NO156132B

NO156132B - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN INSULIN DERIVATIVE.

Info

Publication number: NO156132B
Application number: NO83831263A
Authority: NO
Inventors: Finn Hede Andresen; Kim Ry Hejnaes; Per Balschmidt
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1981-08-10
Filing date: 1983-04-08
Publication date: 1987-04-21
Also published as: NO831263L; NO156132C

Description

Teknisk område Technical area

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte ved fremstilling av et human insulin produkt som er egnet ved fremstilling av terapeutiske insulinpreparater, i hvilken fremgangsmåte svineinsulinprodukt behandles med karboksypeptidase A eller et tilsvarende enzym under dannelse av et desalanin-B30 insulinprodukt, hvilket deretter kondenseres med en L-threonin alkylester i nærvær av trypsin eller et enzym beslektet med dette og et organisk løsningsmiddel, hvoretter den dannede insulinester hydrolyseres til human insulin. The present invention relates to a new method for the production of a human insulin product which is suitable for the production of therapeutic insulin preparations, in which method the porcine insulin product is treated with carboxypeptidase A or a similar enzyme to form a desalanin-B30 insulin product, which is then condensed with an L- threonine alkyl ester in the presence of trypsin or an enzyme related thereto and an organic solvent, after which the insulin ester formed is hydrolyzed to human insulin.

Bakgrunn Background

Insulin er en uunnværlig medisin for behandling av Diabetes. Det ville være selvfølgelig å behandle mennesker med terapeutiske preparater fremstilt fra insulin av human opprinnelse. Imidlertid står antallet diabetikere og det individuelle be-hov for insulin ikke i forhold til den tilgjengelige mengde råmateriale (bukspyttkjertel fra mennesker). Insulin is an indispensable medicine for the treatment of Diabetes. It would be natural to treat humans with therapeutic preparations prepared from insulin of human origin. However, the number of diabetics and the individual need for insulin is not in proportion to the available amount of raw material (pancreas from humans).

Av praktiske grunner brukes derfor terapeutiske preparater For practical reasons, therapeutic preparations are therefore used

som er fremstilt fra storfe-og svineinsulin. I større eller mindre grad gir disse insuliner imidlertid opphav til dannelse av antistoffer i det menneskelige legeme, hvilket medfører en redusert virkning av den videre insulinbehandling. which is produced from bovine and porcine insulin. However, to a greater or lesser extent, these insulins give rise to the formation of antibodies in the human body, which results in a reduced effect of further insulin treatment.

Denne ulempe antas å delvis skyldes forurensninger i svine- This disadvantage is believed to be partly due to contamination in pig-

og storfeinsulinet, delvis av fremmed natur, da aminosyre-rekkefølgen i storfeinsulin adskiller seg fra human insulin i stillingene A8, A10 og B30, mens svineinsulin bare adskiller seg fra insulin i B30-stillingen. and the bovine insulin, partly of a foreign nature, as the amino acid sequence in bovine insulin differs from human insulin in positions A8, A10 and B30, while porcine insulin only differs from insulin in the B30 position.

Problemet med dannelse av antistoffer har blitt redusert vesentlig siden innføringen av terapeutiske preparater som er fremstilt fra kromatografisk renset storfe- og svineinsulin. Imidlertid kan dannelse av antistoffer fortsatt forer . komme. Det antas at dette kan avhjelpes ved å bruke terapeutiske preparater fremstilt fra insulin med samme aminosyre-sekvens som human insulin. The problem of the formation of antibodies has been significantly reduced since the introduction of therapeutic preparations made from chromatographically purified bovine and porcine insulin. However, the formation of antibodies can still occur. come. It is believed that this can be remedied by using therapeutic preparations made from insulin with the same amino acid sequence as human insulin.

Det er kjent å fremstille insulin kjemisk, se US patent nr. 3.903.068 og Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 357, 759-767 It is known to produce insulin chemically, see US Patent No. 3,903,068 and Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 357, 759-767

(1976). (1976).

i in

Disse fremgangsmåter omfatter kondensering av desoktapeptid-(B23-30) svineinsulin med et syntetisk oktapeptid tilsvarende stillingene B-23-30 i human insulin. Imidlertid utføres en alkalisk hydrolyse i den første fremgangsmåten, som med-fører uheldige bireaksjoner. Den andre fremgangsmåten omfatter en ikke-spesifikk reaksjon som gir opphav til mange bi-reaks joner og krever kompliserte rensemetoder. Følgelig er disse fremgangsmåter ikke egnet for bruk i industriell skala. These methods include the condensation of desoctapeptide (B23-30) porcine insulin with a synthetic octapeptide corresponding to positions B-23-30 in human insulin. However, an alkaline hydrolysis is carried out in the first method, which entails unfortunate side reactions. The second method involves a non-specific reaction that gives rise to many side-reactions and requires complicated purification methods. Consequently, these methods are not suitable for use on an industrial scale.

Videre beskriver US patent nr. 3.276.961 en fremgangsmåte Furthermore, US patent no. 3,276,961 describes a method

ved fremstilling av human insulin fra andre animalske insuliner ved innvirkning av et enzym, f.eks. karboksypeptidase A eller trypsin i nærvær av treonin. in the production of human insulin from other animal insulins by the action of an enzyme, e.g. carboxypeptidase A or trypsin in the presence of threonine.

Imidlertid er det ikke mulig å fremstille human insulin i noen nevneverdig mengde ved denne kjente fremgangsmåten. Dette skyldes antagelig at trypsin og karboksypeptidase A ikke bare hydrolyserer lysyl-alanin peptidbindingen (B29-B30), men også andre stillinger i insulin under arbeidsbetingelsene. Trypsin hydrolyserer fortrinnsvis arginyl-glycin peptidbindingen (B22-B23) fremfor lysyl-alaninbindingen (B29-B30). Imidlertid kan ikke karboksypeptidase A utelukkende avspalte alanin ved C-avslutningen av B-kjeden uten også å avspalte asparagin ved C-avslutningen i A-kjeden. Det er senere påvist at en spesiell betingelse, dvs. reaksjon i en ammonium bikarbonat buffer løsning er nødvendig for å hindre at asparagin frigjøres, sammenlign Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 359, 799-802 (1978). Videre forekommer neppe en betydelig peptid-dannelse, da hydrolysereaksjonens. hastighet er høyere enn peptidsyntesens under arbeidsbetingelsene. However, it is not possible to produce human insulin in any significant quantity by this known method. This is presumably because trypsin and carboxypeptidase A not only hydrolyze the lysyl-alanine peptide bond (B29-B30), but also other positions in insulin under the working conditions. Trypsin preferentially hydrolyzes the arginyl-glycine peptide bond (B22-B23) rather than the lysyl-alanine bond (B29-B30). However, carboxypeptidase A cannot exclusively cleave alanine at the C-terminus of the B-chain without also cleaving asparagine at the C-terminus of the A-chain. It has later been demonstrated that a special condition, i.e. reaction in an ammonium bicarbonate buffer solution, is necessary to prevent asparagine from being released, compare Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 359, 799-802 (1978). Furthermore, a significant peptide formation hardly occurs, as that of the hydrolysis reaction. rate is higher than that of peptide synthesis under working conditions.

Til slutt beskriver Nature bind 280, 2. august 1979, 412-413, Biochem. & Biophys. Res. Commun., 29. januar 1980, 92 (2), 396-402 og dansk patentsøknad nr. 1556/80 ( alle Morihara et al) en fremgangsmåte for utskifting av B-30 aminosyren, Finally, Nature vol. 280, Aug. 2, 1979, 412-413, describes Biochem. & Biophys. Res. Commun., 29 January 1980, 92 (2), 396-402 and Danish Patent Application No. 1556/80 (all Morihara et al) a method for replacing the B-30 amino acid,

i hvilken behandling av svineinsulin med karboksypeptidase A, som er tilsatt en inhibitor (diisopropyl fluorfosfat) in which treatment of porcine insulin with carboxypeptidase A, to which an inhibitor (diisopropyl fluorophosphate) has been added

ved 25°C i 8 timer i nærvær av ammonium bikarbonat buffer som fører til et desalanin insulin (DAI), som isoleres. Deretter utføres koplingsreaksjonen ved å tilsette en løs-ning av trypsin i 0,5 M borat bufferløsning og tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK) til en løsning av DAI og treonin butylester (Thr-OBu ) i et løsningsmiddel som inneholder en organisk løsningsmiddelblanding i høy konsentrasjon (ca. 60%) bestående av en blanding av DMF og etanol, hvoretter reaksjonen forløper ved 37°C i 20-48 timer under dannelse av (B30-Thr-OBu ) svineinsulin som isoleres. Til slutt avspaltes butylester beskyttelsesgruppen med trifluoreddikk-syre i nærvær av anisol. at 25°C for 8 hours in the presence of ammonium bicarbonate buffer leading to a desalanin insulin (DAI), which is isolated. The coupling reaction is then carried out by adding a solution of trypsin in 0.5 M borate buffer solution and tosyl-L-phenyl alanine chloromethyl ketone (TPCK) to a solution of DAI and threonine butyl ester (Thr-OBu) in a solvent containing an organic solvent mixture in high concentration (approx. 60%) consisting of a mixture of DMF and ethanol, after which the reaction proceeds at 37°C for 20-48 hours with the formation of (B30-Thr-OBu) porcine insulin which is isolated. Finally, the butyl ester protecting group is removed with trifluoroacetic acid in the presence of anisole.

Undersøkelser har imidlertid vist at sistnevnte kjente metode fører til et human insulin produkt som er uegnet for fremstilling av terapeutiske preparater da det inneholder enzym-forurensninger og av denne grunn er uegnet for bruk ved fremstilling av nødvendige farmasøytiske preparater med langvarig aktivitet. Videre er produktet mutagent i "Ames Test", til forskjell fra human insulin og svineinsulin fremstilt fra Pancreas fra hhv. mennesker og svin. Til slutt inneholder det forurensninger som er vanskelige å fjerne ved vanlig brukte metoder. Investigations have shown, however, that the latter known method leads to a human insulin product which is unsuitable for the manufacture of therapeutic preparations as it contains enzyme contaminants and is therefore unsuitable for use in the manufacture of necessary pharmaceutical preparations with long-term activity. Furthermore, the product is mutagenic in the "Ames Test", in contrast to human insulin and pig insulin produced from Pancreas from respectively. humans and pigs. Finally, it contains contaminants that are difficult to remove by commonly used methods.

Beskrivelse av oppfinnelsen Description of the invention

Det er nå funnet at det er mulig å fremstille et meget rent human insulinprodukt uten de ovenfor nevnte ulempene til human insulinprodukter som er fremstilt ved kjente fremgangsmåter. It has now been found that it is possible to produce a very pure human insulin product without the above-mentioned disadvantages of human insulin products which are produced by known methods.

Ifølge oppfinnelsen utføres koplingen av desalanin-B30 insulin (DAI) med L-treonin alkylester ved bruk av en spesifikk rekkefølge for blanding av de to reaktanter, enzym og reaksjonsmedium uten å bruke en buffer. Derved er koplingsreaksjonen fullstendig på overraskende kort tid. En blanding av en lavere alkanol og vann med eri pH verdi i området fra 5,5 til 7,5 brukes som reaksjonsmedium, slik at molarforholdet mellom DAI. og L-Thr alkylesteren er høyst 1:200. Den således fremstilte insulinester overføres deretter i human insulin på en mildnende måte, delvis ved et hensiktsmessig valg av esterens alkylrest, delvis ved å utføre hydrolysen i et vandig medium med en pH.verdi i området fra 8,5 til 10,5. Derved unngås tilsetningen av enzym, trifluoreddiksyre og anisol. According to the invention, the coupling of desalanine-B30 insulin (DAI) with L-threonine alkyl ester is carried out using a specific order for mixing the two reactants, enzyme and reaction medium without using a buffer. Thereby, the coupling reaction is complete in a surprisingly short time. A mixture of a lower alkanol and water with an eri pH value in the range from 5.5 to 7.5 is used as reaction medium, so that the molar ratio between DAI. and the L-Thr alkyl ester is at most 1:200. The insulin ester thus produced is then transferred into human insulin in a mitigating way, partly by an appropriate choice of the ester's alkyl residue, partly by carrying out the hydrolysis in an aqueous medium with a pH value in the range from 8.5 to 10.5. This avoids the addition of enzyme, trifluoroacetic acid and anisole.

Følgelig er fremgangsmåten ifølge op<p>finnelsen karakterisert ved at desalanin-B30 insulin produktet oppslemmes i en lavere alkanol, suspensjonen tilblandes en løsning av en treonin alkylester og trypsin eller et dermed beslektet enzym i vann justert til en pH verdi fra 5,5 til 7,5 uten tilsetning av en buffer med suspensjonen slik at molarforholdet mellom desalanin-B30 insulin og L-treonin alkylesteren er høyst 1:200, og den resulterende blanding får stå i 5-30 minutter ved 0-50°C, og hydrolysen av insulinesteren utføres i et vandig medium med en pH verdi i området fra 8,5 til 10,5. Consequently, the method according to the invention is characterized in that the desalanine-B30 insulin product is suspended in a lower alkanol, the suspension is mixed with a solution of a threonine alkyl ester and trypsin or a related enzyme in water adjusted to a pH value of from 5.5 to 7.5 without the addition of a buffer with the suspension so that the molar ratio between desalanine-B30 insulin and the L-threonine alkyl ester is at most 1:200, and the resulting mixture is allowed to stand for 5-30 minutes at 0-50°C, and the hydrolysis of the insulin ester is carried out in an aqueous medium with a pH value in the range from 8.5 to 10.5.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i stor skala så som industriell skala ved bruk av f.eks. fra 50 g eller mere utgangsinsulinprodukt,består en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen i å oppløse separat trypsin eller et dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann,, tilsette suspensjonen av desalanin B30 insulinproduktet til den gjenværende del av løsningen When the method according to the invention is carried out on a large scale such as industrial scale using e.g. from 50 g or more of the starting insulin product, a preferred embodiment of the invention consists of dissolving separate trypsin or a related enzyme in a part of the solution of the L-threonine alkyl ester in water, adding the suspension of the desalanine B30 insulin product to the remaining part of the solution

av L-treonin alkylesteren i vann, justere temperaturen og pH verdien i den resulterende blanding og deretter tilsette den separat fremstilte løsning av trypsin eller dermed beslektet enzym i en del av løsningen av L-treonin alkylester i vann. I dette tilfelle foretrekkes det at temperaturen og pH verdien til den resulterende blanding justeres til 10°- of the L-threonine alkyl ester in water, adjust the temperature and pH value of the resulting mixture and then add the separately prepared solution of trypsin or thus related enzyme to a portion of the solution of L-threonine alkyl ester in water. In this case, it is preferred that the temperature and pH value of the resulting mixture be adjusted to 10°-

15°C og hhv. 5,8-6,2. Videre foretrekkes det separat å opp-løse et trypsin eller et dermed beslektet enzym i 10-20 vekt% av løsningen av L-treonin alkylesteren i vann. 15°C and respectively 5.8-6.2. Furthermore, it is preferred to separately dissolve a trypsin or a related enzyme in 10-20% by weight of the solution of the L-threonine alkyl ester in water.

Det påpekes at kondensasjonsreaksjonen utføres uten tilsetning av en buffer idet reaktantenes bufferkapasitet er tilstrekkelig - under betingelsene som foreligger ifølge oppfinnelsen - til å opprettholde en pH i området fra 5,5 til 7,5. It is pointed out that the condensation reaction is carried out without the addition of a buffer, since the buffer capacity of the reactants is sufficient - under the conditions according to the invention - to maintain a pH in the range from 5.5 to 7.5.

De ovennevnte trekk er vesentlige trekk ved fremgangsmåten, The above features are essential features of the method,

og de er avgjørende for muligheten til å utføre reaksjonen på meget kort tid (nedsatt med en faktor 10 0) i industriell skala. and they are crucial for the possibility of carrying out the reaction in a very short time (reduced by a factor of 10 0) on an industrial scale.

I kondensasjonsreaksjonen er reaksjonstiden avhengig av de gjenværende reaksjonsbetingélser. Reaksjonstider fra 5 min. til 30 min., fortrinnsvis fra 5 til 15 min. In the condensation reaction, the reaction time depends on the remaining reaction conditions. Reaction times from 5 min. to 30 min., preferably from 5 to 15 min.

anvendes. are used.

Som følge av den korte reaksjonstid i kondensasjonsreaksjonen opptrer ingen nevneverdige bireaksjoner, og det er videre ikke nødvendig å bruke enzymer behandlet med tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK). As a result of the short reaction time in the condensation reaction, no significant side reactions occur, and it is also not necessary to use enzymes treated with tosyl-L-phenyl alanine chloromethyl ketone (TPCK).

I en spesielt fordelaktig utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes rått svineinsulin, dvs. insulin saltkake, som utgangsmateriale. Det er verd å bemerke at ved bruk av rått svineinsulin i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig å oppnå et høyt utbytte av human insulin tilsvarende det utbyttet som kan oppnås ved fremstilling av kromatografisk renset svineinsulin, når totalutbyttene i begge tilfeller beregnes ut fra mengden anvendt bukspyttkjertel . In a particularly advantageous embodiment of the method according to the invention, raw porcine insulin, i.e. insulin salt cake, is used as starting material. It is worth noting that by using raw pig insulin in the method according to the invention, it is possible to achieve a high yield of human insulin corresponding to the yield that can be obtained by producing chromatographically purified pig insulin, when the total yields in both cases are calculated based on the amount of pancreas used .

Det er overraskende at bruken av rått svineinsulin som utgangsmateriale ikke gir opphav til vanskeligheter i den kromatografiske adskillelse av den erholdte human insulinester fra enzymet som brukes og uomsatt desalanin-B30 insulin. It is surprising that the use of crude porcine insulin as starting material does not give rise to difficulties in the chromatographic separation of the human insulin ester obtained from the enzyme used and unreacted desalanin-B30 insulin.

Det brukte enzym i kondensasjonen.i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen må kunne spalte lysin karbonyl peptidbindinger, og således kan trypsin eller dermed beslektede enzymer brukes, f.eks. akromobakterprotease I, hvis fremstilling og egenskaper er beskrevet av Masaki et al., Agric. Biol. Chem., 4_2, 1443-1445 (1978). Det er unødvendig å bruke enzymer som er behandlet med tosyl-L-fenyl alanin klormetylketon (TPCK) for å fjerne en mulig kontaminering med chymotrypsinlignende enzymer som skyldes de korte reaksjonstider som er nevnt ovenfor og den dårlige reaktiviteten til slike enzymer i den brukte reaksjonsblanding. The enzyme used in the condensation in the method according to the invention must be able to cleave lysine carbonyl peptide bonds, and thus trypsin or related enzymes can be used, e.g. achromobacter protease I, the preparation and properties of which are described by Masaki et al., Agric. Biol. Chem., 4_2, 1443-1445 (1978). It is unnecessary to use enzymes treated with tosyl-L-phenyl alanine chloromethyl ketone (TPCK) to remove a possible contamination with chymotrypsin-like enzymes due to the short reaction times mentioned above and the poor reactivity of such enzymes in the used reaction mixture.

Enzymet kan brukes i oppløst form, men kan også være bundet til en uløselig matrise, f.eks. agarose eller polyakrylamid eller lignende polymere substanser. The enzyme can be used in dissolved form, but can also be bound to an insoluble matrix, e.g. agarose or polyacrylamide or similar polymeric substances.

Kondensasjonsreaksjonen utføres under betingelser hvor den enzymatisk katalyserte hydrolyse ér tilstrekkelig undertrykt til at ' peptiddannelsesreaksjonen forløper. Som ovenfor nevnt må pH verdien være mellom 5^5 og 7,5. Temperaturen lig-ger normalt i området fra 0 til 50°C, fortrinnsvis fra 10 til 37°C. The condensation reaction is carried out under conditions where the enzymatically catalyzed hydrolysis is sufficiently suppressed for the peptide formation reaction to proceed. As mentioned above, the pH value must be between 5^5 and 7.5. The temperature is normally in the range from 0 to 50°C, preferably from 10 to 37°C.

I kondensasjonsreaksjonen bør konsentrasjonen av reaktantene, dvs. des-B30 insulin og L-treonin alkylester, være høy, og videre bør L-treonin alkylesteren som anvendes brukes i et stort overskudd opp til et molarforhold på 200:1, fortrinnsvis i området 20:1 til 100:1. In the condensation reaction, the concentration of the reactants, i.e. des-B30 insulin and L-threonine alkyl ester, should be high, and furthermore the L-threonine alkyl ester used should be used in a large excess up to a molar ratio of 200:1, preferably in the range of 20: 1 to 100:1.

Kondensasjonsreaksjonen utføres i nærvær av vannblandbare lavere alkanoler eller blandinger derav, hvorved hydrolyse-reaksjonen forhindres, og reaktantenes løselighet forbedres. Konsentrasjonen av lavere alkanoler bør velges i området fra 20 til 90%, fortrinnsvis 30 til 80% beregnet på reaksjons-^ blandingens totale volum. The condensation reaction is carried out in the presence of water-miscible lower alkanols or mixtures thereof, whereby the hydrolysis reaction is prevented, and the solubility of the reactants is improved. The concentration of lower alkanols should be chosen in the range from 20 to 90%, preferably 30 to 80% calculated on the total volume of the reaction mixture.

Når kondensasjonsreaksjonen er fullstendig, adskilles de in-sulinlignende proteiner fra de gjenværende bestanddeler ved gelfiltrering, hvorpå human insulinester adskilles fra uomsatte utgangsmaterialer ved anionebytterkromatografi. Det uomsatte utgangsmateriale kan eventuelt brukes på nytt i fremgangsmåten. When the condensation reaction is complete, the insulin-like proteins are separated from the remaining components by gel filtration, after which human insulin ester is separated from unreacted starting materials by anion exchange chromatography. The unconverted starting material can optionally be used again in the process.

De samlede fraksjoner fra anionebytterkromatografien som inneholder human insulinester avspaltes, hvorpå pH verdien til det samlede eluat justeres til ca. 9,5 ved hjelp av NaOH. Etter 24-48 timer ved romtemperatur isoleres rent human insulin ved krystallisering eller andre vanlige metoder. The combined fractions from the anion exchange chromatography containing human insulin ester are separated, after which the pH value of the combined eluate is adjusted to approx. 9.5 using NaOH. After 24-48 hours at room temperature, pure human insulin is isolated by crystallization or other common methods.

Hydrolysen av insulin alkylesteren forløper lett ved The hydrolysis of the insulin alkyl ester proceeds easily with

en pH verdi fra 8,5 til 10,5 i en vandig løsning. Dette har den virkning at hydrolyseblandingen etter hydrolysen lett kan opparbeides på vanlig måte og at det isolerte human insulin oppnås med høy renhet. a pH value from 8.5 to 10.5 in an aqueous solution. This has the effect that the hydrolysis mixture after the hydrolysis can easily be worked up in the usual way and that the isolated human insulin is obtained with high purity.

Derved er human insulinet som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen velegnet for fremstilling av terapeutiske insulinpreparater fordi de ikke inneholder noen proteolytiske urenheter, og kan av denne grunn brukes for fremstilling av preparater med langvarig aktivitet fordi det virker på samme måte som human insulin og svine insulin fremstilt fra Pancreas fra mennesker og svin i ovenfor nevnte "Ames Test", og fordi det ikke inneholder noen forurensninger som er vanskelige å fjerne ved hjelp av vanlig brukte kromatografiske metoder. Thereby, the human insulin produced by the method according to the invention is suitable for the production of therapeutic insulin preparations because they do not contain any proteolytic impurities, and for this reason can be used for the production of preparations with long-term activity because it works in the same way as human insulin and pig insulin prepared from human and porcine Pancreas in the above-mentioned "Ames Test", and because it contains no impurities difficult to remove by commonly used chromatographic methods.

I en foretrukket utførelsesform hvor rått insulin brukes In a preferred embodiment where crude insulin is used

som utgangsmateriale oppnås videre et utbytte av human insulin som på alle hovedsakelige måter er likt det utbytte av meget rent svineinsulin som kan oppnås fra samme mengde rått insulin. Det er således tale om en fremgangsmåte som er både industrielt og klinisk tilfredsstillende i hittil ukjent grad. as starting material, a yield of human insulin is obtained which is in all essential respects similar to the yield of very pure porcine insulin which can be obtained from the same amount of crude insulin. It is thus a procedure that is both industrially and clinically satisfactory to a previously unknown extent.

Utførelsesmåter av oppfinnelsen Embodiments of the invention

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de følgende eksempler. The method according to the invention is further illustrated by means of the following examples.

Eksempel 1 Example 1

Svineinsulin i form av rått insulin (saltkake) tilsvarende 2000 mg svineinsulin ble oppløst i 200 ml 0,2 M vandig NH4HCC>3 løsning (pH verdi 8,4). Til løsningen ble tilsatt Pig insulin in the form of raw insulin (salt cake) corresponding to 2000 mg of pig insulin was dissolved in 200 ml of 0.2 M aqueous NH4HCC>3 solution (pH value 8.4). To the solution was added

20 mg karboksypeptidase A i form av en vandig løsning med 20 mg of carboxypeptidase A in the form of an aqueous solution with

en konsentrasjon på ca. 5 mg/ml. Blandingen ble godt rørt a concentration of approx. 5 mg/ml. The mixture was well stirred

i 5 min., hvorpå den fikk stå ved 20°C i 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble frysetørket. for 5 min., after which it was allowed to stand at 20°C for 2.5 hours. The reaction mixture was freeze-dried.

Måling av frigjort alanin ved hjelp av aminosyremåling Measurement of released alanine using amino acid measurement

viste et spaltningsutbytte på 92%i. showed a cleavage yield of 92%i.

Det frysetørkede pulver ble oppslemmet i 23,4 ml 96% etanol etterfulgt av tilsetning av en løsning på 4,00 g L-treonin metylester og 200 mg trypsin i 14,00 ml destillert vann justert til en pH verdi på 6,50 med 5N saltsyre. Etter grundig blanding fikk blandingen stå ved 35°C i 15 min. Umiddelbart derpå ble reaksjonen avbrutt ved først å justere pH-verdien til 2,5 med 0,1 N saltsyre og volumet til 100 ml ved hjelp a<y> destillert vann. The freeze-dried powder was slurried in 23.4 ml of 96% ethanol followed by the addition of a solution of 4.00 g of L-threonine methyl ester and 200 mg of trypsin in 14.00 ml of distilled water adjusted to a pH value of 6.50 with 5N hydrochloric acid. After thorough mixing, the mixture was allowed to stand at 35°C for 15 min. Immediately thereafter, the reaction was stopped by first adjusting the pH value to 2.5 with 0.1 N hydrochloric acid and the volume to 100 ml using distilled water.

Høytrykksvæske-kromatografianalyse av reaksjonsblandingen viste en produksjon av human insulinester på 80%. High pressure liquid chromatography analysis of the reaction mixture showed a production of human insulin ester of 80%.

Reaksjonsblandingen ble gelfiltrert på en kolonne av Sephadex The reaction mixture was gel filtered on a column of Sephadex

(R) (R)

^G-50 Superfine (8 x 80 cm) i 1 M eddikksyre. Fraksjonen som inneholdt human insulinester og uomsatt desalanin-B30 insulin ble frysetørket. ^G-50 Superfine (8 x 80 cm) in 1 M acetic acid. The fraction containing human insulin ester and unreacted desalanin-B30 insulin was freeze-dried.

Utbytte: 1612 g produktblanding. Yield: 1612 g product mixture.

Deretter ble produktblandingen ionebytterkromatografert ved 4°C på en kolonne av DEAE cellulose (Whatmann DE-52) Then the product mixture was ion-exchange chromatographed at 4°C on a column of DEAE cellulose (Whatmann DE-52)

(9 x 23 cm), ekvilibrert med 140 ml/t av en puffer bestående av 0,02 M tris og 7 M urea, justert til en pH verdi på 8,1 med saltsyre. Når oppfyllingen av produktet var ferdig, ble kolonnen eluert i 2,5 t ved bruk av ovenfor nevnte pufferløsning, deretter 2 timer ved bruk av ovenfor nevnte puffer i blanding med 0,0045 mol natriumklorid pr. liter og til slutt i 12 timer ved bruk av førstnevnte puffer i blanding med 0,011 mol natriumklorid pr. liter. (9 x 23 cm), equilibrated with 140 ml/h of a buffer consisting of 0.02 M tris and 7 M urea, adjusted to a pH value of 8.1 with hydrochloric acid. When the filling of the product was finished, the column was eluted for 2.5 hours using the above-mentioned buffer solution, then 2 hours using the above-mentioned buffer in a mixture with 0.0045 mol of sodium chloride per liter and finally for 12 hours using the first-mentioned buffer in a mixture with 0.011 mol sodium chloride per litres.

Eluatet inneholdt to proteinholdige hovedfraksjoner. Fraksjonen som ble eluert først ble ved høytrykksvæske-kromato-grafi vist å være human insulinester og fraksjonen som ble eluert deretter å være desalanyl insulin. The eluate contained two main proteinaceous fractions. The fraction eluted first was shown by high pressure liquid chromatography to be human insulin ester and the fraction eluted next to be desalanyl insulin.

Den samlede hum.an insulinesterf raks jon ble avsaltet på en kolonne av Sephadex ®G-25 i 0,1 M natriumacetat (pH verdi 8,0) ved 4°C, hvoretter pH verdien ble justert til 9,5 med 1 N NaOH løsning. Fraksjonen fikk stå ved 25°C i 24 timer. The total human insulin ester fraction was desalted on a column of Sephadex ® G-25 in 0.1 M sodium acetate (pH value 8.0) at 4°C, after which the pH value was adjusted to 9.5 with 1 N NaOH solution. The fraction was allowed to stand at 25°C for 24 hours.

950 mg rent human insulin erholdtes, identifisert ved amino-syreanalyse og høytrykks-kromatografi. 950 mg of pure human insulin was obtained, identified by amino acid analysis and high pressure chromatography.

Eksempel 2 Example 2

Svineinsulin i form av rått insulin (saltkake) tilsvarende 66,3 g svineinsulin ble oppløst i 6000 ml 0,2M ammonium acetat, pH verdi 8,4.Til løsningen ble tilsatt 600 mg karboksypeptidase A i form av en vandig løsning med en konsentrasjon på ca. 5 mg/ml. Løsningen ble rørt godt i 3 timer ved 20°C. Pig insulin in the form of raw insulin (salt cake) corresponding to 66.3 g of pig insulin was dissolved in 6000 ml of 0.2 M ammonium acetate, pH value 8.4. To the solution was added 600 mg of carboxypeptidase A in the form of an aqueous solution with a concentration of about. 5 mg/ml. The solution was stirred well for 3 hours at 20°C.

Desalanininsulinet ble utfelt ved tilsetning av 15% (v/v) NaCl. The desalanine insulin was precipitated by the addition of 15% (v/v) NaCl.

Det isolerte lufttørkede presipitat ble hellet forsiktig The isolated air-dried precipitate was carefully decanted

i 770 ml 96% etanol og ga derved en oppslemming av desalanin-isulin i etanol (oppløsning 1). in 770 ml of 96% ethanol, thereby giving a slurry of desalanin-insulin in ethanol (solution 1).

120 g Thr-O-Me, HC1 ble oppløst i 275 ml destillert vann og pH verdien justert til 5,8 med i5 M Na/H (oppløsning 2) . 120 g of Thr-O-Me, HC1 were dissolved in 275 ml of distilled water and the pH value adjusted to 5.8 with 15 M Na/H (solution 2).

Til 60 ml av oppløsning 2 tilsattes 600 mg trypsin (svin), oppløst ved grundig røring (oppløsning 3). To 60 ml of solution 2 was added 600 mg of trypsin (porcine), dissolved by thorough stirring (solution 3).

Oppløsning 1 og 2 ble blandet ved langsomt å helle oppløs-ning 1 i oppløsning 2 under røring. pH-verdien ble justert til 5,8 med 5 M NaOH. Etter blanding ble blandingen avkjølt til 10°C i et termostatisk kontrollert kar. Solutions 1 and 2 were mixed by slowly pouring solution 1 into solution 2 while stirring. The pH was adjusted to 5.8 with 5 M NaOH. After mixing, the mixture was cooled to 10°C in a thermostatically controlled vessel.

Reaksjonen fant sted etter tilsetning av oppløsning 3 til ovenfor nevnte blanding av desalanin insulin og Thr-O-Me i 10 min. The reaction took place after the addition of solution 3 to the above-mentioned mixture of desalanin insulin and Thr-O-Me for 10 min.

Umiddelbart deretter ble reaksjonen avbrutt ved å justere pH-verdien til 2,5 med 0,1 N HC1 og justere volumet til 2400 ml ved hjelp av destillert vann. Immediately thereafter, the reaction was stopped by adjusting the pH to 2.5 with 0.1 N HCl and adjusting the volume to 2400 mL using distilled water.

Høytrykksvæske-kromatografi analyse av reaksjonsblandingen viste en produksjon av human insulinester på 87%. High pressure liquid chromatography analysis of the reaction mixture showed a production of human insulin ester of 87%.

Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 1 og førte til et meget rent produkt (25,4 g) halvsyntetisk human insulin egnet for fremstilling av terapeutiske insulinpreparater. The reaction mixture was worked up as described in example 1 and led to a very pure product (25.4 g) semi-synthetic human insulin suitable for the production of therapeutic insulin preparations.

Claims

1. Process for the production of human insulin in which a porcine insulin product is treated with carboxypeptidase A or a similar enzyme to form a desalanine-B30 insulin product, which is then condensed with an L-threonine alkyl ester in the presence of trypsin or a related enzyme and a organic cosolvent, after which the insulin ester thus formed is hydrolysed to human insulin, characterized by suspending the desalanine-B30 insulin product in a lower alkanol, mixing a solution of the L-threonine alkyl ester and trypsin or a related enzyme in water adjusted to a pH value of from 5.5 to 7.5 without adding a buffer with the suspension so that the molar ratio between desalanin-B30 insulin and the L-threonine alkyl ester is at most 1:200, and let the resulting mixture stand for 5-30 min. at 0-50°C, and that the hydrolysis of the insulin ester is carried out in an aqueous medium with a pH value in the range from 8.5 to 10.5.

2. Method according to claim 1, characterized in that one separately dissolves trypsin or et thus related enzyme in a part of the solution of the L-threonine alkyl ester in water, adding the suspension of the desalanine-B30 insulin product to the remaining part of the solution of the L-threonine alkyl ester in water, adjusting the temperature and pH value of the resulting mixture and then adding it separately prepared solution of trypsin or related enzyme in a part of the solution of the L-threonine alkyl ester in water.

3. Method according to claims 1 and 2, characterized in that raw porcine insulin is used as porcine insulin product.

4. Method according to claim 2, characterized in that the temperature and pH value of the resulting mixture are adjusted to 10°-15°C and respectively. 5.8-6.2.

5. Method according to claim 1, characterized in that the condensation reaction is carried out over a period of 5 to 15 minutes.

6. Method according to claim 1, characterized in that the desalanin-B30 insulin product is isolated without separation of the carboxypeptidase A or equivalent enzyme used.

7. Method according to claim 2, characterized in that trypsin or a related enzyme is dissolved separately in 10-20% by weight of the solution of the L-threonine alkyl ester in water.