HU201096B

HU201096B - Crystal suspensions of insulin derivatives, process for their preparation and their use

Info

Publication number: HU201096B
Application number: HU842841A
Authority: HU
Inventors: Ulrich Grau
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1983-07-29
Filing date: 1984-07-23
Publication date: 1990-09-28
Also published as: DK172241B1; DE3327709A1; IL72512A; PH22649A; US4959351A; FI80277C; IE841947L; JPS6051118A; PT78980A; ATE32729T1; ES8601109A1; DE3469535D1; FI80277B; DK368884D0; HUT35001A; NO843048L; AU567360B2; KR850000981A; IL72512A0; ZA845819B

Description

A találmány tárgya eljárás inzulinszármazékok új kristályszuszpenziójának és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására.

Az inzulin kristályosítása mind szerkezetvizsgálati módszerek [Adams és munkatársai, Natúré 224, 491 (1961), The Peking Insulin Structure Research Goup, Se. Sinica XVII, 152-118 (1974)], mind gyógyszerkészítményként való felhasználás [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle (1961)] szempontjából fokozottan kutatott terület. Az inzulin lassitottan felszívódó formájának terápiás alkalmazásához előnyös, ha az inzulin lehetőleg meghatározott kristályméretű, amely a kb. 30 pm-t nem haladhatja meg, és igy a kristályfelület az inzulinmennyiséggel reprodukálható módon öszszefüggésben van. Ezzel az ügy nevezett monodiszperz szuszpenzióval kapcsolatban meghatározott újrafeloldódási kinetika várható.

Ilyen tulajdonságokkal rendelkező, terápiásán alkalmazott inzulinkristály-szuszpenziók például az olyan szuszpenziók, amelyek kb. 25 um méretű romboéder cink-inzulin-kristályokból állnak és amelyek 0,8-2,5% cink jelenlétében semleges pH-nál stabilak, és lassított hatást mutatnak, valamint az Isophan-inzulin-protamin-kristályok, amelyek 10 jum hosszú és kb. 1 wn vastagságú pálcikák formájában lassított felszivódású készítmények formájában állnak rendelkezésre.

Ezenkívül vannak az inzulinnak további ismert kristálymódosulatai, amelyek eddig csak a röntgen-szerkezetvizsgálat szempontjából voltak érdekesek, igy savas pH-nál cinkmentes ortoromboid és monoklin kristályok nyerhetők [Einstein, Low, Acta Cryst. 15, 32-34 (1962)]. Az izoelektromos pontnál, hasonlóképpen cink távollétében kisebb rombododekaéderek nyerhetők, amelyek kubusokba rendeződnek [Schlichtkrull, Insulin-Kristalle (1961)]. Végül Schlichtkrull az inzulinnak még egy monoklin kristályformáját ismerteti, amely izoelektromos pont fölött cink és fenol vagy fenol-származékok jelenlétében nyerhető. Ezek a kristályok néhány nap alatt nőnek megfigyelhető méretűre (3 mm-ig, és éles szélekkel rendelkeznek. Érdekes módon ezek a kristályok csak az üveg felületén találhatók, az oldat szabad felületén nem [Schlichkrull, Insulin-Kristalle, S. 57-60 (1961)].

A különböző kristályosítási módszerekkel kapott inzulinok és proinzulinok összehasonlításakor azoknál az inzulinszármazékoknál, amelyek legalább egy pozitív töltéssel rendelkeznek, az tapasztalható, hogy izoelektromos pontjuk magasabb pH-értékek felé tolódik el. Ide számítanak különösen azok a származékok, amelyek a B-lánc C-terminális végén egy bázikus csoportot tartalmaznak, mint például az ismert pankreáz-extraktumban kis mennyiségben található proinzulin lebontási termék, az inzulin-Arg^B31-OH és az inzulin-Arg^B31-Arg^3í-OH. Más hasonló tulaj2 donságú származékok félszintetikus úton nyerhetők. Ilyen inzulin-származékokat, előállítási eljárásukat, valamint alkalmazásukat írja le a P 33 26 672.4 és a P 33 26 473.2 sz.

NSZK szabadalmi bejelentés.

Ezek például az arginin helyén vagy ahhoz kapcsolódva más bázikus aminosavakat vagy bázikus aminosavszármazékokat (például D-aminosavakat, ornitint, hidroxi-lizint, argi10 ninolt) vagy egyszerű alkoholokkal vagy aminokkal alkotott észter- vagy amid-származékokat tartalmaznak a C-terminális végen. Itt az alkohol vagy az amid még egy pozitív töltést vihet a molekulába, mint pldául az inzulin-(B30)-kolinészterben.

Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy ezek a származékok izoelektromos pontjuk közelében vizes közegből, aromás hidroxi-vegyűlet jelenlétében nagyon egyenletes formájú, mintegy 10 pm méretű prizmák formájában kristályosodnak.

A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletü inzulin-származékok kristályszuszpenziójának előállítására. Az (1) általá25 nos képletben

R¹ jelentése L-H-Phe,

R³⁰ jelentése L-Ala vagy L-Thr,

R³¹ jelentése D- és/vagy L-konfigurációjü,

Arg és/vagy Lys, amelyeknek a láncvégi karboxilcsoportja szabadon vagy 1-4 szénatomos alifás alkohollal észterezett formában lehet jelen, vagy kolinészter-származéka.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a kristályosítást vizes közegben, az izoelektromos pontnak megfelelő ±1 pH-értéken fenol és/vagy m-krezol legfeljebb 3 mg/ml, előnyösen 1,5-2,5 mg/ml mennyisége és kívánt esetben az inzulin tömegére szá40 mítva 1% cink és izotóniát biztosító anyag jelenlétében, 3 és 27 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

Előnyösek azok a peptidek, amelyekben R³¹ aminosavészter csoportot jelent L-formá45 bán.

Az (1) általános képletü peptidek közül különösen azok fontosak, amelyeknek a C-terminális végén egy karboxilcsoportot blokkoló csoport található, ez 1-4 szénatomos alkoxicsoport.

Az (I) általános képletű inzulin-származékok különösen a humán- vagy sertés-inzulin szekvenciájának felelnek meg.

A találmány szerinti eljárással például a 55 következő inzulin-származékok kristályszuszpenziója állítható elő: humán inzulin-Arg³¹—OH sertés inzulín-Arg^B31-OH sertés inzulin-Arg^B31-OCH3 humán inzulin-Arg^B31-OCH3 sertés inzulin-Arg^B31-Arg^B3Z-OCH3 humán inzulin-Arg^B31-Arg^B3Z-OCH3 humán inzulin-Lys^B3L-OH humán inzulin-D-Arg^B31-OH humán inzulin-D-Arg^B31-Arg^B32-OH

-2HU 201096 Β humán inzulin-Arg^B31-D-Arg^B32-OH humán inzulin-Lys^B31-Arg^B32-OH humán inzulin-Arg^B31-Lys^B32-OH

Az (I) általános képletü inzulinszérmazékokat úgy állítjuk elő, hogy

a) egy (II) általános képletű oktapeptid-(B23-30)-inzulint - ahol R^l jelentése hidrogénatom vagy egy kötés, és S¹ jelentése protonszolvolitikusan vagy /3—eliminációval lehasitható aminovédócsoport, például terc-butil-oxi-karbonil-(Boc), terc-amil-oxi-karbonil-(Aoc) vagy metil-szulfonil-etil-oxi-karbonil-(Msc)-csoport - egy (III) általános képletű pepiiddel H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S²)-Thr(S²)-Pro-Lys(S³)-R³⁰-R³¹ (III) - ahol R³⁰ és R³¹ jelentése a fenti, S² jelentése hidrogénatom, benzil- vagy terc-butil-csoport, S³ jelentése uretán-védőcsoport, például Boc, Moc, Pmoc vagy Z, és az R³⁰ és R³¹ csoportokban adott esetben jelenlévő szabad karboxil-, hidroxil-, tio-, ω-amino-, guanidino- és/vagy imidazolcsoportok szükség esetén védett alakban vannak jelen - kondenzáljuk, és az adott esetben jelenlévő védőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk;

b) egy (I) általános képletü Des-B30-Inzulin-származékot - ahol R¹ jelentése hidrogén vagy H-Phe és a C-terminális r3o_r31 együttesen hidroxilcsoportot jelent - tripszin vagy tripszinhez hasonló endopeptidá'z jelenlétében egy (IV) általános képletű vegyűlettel

H-R30_R3I (IV)

- ahol R³⁰ és R³¹ jelentése a fenti, és ahol a szabad karboxil-, hidroxil-, tio-, ω-amino-, guanidino- és/vagy imidazol-csoportok kívánt esetben védett formában vannak jelen - reagáltatjuk, és az adott esetben jelenlévő védócsoportokat ismert módon eltávolítjuk;

vagy

c) egy az R³¹ csoportban L-konfigurációjú aminosavakat tartalmazó inzulin-származék előállítására egy proinzulint, proinzulin-származékot, preproinzulint vagy preproinzulin-származékot vagy ezek intermedierjét kémiai és/vagy enzimatikus úton hasítunk. A kiindulási Des-Phe^B31-inzulinok ismertek például a 20 05 658 sz. NSZK szabadalmi leírásból vagy a 46 979 sz. európai közrebocsátási iratból.

A b) eljárásban kiindulási anyagként használt Des-B30-inzulinok ismertek például a 46 979 sz. európai közrebocsátási iratból vagy a Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 359, (1978) 799 irodalmi helyről. A b) eljárásban kiindulási anyagként használt (IV) általános képletü vegyületek a peptidkémiában ismert módon állíthatók elő. A (IV) általános képletű vegyületnél használható védócsoportokat ismertet M. Bodanzky és munkatársai, Peptide Synthesis, Ind. Ed. 1976, Wiley and Sons.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, tripszinhez hasonló endopeptidázo5 kát ismertet például a 89 007 számú európai szabadalmi leírás. Ezek olyan enzimek, amelyek peptidkötéseket a karboxilvégi bázikus aminosavaknál specifikusan hasítanak. Egy előnyös tripszinhez hasonló endopeptidáz például a lizil-endopeptidáz.

A c) eljáráshoz géntechnológiai úton előállított humán-, illetve fóemlős-proinzulin áll rendelkezésre. Ebből az Arg(B31) és a di-Arg(B31-32) egyszerű tripszines vagy trip15 színhez hasonló enzimmel végzett emésztéssel nyerhető. Emellett viszonylag egyszerűen állíthatók elő olyan plazmidok, amelyek a megfelelő prepoinzulinszármazékok hasításával új inzulinszármazékokat eredményeznek, mert ezek a természetes körülmények között a B31 vagy B32 helyen található arginin helyén más semleges vagy bázikus aminosavakat kódolnak.

A proinzulin rekombináns-DNS-technika25 val történő előállítása egy olyan proinzulin-amiosav szekvenciához tartozó DNS-szekvenciájának létrehozását teszi szükségessé, amely izolálással, felépítéssel vagy ezek kombinációjával érhető el. A proinzulin-DNS-t ezután leolvasási fázisban egy alkalmas klónozó vagy kifejezővektorba beiktatjuk. A kapott hordozóvektort az alkalmas mikroorganizmus transzformálására használjuk, és az igy kapott transzformált mikroorganizmust azután fermentációs úton szaporítjuk, igy a proinzulint tartalmazó vektor további másolatát és a proinzulin, tiszta inzulin-származék, preproinzulin, illetve preproinzulin-származék kifejezését lehet elérni.

Ha a kifejezési terméknél egy preproinzulinról van szó, akkor ez a termék általában azzal a proinzulinszekvenciával rendelkezik, amelynek végső aminocsoportja egy proteindarabhoz van kapcsolva, amely normál eset45 ben azzal a génszekvenciával fejeződik ki, amelynél a proinzulint vagy a proinzulinszármazékot kódoló szekvenciát beiktattuk. A proinzulin-amiosavszekvencia a proteindarabbal egy specifikusan hasítható helyen van megkötve, ez például metionin lehet. A kapott proinzulin-aminosavszekvenciát a kapcsolódó génterméktói lehasitjuk, például úgy, ahogyan a 32 32036 sz. NSZK közrebocsátási iratban le van írva, majd a proinzulint tisz55 títás után izoláljuk.

A találmány szerinti eljárásban a kristályosító közeg tartalmazhat cinket is, a cinkmennyiség előnyösen legfeljebb 1%, különösen 0,8% lehet, az inzulinszármazék tömegére számítva. A kristályosításhoz általában elég, ha viszonylag csekély cinket használunk, maximum 40 ug/100 egység, előnyösen 30 ug/100 egység, ahol az egységek szárazanyagtartalomra vonatkoznak.

HU 201096 Β

A kristályosítást az izoelektromos pontnál 1 pH-egységgel alacsonyabb és 1 pH-egységgel magasabb pH-értékek közötti tartományban végezzük, azaz Pi±l. A pH beállítását adott esetben egy puffer (például foszfát, acetát vagy citrát) segítségével végezzük.

A kristályosító közeg fenolt, krezolt vagy más hasonló aromás vegyületet tartalmaz. A kristályosítást előnyösen 3 és 27 °C közötti hőmérsékleten különösen 10 és 20 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A szuszpenziót az eljárás során enyhén keverni lehet (például keverőedényben keverve). Az (I) általános képletű inzulinszármazék koncentrációja a kristályosítás előtt 0,2-40 mg/ml, különösen 1-7,5 mg/ml lehet.

A kristályokat közvetlenül olyan közegben is előállíthatjuk, amely az injekciós készítménynek felel meg. Ennek megfelelően a steril közeg fenol vagy más aromás vegyület és a cink mellett egy, az izotóniát biztosító anyagot, például nátrium-kloridot, glicerint, továbbá puffért, például nátriumfoszfátot is tartalmazhat.

A találmány szerinti kristályszuszpenzió adalékanyagként a) egy vagy több (I) általános képletű inzulinszármazékot oldott és/vagy amorf formában, b) inzulint és/vagy c) proinzulint és/vagy d) C-peptidet oldott, amorf és/vagy kristályos formában tartalmazhat. Ezenkívül olyan segédanyagot is tartalmazhat, amely az inzulinfelszabadulás lassítását szolgálja, igy például globint vagy protamin-szulfátot.

A kristálynagyságból és annak homogenitásából adódó előnyök mellett a viszonylag alacsony cinktartalom - amely a cinknek a depo-hordozóknak tekinthető koncentrációja alatt van - lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti kristályszuszpenzlót oldott inzulinnal szabadon keverjük. Ezzel például lehetővé válik, hogy inzulinoldatot inzulin-származék-kristályszuszpenzióval az alkalmazás előtt elegyítsük. A komponensek mennyiségének változtatásával a kapott gyógyszer hatásprofilja optimálisan szabályozható.

Ha a kristályok stabilitásához nagyobb cinkkoncentráció lenne szükséges (amint például a cink-inzulin-romboidok esetén), úgy a hozzáadott oldott inzulin-kicsapódna, és gyorsan ható komponensként nem lenne jelen.

A találmány szerinti kristályszuszpenziók tehát minden olyan előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek a diabetes mellitus kezeléséhez szükséges. A lassú oldódás elve az inzulinszármazékokkal velejár, és proteinkémiai jelenségből adódik, azaz abból, hogy a fehérjék izoelektromos pontjukon nehezen oldhatók.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy bejelentésünket az itt bemutatottakra korlátoznánk.

A kristályosítás során az inzulin gyakorlatilag 100% kitermeléssel kristályosodik.

1. példa nemzetközi egység/ml koncentrációjú, kb 10 pm nagyságú prizmákból álló, sertés proinzulin tripszines emésztésével előállított sertés inzulin-Arg^B31-Arg^B32-OH kristályszuszpenzió

Vízben elkeverünk:

Sertés inzulin-Arg^B3l-Arg^B3Z-0H (27,0 nemzetközi egység/mg) 14,8 mg nátrium-dihidrogén-foszfát-dihldrát 30,0 mg m-krezol 15,0 mg fenol 6,0 mg

A pH-t hígított nátrium-hidroxiddal 7,4-re, a teljes térfogatot pedig vízzel 10 ml-re állítjuk be. Az edényt 18 °C-on enyhén mozgatjuk, és így éles szélű prizma formájú kristályok keletkeznek, amelyek nagyon egyenletesen növekszenek, kb. 10 pm méretűek, és poláros fényben nagyon kis szögtartományban extinkciót mutatnak. A kristályok nagyságbeli eloszlását Coulter Counter-ben mérjük. A görbe (lásd ábrát) különösen egyenletes nagyságbeli eloszlást mutat, amely főleg 5 és 10 pm átmérőnek felel meg (golyó formájú részecskékre vonatkoztatva).

2. példa

50%, géntechológiai úton előállított preprolnzulin tripszines hasításával nyert humán inzulin-Arg^B3l-OH és 50%, sertés inzulinból félszintetikus úton előállított humán inzulin-B30-kolinészter elegyének kristályosítása 40 nemzetközi egység/ml készítmény formájában, és ennek lassított hatása

Vizben elkeverünk:

humán inzulin-Arg^B31-OH (27,5 nemzetközi egység/mg) 7,3 mg humán inzulin-(B30)-kolinészter (28,0 nemzetközi egység/mg) 7,1 mg nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 21,0 mg m-krezol 15,0 mg fenol 0,6 mg glicerin 16,0 mg

A pH-t hígított nátrium-hidroxiddal 7,0-ra, és a teljes térfogatot vízzel 10 ml-re állítjuk be. Az edényt szobahőmérsékleten enyhén mozgatjuk, igy kb. 10 pm méretű prizma alakú kristályok képződnek. Ez a szuszpenzió 4,0 NE/kg adagolásban nyulaknál erősen lassított hatást mutat. A vércukor szint a kezdeti érték%-ában a következő (12 állat esetén).

HU 201096 Β idő (óra) 0 12 4 6 vércukorszint (%) 100 51 44 69 83

3. példa

Sertés inzulinból félszintetikus úton pl. a 31 01 382 sz. NSZK közrebocsátási irat szerinti módon előállított kristályos humán inzulin-Arg^B31-Lys^B32-OCH3 szuszpenzió 50% Isophan-protamin-humán-inzulinkristályokkal keverve 100 egység/ml formájában.

ml teljes térfogatra vízzel feloldunk: humán inzulin-Arg^B31-Lys^B32-OCH3

(27,0 NE/mg, cinkmentes)	37,0	mg
cink-klorid	0,6	mg
nátrium-dihidrogén-foszfát-
-dihidrát	21,0	mg
m-krezol	15,0	mg
fenol	6,0	mg
glicerin	160,0	mg

A pH-t 1 n sósavval, illetve 1 n nátrium-hidroxiddal 7,4-re állítjuk be. Az edényt szobahőmérsékleten enyhén keverjük, így egy napon belül prizma formájú kristályok képződnek. Külön állítunk elő Isophan-hu-

mán-inzulin kristályokat (NPH)	úgy,	hogy
vízben elegyítünk:
humán inzulin (28,0 NE/mg)	35,7	mg
protamin-szulfát	3,2	mg
nátrium-dihidrogén-foszfát-
-dihidrát	21,0	mg
m-krezol	15,0	mg
fenol	6,0	mg
glicerin	160,0	mg

A pH-t 1 n sósavval, illetve 1 n nátrium-hidroxiddal 7,4-re állitjuk be, és a teljes térfogatot vízzel 10 ml-re állítjuk be. Az elegyet enyhén keverjük, így tipikus pálcika formájú NPH-kristályok képződnek.

A két szuszpenziót összesítjük, így 100 NE/ml kevert készítményt kapunk, amely az állatkísérletekben erősen lassított hatást mutat.

4. példa

75%, géntechnológiai úton nyert preproinzulinból tripszines hasítással előállított kristályos humán inzulin-Arg^B31-Arg^B32-OH-ból és 25% oldott humán inzulinból álló, 40 NE/ml koncentrációjú depó-készítmény

250 ml hígított sósavban feloldunk:

1,111 g humán inzulin-Arg^B31-Arg^B32-OH-t (27,0 NE/mg) úgy, hogy a pH=4 legyen. Ezt az oldatot alkalmas módszerrel sterilre szűrjük.

Külön feloldunk vízben: nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 1,575 g m-krezol 1,125 g fenol 0,450 g glicerin 14,118 g

A pH-t nátrium-hidroxiddal 7,5-re állitjuk be, és a térfogatot vízzel 0,5 1-re egészítjük ki. Ezt a pufferoldatot szintén sterilre szűrjük. Aszeptikus körülmények között összekeverjük a két oldatot, és addig keverjük, míg homogén, kb. 10 pm méretű kristályok nem képződnek (A).

Inzulinoldatot (B) készítünk úgy, hogy

összekeverünk:
humán inzulin (28,0 NE/mg)	0,357	g
nátrium-dihidrogén-foszfát-
-dihidrát	0,525	g
m-krezol	0,375	g
fenol	0,150	g
glicerin	4,706	g

A kapott oldat pH-ját hígított nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állitjuk be, és térfogatát 0,25 1-re egészítjük ki vízzel. Az oldatot sterilre szűrjük. Aszeptikus körülmények között a (B) oldatot hozzáadjuk az (A) kristályszuszpenzióhoz, és a készítményt olyan flakonokba töltjük, amelyekből többszöri kivétel lehetséges.

Az ilyen depó-készítmény alkalmas a diabetes mellitus kezelésére.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általános képletű inzulinszármazékok kristályszuszpenziójának előállítására - a képletben 5

R¹ jelentése L-H-Phe,

R³⁰ jelentése L-Ala vagy L-Thr,

R³¹ jelentése D- és/vagy L-konfigurációjú

Arg és/vagy Lys, amelyeknek a láncvégi karboxilcsoport ja szabadon vagy 1-4 10 szénatomos alifás alkohollal észterezett formában lehet jelen, vagy kolinészter származéka -, azzal jellemezve, hogy a kristályosítást vizes közegben, az izoelektromos pontnak megfelelő J5 ±1 pH-értéken, fenol és/vagy m-krezol legfeljebb 3 mg/ml előnyösen 1,5-2,5 mg/ml mennyisége és kivánt esetben az inzulin tömegére számítva legfeljebb 1% cink, izotóniát biztosító anyag jelenlétében, 3 és 27 °C kö- 20 zötti hőmérsékleten végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek kristályszuszpenziójának előállítására, ahol R³¹Dés/vagy L-konfigurációjú Arg és/vagy Lys, 25 R¹ és R³⁰ jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek kristály- 30 szuszpenziójának előállítására, ahol R¹ és R³⁰jelentése az 1. igénypont szerinti, R³¹ aminosavcsoportok vagy származékaik maradéka kizárólag L-konfigurációjú Arg és/vagy Lys, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási 35 vegyületeket alkalmazzuk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mindenkori kristályosítási pH-értéket egy pufferrel állítjuk be. 40
5. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, az (I) általános képletű vegyületek - ahol R¹, R³⁰ és R³¹ jelentése az 1. igénypont szerinti - 45 kristályszuszpenzióját a gyógyszerkészitésben szokásos segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető