NO156132B - Fremgangsmaate ved fremstilling av et insulinderivat. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte ved fremstilling av et human insulin produkt som er egnet ved fremstilling av terapeutiske insulinpreparater, i hvilken fremgangsmåte svineinsulinprodukt behandles med karboksypeptidase A eller et tilsvarende enzym under dannelse av et desalanin-B30 insulinprodukt, hvilket deretter kondenseres med en L-threonin alkylester i nærvær av trypsin eller et enzym beslektet med dette og et organisk løsningsmiddel, hvoretter den dannede insulinester hydrolyseres til human insulin.

Bakgrunn

Insulin er en uunnværlig medisin for behandling av Diabetes. Det ville være selvfølgelig å behandle mennesker med terapeutiske preparater fremstilt fra insulin av human opprinnelse. Imidlertid står antallet diabetikere og det individuelle be-hov for insulin ikke i forhold til den tilgjengelige mengde råmateriale (bukspyttkjertel fra mennesker).

Av praktiske grunner brukes derfor terapeutiske preparater

som er fremstilt fra storfe-og svineinsulin. I større eller mindre grad gir disse insuliner imidlertid opphav til dannelse av antistoffer i det menneskelige legeme, hvilket medfører en redusert virkning av den videre insulinbehandling.

Denne ulempe antas å delvis skyldes forurensninger i svine-

og storfeinsulinet, delvis av fremmed natur, da aminosyre-rekkefølgen i storfeinsulin adskiller seg fra human insulin i stillingene A8, A10 og B30, mens svineinsulin bare adskiller seg fra insulin i B30-stillingen.

Problemet med dannelse av antistoffer har blitt redusert vesentlig siden innføringen av terapeutiske preparater som er fremstilt fra kromatografisk renset storfe- og svineinsulin. Imidlertid kan dannelse av antistoffer fortsatt forer . komme. Det antas at dette kan avhjelpes ved å bruke terapeutiske preparater fremstilt fra insulin med samme aminosyre-sekvens som human insulin.

Det er kjent å fremstille insulin kjemisk, se US patent nr. 3.903.068 og Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 357, 759-767

(1976).

i

Disse fremgangsmåter omfatter kondensering av desoktapeptid-(B23-30) svineinsulin med et syntetisk oktapeptid tilsvarende stillingene B-23-30 i human insulin. Imidlertid utføres en alkalisk hydrolyse i den første fremgangsmåten, som med-fører uheldige bireaksjoner. Den andre fremgangsmåten omfatter en ikke-spesifikk reaksjon som gir opphav til mange bi-reaks joner og krever kompliserte rensemetoder. Følgelig er disse fremgangsmåter ikke egnet for bruk i industriell skala.

Videre beskriver US patent nr. 3.276.961 en fremgangsmåte

ved fremstilling av human insulin fra andre animalske insuliner ved innvirkning av et enzym, f.eks. karboksypeptidase A eller trypsin i nærvær av treonin.

Imidlertid er det ikke mulig å fremstille human insulin i noen nevneverdig mengde ved denne kjente fremgangsmåten. Dette skyldes antagelig at trypsin og karboksypeptidase A ikke bare hydrolyserer lysyl-alanin peptidbindingen (B29-B30), men også andre stillinger i insulin under arbeidsbetingelsene. Trypsin hydrolyserer fortrinnsvis arginyl-glycin peptidbindingen (B22-B23) fremfor lysyl-alaninbindingen (B29-B30). Imidlertid kan ikke karboksypeptidase A utelukkende avspalte alanin ved C-avslutningen av B-kjeden uten også å avspalte asparagin ved C-avslutningen i A-kjeden. Det er senere påvist at en spesiell betingelse, dvs. reaksjon i en ammonium bikarbonat buffer løsning er nødvendig for å hindre at asparagin frigjøres, sammenlign Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 359, 799-802 (1978). Videre forekommer neppe en betydelig peptid-dannelse, da hydrolysereaksjonens. hastighet er høyere enn peptidsyntesens under arbeidsbetingelsene.

Til slutt beskriver Nature bind 280, 2. august 1979, 412-413, Biochem. & Biophys. Res. Commun., 29. januar 1980, 92 (2), 396-402 og dansk patentsøknad nr. 1556/80 ( alle Morihara et al) en fremgangsmåte for utskifting av B-30 aminosyren,

i hvilken behandling av svineinsulin med karboksypeptidase A, som er tilsatt en inhibitor (diisopropyl fluorfosfat)

ved 25°C i 8 timer i nærvær av ammonium bikarbonat buffer som fører til et desalanin insulin (DAI), som isoleres. Deretter utføres koplingsreaksjonen ved å tilsette en løs-ning av trypsin i 0,5 M borat bufferløsning og tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK) til en løsning av DAI og treonin butylester (Thr-OBu ) i et løsningsmiddel som inneholder en organisk løsningsmiddelblanding i høy konsentrasjon (ca. 60%) bestående av en blanding av DMF og etanol, hvoretter reaksjonen forløper ved 37°C i 20-48 timer under dannelse av (B30-Thr-OBu ) svineinsulin som isoleres. Til slutt avspaltes butylester beskyttelsesgruppen med trifluoreddikk-syre i nærvær av anisol.

Undersøkelser har imidlertid vist at sistnevnte kjente metode fører til et human insulin produkt som er uegnet for fremstilling av terapeutiske preparater da det inneholder enzym-forurensninger og av denne grunn er uegnet for bruk ved fremstilling av nødvendige farmasøytiske preparater med langvarig aktivitet. Videre er produktet mutagent i "Ames Test", til forskjell fra human insulin og svineinsulin fremstilt fra Pancreas fra hhv. mennesker og svin. Til slutt inneholder det forurensninger som er vanskelige å fjerne ved vanlig brukte metoder.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Det er nå funnet at det er mulig å fremstille et meget rent human insulinprodukt uten de ovenfor nevnte ulempene til human insulinprodukter som er fremstilt ved kjente fremgangsmåter.

Ifølge oppfinnelsen utføres koplingen av desalanin-B30 insulin (DAI) med L-treonin alkylester ved bruk av en spesifikk rekkefølge for blanding av de to reaktanter, enzym og reaksjonsmedium uten å bruke en buffer. Derved er koplingsreaksjonen fullstendig på overraskende kort tid. En blanding av en lavere alkanol og vann med eri pH verdi i området fra 5,5 til 7,5 brukes som reaksjonsmedium, slik at molarforholdet mellom DAI. og L-Thr alkylesteren er høyst 1:200. Den således fremstilte insulinester overføres deretter i human insulin på en mildnende måte, delvis ved et hensiktsmessig valg av esterens alkylrest, delvis ved å utføre hydrolysen i et vandig medium med en pH.verdi i området fra 8,5 til 10,5. Derved unngås tilsetningen av enzym, trifluoreddiksyre og anisol.

Følgelig er fremgangsmåten ifølge op<p>finnelsen karakterisert ved at desalanin-B30 insulin produktet oppslemmes i en lavere alkanol, suspensjonen tilblandes en løsning av en treonin alkylester og trypsin eller et dermed beslektet enzym i vann justert til en pH verdi fra 5,5 til 7,5 uten tilsetning av en buffer med suspensjonen slik at molarforholdet mellom desalanin-B30 insulin og L-treonin alkylesteren er høyst 1:200, og den resulterende blanding får stå i 5-30 minutter ved 0-50°C, og hydrolysen av insulinesteren utføres i et vandig medium med en pH verdi i området fra 8,5 til 10,5.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i stor skala så som industriell skala ved bruk av f.eks. fra 50 g eller mere utgangsinsulinprodukt,består en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen i å oppløse separat trypsin eller et dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann,, tilsette suspensjonen av desalanin B30 insulinproduktet til den gjenværende del av løsningen

av L-treonin alkylesteren i vann, justere temperaturen og pH verdien i den resulterende blanding og deretter tilsette den separat fremstilte løsning av trypsin eller dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylester i vann. I dette tilfelle foretrekkes det at temperaturen og pH verdien til den resulterende blanding justeres til 10°-

15°C og hhv. 5,8-6,2. Videre foretrekkes det separat å opp-løse et trypsin eller et dermed beslektet enzym i 10-20 vekt% av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann.

Det påpekes at kondensasjonsreaksjonen utføres uten tilsetning av en buffer idet reaktantenes bufferkapasitet er tilstrekkelig - under betingelsene som foreligger ifølge oppfinnelsen - til å opprettholde en pH i området fra 5,5 til 7,5.

De ovennevnte trekk er vesentlige trekk ved fremgangsmåten,

og de er avgjørende for muligheten til å utføre reaksjonen på meget kort tid (nedsatt med en faktor 10 0) i industriell skala.

I kondensasjonsreaksjonen er reaksjonstiden avhengig av de gjenværende reaksjonsbetingélser. Reaksjonstider fra 5 min. til 30 min., fortrinnsvis fra 5 til 15 min.

anvendes.

Som følge av den korte reaksjonstid i kondensasjonsreaksjonen opptrer ingen nevneverdige bireaksjoner, og det er videre ikke nødvendig å bruke enzymer behandlet med tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK).

I en spesielt fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes rått svineinsulin, dvs. insulin saltkake, som utgangsmateriale. Det er verd å bemerke at ved bruk av rått svineinsulin i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig å oppnå et høyt utbytte av human insulin tilsvarende det utbyttet som kan oppnås ved fremstilling av kromatografisk renset svineinsulin, når totalutbyttene i begge tilfeller beregnes ut fra mengden anvendt bukspyttkjertel .

Det er overraskende at bruken av rått svineinsulin som utgangsmateriale ikke gir opphav til vanskeligheter i den kromatografiske adskillelse av den erholdte human insulinester fra enzymet som brukes og uomsatt desalanin-B30 insulin.

Det brukte enzym i kondensasjonen.i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen må kunne spalte lysin karbonyl peptidbindinger, og således kan trypsin eller dermed beslektede enzymer brukes, f.eks. akromobakterprotease I, hvis fremstilling og egenskaper er beskrevet av Masaki et al., Agric. Biol. Chem., 4_2, 1443-1445 (1978). Det er unødvendig å bruke enzymer som er behandlet med tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK) for å fjerne en mulig kontaminering med chymotrypsinlignende enzymer som skyldes de korte reaksjonstider som er nevnt ovenfor og den dårlige reaktiviteten til slike enzymer i den brukte reaksjonsblanding.

Enzymet kan brukes i oppløst form, men kan også være bundet til en uløselig matrise, f.eks. agarose eller polyakrylamid eller lignende polymere substanser.

Kondensasjonsreaksjonen utføres under betingelser hvor den enzymatisk katalyserte hydrolyse ér tilstrekkelig undertrykt til at ' peptiddannelsesreaksjonen forløper. Som ovenfor nevnt må pH verdien være mellom 5^5 og 7,5. Temperaturen lig-ger normalt i området fra 0 til 50°C, fortrinnsvis fra 10 til 37°C.

I kondensasjonsreaksjonen bør konsentrasjonen av reaktantene, dvs. des-B30 insulin og L-treonin alkylester, være høy, og videre bør L-treonin alkylesteren som anvendes brukes i et stort overskudd opp til et molarforhold på 200:1, fortrinnsvis i området 20:1 til 100:1.

Kondensasjonsreaksjonen utføres i nærvær av vannblandbare lavere alkanoler eller blandinger derav, hvorved hydrolyse-reaksjonen forhindres, og reaktantenes løselighet forbedres. Konsentrasjonen av lavere alkanoler bør velges i området fra 20 til 90%, fortrinnsvis 30 til 80% beregnet på reaksjons-^ blandingens totale volum.

Når kondensasjonsreaksjonen er fullstendig, adskilles de in-sulinlignende proteiner fra de gjenværende bestanddeler ved gelfiltrering, hvorpå human insulinester adskilles fra uomsatte utgangsmaterialer ved anionebytterkromatografi. Det uomsatte utgangsmateriale kan eventuelt brukes på nytt i fremgangsmåten.

De samlede fraksjoner fra anionebytterkromatografien som inneholder human insulinester avspaltes, hvorpå pH verdien til det samlede eluat justeres til ca. 9,5 ved hjelp av NaOH. Etter 24-48 timer ved romtemperatur isoleres rent human insulin ved krystallisering eller andre vanlige metoder.

Hydrolysen av insulin alkylesteren forløper lett ved

en pH verdi fra 8,5 til 10,5 i en vandig løsning. Dette har den virkning at hydrolyseblandingen etter hydrolysen lett kan opparbeides på vanlig måte og at det isolerte human insulin oppnås med høy renhet.

Derved er human insulinet som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen velegnet for fremstilling av terapeutiske insulinpreparater fordi de ikke inneholder noen proteolytiske urenheter, og kan av denne grunn brukes for fremstilling av preparater med langvarig aktivitet fordi det virker på samme måte som human insulin og svine insulin fremstilt fra Pancreas fra mennesker og svin i ovenfor nevnte "Ames Test", og fordi det ikke inneholder noen forurensninger som er vanskelige å fjerne ved hjelp av vanlig brukte kromatografiske metoder.

I en foretrukket utførelsesform hvor rått insulin brukes

som utgangsmateriale oppnås videre et utbytte av human insulin som på alle hovedsakelige måter er likt det utbytte av meget rent svineinsulin som kan oppnås fra samme mengde rått insulin. Det er således tale om en fremgangsmåte som er både industrielt og klinisk tilfredsstillende i hittil ukjent grad.

Utførelsesmåter av oppfinnelsen

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de følgende eksempler.

Eksempel 1

Svineinsulin i form av rått insulin (saltkake) tilsvarende 2000 mg svineinsulin ble oppløst i 200 ml 0,2 M vandig NH4HCC>3 løsning (pH verdi 8,4). Til løsningen ble tilsatt

20 mg karboksypeptidase A i form av en vandig løsning med

en konsentrasjon på ca. 5 mg/ml. Blandingen ble godt rørt

i 5 min., hvorpå den fikk stå ved 20°C i 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble frysetørket.

Måling av frigjort alanin ved hjelp av aminosyremåling

viste et spaltningsutbytte på 92%i.

Det frysetørkede pulver ble oppslemmet i 23,4 ml 96% etanol etterfulgt av tilsetning av en løsning på 4,00 g L-treonin metylester og 200 mg trypsin i 14,00 ml destillert vann justert til en pH verdi på 6,50 med 5N saltsyre. Etter grundig blanding fikk blandingen stå ved 35°C i 15 min. Umiddelbart derpå ble reaksjonen avbrutt ved først å justere pH-verdien til 2,5 med 0,1 N saltsyre og volumet til 100 ml ved hjelp a<y> destillert vann.

Høytrykksvæske-kromatografianalyse av reaksjonsblandingen viste en produksjon av human insulinester på 80%.

Reaksjonsblandingen ble gelfiltrert på en kolonne av Sephadex

(R)

^G-50 Superfine (8 x 80 cm) i 1 M eddikksyre. Fraksjonen som inneholdt human insulinester og uomsatt desalanin-B30 insulin ble frysetørket.

Utbytte: 1612 g produktblanding.

Deretter ble produktblandingen ionebytterkromatografert ved 4°C på en kolonne av DEAE cellulose (Whatmann DE-52)

(9 x 23 cm), ekvilibrert med 140 ml/t av en puffer bestående av 0,02 M tris og 7 M urea, justert til en pH verdi på 8,1 med saltsyre. Når oppfyllingen av produktet var ferdig, ble kolonnen eluert i 2,5 t ved bruk av ovenfor nevnte pufferløsning, deretter 2 timer ved bruk av ovenfor nevnte puffer i blanding med 0,0045 mol natriumklorid pr. liter og til slutt i 12 timer ved bruk av førstnevnte puffer i blanding med 0,011 mol natriumklorid pr. liter.

Eluatet inneholdt to proteinholdige hovedfraksjoner. Fraksjonen som ble eluert først ble ved høytrykksvæske-kromato-grafi vist å være human insulinester og fraksjonen som ble eluert deretter å være desalanyl insulin.

Den samlede hum.an insulinesterf raks jon ble avsaltet på en kolonne av Sephadex ®G-25 i 0,1 M natriumacetat (pH verdi 8,0) ved 4°C, hvoretter pH verdien ble justert til 9,5 med 1 N NaOH løsning. Fraksjonen fikk stå ved 25°C i 24 timer.

950 mg rent human insulin erholdtes, identifisert ved amino-syreanalyse og høytrykks-kromatografi.

Eksempel 2

Svineinsulin i form av rått insulin (saltkake) tilsvarende 66,3 g svineinsulin ble oppløst i 6000 ml 0,2M ammonium acetat, pH verdi 8,4.Til løsningen ble tilsatt 600 mg karboksypeptidase A i form av en vandig løsning med en konsentrasjon på ca. 5 mg/ml. Løsningen ble rørt godt i 3 timer ved 20°C.

Desalanininsulinet ble utfelt ved tilsetning av 15% (v/v) NaCl.

Det isolerte lufttørkede presipitat ble hellet forsiktig

i 770 ml 96% etanol og ga derved en oppslemming av desalanin-isulin i etanol (oppløsning 1).

120 g Thr-O-Me, HC1 ble oppløst i 275 ml destillert vann og pH verdien justert til 5,8 med i5 M Na/H (oppløsning 2) .

Til 60 ml av oppløsning 2 tilsattes 600 mg trypsin (svin), oppløst ved grundig røring (oppløsning 3).

Oppløsning 1 og 2 ble blandet ved langsomt å helle oppløs-ning 1 i oppløsning 2 under røring. pH-verdien ble justert til 5,8 med 5 M NaOH. Etter blanding ble blandingen avkjølt til 10°C i et termostatisk kontrollert kar.

Reaksjonen fant sted etter tilsetning av oppløsning 3 til ovenfor nevnte blanding av desalanin insulin og Thr-O-Me i 10 min.

Umiddelbart deretter ble reaksjonen avbrutt ved å justere pH-verdien til 2,5 med 0,1 N HC1 og justere volumet til 2400 ml ved hjelp av destillert vann.

Høytrykksvæske-kromatografi analyse av reaksjonsblandingen viste en produksjon av human insulinester på 87%.

Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 1 og førte til et meget rent produkt (25,4 g) halvsyntetisk human insulin egnet for fremstilling av terapeutiske insulinpreparater.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av human insulin i hvilken fremgangsmåte et svineinsulinprodukt behandles med karboksypeptidase A eller et tilsvarende enzym under dannelse av et desalanin-B30 insulinprodukt, hvilket deretter kondenseres med en L-treonin alkylester i nærvær av trypsin eller et dermed beslektet enzym og et organisk koløs-ningsmiddel, hvoretter den således dannede insulinester hydrolyseres til human insulin, karakterisert ved at man suspenderer desalanin-B30 insulinproduktet i en lavere alkanol, blander en løsning av L-treonin alkylesteren og trypsin eller et dermed beslektet enzym i vann justert til en pH verdi på fra 5,5 til 7,5 uten tilsetning av en puffer med suspensjonen slik at molarforholdet mellcm desalanin-B30 insulin og L-tréonin alkylesteren er høyst 1:200, og lar den resulterende blanding stå i 5-30 min. ved 0-50°C, og at man utfører hydrolysen av insulinesteren i et vandig medium med en pH verdi i området fra 8,5 til 10,5.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man separat oppløser trypsin eller et dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann, setter suspensjonen av desalanin-B30 insulinproduktet til den gjenværende del av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann, justerer temperaturen og pH verdien til den resulterende blanding og deretter tilsetter den separat fremstilte løsning av trypsin eller dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at .det som svineinsulinprodukt brukes rått svineinsulin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at temperaturen og pH verdien til den resulterende blanding justeres til 10°-15°C og hhv. 5,8-6,2.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kondensasjonsreaksjonen utføres over et tidsrom på 5 til 15 min.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at desalanin-B30 insulinproduktet isoleres uten separasjon av det anvendte karboksypeptidase A eller tilsvarende enzym.

7. Fremgangsmåte ifølge krav,2, karakterisert ved at trypsin eller et dermed beslektet enzym oppløses separat i 10-20 vekt% av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann.