NO153061B - Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin Download PDFInfo
- Publication number
- NO153061B NO153061B NO801048A NO801048A NO153061B NO 153061 B NO153061 B NO 153061B NO 801048 A NO801048 A NO 801048A NO 801048 A NO801048 A NO 801048A NO 153061 B NO153061 B NO 153061B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- threonine
- stated
- des
- trypsin
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 75
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 36
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 24
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 22
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 13
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 13
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 claims description 6
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 claims description 4
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 claims description 4
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical group [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 20
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 6
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N tert-butyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- -1 aralkyl ester Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108010021648 semen liquefaction factor Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et B30-threonin-insulin, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at et des-B30-insulin i nærvær av trypsin eller et trypsinlignende enzym i et medium med pH 5 - 9, og temperatur på 0 - 50°C, og som inneholder et eller flere organiske løsningsmidler, omsettes med en overskuddsmengde av et threoninderivat representert ved formelen
Thr (R<1>)(R<2>)
hvori Thr er L-threoninresten, R"<*>" er hydrogen eller en hydroksybeskyttende gruppe, og R er en karboksylbeskyttende gruppe, og, om ønsket, fjernes beskyttelsesgruppen eller gruppene.
Disse og andre trekk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremgår av patentkravene.
Oppfinnelsen vedrører således en halvsyntese av humaninsulin. Mer spesielt består den i en enzymatisk syntese av et B30-threonin-insulin inklusive humaninsulin. Syntesen gjennomføres ved å omsette et des-B30-insulin med en overskuddsmengde av threoninderivat i nærvær av et enzym som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptidbindinger og fjerner en beskyttende gruppe fra threoninet slik at man får et B30-threonin-insulin.
Insulin er en uomgjengelig nødvendig medisin for behandling av diabetes. Okse- og svineinsuliner kan idag fås i handelen. Men disse insuliner er dog forskjellige fra humaninsulin med hensyn til noen aminosyrekomponenter, som bevirker dannelse av antistoffer i pasienter. Antistoffene er kjent for å nedsette effektiviteten av ytterligere insulinbehandling. Derfor be-gunstiges humaninsulin, og dets kommersielle tilgjengelighet har lenge vært sterkt ønsket. Humaninsulin er forskjellig fra annet animalsk insulin ved aminosyrekomponentene i posisjonene 8, 9 og 10 i A-kjeden og ved posisjon 30 i B-kjeden. Denne oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å erstatte aminosyren i 30-posisjonen i B-kjeden av et animalsk insulin med L-threonin. Følgelig kan humaninsulin lett fremstilles ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ved å anvende svineinsulin som utgangsmateriale. Svineinsulin er forskjellig fra humaninsulin i aminosyren ved B30-posisjonen. Således - oppnådd humaninsulin anvendes fordelaktig for behandling av diabetiske pasienter. Oppfinnelsen tilveiebringer videre andre B30-threonin-insuliner ved å gå ut fra andre animalske insuliner. De resulterende insuliner er forskjellige fra humaninsulin i aminosyrene 8, 9 og 10-posisjonene av A-kjeden og kan anvendes som reagenser for å teste antigenj sitet og medikament for diabetes.
Humaninsulin ble kjemisk fremstilt av M.A. Ruttenberg som vist i US patentskrift nr. 3.903.068 og R. Obermeier et al. beskrevet i Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 357, 759-767 (1976). Disse prosesser omfatter kompensering av et desoktapeptid-(B23-30)-svineinsulin med et syntetisk oktapeptid tilsvarende posisjonene B23-30 i humaninsulin. Den første prosess om-fatter imidlertid alkalisk hydrolyse som gir skadelige bireaksjoner. Den siste prosess er også en ikke—spesifikk reaksjon som medfører mange bireaksjoner og krever kompliserte rense-prosedyrer. Disse prosesser kan derfor ikke anvendes i industriell målestokk.
M. Bodanszky et al. foreslo en fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin i US patentskrift nr. 3.276.961 hvor humaninsulin fremstilles fra andre animalske insuliner ved en innvirkning av et enzym som karboksypeptidase A og trypsin i nærvær av threonin. Denne prosess vil sannsynlig ikke frem-bringe humaninsulin på grunn av at trypsin og karboksypeptidase A ikke bare hydrolyserer peptidbindingen av lysyl-alanin (B29-B30), men også de andre posisjoner i insulin under de betingelser som er beskrevet der. Trypsin hydrolyserer foretrukket peptidbindingen i arginyl-glycin (B22-B23) snarere enn lysyl-alaninet (B29-B30). Karboksypeptidase A kan imidlertid ikke frigi bare alaninet ved C-enden av B-kjeden uten å frigi asparagin ved C-enden av A-kjeden. En spesiell betingelse, det vil si omsetning i en ammonium-hydrogenkarbonat-buffer-løsning er nødvendig for å forhindre frigivelsen av aspara-ginet. Denne betingelse ble oppdaget i 1978 (Hoppe-Seylers Z. Physiol Chem., 359, 799-802 (1978)). Videre vil peptidsyntese neppe foregå på grunn av at hydrolysehastigheten er større enn syntesehastigheten ved denne tilstand.
Det konkluderes derfor med at det ikke har vært noen til-gjengelig industriell fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin til denne tid.
Med den foreliggende oppfinnelse kan imidlertid humaninsulin fremstilles i kommersiell målestokk. Prosessen består av enzymatisk kondensering av et des-B30-insulin med et L-threonin derivat. Fremgangsmåten er forskjellig fra alle tidligere kjente prosesser og har mange fordeler. Den er en spesifikk reaksjon som ikke medfølges av noen skadelige bireaksjoner som for eksempel racemisering. I tillegg kan uomsatt utgangsmaterial lett gjenvinnes uten skade og anvendes på nytt. Prosessen anvender en overskuddsmengde av L-threoninderivat. Overskuddsmengden av threoninderivatet forhindrer bruddet av karbonylbindingen til argininet i 22-posisjonen av B-kjeden, selv om bindingen vanligvis spaltes av trypsin. Følgelig er beskyttelsen av argininresten som må foretas ved vanlig enzymatisk reaksjon, ikke nødvendig ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.
Prosessen omfatter således en omsetning av et des-B30-insulin (benevnt forbindelse II heretter) med en overskuddsmengde av L-threoninderivat (benevnt forbindelse I heretter) i nærvær av et enzym som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptidbindinger og etterfølgende fjernelse av de beskyttende grupper på threoninet.
Forbindelsen I representeres ved hjelp av følgende formel:
Thr (R<1>)(R<2>)
hvori Thr er L-threoninresten, R"'" er hydrogen eller en hydroksybeskyttende gruppe, og R <2>er en karboksylbeskyttende gruppe.
Forbindelsen II kan fremstilles ved å omsette forskjellige animalske insuliner (for eksempel fra gris, kveg, hval, sau, kanin, fisk, aper o.l.) med karboksypeptidase A som omhandlet av E. W. Shimitt et al. i Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem.
359, 799 (1978). Den kan også fremstilles ved å anvende en protease fremstilt ved hjelp av Achromobachter lyticus. Proteasen har en spesifikk virkning overfor lysin og spalter spesifikt lysinkarbonylbindinger i peptidbindinger. Isolasjonen og egenskapene er beskrevet av Masaki et al. i Agric. Biol. Chem., 42, 1443 (1978). Enzymet benevnes protease I. Fremstillingen av des-B30-svineinsulin er omhandlet i Biochem. Biophys. Res. Commun. 92, 396-402 (1980) og japansk off. skrift nr. 54-135789. Des-B30-insuliner av andre dyr kan fremstilles på samme måte.
Hydroksygruppen i forbindelsen I kan beskyttes eller ikke. Begge forbindelser kan anvendes for reaksjonen. Den beskyttende gruppe som anvendes velges fra hvilken som helst hydroksybeskyttende gruppe som vanlig anvendes i peptidsyntese som for eksempel t-butyl, benzyl, acetyl o.l. Karboksylgruppen i forbindelsen I må beskyttes og en hvilken som helst karboksylbeskyttende gruppe anvendt ved peptidsyntese kan anvendes. Slike grupper er for eksempel alkylester (for eksempel t-butyles ter) , aralkylester (for eksempel benzyl-ester), amid, substituerte amider (for eksempel anilid), salter (for eksempel natriumsalter) o.s.v.
Den beskyttende gruppe bør velges i betraktning av innførings-reaksjonen og fjernelsesreaksjonen for insulin på grunn av at reaksjonene kan resultere i denaturering eller inaktivering av insulinet. Hvis en hydroksybeskyttende gruppe og en
karboksylbeskyttende gruppe av threoninresten velges på passende måte, er en fjernelseprosedyre nok for å fjerne begge
de beskyttende grupper. Beskyttende grupper anvendt ved pep-tidsynteser er gjengitt detaljert av M. Bodansky et al. i Peptide Synthesis, 2. utgave (1976), utgitt av John Wiley & Sons .
Enzymet anvendt ved fremgangsmåten omfatter enzymer som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptidbindinger som kan oppnås av forskjellige planter og dyr, og disse er for eksempel trypsin, trypsinlignende enzymer o.l. Trypsinlignende enzymer er illustrert som for eksempel protease isolert av Morihara et al. i Arch. Biochem. Biophys. 126, 971 (1968) og proteasen er omhandlet av Yoshida et al. i FEBS Lett., 15, 129 (1971). Det enzym som skal anvendes kan behandles med tosyl-L-fenylalanin-klormetylketon (forkortet TPCK i det følgende) for å fjerne blandede enzymer som for eksempel chymotrypsin og chymotrypsinlignende enzym.
Videre er proteaser I fremstilt av Achromobacter lyticus
M497-1 et trypsinlignende enzym og inkludert i de enzymer som kan anvendes. Protease I virker spesifikt på lysinkarbonyl i peptidbindinger og isoleringen, og egenskapene er beskrevet i Agric. Biol Chem., 42, 1443 (1978). Kondenseringen av forbindelsen I med forbindelsen II gjennomføres under passende betingelser for peptidsyntesen av de ovennevnte enzymer. Reaksjonen gjennomføres som angitt ved pH 5 - 9, foretrukket pH 6 - 7. Reaksjonstemperaturen er 0 til 50°C, foretrukket omtrent 20 til 40°C. Det er ønskelig at konsentrasjonene både av forbindelsen I og forbindelsen II er så høye som mulig. Det foretrukne mol-forhold mellom forbindelsen I og forbindelsen II er 5:1 til 1000:1, spesielt 25:1 til 200:1. Med vann blandbare organiske løsningsmidler tilsettes som angitt til reaksjonsblandingen. Tilsetningen av organisk løs-ningsmiddel nedsetter de vandige konsentrasjoner av reaksjonsblandingen og resulterer i forhindring av reverserte reak-sjoner, det vil si hydrolyse av produktet, og øker også opp-løseligheten av forbindelsen I og forbindelsen II merkbart.
De organiske løsningsmidler som anvendes er for eksempel metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, glycerol o.l. De kan anvendes enkeltvis eller som en blanding. Den foretrukne konsentrasjon av det organiske løsningsmiddelet er 0 til 65 %, spesielt 40 til 60 % av reaksjonsblandingen. Mengden av organisk løsningsmiddel bør bestemmes av oppløse-ligheten av utgangsmaterialene, tendensen til denaturering for enzymet og dets hydrolyserende aktivitet.
Reaksjonsmediet kan velges fra trishydroksymetylaminometan (forkortet tris i det følgende), karbonat, borat-buffer-løsninger o.l. Enzymkonsentrasjonen bestemmes i avhengighet av konsentrasjonen av substrater og enzymaktiviteter. For eksempel anvendes handelsvanlig krystallinsk trypsin foretrukket i konsentrasjoner på omtrent 1 mg/ml til 10 mg/ml. Enzymet kan anvendes intakt eller i en fiksert form som for eksempel en kombinasjon mellom eller en inklusjon i en uopp-løselig bærer som for eksempel cellulose, dextran (for eksempel "Sephadex"), agarose (for eksempel "Sepharose"), polyakrylamidgel ("Bio-gel"), porøst glass o.l.
Reaksjonstiden er varierbar og påvirkes av andre reaksjonsbe-tingelser. Reaksjonen kan fortsettes inntil substrat og produkt blir i likevekt. Det tar vanligvis 3 til' 72 timer og i de fleste tilfeller 6 til 24 timer.
Insulinproduktet kan isoleres ved kombinasjon av den vanlige metode anvendt i peptidkjemien. En isolasjonsprosedyre illu-streres som følger: Reaksjonsblandingen underkastet gelfiltrering for å isolere og samle ureagert forbindelse I og enzym. Gjenvunnet forbindelse I og enzym kan anvendes på nytt. Den resterende del overføres til passende kromatogra-fering for å isolere et resulterende beskyttet insulin og et ureagert des-B30-insulin.
Det sistnevnte kan anvendes på nytt som forbindelse II. Det førstnevnte utsettes for reaksjon for fjernelse av den beskyttende gruppe.
Fjernelsen av beskyttende gruppe gjennomføres på vanlig måte, selv om metoden bør velges i avhengighet av egenskapene av den beskyttende gruppe. t-butylgruppen er et eksempel på en beskyttende gruppe for både hydroksy- og karboksylgruppen i threonin. Den kan fjernes ved å behandle med trifluoreddiksyre i nærvær av kationoppfangende middel, for eksempel anisol. Som bemerket ovenfor, hvis en enkel behandling kan fjerne den hydroksybeskyttende og den karboksylbeskyttende gruppe samtidig, blir prosessen enkel og fører til godt utbytte. Når C-enden av det resulterende insulin er beskyttet med en annen ester, amid, substituert amid eller salt, kan den beskyttende gruppe fjernes ved passende hydrolyse eller av-saltningsteknikk.
Insulin fremstilt ved oppfinnelsen er nyttig for behandling av diabetes og også som et reagens.
Insulinet oppnådd ved oppfinnelsen viser den samme aktivitet med senkning av blodsukkernivået som okseinsulin i mus som følger:
Testmetode:
Testforbindelsen oppløses i 0,01 M saltsyre og løsningen fortynnes til en passende konsentrasjon (2,5 - 20 ^ug/ml) med 20 til 60 ganger fysiologisk saltløsning. Den resulterende oppløsning tilføres intravenøst i en mengde av 0,1 ml/10 g kroppsvekt i DS mus som har fastet i fem timer. Blod tas fra orbitalblodkar 45 minutter etter tilførselen og blodsukker måles ved hjelp av glukoseoksidasemetoden under anvendselse av et kommersielt utstyr fremstilt av Boehringer Mannheim Corporation.
Bemerk: (2)-(4), (3)-(5) ingen vesentlig forskjell.
Humaninsulin fremstilt ved oppfinnelsen kan tilføres mennesker på samme måte som svine- eller okseinsulinpreparater på markedet. Det kan omdannes til farmasøytiske preparater på vanlig måte. For eksempel kan det gjøres til en injiserbar opp-løsning ved passende metoder som for eksempel fremstilling av sinkkomplekset med sinkklorid, en bufret oppløsning med en passende buffer som for eksempel natriumhydrogenfosfat, natriumacetat o.l. og en isotonisk oppløsning som for eksempel natriumklorid. Videre kan passende antiseptiske be-standdeler tilsettes, for eksempel kresol, fenol, para-hydroksybenzosyre, alkylestere (for eksempel metyl-, etyl-, propyl-, butylestere o.l.).
Doseringen av humaninsulinet er den samme som for insulin-preparater på markedet, nemlig omtrent 1 til 100 enheter kan tilføres til voksne mennesker pr. døgn, selv om doseringen avhenger av sykdommens alvorlighet.
De følgende eksempler gis for å illustrere og beskrive oppfinnelsen. I det folgende betyr hver forkortelse følgende: Ala: alanin, Arg: arginin, Asp: aspartinsyre, CysO^H: cysteinsyre, Glu: glutaminsyre, Gly: glycin, His: histidin, Ile: isoleucin, Leu: leucin, Lys: lysin, Phe: fenylalanin,
Pro: prolin, Ser: serin, Thr: threonin, Tyr: tyrosin,
Val: valin, OBu<1>": t-buty lesterrest.
Eksempel 1.
(1) Desalanin-(B30)-svineinsulin.
Til en oppløsning av svineinsulin (500 mg) i 0,1 M ammonium-hydrogenkarbonat (100 ml, pH 8,3) tilsettes krystallinsk karboksypeptidase A (5 mg, Worthington Co., forhåndsbehandlet med diisopropylfluorofosfat, 49 ^u/mg). Blandingen inkuberes ved romtemperatur i åtte timer.
Inkubasjonen stanses når alanin frigis med en hastighet på 0,77 M/IM insulin. Reaksjonsblandingen frysetørkes. Produktet oppløses i 0,5 M eddiksyre og absorberes på en kolonne av Sephadex G 50- (3,5 x 95 cm) av superfine partikler. Kolonnen elueres med 0,5 M eddiksyre med en del av 11,5 ml for hver fraksjon. Fraksjon nr. 40-60 oppsamles og frysetørkes til å gi den i overskriften nevnte forbindelse (460 mg). Utbyttet er lik 92 %.
Produktet hydrolyseres for aminosyreanalyse med 6 M saltsyre ved 110°C i 24 timer til å gi følgende resultat. Tallene i parentes viser de teoretiske verdier i denne sammenheng.
Aminosyreanalyse: Lys 1.00 (1), His 1.91 (2),
Arg 0.95 (1), Asp 3.21 (3), Thr 2.09 (2), Ser 2.97 (3),
Glu 7.35 (7), Gly 4.29 (4), Ala 1.26 (1), Cys03H 5.94 (6), Val 3.86 (4), Ile 1.55 (2), Leu 6.53 (6), Tyr 4.08 (4),
Phe 3.22 (3), Pro 1.2 (1).
(2) ^B30-Thr-OBu^j-svineinsulin.
Det ovennevnte produkt (100 mg, 10 mM) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (1,05 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1, volumbasis). Til oppløsningen tilsettes en oppløsning av krystallinsk trypsin (4 mg, Worthington Co., omkrystallisert tre ganger) i 0,5 borat-bufferløsning (0,75 ml, pH 6,5) og TPCK i den endelige konsentrasjon på 0,01 mM. Blandingen holdes over natten ved 37°C. Produktet bekreftes ved hjelp av høypresis væskekromatografering og det teoretiske utbyttet er 75 %. Blandingen gjøres sur med iseddik og tilføres gelfiltrering med en kolonne av "Sephadex G 50" (4,2 x 130 cm) av superfine partikler til å gi tre fraksjoner tilsvarende trypsin, det i overskriften nevnte insulinderi vat og L-thr.eonin-t-butylester. Målinger av enzymaktivitet og ninhydrinreaksjon viser at trypsin og L-threonin-t-butylester gjenvinnes hver med 50 %.
Fraksjonen inneholdende insulinderivatet frysetørkes til å gi et råpulver (89 mg) av den i overskriften nevnte forbindelse. Produktet tilføres ved 4°C til en kolonne av "DEAE-
Sephadex A 25" (1,9 x 24,5 cm) som på forhånd er ekvilibrert med 0,01 M tris-bufferløsning (pH 7,6) og 7 M urea. Kolonnen elueres med den ovennevnte bufferløsning (800 ml) og deretter gjennomføres en lineær Na<+> gradient (til 0,3 M NaCl) til en fraksjon A nær 0,08 til 0,09 M konsentrasjon og en fraksjon B nær 0,13 til 0,14 M. Hver fraksjon dialyseres umiddelbart mot 0,01 ammoniumacetat i tre til fire døgn på et koldt sted og frysetørkes til å gi et pulver (35 mg) fra fraksjon A og et pulver (27 mg) fra fraksjon B. Den førstnevnte identifiseres til å være den i overskriften nevnte forbindelse og den sistnevnte bekreftes å være en blanding av desalanin-(B30)-svineinsulin og intakt svineinsulin ved hjelp av høypresis væskekromatografering og polyakrylamid-gel-elektroforese.
(3) Humaninsulin.
Tri fluoreddiksyre (2 ml) med anisol (0,2 ml) tilsettes til produktet (30 mg) oppnådd ovenfor og blandingen holdes ved romtemperatur i 30 minutter. Trifluoreddiksyre fjernes under nitrogenatmosfære og blandingen ekstraheres med eter (15 ml) etter tilsetning av IN eddiksyre (2 ml) for å fjerne anisolen. Eddiksyrelaget frysetørkes til å gi den i overskriften forbindelse (28 mg). Utbyttet er 43 % ved beregning fra utgangsforbindelsen i 77 % renhet.
Produktet identifiseres som den i overskriften nevnte forbindelse med aminosyreanalyse, gel-elektroforese og høypresis væskekromatografering. Aminosyreanalyse gjennomføres under samme betingelser som i (1) og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse:
Lys 1.00 (1), His 1.89 (2), Arg 0,87 (1), Asp 3.32 (3),
Thr 3.16 (3), Ser 2.99 (3), Glu 7.35 (7), Pro 1.29 (1), Gly 4,39 (4), Ala 1.26 (1), CysO H 4,6 (6), Val 3.93 (4), Ile 1.61 (2), Leu 6,51 (6), Tyr 3,68 (4), Phe 3.19 (3).
Eksempel 2.
(1) Desalanin-(B30)-okseinsulin.
Til en løsning av svineinsulin (200 mg) i 0,1 M ammonium-hydrogenkarbonat (40 ml) tilsettes krystallinsk karboksypeptidase A (1,8 mg, 49 ^u/mg). Blandingen holdes over natten ved romtemperatur og frysetørkes til å gi et råpulver (180 mg) av den ovennevnte forbindelse. Produktet påvises å bestå av 78 % av den i overskriften nevnte forbindelse og 22 % desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin.
(2) |^B30-Thr-OBu^] -okseinsulin.
Produktet (116 mg, 5 mM) oppnådd ovenfor (1) og L-threonin-t-butylester (448 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (2,4 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1). Oppløsningen blandes med 0,5 M borat-bufferløsning (1,6 ml, pH 7,0) inneholdende krystallinsk trypsin (87,5 mg, 0,94 mM) og TPCK (0,27 mg,
0,2 mM) og inkuberes over natten ved 37°C. Fremstillingen av den i overskriften nevnte forbindelse bekreftes ved høypre-sis væskekromatografering og utbyttet beregnes å være 80 %.
Reaksjonsblandingen behandles på samme måte som i
Eksempel 1 (2). Den resulterende fraksjon A rekromatograferes for å fjerne desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin og behandles på samme måte som i Eksempel 1 (2) til å gi et råpulver (63 mg). Produktet identifiseres å være den i overskriften nevnte forbindelse ved hjelp av høypresis væske-kromatograf ering og gel-elektroforese.
(3) ^B30-ThrJ -okseinsulin.
Til produktet (63 mg) av den ovennevnte (2) tilsettes trifluoreddiksyre (2 ml) med anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved romtemperatur i 30 minutter, behandles så på samme måte som i Eksempel 1 (3) og frysetørkes til å gi den i overskriften nevnte forbindelse (60 mg). Utbyttet er 66 % ved beregning fra utgangsforbindelsen i 78 % renhet.
Produktet identifiseres med |^B30-ThrJ -okseinsulin fremstilt ved en annen metode med aminosyreanalyse, gel-elektroforese og høypresis væskekromatografering. Aminosyreanalyse gjennom-føres under samme betingelser som i Eksempel 1 (1) og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse:
Lys 1.00 (1), His 1.95 (2), Arg 0.98 (1), Asp 3.00 (3), Thr 2.00 (2), Ser 2,83 (3), Glu 6.69 (7), Gly 4.06 (4). Ala 2.06 (2), CysC>3 5.38 (6), Val 4.45 (5), Ile 0,76 (1),
Leu 6.14 (6), Tyr 3,92 (4), Phe 2.97 (3), Pro 1.20 (1).
Eksempel 3.
(L) [B30-Thr-OBu^j -svineinsulin.
Desalanin-(B30)-svineinsulin (100 mg, 10 mM) fremstilt ved hjelp av prosessen i Eksempel 1 (1) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (1,05 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1, volumbasis). Oppløsningen blandes med en 0,5 M borat-bufferløsning (0,7 ml) av protease I (0,35 mg) fremstilt av Achromobacter lyticus M'4 9 7-1 og inkuberes ved 37°C i to døgn. Reaksjonsblandingen gjøres sur med iseddik og tilføres en gelfiltrering med en kolonne (4,2 x 130 cm) av "Sephadex G 50" av superfine partikler til separering til en enzymfraks jon, en insulinfraks jon og en threoninfraks jon. Enzymet og L-threonin-t-butylester gjenvinnes med mer enn 50 %. Insulinfraksjonen frysetørkes til å gi et råpulver (83 mg). Pulveret tilføres kolonnekromatografering på samme måte som i Eksempel 1 (2) til å gi et pulver (48 mg) fra fraksjon A og et annet pulver (20 mg) fra fraksjon B. Den førstnevnte identifiseres å være den i overskriften nevnte forbindelse og den sistnevnte identifiseres til å være en blanding av desalanin-(B30)-svineinsulin og forurenset svineinsulin .
(2) Humaninsulin.
Produktet (40 mg) oppnådd ovenfor behandles med trifluoreddiksyre (2 ml) og anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved romtemperatur i 30 minutter og behandles så på samme måte som i Eksempel 1 (3) til å gi den i overskriften nevnte forbindelse (37 mg). Utbyttet er 56 % ved beregning fra utgangs-materialet i 76 % renhet.
Produktet identifiseres å være den i overskriften nevnte forbindelse ved hjelp av aminosyreanalyse, gel-elektroforese og høypresis væskekromatografering. Aminosyreanalyse gjennom-føres under samme betingelser som i Eksempel 1 (1) og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse:
Lys 1.00 (1), His 1.90 (2), Arg 0,93 (1), Asp 3.21 (3), Thr 3.05 (3), Ser 2.99 (3), Glu 7.23 (7), Pro 1.25 (1), Gly 4.33 (4), Ala 1.25 (1), Val 3.91 (4), Ile 1.58 (2), Leu 6.51 (6), Tyr 3.66 (4), Phe 3.15 (3).
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et B30-threonin-insulin,
karakterisert ved at et des-B30-insulin i nærvær av trypsin eller et trypsinlignende enzym i et medium med pH 5 - 9, og temperatur på 0 - 50°C, og som inneholder et eller flere organiske løsningsmidler, omsettes med en overskuddsmengde av et threoninderivat representert ved formelen: Thr (R<1>)(R<2>)
hvori Thr er L-threoninresten, R"'" er hydrogen eller en hydroksybeskyttende gruppe, og R er en karboksylbeskyttende gruppe, og, om ønsket; fjernes beskyttelsesgruppen eller gruppene.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som trypsinlignende enzym anvendes protease I.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at L-threoninderivatet i forhold til des-B30-insulinet anvendes i et molart forhold på fra 5:1 til 1000:1, foretrukket fra 25:1 til 200 : 1.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at det som organisk løsningsmiddel anvendes metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd eller glyserol, eller blandinger derav, foretrukket etanol eller dimetylformamid.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som des-B30-insulin anvendes des-B30-svineinsulin, eller des-B30-okseinsulin.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som threoninderivat anvendes t-butylesteren av L-threonin.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at reaksjonen gjennom-føres ved pH 6 til pH 7.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at reaksjonen gjennom-føres ved temperatur 20 til 40°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO844636A NO163531C (no) | 1979-04-13 | 1984-11-21 | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4571079A JPS55138393A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | Semisynthesis of insulin |
| JP4571179A JPS55138391A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | New synthetic method of peptide derivative |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO801048L NO801048L (no) | 1980-10-14 |
| NO153061B true NO153061B (no) | 1985-09-30 |
| NO153061C NO153061C (no) | 1986-01-08 |
Family
ID=26385768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO801048A NO153061C (no) | 1979-04-13 | 1980-04-11 | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0017938B1 (no) |
| DE (1) | DE3064479D1 (no) |
| DK (1) | DK146482C (no) |
| NO (1) | NO153061C (no) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| WO1983000504A1 (en) * | 1981-08-10 | 1983-02-17 | Andresen, Finn, Hede | Enzymatic preparation of human insulin |
| DK353781A (da) * | 1981-08-10 | 1983-02-11 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
| US4601979A (en) * | 1981-09-15 | 1986-07-22 | Nordisk Insulinlaboratorium | Process for preparing human insulin or B-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DK182483A (da) * | 1982-04-23 | 1983-10-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Fremgangsmaade til semi-syntese af humant insulin og alkalisk protease til anvendelse derved |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DK119785D0 (da) * | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Nordisk Gentofte | Insulinpraeparat |
| EP0294851A3 (de) * | 1987-06-12 | 1990-05-09 | Berlin-Chemie Ag | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| NL7110277A (no) * | 1970-07-31 | 1972-02-02 | ||
| GB1426061A (en) * | 1972-12-28 | 1976-02-25 | Ici Ltd | Polypeptides |
| CH602599A5 (en) * | 1974-03-27 | 1978-07-31 | Ciba Geigy Ag | Insulin prodn. using different cysteine protecting groups |
| US4116768A (en) * | 1975-04-29 | 1978-09-26 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| GB1465235A (en) * | 1975-04-29 | 1977-02-23 | Sagami Chem Res | Process for preparing peptides |
-
1980
- 1980-04-11 DK DK155680A patent/DK146482C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-04-11 EP EP80101966A patent/EP0017938B1/en not_active Expired
- 1980-04-11 DE DE8080101966T patent/DE3064479D1/de not_active Expired
- 1980-04-11 NO NO801048A patent/NO153061C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK146482C (da) | 1986-10-06 |
| EP0017938B1 (en) | 1983-08-03 |
| DE3064479D1 (en) | 1983-09-08 |
| DK146482B (da) | 1983-10-17 |
| NO153061C (no) | 1986-01-08 |
| EP0017938A1 (en) | 1980-10-29 |
| DK155680A (da) | 1980-10-14 |
| NO801048L (no) | 1980-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4400465A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
| NO167810B (no) | Analogifremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater. | |
| US5338668A (en) | Opioid peptides derived from wheat proteins | |
| US4401757A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| US4645740A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| EP0382732B1 (en) | Superactive human insulin analogues | |
| FI79853C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| FI79117B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av bovine-, svin- eller humaninsulin. | |
| JPH06128287A (ja) | ペプチドおよびその製造方法 | |
| IL43751A (en) | Des-lys29-ala30-insulins and their preparation | |
| HRP940766A2 (en) | Enzymatic process for conversion of preproinsulin to insulin | |
| FI73239C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett insulinderivat. | |
| DK155887B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| Russell et al. | Modification of human placental lactogen with plasmin. Preparation and characterization of a modified hormone with increased biologic activity | |
| JPH0533993B2 (no) | ||
| Okamoto et al. | An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon | |
| NO830178L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinderivater | |
| JPH0150719B2 (no) | ||
| JPS6312480B2 (no) |