. Chem. 359 (1978) 799. Vaihtoehdossa b) käytettävä kaavan IV mukainen lähtöaine valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla 5 peptidikemiallisin menetelmin. Yhdisteen IV suojaamisessa käyttökelpoisia suojausryhmiä kuvataan yksityiskohtaisesti kirjassa M. Bodanzky et ai., Peptide Synthesis, 2. painos, Wiley & Sons, 1976.

Geeniteknologisin menetelmin on saatavissa ihmisen tai 10 kädellisten proinsuliinia lähtöaineeksi menetelmävaihtoehtoon c). Johdannaiset Arg(B31) ja di-Arg(B31-32) voidaan saada siitä yksinkertaisella hajotuksella trypsiinin tai trypsiininkaltaisten entsyymien avulla. Sen lisäksi voidaan myös suhteellisen yksinkertaisesti muodostaa plasmideja, 15 jotka vastaavien preproinsuliinijohdannaisten pilkkoutumisen kautta johtavat uusiin insuliinijohdannaisiin, koska ne koodaavat luonnossa asemassa B31 tai B32 esiintyvien argi-niinien asemesta muita neutraaleja tai emäksisiä aminohappoja .

20 Proinsuliinin valmistus yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen edellyttää proinsuliiniaminohappojaksoa koodaavan DNA-jakson muodostamista, joka on toteutettavissa joko eristämällä tai rakentamalla tai käyttämällä näiden molempien yhdistelmää. Proinsuliini-DNA:a käytetään luentajak-25 sossa sopivassa kloonaus- ja ilmentämisvektorissa. Vektori transformoi soveltuvan mikro-organismin, ja näin saatava transformoitu mikro-organismi asetetaan sitten fermentointi-olosuhteisiin, mikä johtaa proinsuliinipitoisen vektorin uusien kopioiden muodostumiseen ja proinsuliinin, puhdas-30 insuliinijohdannaisen, proinsuliinin esiasteen tai preproinsuliini johdannaisen ilmentymiseen.

Ilmentymistuotteen ollessa proinsuliinin esiaste kyseinen tuote sisältää yleensä proinsuliinin aminohappo-jakson, joka on sitoutunut pääteaminoryhmästään sellaiseen 35 proteiinipalaseen, jona geenijakso, jossa proinsuliini tai proinsuliinijohdannainen on määrätty, normaalisti ilmentyy.

9 80277

Proinsuliinin aminohappojakso on liittynyt proteiinipala-seen spesifisesti pilkottavissa olevan kohdan kautta, jossa esiintyy esimerkiksi metioniini. Saatava proinsuliinin aminohappojakso lohkaistaan yhteensulautuneesta geenituot-5 teestä, esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa 32 32 036 kuvatulla tavalla, ja puhdistuksen jälkeen proinsuliini eristetään .

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä kitey-tysväliaine voi sisältää sinkkiä, jolloin sinkin määrä on 10 edullisesti korkeintaan 1 %, edullisesti enintään 0,8 %, insuliinijohdannaisen massasta laskettuna. Tavallisesti kiteytymiseen riittävät vain suhteellisen pienet sinkki-määrät, suurimmillaan 40 ^ug/100 yksikköä, edullisesti kuitenkin alle 30 ^,ug/100 yksikköä, jollaisia määriä voi 15 tietyissä olosuhteissa sisältyä jo kuiva-aineeseen.

Kiteyttäminen tapahtuu edullisesti pH-alueella, joka ulottuu yhden pH-yksikön isoelektrisen pisteen alapuolelle sekä yläpuolelle (Pj“ 1). pH:n säätö voidaan kyseisessä tapauksessa suorittaa puskureiden (esim. fosfaatti-, ase-20 taatti- tai sitraattipuskureiden) avulla.

Kiteytysväliaine sisältää lisäksi fenolia, kresolia tai muuta vastaavaa aromaattista yhdistettä. Kiteytyslämpö-tila on edullisesti 3-27°C, erityisesti 10-20°C. Suspensiota voidaan liikuttaa (esim. sekoittaa sekoitusastiassa) kevy-25 esti prosessin aikana. Kaavan I mukaisen insuliinijohdannaisen pitoisuus on ennen kiteytymistä edullisesti noin 0,2-40 mg/ml, erityisesti 1-7,5 mg/ml.

Kiteet voidaan tuottaa myös esimerkiksi sellaisessa väliaineessa, joka on jo valmiiden injektiosuspensioiden 30 (joita käytetään puhtaissa, insuliinia hitaasti vapauttavissa valmisteissa) mukainen. (Steriili) väliaine voi sen mukaisesti jo sisältää fenolin tai muiden vastaavien aromaattisten yhdisteiden ja mahdollisen sinkin ohella isotoniseksi tekevää ainetta, kuten esimerkiksi NaCl tai gly-35 serolia, sekä puskurlainetta, kuten esimerkiksi natrium-fosfaattia .

10 80277

Suhteellisen suuren kidekoon ja kiteiden homogeenisuuden muodostamien etujen lisäksi suhteellisen pieni sinkkipitoisuus, joka on pienempi kuin se pitoisuus, jossa sinkkiä pidetään depot-kantajana, tekee mahdolliseksi kek-5 sinnön mukaisesti valmistettujen kidesuspensioiden sekoittamisen vapaasti liuenneessa muodossa olevan insuliinin kanssa. Siten on esimerkiksi mahdollista yhdistää insulii-niliuoksia insuliinijohdannaiskiteitä sisältäviin suspensioihin ennen käyttöä. Kunkin komponentin osuutta muutta-10 maila voidaan säätää siten saatavan lääkkeen vaikutuspro-fiilia parhaalla mahdollisella tavalla.

Mikäli suurempi sinkkipitoisuus olisi tarpeen kiteiden stabiilisuuden kannalta (niin kuin on asia esimerkiksi rombisten sinkki-insuliinikiteiden yhteydessä), li-15 sättävä liuotettu insuliini saostuisi eikä olisi enää tehokas nopeasti vaikuttavana komponenttina.

Esitettyjä johdannaisia sisältävillä kidesuspen-sioilla esiintyvät ihanteellisella tavalla ne ominaisuudet, jotka ovat toivottavia diabetes mellitus -taudin hoi-20 don kannalta. Hidastusperiaate kuuluu luonnostaan yhteen insuliinijohdannaisten kanssa ja pohjautuu erääseen pro-teiinikemialliseen ilmiöön, vaikealiukoisuuteen isoelekt-risessä pisteessä.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

25 Esimerkki 1

Sian proinsuliinista trypsiinillä hajottaen valmistettu sikainsuliini-ArgB31-ArgB32-OH kidesuspensiona, joka sisältää kooltaan noin 10 pm:n prismoja ja jonka vahvuus on non 40 ky/ml, ja sen kidekokojakautuma.

30 Sekoitetaan veteen:

Sikainsuliini-ArgB3 1 -ArgB32-OH:a (27,0 ky/mg) 14,8 mg

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 30,0 mg m-kresolia 15,0 mg fenolia 6,0 mg 35 glyserolia 16,0 mg pH säädetään laimealla Na0H:lla arvoon 7,4, ja li-

II

n 80277 sätään vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 10 ml. Erää sekoitetaan kevyesti 18°C:ssa, jolloin muodostuu te-räväreunaisia prismanmuotoisia kiteitä, jotka ovat kasvaneet erittäin homogeenisesti, noin 10 pm:n kokoisiksi, ja 5 joilla esiintyy polaroidussa valossa hyvin pienellä kulma-välillä ekstinktioilmiöitä. Näiden kiteiden kokojakautuma mitattiin Coulter Conter -laitteella. Käyrä (ks. kuvio) osoittaa kokojakautuman erittäin homogeeniseksi; suurimmalla osalla ekvivalenttiläpimitta (pohjautuu pallomaisiin 10 hiukkasiin) on 5-10 pm.

Esimerkki 2 50 % ihmisinsuliini-ArgB31 -OH:a, joka on valmistettu geenitekniikalla tuotetusta preproinsuliinista tryp-siinillä pilkkoen, ja 50 % ihmisinsuliini-(B30)-kolines-15 teriä, joka on valmistettu puolisynteettisesti sian insuliinista, sisältävän seoksen kiteyttäminen valmisteessa, jonka vahvuus on 40 ky/ml, ja sen hidastunut vaikutus.

Sekoitetaan veteen:

Ihmisinsuliini-ArgB31-OH:a (27,5 ky/mg) 7,3 mg 20 Ihmisinsuliini-B330)-kolinesteriä (28,0 ky/ml) 7,1 mg

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 21,0 mg m-kresolia 15,0 mg fenolia 0,6 mg glyserolia 16,0 mg 25 pH säädetään laimealla NaOH:lla arvoon 7,0, ja lisätään vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 10 ml. Erää sekoitetaan kevyesti huoneen lämpötilassa, jolloin muodostuu kooltaan noin 10 pm olevia prismanmuotoisia ki-30 teitä. Sellaisella suspensiolla on voimakkaasti hidastunut vaikutus kaniinissa käytettäessä annostusta 4,0 ky/kg. Veren glukoosiarvot (% lähtöarvosta) ovat (n = 12 eläintä): t(h) 0 12 4 6

Verenglukoosi 100 % 51 % 44 % 69 % 83 % 35 12 80277

Esimerkki 3

Suspensio, joka sisältää puolisynteettisesti sian insuliinista valmistettua kiteistä ihmisinsuliini-ArgB 31-Lys-B32-OCH3:a sekoitettuna 50 %:iin isofaani-protamiini-5 ihmisinsuliinikiteitä ja jonka vahvuus on 100 ky/ml.

Sekoitetaan veteen (niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 10 ml):

Ihmisinsuliini-ArgB 31-LysB 3 2-OCH3:a (27,0 ky/mg) (sinkitöntä) 37,0 mg 10 Sinkkikloridia 0,6 mg

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 21,0 mg m-kresolia 15,0 mg

Fenolia 6,0 mg

Glyserolia 160,0 mg 15 pH säädetään 1 N HClrlla tai 1 N NaOH:lla arvoon 7.4. Erää sekoitetaan kevyesti huoneen lämpötilassa, jolloin muodostuu yhden vuorokauden sisällä prismanmuotoisia kiteitä. Tuotetaan erikseen isofaani-ihmisinsuliinikiteitä (NPH) sekoittamalla veteen: 20 Ihmisinsuliinia (28,0 ky/mg) 35,7 mg

Protamiinisulfaattia 3,2 mg

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 21,0 mg m-kresolia 15,0 mg

Fenolia 6,0 mg 25 Glyserolia 160,0 mg pH säädetään 1 N HCl:lla tai 1 N NaOHtlla arvoon 7.4, ja lisätään vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 10 ml. Erää sekoitetaan kevyesti, jolloin muodostuu tyypillisiä sauvamaisia NPH-kiteitä.

30 Molemmat suspensiot yhdistetään, jolloin syntyy haluttu sekavalmiste, jonka vahvuus on 100 ky/ml ja jolla on koe-eläimessä voimakkaasti hidastunut vaikutus.

Esimerkki 4

Depot-valmiste, jonka vahvuus on 40 ky/ml ja joka 35 sisältää 75 % geenitekniikalla tuotetusta preproinsulii- 13 80277 nista trypsiinillä pilkkoen saatua kiteistä ihmisinsulii-ni-ArgB31-OH:a ja 25 % liuotetussa muodossa olevaa ihmis-insuliinia.

250 ml:aan laimeata HCl:a liuotetaan 1,111 g ihmis-5 insuliini-ArgB3 1 -ArgB32-OH:a (27,0 ky/mg) siten, että pH

on 4,0. Tämä liuos suodatetaan steriilisti soveltuvalla tavalla.

Erikseen liuotetaan veteen:

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 1,575 g 10 m-kresolia 1,125 g

Fenolia 0,450 g

Glyserolia 14,118 g pH säädetään 1 N NaOH:lla arvoon 7,5, ja lisätään vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 0,5 1. Tämä 15 puskuriliuos suodatetaan myös steriilisti soveltuvalla tavalla.

Molemmat steriilit liuokset yhdistetään aseptisissa olosuhteissa ja samalla sekoittaen, ja sekoitetaan niin pitkään, että on muodostunut kooltaan noin 10 pm olevia 20 homogeenisia kiteitä (A). Valmistetaan insuliiniliuos (B) sekoittamalla:

Ihmisinsuliinia (28,0 ky/mg) 0,357 g

Natriumdivetyfosfaattidihydraattia 0,525 g m-kresolia 0,375 g 25 Fenolia 0,150 g

Glyserolia 4,706 g

Liuoksen pH säädetään laimealla NaOH:lla arvoon 7,3, ja lisätään vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 0,25 1. Tämä liuos suodatetaan steriilisti. Insulii-30 niliuos (B) lisätään aseptisissa olosuhteissa kidesuspen-sioon (A), ja valmiste pullotetaan sopiviin moniannospul-loihin.

Tällaista depot-valmistetta voidaan käyttää diabetes mellitus -taudin hoitoon.

Claims

14 80277

1. Menetelmä yhden tai useamman kaavan I mukaisen insuliini johdannaisen kidesuspension valmistamiseksi, jol- 5 loin kiteiden koko on noin 10 pm, AI — S-S-j A21 H-j Gly A-ketju Asn -OH 10 i s S ' ' (I) s s 11 B2 B29 1 --;-:-- 30 31 R- vai B-ketju -R R 15 —-- jossa kaavassa R1 on H tai H-Phe, R30 on Ala, Thr tai Ser ja R31 on ryhmä, jonka kaava on -XnS, jossa n on 0, 1, 2 tai 3, X tarkoittaa samanlaisia tai erilaisia, luonnossa 20 esiintyvien neutraalien tai emäksisten L-aminohappojen, edullisesti emäksisten L-aminohappojen, erityisesti Arg:n, Lys:n, His:n tai Orn:n, tähteitä ja/tai näitä vastaavia D-aminohappotähteitä ja S on OH-ryhmä tai fysiologisesti sopiva, karboksyyliryhmää suojaava ryhmä, joka, kun n on 0, 25 sisältää positiivisesti varautuneen tai protonoitavissa olevan emäksisen ryhmän tai joka, kun n on suurempi kuin 0, voi sisältää sellaisen ryhmän, jolloin C-terminaalinen -X-S voi myös olla vastaavaksi alkoholiksi pelkistetyn aminohapon tähde tai, kun n on 2 tai 3, homoseriinilakto-30 niryhmä, jolloin insuliinijohdannaisen isoelektrinen piste on 5,8-8,5, tunnettu siitä, että insuliinijohdan-nainen tai -johdannaiset kiteytetään väliaineesta lähellä johdannaisen tai johdannaisten isoelektristä pistettä isotoniseksi tekevän glyserolin ja vähintään yhden fenolin 35 läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, is 80277 tunnettu siitä, että R1 on H-Phe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on Arg ja/tai Lys.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että R31 tarkoittaa yksinomaan L-muodossa olevan aminohapon tai sen johdannaisen tähdettä.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I C-pääteasemassa on 10 karboksyylisuojaryhmä, joka on metyyli- tai koliiniesteri-ryhmä.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytysväliaine sisältää sinkkiä, jonka määrä on enintään 1 % insuliinin massasta 15 laskettuna.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytysväliaine puskuroidaan kiteytys-pH-arvoon lisäämällä siihen sopiva määrä puskurointiainetta.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että kiteytys suoritetaan lämpötilassa 3-27°C.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliinijohdannaisen (1) 25 konsentraatio kiteytysvällaineessa on 0,2-40 mg/ml. ie 80277