DK146482B - Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin Download PDFInfo
- Publication number
- DK146482B DK146482B DK155680AA DK155680A DK146482B DK 146482 B DK146482 B DK 146482B DK 155680A A DK155680A A DK 155680AA DK 155680 A DK155680 A DK 155680A DK 146482 B DK146482 B DK 146482B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- insulin
- threonine
- trypsin
- enzyme
- amino acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
146482
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et B30-threonin-insulin, herunder human insulin.
Insulin er et uundværligt lægemiddel til behandling af diabetes.
Okse-og svineinsulin kan i øjeblikket fis i handelen. Disse insuliner 05 afviger imidlertid fra human insulin ved nogle få aminosyrekomponen-ter, som bevirker dannelse af antistof i patienter. Antistoffet vides at formindske effektiviteten af videre insulinbehandling. Human insulin er derfor mere gunstigt, og der har været et stærkt ønske om at kunne få det i handelen. Human insulin afviger fra andre animal-M0 ske insuliner ved aminosyrekomponenterne i stillingerne 8, 9 og 10 i A-kæden og i B-kædens 30-stilling. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til erstatning af aminosyren i 30-stil-lingen i et animalsk insulins B-kæde med L-threonin. Human insulin kan følgelig let fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 ved som udgangsmateriale at anvende svineinsulin. Svineinsulin afviger fra human insulin ved aminosyren i B30-stillingen. Human insulin opnået på denne måde kan med fordel anvendes til behandling af diabetes patienter. Opfindelsen tilvejebringer desuden andre B30--threonin-insuliner ved anvendelse af andre animalske insuliner som 20 udgangspunkt. De resulterende insuliner afviger fra human insulin ved aminosyrer i A-kædens 8-, 9- og 10-stilling, og de kan anvendes som reagenser til prøver for antigenicitet og som diabetes lægemidler.
Human insulin er blevet fremstillet kemisk af M.A. Ruttenberg 25 som vist i U.S.A. patentskrift nr. 3.903.068 og af R. Obermeier et al. som beskrevet i Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 357, 759-767 (1976). Disse fremgangsmåder omfatter kondensation af et desocta-peptid-(B23-30)-svineinsulin med et syntetisk octapeptid, der svarer til stillingerne B23-30 i human insulin. Den første fremgangsmåde 30 omfatter imidlertid alkalisk hydrolyse, som ledsages af uheldige bireaktioner. Sidstnævnte fremgangsmåde er også en ikke-specifik omsætning, som bevirker mange bireaktioner og kræver komplicerede rensningsprocedurer. Disse fremgangsmåder kan derfor ikke anvendes i industriel målestok.
35 M. Bodanszky et al. tilvejebringer i U.S.A. patentskrift nr.
3.276.961 en fremgangsmåde til fremstilling af human insulin, ved hvilken human insulin fremstilles ud fra andre animalske insuliner 146482 2 ved indvirkning af et enzym, såsom carboxypeptidase A eller trypsin, i nærværelse af threonin. Det er ikke sandsynligt, at denne fremgangsmåde vil frembringe human insulin, fordi trypsin og carboxypeptidase A ikke kun hydrolyserer lysyl-alaninpeptidbindingen 05 (B29-B30), men også andre positioner i insulin under de i patent skriftet beskrevne betingelser. Trypsin hydrolyserer fortrinsvis ar-ginyi-glycinpeptidbindingen (B22-B23) frem for lysyl-alaninbindingen (B29-B30). Carboxypeptidase A kan ikke frigøre afaninen ved B-kæ-dens C-terminal alene uden at frigøre asparagin ved A-kædens C-ter-10 minal. En speciel betingelse, dvs. omsætning i en ammon iumhyd rogen -carbonatpufferopløsning, er nødvendig for at forhindre asparaginfri-gørelsen. Denne betingelse blev opdaget i 1978 (Hoppe-Seyler's Z.
Physiol. Chem., 359, 799-802 (1978)). Desuden kan peptidsyntese næppe finde sted, fordi hydrolysen sker hurtigere end syntesen i 15 denne tilstand.
Det konkluderes derfor, at der indtil nu ikke har været nogen industriel tilgængelig fremgangsmåde tii fremstilfing af human insulin.
Den foreliggende opfindelse kan imidlertid tilvejebringe human insulin i kommerciel målestok. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til 20 fremstilling af et B30-threonin-insulin er ejendommelig ved, at man omsætter et des-B30-insulin (herefter betegnet forbindelse II) med et overskud af et L-threoninderivat (herefter betegnet forbindelse I) med den almene formel: 25 Thr(R1)(R2) i hvori Thr stir for en L-threoninrest, R er hydrogen eller en hydro- 2 xybeskyttende gruppe, og R er en carboxylbeskyttende gruppe, i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym og i en reak-30 tionsblanding med en pH-værdi på ca. 5-9 og en temperatur på ca.
0-50°C og indeholdende et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, hvorpå den eller de beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåde frembyder mange fordele. Det er en specifik omsætning, som ikke ledsages af nogen ugunstig bireaktion, såsom racemisering.
35 Desuden kan uomsatte udgangsmaterialer let genvindes uden at være ødelagt, og de kan genanvendes. Fremgangsmåden benytter et overskud af et L-threoninderivat. Overskudet af threoninderivatet hin- 3 146482 drer brydning af arginincarbonylbindingen i B-kædens 22-stilling, selv om denne binding sædvanligvis spaltes med trypsin. Den beskyttelse af argininresten, som er ufravigelig ved sædvanlig enzymatisk omsætning, er følgelig ikke nødvendig ved denne fremgangs-05 måde.
Forbindelse II kan fremstilles ved omsætning af forskellige animalske insuliner (f.eks. svine-, kvæg-, hval-, fire-, kanin-, fiske-, abeinsulin, og lignende) med carboxypeptidase A som beskrevet af E.W. Shimitt et al. i Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 359 , 799 10 (1978). Det kan også fremstilles ved anvendelse af en protease frem stillet af Achromobacter lyticus. Proteasen har en specificitet over for lysin og spalter specifikt lysincarbonylbindingen i peptidbindinger. Isolering og karakteristika er beskrevet af Masaki et al. i Agric.Biol.
Chem., 42, 1443 (1978). Enzymet kaldes Protease I. Fremstillingen 15 af des-B30-svineinsulin er beskrevet i Biochem.Biophys.Res.Commun.
92, 396-402 (1980) og japansk offentliggørelsesskrift 54-135789. Des--B30-insuliner af andre dyreinsuliner kan fremstilles på samme måde.
Forbindelse I's hydroxygruppe kan være beskyttet eller ej. Begge forbindelser kan benyttes ved omsætningen. Den beskyttende 20 gruppe, som anvendes, udvælges blandt vilkårlige af de hydroxybe-skyttende grupper, der i almindelighed anvendes ved peptidsyntese, såsom t-butyl, benzyl, acetyl og lignende. Forbindelse l's carboxyl-gruppe skal være beskyttet, og der kan anvendes en hvilken som helst af de ved peptidsyntese anvendte carboxylbeskyttende grupper, 25 f.eks. i form af alkylestere (f.eks. t-butylestere), aralkylestere (f.eks. benzylester), amid, substituerede amider (f.eks. anilid), salte (f.eks. natrium), osv.
En beskyttende gruppe bør udvælges under hensyntagen til indførings- og fjernelsesomsætningernes indvirkning på insulin, da 30 omsætningerne kan resultere i denaturering eller inaktivering af insulinet. Hvis en hydroxy beskyttende gruppe og en carboxylbeskyttende gruppe for threon in resten udvælges hensigtsmæssigt, er én fjernelsesprocedure tilstrækkelig til at fjerne begge de beskyttende grupper. Beskyttende grupper, der anvendes ved peptidsyntese, er 35 beskrevet nærmere af M. Bodanszky et al. i Peptide Synthesis, 2. udgave (1976) udgivet af John Wiley & Sons.
146482 4
Det ved fremgangsmåden anvendte enzym indbefatter enzymer, der kan fis fra forskellige planter og dyr. Som tidligere nævnt udføres omsætningen i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym. Til illustration af trypsinlignende enzymer kan nævnes sådan-05 ne enzymer, som den af Morihara et al. isolerede protease, Arch.
Biochem. Biophys., 126, 971 (1968), og den af Yoshida et al. i FEBS Lett., 15, 129 (1971) beskrevne protease. Enzymet, som skal anvendes, kan behandles med tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (herefter forkortet TPCK) til fjernelse af blandede enzymer, såsom chymo-10 trypsin og chymotrypsinlignende enzym.
Desuden er Protease I, der produceres af Achromobacter lyti-cus M497-1, et trypsinlignende enzym og medregnet blandt enzymerne, der kan anvendes. Protease I virker specifikt på lysincarbonyi i peptidbindinger, og dets isolering og karakteristika er beskrevet i 15 Agric. Biol. Chem., 42, 1443 (1978).
Kondensationen af forbindelse I med forbindelse II gennemføres under betingelser, der er egnede til peptidsyntese med ovenstående enzymer. Omsætningen gennemføres således ved et pH på ca. 5 til 9, fortrinsvis pH ca. 6 til 7. Omsætningstemperaturen er ca. 0-50°C, 20 fortrinsvis ca. 20-40°C. Det ønskes, at koncentrationen af såvel forbindelse I som forbindelse II er si høj som mulig. Det foretrukne molforhold mellem forbindelse I og forbindelse II er ca. 5:1 til 1000:1, især ca. 25:1 til 200:1. Reaktionsblandingen indeholder som nævnt et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Tilsætningen af organisk 25 opløsningsmiddel sænker reaktionsblandingens vand koncentration, hvilket resulterer i, at den omvendte reaktion, dvs. hydrolyse af produktet hindres, og forøger også bemærkelsesværdigt opløseligheden af forbindelserne I og II. De organiske opløsningsmidler til brug herfor er f.eks. methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsul-30 foxid, glycerol, og lignende. De kan anvendes enkeltvis eller som en blanding. Den foretrukne koncentration af det organiske opløsningsmiddel er ca. 0-65%, især ca. 40-60% af reaktionsblandingen.
Den relative mængde af det organiske opløsningsmiddel bør bestemmes af udgangsmaterialernes opløselighed, enzymets tilbøjelighed til 35 denaturering og dets hydrolyseaktivitet.
Reaktionsmediet kan udvælges blandt trishydroxymethylamino-methan (herefter forkortet til tris), carbonat, boratpufferopløsnin- 146482 5 ger, og lignende. Enzymkoncentrationen bestemmes i afhængighed af koncentrationen af substrater og enzymaktiviteten. F.eks. anvendes krystallinsk trypsinhandelsvare fortrinsvis i en koncentration fra ca. 1 mg/ml til 10 mg/rnl. Enzymet kan anvendes, som det er, eller 05 i fixeret form, såsom i kombination med eller som inklusion i en uopløselig bærer, såsom cellulose, dextran (f.eks. "Sephadex"), agarose (f.eks. "Sepharose"), polyacrylamidgel ("Bio-gel")/ porøst glas, og lignende.
Reaktionstiden er variabel og påvirkes af andre reaktionsbetin-10 gelser. Omsætningen kan fortsættes, indtil substratet og produktet kommer i ligevægt. Det tager i almindelighed ca. 3 til 72 timer, og i de fleste tilfælde ca. 6 til 24 timer.
Insulinproduktet kan isoleres ved kombination af de sædvanlige inden for peptidkemi anvendte metoder. Til illustration kan nævnes 15 følgende isoleringsfremgangsmåde: Reaktionsblandingen underkastes gelfiltrering til isolering og opsamling af uomsat forbindelse I og enzym. Udvundet forbindelse I og enzym kan genanvendes. Den tilbageværende del underkastes passende kromatografi til isolering af opnået beskyttet insulin og uomsat des-B30-insulin. Sidstnævnte kan gen-20 anvendes som forbindelse II. Førstnævnte underkastes en omsætning til fjernelse af den eller de beskyttende grupper.
Fjernelsen af den eller de beskyttende grupper gennemføres på sædvanlig måde, idet metoden dog skal udvælges i afhængighed af den beskyttende gruppes egenskaber. En t-butylgruppe er et eksem-25 pel på en beskyttende gruppe for såvel threoninens hydroxygruppe som dens carboxylgruppe. Den kan fjernes ved behandling med tri-fluoreddikesyre i nærværelse af et kation-opfangningsmiddel, f.eks. anisol. Som nævnt ovenfor bliver processen simpel, hvis en enkelt behandling kan fjerne den hydroxybeskyttende og den carboxylbeskyt-30 tende gruppe på én gang, og den resulterer i godt udbytte. Når C-terminalen i det opnåede insulin beskyttes med en anden ester, et amid, substitueret amid eller salt, kan den beskyttende gruppe fjernes ved passende hydrolyse- eller afsaltningsteknik.
Det ifølge opfindelsen fremstillede insulin er nyttigt til behand-35 |jng af diabetes og også som reagens.
Det ifølge opfindelsen opnåede insulin viser samme aktivitet til sænkning af blodsukkerniveau som okseinsulin i mus på følgende mide: 6 146682
Testmetode: Testforbindelsen opløses i 0,01M saltsyre, og opløsningen fortyndes til en passende koncentration (2,5 - 20 pg/ml) med 20 til 60 gange fysiologisk saltopløsning. Den resulterende opløsning administreres intravenøst i en mængde pi 0,1 ml/10 g legems-05 vægt til DS mus, der har fastet i 5 timer. Blod udtages fra orbital blodkar 45 minutter efter administreringen, og blodsukker måles ved hjælp af giucose-oxidasemetoden under anvendelse af et i handelen værende udstyr fremstillet af Boehringer Mannheim Corporation.
10 Tabel I
Insulinaktivitet
Test- Dosis Blodglucoseniveau forbindelse (pg/10 g legemsvægt) (mg/dl) 15 _
Fysiologisk saltopløsning - 112,2 ± 7,3 (1)
Semisyntetisk 0,25 80,2 ± 2,6 (2) human insulin 1 41,0 ± 6,0 (3) 20 _
Okseinsulin 0,25 73,2 ±1,5 (4) 1 41,0 ± 2,3 (5)
Note: (2)-(4), (3)-(5) ingen signifikant forskel.
25
Human insulin fremstillet ifølge opfindelsen kan administreres til mennesker pi samme mide som de på markedet værende svine-eller okseinsulinpræparater. Det kan anvendes til farmaceutiske præparater på sædvanlig måde. F.eks. kan det udformes som en injicer-30 bar opløsning ved hjælp af passende fremgangsmåder, såsom fremgangsmåder til fremstilling af zinkkompleks med zinkchlorid, en pufret opløsning med en passende puffer, såsom natriumhydrogenphosphat, natriumacetat, og lignende, og en isotonisk opløsning med natrium-chlorid. Desuden kan der tilsættes passende antiseptiske midler. Så-35 danne er f.eks. cresol, phenol, para-hydroxybenzoesyrealkylestere (f.eks. methyl-, ethyl-, propyl-, butylestere, og lignende). Dose- 7 146482 ringen af den humane insulin er som for insulinpræparaterne på markedet. Der kan således administreres ca. 1 til 100 enheder til voksne mennesker pr. dag, om end dosis afhænger af, hvor alvorlig diabetes lidelsen er.
05 De efterfølgende eksempler tjener til yderligere illustration og beskrivelse af den foreliggende opfindelse. Forkortelserne har følgende betydning: Ala: alanin, Arg: arginin, Asp: asparaginsyre,
CysOgH: cysteinsyre, Glu: glutaminsyre, Gly: glycin, His: histidin,
Ile: isoleucin, Leu: leucin, Lys: lysin, Phe: phenylalanin, Pro: pro-10 lin, Ser: serin, Thr: threonin, Tyr: tyrosin, Val: valin, Obu*: t--butylesterrest.
Eksempel 1 (1) Desalanin-(B30)-svineinsulin 15 Til en opløsning af svineinsuiin (500 mg) i 0,1M ammoniumhy- drogencarbonat (100 ml, pH 8,3) sættes krystallinsk carboxypepti-dase A (5 mg, Worthington Co., forbehandlet med diisopropylfluor-phosphat, 49 u/mg). Blandingen inkuberes ved stuetemperatur i 8 timer. Inkubationen afbrydes, når alanin frigøres i forhold på 20 0,77M/1M insulin. Reaktionsblandingen lyofiliseres. Produktet oplø ses i 0,5M eddikesyre og adsorberes på en søjle af "Sephadex G 50" (3,5 x 95 cm) af yderst fine partikler. Søjlen elueres med 0,5M eddikesyre med en portion på 11,5 ml pr. fraktion. Fraktion nr. 40-60 opsamles og lyofiliseres til frembringelse af den i overskriften anførte 25 forbindelse (460 mg). Udbyttet er 92%.
Produktet hydrolyseres til aminosyreanalyse med 6M saltsyre ved 110°C i 24 timer, hvorved følgende resultat fås. De i parentes viste tal er i hele beskrivelsen de teoretiske værdier.
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,91 (2), Arg 0,95 (1), 30 Asp 3,2I (3), Thr 2,09 (2), Ser 2,97 (3), Glu 7,35 (7), Gly 4,29 (4), Ala 1,26 (1), CysOgH 5,94 (6), Val 3,86 (4), Ile 1,55 (2), Leu 6,53 (6), Tyr 4,08 (4), Phe 3,22 (3), Pro 1,2 (1).
(2) |'B30-Thr-OBut1-svineinsuiin 35 Ovenstående produkt (100 mg, 10 mM) og L-threonin-t-butyl- ester (205 mg, 500 mM) opløses i en blanding (1,05 ml) af ethanol og dimethylformamid (1:1, vol./vol.) Til opløsningen sættes en op- 8 146482 løsning af krystallinsk trypsin (4 mg, Worthington Co., omkrystalliseret tre gange) i 0,5M boratpufferopløsning (0,75 ml, pH 6,5) og TPCK til en s lutkoncentration på 0,01 mM. Blandingen holdes natten over ved 37°C. Produktet bekræftes med hp væskekromatografi, og 05 det beregnede udbytte er 75%. Blandingen gøres sur med iseddikesyre og underkastes gelfiltrering med en søjle af "Sephadex G 50" (4,2 x 130 cm) af yderst fine partikler, hvorved der fis tre fraktioner svarende til trypsin, det i overskriften anførte insulinderivat og L-threonin-t-butylester. Målinger af enzymaktivitet og ninhydrin-10 reaktion viser, at henholdsvis trypsin og L-threonin-t-butylester genvindes 50%.
Den fraktion, der indeholder insulinderivatet, lyofiliseres til frembringelse af et råt pulver (89 mg) af den i overskriften anførte forbindelse. Produktet fyldes ved 4°C på en søjle af "DEAE-Sepha-15 dex A 25" (1,9 x 24,5 cm), som på forhånd er ligevægtsindstillet med 0,01M trispufferopløsning (pH 7,6) og 7M urinstof. Søjlen elu-eres med ovenstående pufferopløsning (800 ml), og der frembringes så en lineær Na+ gradient (til 0,3M NaCI), og der fås en fraktion A nær ved 0,08 til 0,09M koncentration og en fraktion B nær ved 0,13 20 til 0,14M. Hver fraktion dialyseres øjeblikkeligt mod 0,01M ammoniumacetat i 3 til 4 dage på et køligt sted og lyofiliseres, hvorved der fås et pulver (35 mg) fra fraktion A og et pulver (27 mg) fra fraktion B. Førstnævnte identificeres som den i overskriften anførte forbindelse, og sidstnævnte som en blanding af des-alanin-(B30)-svine-25 insulin og intakt svineinsulin ved hp væskekromatografi og polyacryl-amidgelelektroforese.
(3) Human insulin
Trifluoreddikesyre (2 ml) med anisol (0,2 ml) sættes til det ovenfor 30 opnåede produkt (30 mg), og blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter. Trifluoreddikesyren fjernes under nitrogenatmosfære, og blandingen ekstraheres med ether (15 ml) efter tilsætning af 1N eddikesyre (2 ml) til fjernelse af anisolen. Eddikesyrelaget lyofiliseres, hvorved den i overskriften anførte forbindelse fås (28 mg). Udbyt-35 tet er 43% beregnet ud fra udgangsforbindelsen i 77% renhed.
Produktet identificeres som den i overskriften anførte forbindelse ved aminosyreanalyse, "Slab" gelelektroforese og hp væske 9 146482 kromatografi. Aminosyreanalysen gennemføres under samme betingelser som i afsnit (1), og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,89 (2), Arg 0,87 (1),
Asp 3,32 (3), Thr 3,16 (3), Ser 2,99 (3), Glu 7,35 (7), Pro 1,29 05 CD, Gly 4,39 (4), Ala 1,26 (1), CysC>3H 4,6 (6), Val 3,93 (4), Ile 1,61 (2), Leu 6,51 (6), Tyr 3,68 (4), Phe 3,19 (3).
Eksempel 2 (1) Desalanin-(B30)-o kseinsulin 10 Til en opløsning af okseinsulin (200 mg) i 0,1M ammoniumhy- drogencarbonat (40 ml) sættes krystallinsk carboxypeptidase A (1,8 mg, 49 u/mg). Blandingen holdes natten over ved stuetemperatur og lyofiliseres, hvorved der fås et råt pulver (180 mg) af den i overskriften anførte forbindelse. Man forvisser sig om, at produktet be-15 står af 78% af den i overskriften anførte forbindelse og 22% desaspa-ragm-(A21)-desalanin-(B30)-insulin.
(2) [BSO-Thr-OBu*'] -okseinsulin
Det under afsnit (1) ovenfor opnåede produkt (116 mg, 5 mM) 20 og L-threonin-t-butylester (448 mg, 500 mM) opløses i en blanding (2,4 ml) af ethanol og dimethylformamid (1:1). Opløsningen blandes med 0,5M boratpufferopløsning (1,6 ml, pH 7,0) indeholdende krystallinsk trypsin (87,5 mg, 0,94 mM) og TPCK (0,27 mg, 0,2 mM) og inkuberes natten over ved 37°C. Fremstillingen af den i overskrif-25 ten anførte forbindelse bekræftes ved hp væske kromatografi, og udbyttet beregnes til 80%.
Reaktionsblandingen behandles på samme måde som i eksempel 1 (2) . Den resulterende fraktion A rekromatograferes for at fjerne desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin og behandles pi samme 30 måde som i eksempel 1 (2), hvorved der fås et råt pulver (63 mg).
Produktet identificeres som den i overskriften anførte forbindelse ved hp væske kromatografi og "Slab" gelelektroforese.
(3) [B30-Thr1-okseinsulin 35 Til produktet (63 mg) fra afsnit (2) ovenfor sættes trifluoreddi- kesyre (2 ml) med anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter, behandles så på samme måde som i eksempel 1 146482 10 (3) og lyofiliseres, hvorved der fis den i overskriften anførte forbindelse (60 mg). Udbyttet er 66% beregnet ud fra udgangsforbindelsen i 78% renhed.
Produktet identificeres ved hjælp af [B30-Thr]-okseinsulin frem-05 stillet på en anden måde, ved aminosyreanalyse, "Slab" gelelektroforese og hp væske kromatografi. Aminosyreanalysen gennemføres under samme betingelser som i eksempel 1 (1), og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,95 (2), Arg 0,98 (1),
Asp 3,00 (3), Thr 2,00 (2), Ser 2,83 (3), Glu (6,69 (7), Gly 4,06 10 (4), Ala 2,06 (2), Cys03H 5,38 (6), Val 4,45 (5), Ile 0,76 (1), Leu 6,14 (6), Tyr 3,92 (4), Phe 2,97 (3), Pro 1,20 (1).
Eksempel 3 (1) [B30-Thr-OBu*j-svineinsulin 15 Desalanin-(B30)-svineinsulin (100 mg, 10 mM) fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 1 (1) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) opløses i en blanding af (1,05 ml) af ethanol og dime-thylformamid (1:1, vol./vol.). Opløsningen blandes med en 0,5M borat-pufferopløsning (0,7 ml) og Protease I (0,35 mg) fremstillet med 20 Achromobacter lyticus M497-1 og inkuberes ved ved 37°C i 2 dage.
Reaktionsblandingen gøres sur med iseddikesyre og underkastes gelfiltrering med en søjle (4,2 x 130 cm) af "Sephadex G 50" med yderst fine partikler til adskillelse i en enzymfraktion, en insulinfraktion og en threoninfraktion. Enzymet og L-threonin-t-butyleste-25 ren genvindes mere end 50%. Insulinfraktionen lyofiliseres, hvorved der fås et rit pulver (83 mg). Pulveret underkastes søjlekromatogra-f? på samme måde som i eksempel 1 (2), hvorved der fis et pulver (48 mg) fra fraktion A og et andet pulver (20 mg) fra fraktion B. Førstnævnte identificeres som den i overskriften anførte forbindelse, 30 og sidstnævnte som en blanding af desalanin-(B30)-svineinsulin og et kontamineret svineinsulin.
(2) Human insulin
Det ovenfor opnåede produkt (40 mg) behandles med trifluor-35 eddikesyre (2 ml) og anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter og behandles så på samme mide som i eksempel 1 (3), hvorved der fås den i overskriften anførte forbindelse
Claims (5)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et B30-threonin-insulin, KENDETEGNET ved, at man omsætter et des-B30-insulin med et 15 overskud af et threoninderivat med den almene formel: Thr(R1)(R2) o 1 hvori Thr står for en L-threoninrest, R er hydrogen eller en hy- 2 20 droxybeskyttende gruppe, og R er en carboxylbeskyttende gruppe, i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym og i en reaktionsblanding med en pH-værdi pi ca. 5-9 og en temperatur pi ca. 0-50°C og indeholdende et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, hvorpå den eller de beskyttende grupper fjernes. 25
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at enzymet er trypsin.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det 30 trypsinlignende enzym er Protease I.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at molforholdet mellem L-threoninderivatet og des-B30-insulinet er 5:1 til 1000:1. 35
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at molforholdet er 25:1 til 200:1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK545181A DK155887C (da) | 1979-04-13 | 1981-12-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4571179 | 1979-04-13 | ||
| JP4571179A JPS55138391A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | New synthetic method of peptide derivative |
| JP4571079 | 1979-04-13 | ||
| JP4571079A JPS55138393A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | Semisynthesis of insulin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK155680A DK155680A (da) | 1980-10-14 |
| DK146482B true DK146482B (da) | 1983-10-17 |
| DK146482C DK146482C (da) | 1986-10-06 |
Family
ID=26385768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK155680A DK146482C (da) | 1979-04-13 | 1980-04-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0017938B1 (da) |
| DE (1) | DE3064479D1 (da) |
| DK (1) | DK146482C (da) |
| NO (1) | NO153061C (da) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| EP0085083B1 (en) * | 1981-08-10 | 1985-01-23 | Nordisk Insulinlaboratorium | Process for the enzymatic preparation of human insulin |
| DK353781A (da) * | 1981-08-10 | 1983-02-11 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| EP0367302A3 (en) * | 1982-04-23 | 1991-06-19 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked achromobacter protease i for use therein and a process for preparing the same |
| IT1189353B (it) * | 1982-06-07 | 1988-02-04 | Nordisk Insulinlab | Procedimento per la preparazione di insulina umana e suoi esteri |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| EP0294851A3 (de) * | 1987-06-12 | 1990-05-09 | Berlin-Chemie Ag | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| NL7110277A (da) * | 1970-07-31 | 1972-02-02 | ||
| GB1426061A (en) * | 1972-12-28 | 1976-02-25 | Ici Ltd | Polypeptides |
| CH602599A5 (en) * | 1974-03-27 | 1978-07-31 | Ciba Geigy Ag | Insulin prodn. using different cysteine protecting groups |
| US4116768A (en) * | 1975-04-29 | 1978-09-26 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| GB1465235A (en) * | 1975-04-29 | 1977-02-23 | Sagami Chem Res | Process for preparing peptides |
-
1980
- 1980-04-11 DE DE8080101966T patent/DE3064479D1/de not_active Expired
- 1980-04-11 EP EP80101966A patent/EP0017938B1/en not_active Expired
- 1980-04-11 NO NO801048A patent/NO153061C/no unknown
- 1980-04-11 DK DK155680A patent/DK146482C/da not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0017938B1 (en) | 1983-08-03 |
| NO801048L (no) | 1980-10-14 |
| DK146482C (da) | 1986-10-06 |
| DE3064479D1 (en) | 1983-09-08 |
| DK155680A (da) | 1980-10-14 |
| EP0017938A1 (en) | 1980-10-29 |
| NO153061C (no) | 1986-01-08 |
| NO153061B (no) | 1985-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4320196A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
| US4701440A (en) | Insulin derivatives, processes for their preparation and their use, and pharmaceutical agents for the treatment of diabetes mellitus | |
| DK146482B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin | |
| US5015728A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives, the B chain of which is lengthened c-terminally | |
| HU201096B (en) | Crystal suspensions of insulin derivatives, process for their preparation and their use | |
| CA2083360A1 (en) | Tri-arginine insulins | |
| US4320197A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| JPS642360B2 (da) | ||
| US4639332A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives | |
| MOLLAY et al. | Isolation of a dipeptidyl aminopeptidase, a putative processing enzyme, from skin secretion of Xenopus laevis | |
| Deschodt-lanckman et al. | In vitro and in vivo degradation of human gastrin by endopeptidase 24.11 | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| FI79117B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av bovine-, svin- eller humaninsulin. | |
| JPH06128287A (ja) | ペプチドおよびその製造方法 | |
| DK155887B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin | |
| FI73239B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett insulinderivat. | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| Russell et al. | Modification of human placental lactogen with plasmin. Preparation and characterization of a modified hormone with increased biologic activity | |
| EP0348399B1 (fr) | Sorbine et peptides derives, elevant l'absorption par les muqueuses | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| JPH0150719B2 (da) | ||
| JPS6312480B2 (da) | ||
| JPH0150718B2 (da) | ||
| JPS6246560B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |