KR920008710B1

KR920008710B1 - 인슐린 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR920008710B1
Application number: KR1019840004611A
Authority: KR
Inventors: 그라우 울리히
Original assignee: 훽스트 아크티엔게젤샤프트; 하인리히 벡커,베른하르트 벡크
Priority date: 1983-08-03
Filing date: 1984-08-02
Publication date: 1992-10-08
Also published as: DK172242B1; EP0135720B1; ES534798A0; NZ209074A; NO167036B; IE841995L; ES8504679A1; JPH0696597B2; ATE41162T1; FI79853B; DE3327928A1; AU568866B2; JPS6064997A; CA1229588A; IL72568A0; PT79013A; IL72568A; DE3477004D1; ZA845980B; IE57666B1

Abstract

내용 없음.

Description

인슐린 유도체의 제조방법

본 발명은 일반식(I)의 인슐린 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서, R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내며, X는 유전학적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산의 동일하거나 상이한 라디칼을 나타내고, 이들중 하나 이상의 염기성 아미노산이며, C-말단 그룹은 호모세린-락톤 라디칼일 수 있고, Y는 Phe 또는 H이며, n은 1,2 또는 3이다.

인슐린은 생체내에서 프리프로인슐린이라고 하는 선구물질의 형태로 합성된다. 예비 서열(Presequence)은 막과의 상호작용을 위한 암호부위를 나타내며 합성 도중에 또는 합성 후 즉시 전달된다. 이와는 대조적으로, 프로인슐린은 췌장 추출물중에서 소량 검출될 수 있는 분자이다. 프로인슐린이 인슐린으로 전환되는 도중에, 특정 효소 시스템에 의해서 C-펩타이드가 절단된다.

효소에 의한 절단부위는 B31과 B32 위치(B30은 B쇄의 C-말단 뒤에 있음)상의 Arg-Arg 서열 및 62(또는 A1)번과 63(또는 A0)번 위치(이들은 A쇄의 N-말단 뒤에 있음)상의 Lys-Arg 서열이다. 프로인슐린은 시험관내에서 트립신 및 카복시펩티다제 B 활성을 갖는 효소에 의해서 쉽게 인슐린으로 전환될 수 있다[참조 : Kemmler et al., JBC 246, 6786-91(1971)]. 이와는 대조적으로, 트립신 또는 트립신-유사 효소만으로 단백질이 분해되면, 리신-(B22)-인슐린(=데-알라닌-(B30)-돼지의 인슐린, 데-트레오닌-(B30)-사람 인슐린)또는 아르기닌-(B22)-인슐린(=데옥타펩타이드 인슐린)을 생성하기 위해 B-말단이 절단되는 인슐린 분해 생성물 외에도 B쇄의 C-말단상의 31번과 32번 위치에 있는 하나 또는 둘 모두의 아르기닌을 여전히 함유하는 그들 중간체가 우선적으로 생성된다[참조 : Chance, in Proc. VII Congress of InternationaI Diabetes Fed., (1970); D.E.Steiner et aI., Fed. Proc. 33, 2105-15(1974); J. Markussen in Proc. Symp. on ProinsuIin, C-Peptide, Tokushima(1978)].

최근에는 프리프로인슐린을 원핵 동물, 특히 대장균(E. coIi)을 이용한 유전공학에 의해서 얻을 수 있다. 사람인술린 서열을 갖는 프로인슐린을 함유한 그들 균주가 본 명세서에서 특히 관심이 있다. 무엇보다도,플라스미드를 변형시킴으로써, 특히 효소적 또는 화학적 절단부위를 인슐린 또는 인슐린 유도체의 생성을위해 유지시키는 방식으로 프로인슐린 서열의 31-33번 및 61-63번 위치를 변화시킴으로써, 조절된 방법으로 새로운 서열 단위를 구성할 수 있다. 이들은 예를 들어, 31번과 32번 위치에 아르기닌을 하나 또는 둘 함유하는 대신에, 다른 염기성 아미노산, 즉 리신 또는 히스티딘을 함유하는 그들 유도체가 포함되며, 따라서 트립신 특이성을 갖는 효소를 절단용으로 사용할 수 있다. 그러나, 또한 다른 공지된 단백질 분해효소의 기질인 서열, 또는 화학적 방법에 의해 절단되는 서열을 도입할 수도 있다. 본 발명의 예비 조건은, 프로인슐린 동족체의 적절한 절단시에, A쇄의 N-말단 앞에 어떠한 추가의 아미노산도 함유하지 않으며 B쇄의 C말단(31 내지 33번 위치)상에 존재하는 3개 이하의 추가의 아미노산 중에서 하나 이상은 염기성 아미노산인 인슐린 유도체를 생성하는 것이다.

부가적으로 B쇄의 C-말단상에 양의 전하를 갖는 인슐린 유도체, 그의 제조방법, 그들을 함유하는 약제 및 이의 용도는 문헌[참조 : 독일연방공화국 특허원 P 33 26 472.4호(HOE 83/F 141) 및 P33 26 473.2호(HOE 83/F 142)]에 기술되어 있다. 이의 결정화 방법은 독일연방공화국 특허원 P33 27 709.5호(HOE 83/F 148)의 요지이다.

이들 인슐린 유도체는 특히 단백질 분해효소의 분해에 의해서 또는 페놀 또는 유사한 방향족 물질의 존재하에 목적하는 유도체의 등전점 가까이에서 화학적 절단에 의해서 상응하는 중간체, 프로인슐린, 프리프로 인슐린 또는 상응하는 동족체로부터 쉽게 제조될 수 있다. 이 방법에 의해서, 최종 생성물은 반응 용액으로부터 침전되고 따라서 반응 평형으로부터 실질적으로 제거될 뿐만 아니라; 표면적이 작기 때문에, 예를 들어 무정형 침전물보다 훨씬 추가의 반응의 진행에 더욱 안정한 첨예한, 프리즘 모양의 결정이 기술된 조건하의 매질중에서 직접 생산된다. 따라서, 예를 들면, 결정형의 유도체 인슐린 -Arg^B31-OH가 예외적으로 트립신 분해에 대해 더욱 안정하다는 사실은 놀랍다.

일반식(I)의 인슐린 유도체는 방향족 하이드록시 화합물의 존재하에 일반식(I)의 인슐린 유도체의 등전점 가까이에서 절단반응을 수행함을 특징으로 하여, 일반식(I)의 인슐린 유도체의 중간체, 프로인슐린, 프리프로인슐린 또는 그의 동족체를 절단함으로써 제조된다.

일반식(I)에 있어서, Y는 바람직하게는 Phe이다.

다음의 L-아미노산은 유전학적으로 암호화될 수 있다 : Gly, Ala, Ser, The, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp 및 Pro(밑줄친 것은 중성 아미노산임).

중성 아미노산이란, 특히 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gln, Met, Phe 또는 Pro를 의미하며; 염기성 아미노산이란 특히 Arg, Lys 또는 His를 의미한다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해서 다음의 인슐린 유도체를 제조할 수 있다(이들이 본 발명을 제한하는 것은 아님) :

사람 인슐린-Arg^B31-OH

돼지 인슐린-Arg^B31-OH

소 인슐린-Arg^B31-OH

사람 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH

돼지 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH

소 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH

사람 인슐린-Lys^B31-OH

사람 인슐린-Ala^B31-Lys^B32-OH

사람 인슐린-Val^B31-Arg^B32-OH

사람 인슐린-Leu^B31-Arg^B32-Arg^B33-OH

돼지 인슐린-Val^B31-His^B32-Arg^B33-OH

돼지 인슐린-Leu^B31-Val^B32-Arg^B33-OH

사람 인슐린-Arg^B31-Phe^B32-OH

사람 인슐린-Arg-NH

본 발명에 따른 제조방법은 페놀 또는 여러가지 페놀 혼합물의 존재하에서 등전점보다 1pH 단위 낮은 pH 내지 등전점보다 1pH단위 높은 pH에서 수행하는 것이 바람직하다.

pH는 적절한 완충액(예 : 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염)에 의해서 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 반응은 출발 물질의 농도가 0.5 내지 30mg/ml, 바람직하게는 1 내지 10mg/ml이고, 반응 속도가 결정 형성속도보다 약간 빠르거나 동일한 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 이것은 많은 결정 알갱이가 형성되고, 따라서 결정 크기가 평균 30μm를 초과하지 않음을 의미한다. 특히 효소 촉매작용의 경우에, 목적하는 방법으로 아주 정확하게 반응속도를 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법으로, 목적 생성물을 얻기 위한 반응을 더욱 훌륭히 조절할 수 있으며, 따라서 수율면에서도 월등히 향상될 수 있다. 생성물은 쉽게 더욱 반응시킬 수 있고, 단순히 세척함으로써 과량의 절단제, 예를 들어, 프로테아제가 거의 없는 형태로 얻어진다.

선택된 절단제는, 예를 들어, 목적하는 라디칼 Xn은 보유되는 반면에, 절단 공정이 이루어진 후에 A쇄가 유리 N-말당의 H-Gly을 갖는 특이성을 지닌 프로테아제이다. 메티오닌이 프로인슐린 서열중의 상응하는 부위에 도입되면, 절단 공정은 시아노겐 브로마이드로 수행할 수 있으며, 이 경우에 호모세린-락톤 라디칼이 C-말단상에 보유된다.

일반식(I)의 인슐린 유도체 및 이들을 함유하는 약제학적 제제는 아연 또는 프로타민 설페이트와 같은 데포(depot)보조제 없이도 자연작용을 완전하게 나타낸다. 데포 작용은 단백질 화학으로부터의 고유한 생리적 원리, 즉 등전점에서 거의 녹지 않는 인슐린 유도체 성질에 의한 것이다. 생리학적 조건하에서 이의 재용해성은 가능하게는 추가의 염기성 그룹을 절단함으로써 이루어지며, 유도체에 따라서, 트립신 또는 트립신-유사 및/또는 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B-유사 및/또는 에스테라제 활성에 의해서 일어난다.

[실시예 1]

페놀의 존재하 및 부재하에서 돼지로부터 의 데노나펩타이드-프로인슐린의 트립신 분해

350mg의 데노나펩타이드-돼지 프로인슐린을 산성 조건하에서 용해시키고, 이 용액을 200μg의 트립신(소)을 함유하는 215ml의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.5)에 가한다. 5분 이내에 혼탁이 일어난다. 반응이 종결되면 (약1시간), 100μg의 트립신 억제제를 하고, 이 혼합물을 원심분리하며, 백색 침전을 0.1%의 적절한 세정제와 함께 20ml의 0.05M 아세트산 암모늄 완충액(pH 4.0)에 용해시킨 다음, 0 내지 1M 염화나트륨 경사의 양이온 교환수지상에서 정제시킨다. 하기 물질이 분리된다 : 순수한 형태의 96mg(36.6%)의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH, 72mg(27.4%)의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 및 인슐린 -Arg^B31-OH의 혼합물 및 2개 이상의 불순물(등전점과 HPLC 에 따른). 아주 작고, 확인되지 않는 피크(HPLC) 이외에 14.9%의 출발 물질, 8.7%의 디-및 모노-아르기닌 유도체, 49.3%의 데-알라닌(B30)-인슐린 및 12.2%의 데옥타펩타이드-인슐린을 함유하는 56mg(약 21%)의 혼합물을 반응의 상등액으로 분리한다.

평행 배취에서, 100mg의 데노나펩타이드-돼지 프로인슐린을 산성 조건하에서 용해시키고, 이 용액을 2.5mg/ml의 m-크레졸과 50μg의 트립신(소)을 함유하는 50ml의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.5)가한다. 약 15분후에, 첨예한 프리즘 형태의 결정성 침전물이 약 5 내지 15μm의 크기로 생성된다. 3시간 후에 기술된 방법으로 반응을 중단한다. 상기에 기술한 바와 같이 후처리한다.

수득 : 56mg(74.7%)의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH, 11mg(14.7%)의 다이르기닌과 모노아르기닌 유도체의 혼합물

인슐린-유사 물질 극소량만이 상등액에 남아있다.

[실시예 2]

대장균에서 발현된 원숭이의 프리프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의한 사람 인슐린-Arg^B31-OH의 제조

10mg의 원숭이 프리프로인슐린을 산성 조건하에서 용해시키고, 이 용액을 25μg의 트립신(소)뿐 아니라 1.5mg/ml의 페놀과 0.7mg/ml의 m-크레졸을 함유하는 5ml의 0.1M 인산염 완충액 및 0.5M 염화나트륨(pH 6.8)에 가한다. 목적하는 생성물이 반응 용액중에서 약 5 내지 20μm의 크기의 첨예한 프리즘 모양으로 침전된다. 이 결정은 92%의 인슐린과 인슐린 유도체를 함유한다 : HPLC 에 따르면, 생성물의 78%가 사람 인슐린-Arg^B31-OH이고, 14%가 사람 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH이다. 5% 미만의 인슐린-유사 단백질만이 반응의 맑은 상등액에서 발견된다. 결정성 현탄액을 트립신의 존재하에 실온에서 2일 이상 정치시키면, 인슐린 및 인슐린 유도체의 이론적인 양의 87%가 여전히 결정 상태이며, 생성물의 79%가 사람 인슐린-Arg^B31-OH이고 11%가 사람 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH이다.

Claims

방향족 하이드록시 화합물의 존재하에 일반식(I)의 인슐린 유도체의 등전점 가까이에서 절단반응을 수행함을 특징으로 하여, 일반식(I)의 인슐린 유도체의 중간체, 프로인슐린, 프리프로인슐린 또는 그의 동족체를 절단함으로써 일반식(I)의 인슐린 유도체를 제조하는 방법.

상기식에서, R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내고, X는 유전학적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산의 동일하거나 상이한 라디칼을 나타내며, 이들중 하나 이상은 염기성 아미노산이며, C-말단 그룹은 호모세린-락톤일 수 있고, Y는 Phe 또는 H이며, n은 1,2 또는 3이다.
제1항에 있어서, 일반식(I)에서 R³⁰이 Ala, Thr 또는 Ser을 나타내는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(I)에서 Y가 Phe를 나타내는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(I)의 인슐린 유도체가 사람 인슐린, 돼지 인슐린 또는 소 인슐린의 서열을 갖는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(I)에서 X가 중성 아미노산 라디칼, 염기성 아미노산 라디칼 또는 이들 모두의 라디칼을 나타내는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 절단반응이 페놀 또는 여러 가지 페놀 혼합물의 존재하에서 수행되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 생성물이 우선적으로 크기가 30μm 이하인 결정형으로 수득되어 지도록 반응속도가 선택되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 중간체, 프로 인슐린 또는 이의 동족체가 반응 개시시에 0.5 내지 30mg/ml의 농도로 반응 매질중에 존재하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 매질이 적절한 방법으로 완충화된 수성 매질인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 절단제가 프로테아제이고, 이의 특이성에 의해 목적하는 라디칼 Xn은 보유되는 반면에, 절단공정이 수행된 후에 A쇄가 유리 -N-말단을 갖게 되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 절단제가 시아노겐브로마이드이고, 호모세린-락톤 라디칼은 B쇄의 C-말단상에 보유되는 반면에, 절단시 A쇄의 천연 N-말단이 Met-AO상에 형성되는 방법.