NO167036B - Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater - Google Patents
Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater Download PDFInfo
- Publication number
- NO167036B NO167036B NO843109A NO843109A NO167036B NO 167036 B NO167036 B NO 167036B NO 843109 A NO843109 A NO 843109A NO 843109 A NO843109 A NO 843109A NO 167036 B NO167036 B NO 167036B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- arg
- reaction
- cleavage
- formula
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- -1 aromatic hydroxy compound Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 16
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 4
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 3
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 abstract 2
- QJPWUUJVYOJNMH-VKHMYHEASA-N L-homoserine lactone Chemical compound N[C@H]1CCOC1=O QJPWUUJVYOJNMH-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 2
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 2
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 6,7-dihydrodipyrido[1,2-b:1',2'-e]pyrazine-5,8-diium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C1=CC=[N+]2CC[N+]3=CC=CC=C3C2=C1 ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000005630 Diquat Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710114386 Insulin-like protein Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
Description
Insulin syntetiseres ln vlvo 1 form av en forløper, prepro-lnsulin. <p>resekvensen er en slgnalreglon for vekselvirkning med membraner og avspaltes enda ved eller også umiddelbart etter syntesen. Prolnsullnet derimot er et molekyl som 1 små mengder er påvisbart 1 pankreasekstrakter. Ved dets om-dannelse til Insulin avspaltes C-peptldet ved hjelp av et spesifikt enzymsystem.
Snittstedene for prosesserlngsenzymene dannes ved sekvensene Arg-Arg ved stillingene B31 og B32 (B30 er B-kjeden senere C-termlnus) og Lys-Arg ved stilling 62 (resp. A 1) og 63 (resp. A 0) som befinner seg N-terminal til den senere A-kjede. Med enzymer som har tryptlsk og karboksypeptidase-B-aktlvltet, lar prolnsulln seg ln vltro lett omdanne til Insulin (Kemmler et al., JBC 246, 6786-91 (1971)). Proteolysen med trypsln eller trypslnllgnende enzymer alene gir derimot fortrinnsvis mellomprodukter som enda har en eller begge arglnlner 1 stillingene 31 og 32 ved B-kjedens C-termlnus, ved siden av de lnsulln-avbygnlngsprodukter som B-termlnal er spaltet til lysln-(29) Insulin (-alanin-(B30)-svineinsullnet, treonin-(B30)-humaninsulln) eller til arginin-(B22) (-desoktapeptid-Insulln) (Chance, 1 Proe. VII Congress of Internation Diabetes Fed., (1970), D.E. Steiner et al., Fed. Proe. 33, 2105-15 (1974), J. Markussen i Proe. Symp. on Prolnsulln, Insulin, C-peptid, Tokushima (1978)).
Ved hjelp av genteknologiske metoder er det i dag til-gjengelig preproinsuliner av prokaryoter, spesielt E. coil. Spesielt Interessante er derved slike stammer som Inneholder proinsuliner med menneskelig insullnsekvens. Ved endring av plasmidet er det dessuten mulig å konstruere målrettet nye sekvensavsnltter, spesielt endringer ved stillingene 31-33 og 61-63 av prolnsullnsekvensen, således at enzymatiske eller kjemiske spaltesteder bibeholdes til frigjøring av insulin, respektivt insulinderivater. Hertil hører eksempelvis slike derivater som i stedet for en eller begge arginer ved posisjon 31 og 32, Inneholder en annen basisk aminosyre, altså lysin eller hlstldln, således at det kan anvendes enzymer med tryptisk spesifisitet til spalting. Det kan Imidlertid også Innføres sekvenser som er substrater av andre kjente proteolytlske enzymer eller sekvenser, hvorved det er mulig en spalting med kjemiske metoder. Forutsetningen for foreliggende oppfinnelse er bare, at ved egnet spalting av prolnsullnanalogene oppstår et InsulInderlvat som Ikke har noen ekstra aminosyre før A-kjedens N-terminus og blant de Inntil tre ekstra aminosyrer ved B-kjedens C-termlnus (posisjoner 31-33) minst har en basisk aminosyre.
Slike lnsulInder1vater som ved B-kjedens C-termlnus 1 tillegg har positive ladninger, fremgangsmåte til deres fremstilling, midler som inneholder disse og deres anvendelse er gjenstand for de tyske søknader P 33 26 472.4 og P 33 26 473.2. En fremgangsmåte til deres krystallisering er gjenstand for den tyske søknad P 33 27 709.5.
Det ble nå funnet at disse lnsulinder1vater spesielt lett er fremstlllbare fra de tilsvarende Intermediater, prolnsullner, preproinsuliner eller de tilsvarende analoger, idet man gjennomfører den proteolytlske fordøyelse eller den kjemiske spalting 1 nærheten av det ønskede derivats lsoelektrlske punkt 1 nærvær av fenol eller lignende aromater. Det oppnås på denne måte Ikke bare at sluttproduktet faller ut fra reaksjonsoppløsningen og således sterkt unndras reaksjons-llkevekten, under de omtalte betingelser oppstår direkte 1 mediet skarpkantede, prlsmeformede krystaller, som på grunn av liten overflate ligger meget mindre under for en videre reaksjon enn f.eks. amorfe utellinger. Således er det
B31
eksempelvis overraskende at derivatet lnsulin-Arg -0H er overordentlig stabilt i krystallinsk form mot ytterligere tryptisk nedbrytning.
Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte til fremstilling av lnsulinder1vater med formel I
der
R<30> betyr Ala, Thr eller Ser,
X betyr Arg<B31->0H eller Arg<B31->Arg<B32->0H,
Y betyr Phe eller H,
n betyr 1 eller 2 ved spalting av lntermedlater, prolnsulln, preprolnsulln eller deres analoger,
Idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved at spaltereaksjonen gjennomføres 1 nærheten av det lsoelektrlske punkt til lnsullnderlvatet med formel I 1 nærvær av fenol eller laverealkyl-fenol.
Fremgangsmåten er videre kjennetegnet ved at det fremstilles et lnsulinderivat med formel I som har sekvensen til humanlnsulln eller svlnelnsulln.
Ved fremgangsmåten Ifølge oppfinnelsen lar det seg eksempelvis fremstille følgende insulinderivater:
Humanlnsulin-Arg -0H
Svineinsulin-Arg<B31->0H
Humaninsulin-Arg<B31->Arg<B32->0H
Svineinsulin-Arg<B31->Arg<B32->0H
B31
Humaninsulin-Lys -0H
Humaninsulin-AlaB31-LysB32-0H
Humaninsulin-ValB31-Arg<B32->0H
Humaninsulin-Leu<B31->Arg<B32->Arg<B32->0H
Svineinsulin-ValB31-His<B32->Arg<B33->0H
Svineinsulin-Leu<B>31-Val<B32->Arg<B33->0H
Humaninsulin-Arg<B>31-Phe<B32->0H
Humanlnsulln-Arg-NH
Fremgangsmåten Ifølge oppfinnelsen gjennomføres fortrinnsvis 1 pH-området på en pH-enhet under det lsoelektrlske punkt Inntil en enhet over dette punkt i nærvær av et fenol eller en blanding av flere fenoler.
Til innstilling av pH-verdien kan det anvendes egnede buffere (som acetater, citrat eller fosfat).
Fortrinnsvis fører fremgangsmåten Ifølge oppfinnelsen til at konsentrasjonen av utgangsmaterialet utgjør 0,5-30 mg/ml, fortrinnsvis 1-10 mg/ml, og reaksjonshastlgheten er litt større eller lik krystallenes dannelesnastignet. På denne måte oppnås at det oppstår mange krystallklmer, og dermed overstiger krystallstørrelsen gjennomsnittlig ikke 30 jjm. Reaksjonshastlgheten kan fremfor alt ved enzymkatalyse kontrolleres meget nøyaktig på den ønskede måte.
Med den omtalte fremgangsmåte er det altså mulig å styre reaksjonen bedre i retning mot det ønskede produkt og dermed forbedre utbyttet betydelig. Produktet fremkommer i en lett videre bearbeldbar form som ved enkel vasking sterkt kan befris for overskytende spaltnlngsreagens, f.eks. proteaser.
Som spaltnlngsreagens velges eksempelvis en protease, hvis spesifltet er således at den ønskede rest Xn bibeholdes, mens A-kJeden etter foretatt spalting, har en fri N-terminus H-Gly.
Insulinderivater med formel I og farmasøytiske midler som Inneholder disse er helt nye forsinkelsesprinsipper, som uten depothjelpestoffer som sink eller protamlnsulfat, kan bringes til virkning. Depotvirkningen går tilbake på et inherent, proteinkjemisk betinget fysikalsk prinsipp, tungoppløselig-heten av insulinderivatet ved det lsoelektrlske punkt. Dets gjenoppløsnlng under fysiologiske betingelser oppnås muligens ved avspaltlng av de ekstra basiske grupper som alt etter derivat kommer 1 stand ved tryptisk eller trypsinllgnende og/eller karboksypeptidase B- eller karboksypeptldase B-lignende og/eller esterase-aktivitet.
Eksempel 1
Tryptisk spalting av desnonapeptid-proinsulin fra svin i fravær og i nærvær av fenol.
350 mg desnonapeptld-svineproinsulin ble oppløst surt og satt til 215 ml 0,1 M-tris-buffer pH - 7,5, som inneholder 200 jig trypsin (storfe). I løpet av få minutter opptrådte en uklarhet. Etter avsluttet reaksjon (ca. 1 time) ble det tilsatt 100 yig trypsin-inhibitor, sentrifugert, den hvite utfelling oppløst i 20 ml 0,05 M ammoniumacetatbuffer pH - 4,0 med 0,1* av en egnet detergent og renset på kationut-veksler med en 0-1 M koksaltgradient. Det ble isolert: 96 mg (36,6*) insulin-Arg<B31->Arg<B>32-OH i ren form og 72 mg (27,4*)
B31 B32 B31 av en blanding av insulin-Arg -Arg -0H og insulin-Arg OH og minst to ytterligere forurensninger (etter isoelektrlsk fokusering og høytrykkvæskekromatografi (HPLC)). Fra det ovenstående fra reaksjonen ble det isolert 56 mg (ca.21*) av en blanding med 14,9* utgangsstoff, 8,7* di- og monoarginin-derivat, 49,3* des-alanln(B30)-insulin og 12,2* desoktapep-tidinsulin ved siden av noen mindre uidentifiserte topper
(HPLC).
I en parallellblanding ble det oppløst 100 mg desnonapeptld-svineproinsulin surt og satt til 50 ml av en 0,1 M trisbuffer pH - 7,5, som inneholdt 2,5 mg/ml m-kresol g 50 jjg trypsin
(storfe). Etter ca. 15 minutter dannet det seg en krystallinsk utfelling av skarpkantede prismer på ca. 5-15 jjg størrelse. Reaksjonen ble avbrutt etter 3 timer på den omtalte måte. Opparbeidelsen foregikk som ovenfor.
Utbytte: 56 mg (74,7*) lnsulln-ArgB31-Arg<832->0H
11 mg (14,7*) blanding av dl-arglnin- og mono-arglninder1vat
I det ovenstående befant det seg dessuten et spor av insullnllgnende stoffer.
Eksempel 2
B31
Fremstilling av humaninsulin-Arg -0H av ape-preproinsulin, uttrykt i E. coli, ved tryptisk spalting.
10 mg ape-preproinsulin oppløses surt og settes til 5 ml 0,1 M fosfatbuffer med 0,5 M koksalt pH = 6,8, som inneholdt 1,5 mg/ml fenol og 0,7 mg/ml m-kresol, samt 25 jjg trypsin (storfe). Fra reaksjonsoppløsningen falt det ønskede produkt ut i skarpkantede prismer av ca. 5-20 pm størrelse. Krystal-lene inneholdt 92* av Insulin og insulinderivater derav
t>oi
ifølge HPCL 78* humaninsulin-Arg -0H og 14* humanlnsulln-B31 B32
Arg -Arg -0H. I det klare overstående finnes bare mindre enn 5* av insullnllgnende protein. Lar man krystallsuspen-sjonen stå i nærvær av trypsin enda ytterligere 2 dager ved værel ses temperatur, så befinner seg enda alltid 87* av de teoretiske insulin- og insulinderivatmengder i krystallinsk tilstand, derav 79* humaninsulin-Arg <B31->0H og 11* human-insul ln-Arg31_ArgB32_0H
Claims (7)
1.
Fremgangsmåte til fremstilling av lnsulInderlvater med formel (I).
der
R<30> betyr Ala, Thr eller Ser,
X betyr Arg-OH eller Arg-Arg-OH
Y betyr Phe eller H,
n betyr 1 eller 2 ved spalting av Intermedlater, prolnsulln, preproinsulin eller deres analoger, karakterisert ved at spaltereaksjonen gjennomføres 1 nærheten av det Isoelektrlske punkt til lnsulInderivater med formel (I) 1 nærvær av fenol eller laverealkyl-fenol.
2.
Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles et lnsullnderlvat med formel (I) som har sekvensen til humaninsulln eller svlnelnsulln.
3.
Fremgangsmåte Ifølge et av kravene 1-2, karakterisert ved at spaltereaksjonen gjennomføres 1 nærvær av et fenol eller en blanding av flere fenoler.
4.
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at reaksjonshastlgheten velges således at reaksjonsproduktet fortrinnsvis fremkommer 1 form av opp til 30 pm store krystaller.
5.
Fremgangsmåte Ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at ved begynnelsen av reaksjonen oppnås lntermediatet, prolnsulln eller deres analoger i en konsen-trasjon fra 0,5-30 mg/ml i reaksjonsmedlet.
6.
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at reaksjonsmedlet som anvendes er et vandig medium bufret på egnet måte.
7.
Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at spaltnlngsreagensen som anvendes er en protease, hvis spesifisitet er således at den ønskede rest Xn bibeholdes, mens A-kjeden etter foretatt spalting har en fri N-termlnus.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833327928 DE3327928A1 (de) | 1983-08-03 | 1983-08-03 | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO843109L NO843109L (no) | 1985-02-04 |
| NO167036B true NO167036B (no) | 1991-06-17 |
| NO167036C NO167036C (no) | 1991-09-25 |
Family
ID=6205606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO843109A NO167036C (no) | 1983-08-03 | 1984-08-02 | Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4639332A (no) |
| EP (1) | EP0135720B1 (no) |
| JP (1) | JPH0696597B2 (no) |
| KR (1) | KR920008710B1 (no) |
| AT (1) | ATE41162T1 (no) |
| AU (1) | AU568866B2 (no) |
| CA (1) | CA1229588A (no) |
| DE (2) | DE3327928A1 (no) |
| DK (1) | DK172242B1 (no) |
| ES (1) | ES8504679A1 (no) |
| FI (1) | FI79853C (no) |
| GR (1) | GR80008B (no) |
| HU (1) | HU202886B (no) |
| IE (1) | IE57666B1 (no) |
| IL (1) | IL72568A (no) |
| NO (1) | NO167036C (no) |
| NZ (1) | NZ209074A (no) |
| PH (1) | PH21160A (no) |
| PT (1) | PT79013B (no) |
| ZA (1) | ZA845980B (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3327709A1 (de) * | 1983-07-29 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
| DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| WO1997005166A1 (en) | 1995-07-25 | 1997-02-13 | Novartis Ag | Transforming growth factor beta crystals |
| US6310038B1 (en) * | 1997-03-20 | 2001-10-30 | Novo Nordisk A/S | Pulmonary insulin crystals |
| HUP0000547A3 (en) * | 1997-03-20 | 2002-11-28 | Novo Nordisk As | Zinc free insulin crystals for use in pulmonary compositions |
| US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
| KR100520616B1 (ko) * | 2002-12-05 | 2005-10-10 | 태양금속공업주식회사 | 보울트 머리 성형용 트리밍 다이스 |
| US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
| US7741281B2 (en) * | 2005-11-03 | 2010-06-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Hepatitis C virus inhibitors |
| US7714025B2 (en) * | 2006-05-10 | 2010-05-11 | Arizona Biomedical Research Commission | Modified chalcone compounds as antimitotic agents |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1072410A (fr) * | 1951-11-15 | 1954-09-13 | Novo Terapeutisk Labor As | Perfectionnements apportés au procédé de préparation d'insuline sous une forme cristallisée |
| DK78069C (da) * | 1952-06-23 | 1954-09-06 | Novo Terapeutisk Labor As | Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk insulin. |
| DE952208C (de) * | 1953-11-13 | 1956-11-15 | Novo Terapeutisk Labor As | Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin |
| DE2214405A1 (de) * | 1972-03-24 | 1973-10-04 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin und insulinanalogen |
| NL7314766A (no) * | 1972-10-31 | 1974-05-02 | ||
| DE2428412A1 (de) * | 1974-06-12 | 1976-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
| DE3033127A1 (de) * | 1980-09-03 | 1982-04-08 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Neue analoga des insulins |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DE3334407A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | In position b 30 modifizierte insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
-
1983
- 1983-08-03 DE DE19833327928 patent/DE3327928A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-07-27 HU HU842890A patent/HU202886B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-08-01 AT AT84109067T patent/ATE41162T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-01 FI FI843045A patent/FI79853C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-08-01 EP EP84109067A patent/EP0135720B1/de not_active Expired
- 1984-08-01 NZ NZ209074A patent/NZ209074A/xx unknown
- 1984-08-01 ES ES534798A patent/ES8504679A1/es not_active Expired
- 1984-08-01 DE DE8484109067T patent/DE3477004D1/de not_active Expired
- 1984-08-01 PH PH31054A patent/PH21160A/en unknown
- 1984-08-01 GR GR80008A patent/GR80008B/el unknown
- 1984-08-01 US US06/636,672 patent/US4639332A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-02 KR KR1019840004611A patent/KR920008710B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 DK DK375784A patent/DK172242B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 JP JP59161643A patent/JPH0696597B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-02 PT PT79013A patent/PT79013B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 AU AU31460/84A patent/AU568866B2/en not_active Ceased
- 1984-08-02 CA CA000460239A patent/CA1229588A/en not_active Expired
- 1984-08-02 ZA ZA845980A patent/ZA845980B/xx unknown
- 1984-08-02 NO NO843109A patent/NO167036C/no not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 IL IL72568A patent/IL72568A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-08-02 IE IE1995/84A patent/IE57666B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5986048A (en) | Process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges | |
| NO167036B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater | |
| NO167207B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivat-krystallsuspensjoner. | |
| FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| Levy et al. | The synthesis of triaminoacyl-insulins and the use of the t-butyloxycarbonyl group for the reversible blocking of the amino groups of insulin | |
| CA2464616C (en) | Process for preparing insulin compounds | |
| KR880001107B1 (ko) | 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| EP0547544B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von insulinhaltigen Lösungen | |
| DK173007B1 (da) | Fremgangsmåde til semisyntetisk fremstilling af humaninsulin og modificeret humaninsulin til brug ved fremgangsmåden | |
| Salokangas et al. | Bovine proinsulin: amino acid sequence of the C‐peptide isolated from pancreas | |
| EP0085083B1 (en) | Process for the enzymatic preparation of human insulin | |
| NO156132B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av et insulinderivat. | |
| WO1982004069A1 (en) | A process for the preparation of insulin derivatives | |
| DK155887B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin | |
| WO1984003107A1 (en) | A process for the preparation of human insulin | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN FEBRUARY 2003 |