KR20110059602A - 인슐린 화합물의 제조방법 - Google Patents

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KR20110059602A
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Abstract

본 발명은 임의의 바람직하지 않은 부산물의 생성을 피하기 위해 통제된 방법으로 반응을 지시하는 단계를 상승 작용에 의해 수행하는 트립신의 최적량의 조합의 및 동시 발생의 사용을 포함하는 단일 단계 효소적 반응에 의해 형성되는 대응하는 전구체로부터 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 인슐린 화합물의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 효소적 전환 반응은 작용 단계의 수가 감소하고, 수율과 바람직한 최종 산물의 순도가 높다는 이점을 제공한다.

Description

인슐린 화합물의 제조방법{A PROCESS FOR PREPARATION OF INSULIN COMPOUNDS}
본 발명은 임의의 바람직하지 않은 부산물의 생성을 피하기 위해 통제된 방법으로 반응을 지시하는 단계를 상승 작용에 의해 수행하는, 트립신 및 카르복시펩티다아제 B의 최적량의 조합의 및 동시 발생의 용도를 포함하는 단일 단계 효소적 반응에 의해 형성되는 대응하는 전구체로부터 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 인슐린 화합물의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 효소적 전환 반응은 작용 단계의 수가 감소하고, 수율과 바람직한 최종 산물의 순도가 높다는 이점을 제공한다.
유전 공학법은 미생물에 발현되는 인슐린의 전구체 형태를 점점 가능하게 한다 (EP-A-347 781, EP-A-367 163). 프리 프로 시퀀스(pre pro sequences)는 일반적으로 화학적으로 및/또는 효소적으로 쪼갠다 (DE-P-3 440 988, EP-A-0264250). 알려진 효소적 전환 방법은 트립신 및 카르복시펩티다아제 B로 쪼개는 것이 따른다(Kem㎖er W. et al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; EP-A-195 691; EP-B-89007). 인슐린 전구체 분자의 대응하는 분자로의 전환의 일반적인 방법에 있어서, A와 B쇄 사이의 링커 펩티드(linker peptide)는 제거된다. 트립신을 사용하는 효소적 반응은 분열이 인간 인슐린 또는 바람직한 최종 산물을 생성하는 펩티드 결합 뿐만 아니라, 경쟁 반응에 있어서, 다른 예민한 부위에서의 분열이 바람직하지 않은 다수의 부산물을 생성하는 펩티드 결합을 쪼개는, 효소적 및 복합적 반응이다.
선행 기술법은 요구되는 중간체가 반응에서 형성될 때 제 2 효소 카르복시펩티다아제가 첨가되는 방법으로 제 2 효소 카르복시펩티다아제 및 트립신의 용도를 포함한다. 이 방법의 단점은 반응 용액으로부터 겨우 제거될 수 있는 많은 양의 불순물 부산물이 형성되는 것이다. 인간 전구체 형태의 인간 인슐린(인간 인슐린, HI)로의 전환의 특정 케이스에 있어서, 많은 양의 des-Thr(B30)-인간 인슐린 (des-Thr(B30)-HI)이 형성된다.
상기로부터, 가능한 한 완전히 중합성 불순물의 가능한 형성을 제거하고, 동시에 가능한 한 많이 바람직한 인슐린 최종 산물의 농도를 증가시키는 매우 단순한 단계를 통해 전구체 인슐린 화합물, 그 유사체 및 그 유도체의 인슐린으로의 분열을 위한 단순한 효소적 반응 방법에 따르는 것이 유용하다는 것을 알 수 있다. 운용의 용이함을 전체적으로 향상시키는 고수율, 바람직한 최종 산물의 양만큼의 질을 확인하는데 추가적인 조건이 필요하다.
알려진 방법의 단점은 본 발명에서 행해지는 효소적 반응에 의해 처리되고, 바람직하지 않은 부산물 없이 수율의 증가는 유익한 반응 상태 하에서 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제의 최적의 농도에 관련된다는 것을 알았다. 발명자들은 최종 산물의 작용, 순도 및 수율을 쉽게 향상시키는 바람직한 최종 산물을 제공하기 위해 상승 작용에 의해 수행하는, 트립신 및 카르복시펩티다아제 B의 최적량의 조합의 및 동시 발생의 용도를 포함하는 개선된 단일 단계 효소적 반응 방법을 개선하기 위해 노력했다.
(발명의 목적)
본 발명의 주목적은 바람직한 최종 산물을 제공하기 위해 상승 작용에 의해 작용하는 트립신 및 카르복시펩티다아제 B의 최적량의 조합의 및 동시 발생의 용도를 포함하는 단일 단계 효소적 반응에 의해 가능한, 바람직하지 않은 부산물이 최소로 형성된 대응하는 전구체로부터 인슐린 화합물 및 그 유사체 또는 유도체의 제조 방법을 얻는 것이다.
본 발명의 다른 주목적은 개시 물질로서 사용될 수 있는 SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 나타내는 인슐린 유사 전구체를 제공하는 것이고, 상기 전구체는 액상 또는 결정형이어도 좋다.
본 발명의 또 다른 목적은 전구체 분자를 코드하는 상기 각각의 DNA 시퀀스를 포함하는 프로인슐린 또는 그 유사체 또는 유도체의 발현을 위해 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질 전환되는 적합한 미생물/숙주를 제공하고, 적합한 발효 배지 및 발효 상태로 상기 형질 전환된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 각각의 인슐린 화합물을 제조하는 방법을 이어서 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 단일 단계 효소 반응을 통해 인슐린 화합물 전구체 형태를 각각의 활성 형태로 전환하는 방법을 포함하는 것이고, 트립신 및 카르복시펩티다아제는 원하지 않는 최종 산물의 생성을 최소화하는 상승적인 및 통제된 반응을 시키는 최적량으로 함께 첨가된다.
본 발명의 또 다른 목적은 순차적인 순서로 단계를 성공적으로 행하는 것을 포함하는 각각의 전구체 짝으로부터 인슐린 또는 그 유사체 또는 유도체를 얻는 방법을 얻는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린 분자를 얻는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린, 리스프로, 아스파르트, 글루리신 또는 IN-105로부터 선택되는 인슐린 분자를 얻는 것이다.
따라서, 본 발명은 대응하는 전구체로부터 인슐린 화합물 및 그 유사체 또는 유도체의 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 전구체를 조합의 및 동시에 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하고, 단 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1이고; 이하 순서로 이하 단계를 성공적으로 수행하는 단계를 포함하는 각각의 전구체의 짝으로부터 그 유사체 또는 유도체를 얻는 방법에 관한 것이고, (a) 완충 용액 내 인슐린의 전구체 또는 인슐린 유도체의 최적량을 용해하는 단계; (b) 약 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 전구체 용액의 각종 분취량을 제조하는 단계; (c) 단계(b)에서 제조되는 각종 분취량에 효소 트립신 및 카르복시펩티다아제를 동시에 도입하고, 약 4-10시간 동안 혼합물을 배양하는 단계; (d) 시트르산 완충제 및 ZnCl2의 첨가에 의해 제조되는 바람직한 인슐린을 침전시키는 단계이고, 인슐린 분자는 인슐린, 리스프로, 아스파르트, 글루리신 또는 IN-105를 포함하는 군으로부터 제조된다.
(첨부되는 서열 목록의 간단한 설명)
SEQ ID 1은 아스파르트 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 2는 아스파르트 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 3은 아스파르트 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 4는 리스프로 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 5는 리스프로 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 6은 리스프로 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 7은 글루리신 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 8은 글루리신 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
SEQ ID 9는 글루리신 전구체 분자의 아미노산 시퀀스이다.
본 발명은 이하 식으로 나타내는 대응하는 전구체로부터 인슐린 화합물 및 그 유사체 또는 유도체의 제조방법으로:
Figure pct00001

식 중, R은 수소 또는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 아미노산 잔기 또는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 펩티드이다.
R1은 OH 또는 아미노산 잔기 또는 Y1-Y2이고, Y는 아미노산 잔기이다.
아미노산 치환, 제거 및/또는 첨가를 포함하는, A1 내지 A21 부위는 인슐린 A 쇄에 대응하고, B1 내지 B27 부위는 인슐린 B 쇄에 대응한다.
R2는 Z1-Z2이고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu 또는 Z1-Z2-Z3으로부터 선택되고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu로부터 선택되고, Z3은 트레오닌 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기의 펩티드 부위이고, 단 B30에 대응하는 아미노산은 트레오닌이다.
X는 적어도 2개의 아미노산을 갖는 A쇄 또는 B쇄를 간섭하지 않고 효소적으로 쪼갤 수 있는 A쇄와 B쇄를 연결하는 폴리펩티드이고, 최초 및 마지막 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다.
상기 방법은 상기 전구체를 조합의 및 동시에 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하고, 단 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1이다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서 각각의 전구체 분자는 SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 시작하는 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 85% 상동인 아미노산 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서 인슐린 전구체에 대한 트립신의 상대적인 양은 약 1:10 내지 약 1:500의 범위이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 인슐린 전구체에 대한 트립신의 상대적인 양은 약 1:100이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 인슐린 전구체에 대한 카르복시펩티다아제의 상대적인 양은 약 1:500이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 전환 반응에 사용되는 트립신의 농도는 적어도 0.01mg/㎖이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 전환 반응에 사용되는 카르복시펩티다아제의 농도는 적어도 0.001mg/㎖이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 상기 전구체는 액상 또는 결정 형태이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 전환 반응은 pH 6.5 내지 10에서 행해진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 전환 반응은 pH 7 내지 9에서 행해진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 전환 반응은 약 2℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 행해진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 효소적 전환 반응 기간은 약 2 내지 24 시간이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 반응 배지는 적어도 30%의 물 또는 수혼합성 용매를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 상기 수 혼합성 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 N,N-디메틸포름아미드를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 반응 배지는 완충제로서 작용하는 염을 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 염은 TRIS, 에틸렌디아민, 트리에탄올아민, 글리신, HEPES(N-2-히드록시-에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 반응 배지에 사용되는 염의 농도는 약 10mM 내지 1M이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서 반응 배지에 사용되는 염의 농도는 약 0.6M이다.
본 발명은 이하 순서로 이하 단계를 성공적으로 수행하는 단계를 포함하는 각각의 전구체의 짝으로부터 그 유사체 또는 유도체를 얻는 방법에 관한 것이다.
(a) 완충 용액 내 인슐린의 전구체 또는 인슐린 유도체의 최적량을 용해하는 단계
(b) 약 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 전구체 용액의 각종 분취량을 제조하는 단계
(c) 단계(b)에서 제조되는 각종 분취량에 효소 트립신 및 카르복시펩티다아제를 동시에 도입하고, 약 4-10시간 동안 혼합물을 배양하는 단계
(d) 시트르산 완충제 및 ZnCl2의 첨가에 의해 제조되는 바람직한 인슐린을 침전시키는 단계.
본 발명은 상기 항 중 어느 것에 따라 제조되는 인슐린 분자에 관한 것이다.
본 발명은 인슐린, 리스프로, 아스파르트, 글루리신 또는 IN-105를 포함하는 군으로부터 선택되는 상기 항 중 어느 것에 따라 제조되는 인슐린 분자에 관한 것이다.
참조는 본 발명의 원리를 설명하기 위해 이하 실시예와 함께 제공되는 본 발명의 바람직한 실시형태에 상세하게 만들어질 것이다.
본 발명의 설명 및 주장에 있어서, 이하 전문 용어는 여기에 설명되는 정의에 따라 사용될 것이다.
여기에 정의되지 않으면, 본 발명에 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미가 있다. 또한, 문맥에 요구되지 않으면, 단수형 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 종래의 공지의 방법에 따라 행해진다. 일반적으로, 관련되어 사용되는 명명법, 및 여기에 기재된 기술은 기술 분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 기술 분야에서 잘 알려진 종래의 방법에 따라 행해진다.
여기에 사용되는 "아미노산(amino acid)"은 펩티드 또는 프로테인 시퀀스 또는 그 부분을 말한다. "프로테인(protein)", "펩티드(peptide) 및 "폴리펩티드(polypeptide)"는 상호 교환적으로 사용된다.
여기서, "인슐린(insulin)"은 돼지 인슐린(porcine insulin), 소 인슐린(bovine insulin) 및 인간 인슐린 및 그 혼합물, 예컨대 다이머 및 올리고머, 예컨대 헥사머를 포함하는 아연 복합체와 같은 임의의 종의 인슐린을 포함한다. 추가적으로, 여기서 "인슐린(insulin)"은 이른바 "인슐린 유사체(insulin analogues)"를 포함한다. 인슐린 유사체는 본래의 인간 인슐린 분자에 대해 A 및/또는 아미노산쇄의 하나 이상의 변이, 치환, 삭제 및/또는 첨가를 갖는 인슐린 분자이다. 더욱 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기와 교환되어도 좋고, 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 삭제되어도 좋고, 및/또는 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 첨가되어도 좋고, 단 상기 인슐린 유사체는 충분한 인슐린 활성을 갖는다. 인슐린 유사체는 하나 이상의 자연스럽게 발생하는 아미노산 잔기, 바람직하게는 그들의 1, 2 또는 3은 다른 코드의 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이 바람직하다. 인슐린 유사체의 예는 이하 특허 및 그것에 동등한 것: US 5,618,913, EP 254,516, EP 280,534, US 5,750,497 및 US 6,01 1 ,007에 기재되었다. 구체적인 인슐린 유사체의 예는 인슐린 아스파르트(insulin aspart) (즉, AspB28 인간 인슐린) 및 인슐린 리스프로(insulin lispro) (즉, LysB28,ProB29 인간 인슐린) 및 "인슐린 글루리신" (Lys B(3), GIu B(29) 인간 인슐린)이다.
본 발명의 하나의 실시형태는 이하 식으로 나타내는 인슐린 전구체 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00002

식 중, R은 수소 또는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 아미노산 잔기, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 펩티드이다.
R1은 OH 또는 아미노산 잔기 또는 Y1-Y2이고, Y는 아미노산 잔기이다.
아미노산 치환, 제거 및/또는 첨가를 포함하는, A1 내지 A21 부위는 인슐린 A 쇄에 대응하고, B1 내지 B27 부위는 인슐린 B 쇄에 대응한다.
R2는 Z1-Z2이고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu 또는 Z1-Z2-Z3으로부터 선택되고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu로부터 선택되고, Z3은 트레오닌 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기의 펩티드 부위이고, 단 B30에 대응하는 아미노산은 트레오닌이다.
x는 적어도 2개의 아미노산을 갖는 A쇄 또는 B쇄를 간섭하지 않고 효소적으로 쪼갤 수 있는 A쇄와 B쇄를 연결하는 폴리펩티드이고, 최초 및 마지막 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다.
본 발명의 하나의 실시형태는 구체적으로 분자 IN-105에 관한 것이다. IN-105는 인슐린 B-쇄의 위치 B29에서 엡실론 아미노산 리신에서 구조식 CH30-(C4H2O)3-CH2-CH2-COOH의 양친매성 올리고머(ampiphilic oligomer)와 콘쥬게이트 되는 인슐린 분자이다. 이 분자는 A1, B1 및 B29에서 모노콘쥬게이트(monoconjugated), A1, B1 및 B29에서 디콘쥬게이트(di-conjugated), 또는 A1, B1 및 B20의 각종 조합에서 트리콘쥬게이트(triconjugated)되어도 좋다.
하나의 실시형태에 있어서, SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 나타내는 폴리펩티드 분자에 대해서 핵산 시퀀스와 적어도 약 80% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 81% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 82% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 83% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 84% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 85% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 86% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 87% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 88% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 89% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 90% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 91% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 92% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 93% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 94% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 95% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 96% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 97% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 98% 상동인, 혹은 핵산 시퀀스와 적어도 99% 상동인 아미노산 시퀀스를 포함한다.
트립신은 일반적인 세린 프로테아제이고, 아르기닌 또는 리신 잔기의 카르복실 말단에서 프로테인 또는 펩티드를 가수분해한다 (Enzymes, pp 261-262(1979), ed. Dixon, M. & Webb, E. C., Longman Group Ltd., London). 특히, 가수분해는 연속적인 아르기닌 또는 리신 잔기가 존재하는 2염기성 부위에서 일어나고, 가수분해는 2염기성 부위가 β-턴 구조(β-turn structure) 내에 또는 옆에 위치할 때 가장 쉽게 일어난다는 것을 알았다 (Rholam, M., et al., FEBS Lett., 207, 1-6(1986) The Enzyme Vol. II, 3rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press NY. Pp. 249-275). 특히, 트립신은 C-터미널 아르기닌(Arg) 또는 리신(Lys) 잔기에서 펩티드 결합을 쪼갠다. 인슐린 전구체 분자의 트립신의 분열은 다른 분열 부위에서 동시에 발생할 수 있다. 특정 인슐린 전구체 분자 내에 많은 분열 쪽 때문에, 많은 바람직하지 않은 부산물이 트립신의 분열 반응 동안 형성될 수 있다.
재조합 돼지 췌장 트립신(Recombinant porcine pancreatic trypsin)은 분자 무게가 약 23,000달톤이고, pH 8.0에서 효소적 활성이 최고이다. 트립신은 인슐린 및 인슐린 유사체의 공업적 제조 방법에 사용된다. 이들 생체 분자의 제조는 문헌에 기재되어 있고, 일부 접근이 선택되었다.
카르복시펩티다아제 B(Carboxypeptidase B)는 폴리펩티드의 C-터미널로부터 염기성 아미노산 리신, 아르기닌 및 오르니틴(ornithine)을 가수분해하는 것이 바람직하다. 카르복시펩티다아제 B는 펩티드 및 프로테인으로부터 아르기닌 및 리신의 C-터미널 염기성 아미노산 잔기의 가수분해적 해리(hydrolytic release)를 촉매화하는 엑소펩티다아제(exopeptidase)이다.
여기에 사용되는 "C-펩티드(C-peptide)" 또는 "링커 펩티드(linker peptide)"는 본래의 또는 합성 펩티드를 포함하는 모든 형태의 인슐린 C-펩티드를 포함한다. 이들 인슐린 펩티드는 인간 펩티드이어도 좋고, 다른 동물의 종(species) 및 속(genera), 바람직하게는 포유류의 것이어도 좋다. 따라서, 본래의 인슐린 C-펩티드의 변이 및 변형은 그들이 인슐린 C-펩티드 활성을 유지하는 한 포함된다. 유용한 활성을 유지하면서 프로테인 또는 펩티드의 시퀀스를 변형시키는 기술이 알려져 있지만, 이것은 기술 분야에 표준이고 문헌에 널리 기재되어 있는, 예컨대 임의의 또는 위치 지정 돌연변이 유발(random or site-directed mutagenesis), 분열 및 핵산의 결찰(ligation) 등의 기술을 사용하여 행할 수 있다. 따라서, 기능적으로 동등한 변이체 또는 본래의 인슐린 C-펩티드 시퀀스의 유도는 기술 분야에 공지된 기술에 따라 쉽게 제조될 수 있고, 기능적, 예컨대 생물학적, 본래 인슐린 C-펩티드의 활성을 갖는 펩티드 시퀀스를 포함한다. 인슐린 C-펩티드의 이들 유사체, 변이체, 유도체 또는 단편 모두는 특히 본 발명의 범위내에 포함되고, "인슐린 C-펩티드"를 포함한다.
C-펩티드의 주요 요건은 A-와 B-쇄 사이에 디-술파이드 결합 형성이 가능하도록 충분한 길이여야 하고, 인슐린 형성을 야기하는 인슐린 전구체로부터 쪼갤 수 있는 것이어야 한다.
C-펩티드로서 사용되는 일반적인 디-펩티드는 -Arg-Arg-이다. C-펩티드는 Arg 또는 Lys로 개시하고 Arg 또는 Lys로 종결되는 임의의 길이이어도 좋다.
본 발명은 여기에 기재된 유전자 중 어느 것으로 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 임의의 이들 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell)는 제공된다. 실시예를 통해, 숙주 세포는 박테리아, 균류, 또는 포유류일 수 있다.
본 발명은 인슐린 화합물 전구체를 발현하는 핵산 시퀀스의 적어 하나의 부분이 제조되는 재조합 숙주 세포를 사용한다. 재조합 발현 시스템은 원핵(prokaryotic) 및 진핵(eukaryotic) 숙주로부터 선택된다. 진핵 숙주는 이스트 세포(예컨대, 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 포유류 세포 또는 식물 세포를 포함한다. 박테리아 및 진핵 세포는 당업자에게 상업적 원천(Commercial sources), 예컨대 the American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Md.)을 포함하는 많은 다양한 원천으로부터 이용 가능하다. 또한, 재조합 프로테인 발현에 사용되는 세포의 상업적 원천은 세포의 사용에 대한 지시를 제공한다. 발현 시스템은 발현 폴리펩티드에 바람직한 특성에 따라 다르다.
가장 바람직하게 관련된 본 발명의 실시형태에 있어서, 가장 바람직한 숙주 세포는 메틸로트로픽 효모(methylotrophic yeast)이다. 본 발명에 사용하는 변형될 수 있는 메틸로트로픽 효모의 가닥은 그것에 한정되지 않지만, 메탄올에서 배양할 수 있는 효모 가닥, 예컨대 피치아속(genera Pichia), 칸디다속(Candida), 한세눌라속(Hansenula) 또는 토룰롭시스속(Torulopsis)의 효모를 포함한다. 바람직한 메틸로트로픽 효모는 피치아속이다. 또한, 본 발명에 사용하는 변형될 수 있는 메틸로트로픽 효모 가닥은 하나 이상의 관심의 이종 프로테인을 발현하도록 조작되는 메틸로트로픽 효모 가닥을 포함한다. 본 발명의 실시형태에 따른 가장 바람직한 숙주 세포는 피치아 파스토리스 GS115이다.
숙주 세포 또는 기관은 표준 기술을 사용하여 재조합 프로테인 또는 펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 예컨대, 재조합 프로테인은 벡터로부터 또는 숙주의 게놈에 삽입되는 외인성 유전자로부터 발현될 수 있다.
외인성 프로테인을 발현하는데 사용될 수 있는 벡터는 기술 분야에 잘 알려져 있고, 이하에 설명된다. 인슐린 전구체 분자 유전자를 갖는 본 발명의 바람직한 벡터는 한정되지 않지만 pPIC9K를 포함한다.
본 발명의 가장 중요한 실시형태는 이하 식으로 나타내는 대응하는 전구체로부터 인슐린 화합물 및 그 유사체 또는 유도체를 전환하는 방법에 관한 것이다.
Figure pct00003

식 중, R은 수소 또는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 아미노산 잔기, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 펩티드이다.
R1은 OH 또는 아미노산 잔기 또는 Y1-Y2이고, Y는 아미노산 잔기이다.
아미노산 치환, 제거 및/또는 첨가를 포함하는, A1 내지 A21 부위는 인슐린 A 쇄에 대응하고, B1 내지 B27 부위는 인슐린 B 쇄에 대응한다.
R2는 Z1-Z2이고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu 또는 Z1-Z2-Z3으로부터 선택되고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu로부터 선택되고, Z3은 트레오닌 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기의 펩티드 부위이고, 단 B30에 대응하는 아미노산은 트레오닌이다.
x는 적어도 2개의 아미노산을 갖는 A쇄 또는 B쇄를 간섭하지 않고 효소적으로 쪼갤 수 있는 A쇄와 B쇄를 연결하는 폴리펩티드이고, 최초 및 마지막 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다.
상기 방법은 상기 전구체를 조합의 및 동시에 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하고, 단 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1이다.
전구체 분자는 액상 또는 결정형이어도 좋다.
인슐린 전구체 분자의 대응하는 인슐린 분자로의 전환 방법은 적어도 약 40$의 물을 포함하는 수용성 배지에서 행해지고; 그러나 적어도 약 30%, 또는 약 50% 또는 약 60% 또는 약 70% 또는 약 80%의 물의 존재 및 수혼합성 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드 등이 존재하지 않는 것은 아니다.
반응 배지는 완충 특성을 갖는 임의의 염을 추가적으로 포함해도 좋다. 바람직하게, 반응 배지는 10mA 내지 1M의 범위에서 염으로서 TRIS를 포함한다. 가장 바람직하게, 반응 배지로 사용되는 TRIS의 농도는 0.6M이다.
전환은 임의의 넓은 온도 범위, 일반적으로 약 0℃부터 40℃까지에서 행해진다. 바람직하게 반응은 약 10℃ 내지 약 30℃의 온도에서 행해지고, 가장 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 25℃이다.
반응 혼합물의 pH는 약 2 내지 약 12의 범위일 수 있다. 그러나, 최상의 결과는 반응이 약 6.5 내지 10의 pH 범위에서 진행되도록 pH를 조심히 통제함으로써 얻어진다. 바람직하게, 반응은 pH 범위 7 내지 9.5, 바람직하게는 약 8 내지 9, pH 8.5에서 정확하게 통제된 때 일어난다.
pH 통제는 완충제의 사용에 의해 통제된다. 사용되는 적합한 완충제의 임의의 넓은 범위는 TRIS, 에틸렌디아민, 트리에탄올아민, 글리신, HEPES (N-2-히드록시-에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 등을 포함한다.
일반적으로 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제의 양은 2개의 효소를 인슐린 전구체 분자의 양과 관련시킨다. 효소는 용액으로 또는 적합한 지지체 상에 부동화와 같은 인정된 기술을 사용하여 반응 혼합물에 도입되어 반응 매체에서 이용 가능해질 수 있다.
중량:중량을 기준으로, 트립신은 일반적으로 인슐린 전구체에 대해서 약 1:10 내지 약 1:500, 바람직하게는 약 1:10 내지 약 1:200, 가장 바람직하게는 약 1:10 내지 약 1:100 또는 1:10 내지 약 1:50 또는 약 1:10 내지 약 1:25의 범위로 존재한다. 사용되는 인슐린의 농도에 대한 트립신의 가장 바람직한 농도는 1:100이다. 전환 반응에 사용되는 트립신의 농도는 적어도 0.01mg/㎖이다.
중량:중량을 기준으로, 카르복시펩티다아제 B는 일반적으로 인슐린 전구체에 대해 약 1:500 내지 약 3:500의 범위의 양으로 존재한다. 사용되는 인슐린 농도에 대한 카르복시펩티다아제의 가장 바람직한 농도는 1:500이다. 전환 반응에 사용되는 카르복시펩티다아제의 농도는 적어도 0.001mg/㎖이다.
본 발명의 다른 중요한 파라미터는 반응 혼합물에서 카르복시펩티다아제 B에 대한 트립신의 비이다. 일반적으로, 중량 기준으로, 카르복시펩티다아제 B에 대한 트립신의 비율은 5:1 내지 50:1의 범위이다. 바람직하게, 중량 기준으로, 카르복시펩티다아제 B에 대한 트립신의 비는 약 50:3 내지 약 5:3이다. 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 가장 바람직한 비는 약 5:1이다.
반응 시간은 약 2 내지 48시간이고, 바람직하게 반응 시간은 약 2 내지 24시간이다.
따라서, 본 발명은 이하에 제공되는 순서로 이하 단계를 성공적으로 수행하는 단계를 포함하는 각각의 전구체의 짝으로부터 인슐린 또는 그 유사체 또는 유도체를 얻는 방법에 관한 것이다.
(a) 완충 용액 내 인슐린의 전구체 또는 인슐린 유도체의 최적량을 용해하는 단계
(b) 약 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 전구체 용액의 각종 분취량을 제조하는 단계
(c) 단계(b)에서 제조되는 각종 분취량에 효소 트립신 및 카르복시펩티다아제를 동시에 도입하고, 약 4-10시간 동안 혼합물을 배양하는 단계
(d) 시트르산 완충제 및 ZnCl2의 첨가에 의해 제조되는 바람직한 인슐린을 침전시키는 단계.
본 발명의 바람직한 실시형태는 이하의 도면 및 바람직한 실시형태의 내용으로 설명된다. 이들 내용이 상기 실시형태를 직접적으로 설명하지만, 여기에 나타내고 설명하는 특정 실시형태에 변형 및/또는 변이가 가능한 것은 당업자에게 당연하다. 본 설명의 범위내에 포함되는 임의의 이들 변형 및 변이는 여기에 포함되어야 한다. 구체적으로 명시하지 않으면, 내용 및 청구항의 단어 및 구문은 사용 기술 분야의 당업자에 있어서 일반적이고 익숙한 의미로 제공되는 것이 발명자의 의도이다. 본 출원의 출원시 출원인에게 알려진 본 발명의 바람직한 실시형태 및 최적의 형태의 내용은 있어 왔고, 설명만을 목적으로 하는 것이다. 본 발명은 기재된 정확한 형태에 한정되거나 철저한 것이 아니고, 상기 가르침을 고려하여 많은 변형 및 변이가 가능하다. 실시형태는 본 발명의 원리 및 실질적인 용도를 최상으로 설명하기 위해 선택되고 설명되어 타업자에 있어서 고려된 특정 사용에 적합한 각종 변형된 다양한 실시형태로 사용할 수 있도록 한다.
본 발명은 이하 실시예를 사용하여 더 자세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
실시예 1A:
아스파르트 전구체 (Aspart Precursor) (Seq ID 1, 2 and 3)
식 X-[ 아스파르트 B 쇄 (B1-B30)]- Y- [아스파르트 A 쇄 (A1-A21)]의 아스파르트 전구체, 식 중 X는 리더 펩티드 시퀀스이고, B 쇄는 B1-B30의 아스파트르 B 쇄 시퀀스이고, Y는 B 쇄와 A 쇄 사이의 링커 펩티드 시퀀스이고, A 쇄는 아스파르트의 A-쇄이다. 시퀀스는 리더 또는 다른 리더 펩티드(예컨대, EEAEAEAEPR 또는 GAVR)가 전혀 없어도 좋다. 링커 펩티드 Y는 예컨대 R 및 RDADDR 중 어느 것일 수 있다.
(코멘트: 링커 펩티드에서 "RR"은 제거되어 왔지만, 만약 놓쳤다면 다른 부분에서 삭제해야함).
전구체 시퀀스는 SEQ IDs 1 및 2로 나타낸다. 전구체는 대장균(Escherichia coli), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 맥주 효모군(Saccharomyces cerevisiae), CHO 세포 등과 같은 임의의 적합한 발현 시스템으로 제조되어도 좋다.
아스파르트 전구체는 피치아 발현 벡터, pPIC9K에 Mat-alfa 시그널 펩티드의 구조로 복제되었다. 피치아 파스토리스 숙주 가닥 GS115는 재조합 플라스미드로 형질 전환되어 클론 발현 아스파르트 전구체(clone expressing Aspart precursor)를 얻었다.
아스파르트 전구체는 배양액(culture medium)에서 피치아 파스토리스로 분비된다. 브로스(broth)를 원심분리하고 세포를 상청액으로부터 분리했다. 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic chromatography)를 포함하는 전구체의 포획에 사용되는 복수의 옵션이 있다.
본 발명을 위해 양이온-교환 크로마토그래피 및 HIC는 특정 전구체를 포획하는데 사용된다.
실시예 1B:
리스프로 전구체 (Seq ID 3, 4 and 5)
식 X-[ 리스프로 B 쇄 (B1-B30)]- Y- [리스프로 A 쇄 (A1-A21)]의 리스프로 전구체, 식 중 X는 리더 펩티드 시퀀스이고, B 쇄는 B1-B30의 리스프로 B 쇄 시퀀스이고, Y는 B 쇄와 A 쇄 사이의 링커 펩티드 시퀀스이고, A 쇄는 리스프로의 A-쇄이다. 시퀀스는 리더 또는 다른 리더 펩티드가 전혀 없어도 좋다. 링커 펩티드 Y는 예컨대 R 및 RDADDR 중 어느 것일 수 있다. 전구체 시퀀스는 SEQ IDs 3 및 4로 나타낸다. 전구체는 대장균, 피치아 파스토리스, 맥주 효모군, CHO 세포 등과 같은 임의의 적합한 발현 시스템으로 제조되어도 좋다.
리스프로 전구체는 피치아 발현 벡터, pPIC9K에 Mat-alfa 시그널 펩티드의 구조로 복제되었다. 피치아 파스토리스 숙주 가닥 GS115는 재조합 플라스미드로 형질 전환되어 클론 발현 리스프로 전구체(clone expressing Lispro precursor)를 얻었다.
리스프로 전구체는 배양액에서 피치아 파스토리스로 분비된다. 브로스(broth)를 원심분리하고 세포를 상청액으로부터 분리했다. 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic chromatography)를 포함하는 전구체의 포획에 사용되는 복수의 옵션이 있다. 본 발명을 위해 양이온-교환 크로마토그래피 및 HIC는 특정 전구체를 포획하는데 사용된다.
실시예 1C:
글루리신 전구체 (Seq ID 5 , 6 및 7 )
식 X-[ 글루리신 B 쇄 (B1-B30)]- Y- [글루리신 A 쇄 (A1-A21)]의 글루리신 전구체, 식 중 X는 리더 펩티드 시퀀스이고, B 쇄는 B1-B30의 글루리신 쇄 시퀀스이고, Y는 B 쇄와 A 쇄 사이의 링커 펩티드 시퀀스이고, A 쇄는 글루리신의 A-쇄이다. 시퀀스는 리더 또는 다른 리더 펩티드가 전혀 없어도 좋다. 링커 펩티드 Y는 예컨대 R 및 RDADDR 중 어느 것일 수 있다. 전구체 시퀀스는 SEQ IDs 5 및 6으로 나타낸다. 전구체는 대장균, 피치아 파스토리스, 맥주 효모군, CHO 세포 등과 같은 임의의 적합한 발현 시스템으로 제조되어도 좋다. 글루리신 전구체는 피치아 발현 벡터, pPIC9K에 Mat-alfa 시그널 펩티드의 구조로 복제되었다. 피치아 파스토리스 숙주 가닥 GS115는 재조합 플라스미드로 형질 전환되어 클론 발현 글루리신 전구체(clone expressing Glulisine precursor)를 얻었다.
글루리신 전구체는 배양액에서 피치아 파스토리스로 분비된다. 브로스(broth)를 원심분리하고 세포를 상청액으로부터 분리했다. 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic chromatography)를 포함하는 전구체의 포획에 사용되는 복수의 옵션이 있다. 본 발명을 위해 양이온-교환 크로마토그래피 및 HIC는 특정 전구체를 포획하는데 사용된다.
전구체 결정화
양이온-교환 크로마토그래피 단계를 사용함으로써 발효 브로스로부터 포획된 다양한 인슐린 화합물은 색 제거 및 저장을 위해 결정화했다. 결정화가 행해지면 결정화 개시시 전구체의 농도는 2 내지 20g/L이고, 바람직하게는 8 내지 14g/L이다. ZnCl2 및 페놀을 첨가함으로써 결정화를 행한 후 pH를 3.0 내지 8.0, 바람직하게는 3.5 내지 5.5로 조정했다. 페놀은 CIEX 용리 풀(elution pool) 체적의 0.1 내지 0.5% 가해질 수 있다. 4% ZnCl2 용액은 CIEX 용리 풀 체적의 3 내지 15% 가해질 수 있다. pH는 임의의 알칼리, 바람직하게는 NaOH 또는 TRIS에 의해 조절될 수 있다. 결정 방법은 2~30℃의 온도에서 행해질 수 있고, 슬러리(slurry)는 결정이 완전히 형성되기 위해 몇시간 동안 저장된다. 전구체 결정은 원심분리 또는 디캔팅(decantation)에 의해 상청액으로부터 분리될 수 있다.
실시예 2A:
전구체 리스프로 결정화의 실시예
용리 풀 (전구체 농도 13.8 g/L) 463 ㎖를 취해 적당히 해동된 후에 페놀 2.315 ㎖ (EP 체적의 0.5%)에 첨가했다. 이어서, 이것에 4% ZnCl2 용액 57.875 ㎖ (EP 체적의 12.5%)를 첨가했다. pH는 이 단계에서 4.08이고, 2.5N NaOH 420㎖를 첨가함으로써 4.8로 조절했다. 모액(mother liquor)을 15분 동안 천천히 교반한 후 추운 방(2-8℃)으로 옮겨 밤새 두었다. 총 혼합물을 Beckman Coulter Avanti J-26 XP 원심분리기(centrifuge)에서 20분 동안 5000rpm에서 원심분리했다. 상청액에서의 손실은 1.55%이었다.
실시예 2B:
전구체 아스파르트 결정화의 실시예
용리 풀 (전구체 농도 2.9 g/L) 500 ㎖를 취해 적당히 해동된 후에 페놀 0.625 ㎖ (EP 체적의 0.125%)에 첨가했다. 이어서, 이것에 4% ZnCl2 용액 15.625 ㎖ (EP 체적의 3.125%)를 첨가했다. pH는 이 단계에서 4.08이고, 2.5N NaOH 315㎖를 첨가함으로써 4.8로 조절했다. 모액(mother liquor)을 15분 동안 천천히 교반한 후 추운 방(2-8℃)으로 옮겨 5시간 동안 두었다. 그 후 상청액을 원심분리에 의해 분리했다. 상청액에서의 손실은 4%이었다.
코멘트: 넘버링을 변경할 수 있는가(아스파르트 2A 및 리스프로 2B)? 나머지 장소에서는 A: 아스파르트, B:리스프로 및 C: 글루리신의 시퀀스를 유지함으로써 실시예를 제공한다.
실시예 2C:
전구체 글루리신 결정화의 실시예
전구체 글루리신의 Sp 세파로오스로부터 용리 풀 (전구체 농도 2.9 g/L) 250 ㎖를 취해 적당히 해동된 후에 페놀 0.31 ㎖ (EP 체적의 0.125%)에 첨가했다. 이어서, 이것에 4% ZnCl2 용액 7 ㎖ (EP 체적의 3%)를 첨가했다. pH는 이 단계에서 4.13이고, 2.5N NaOH를 첨가함으로써 4.9로 조절했다. 모액(mother liquor)을 30분 동안 천천히 교반한 후 추운 방(2-8℃)으로 옮겨 5시간 동안 두었다. 그 후 상청액을 원심분리에 의해 분리했다. 상청액에서의 손실은 7%이었다.
실시예 3A:
효소 반응
다양한 인슐린 화합물은 효소 전환을 통해 대응하는 전구체로부터 형성될 수 있다. 전구체로부터 최종 산물까지의 직접적인 전환은 2개의 프로테아제 효소의 존재에 의해 얻어질 수 있다. 효소 반응은 2가지 다른 방법으로 행해진다. 첫번째로, 전구체는 식물, 동물 또는 미생물 재조합 근원의 트립신 또는 트립신 유사 효소로 처리되어야 한다. 트립신 반응이 끝나면, 동일한 반응 혼합물에서 중간체는 제 2 프로테아제 효소 카르복시펩티다아제 B 또는 식물, 동물, 미생물 재조합 근원의 유사한 효소로 처리되었다. 카르복시펩티다아제 B는 C-터미널 말단에 염기성 아미노산에서 작용할 수 있다. 또한, 트립신 및 카르복시펩티다아제 효소는 칵테일과 같이(함께) 반응 혼합물에 첨가되고, 반응은 최적의 대응물의 형성이 일어날 때까지 계속되었다.
실시예 4A:
트립신만이 각각의 전구체 반응 혼합물에 첨가된 경우
각각의 아스파르트, 리스프로 및 글루리신 전구체 결정 2gm를 6M TRIS 용액 5㎖로 가용화했다. 각각의 반응 혼합물의 산물의 농도는 3-5 mg/㎖로 유지되었다. 반응 혼합물의 pH는 8.5로 조절되었다. 트립신은 각각의 혼합물에 50㎍/㎖의 농도로 첨가되었다. 반응은 4±0.5℃ 및 실온(24±0.5℃)에서 행해졌다. 반응 혼합물이 반응 온도에 대해서 변화하지 않는 마지막이지만, 온도가 증가함에 따라 반응이 감소되는 완료시에 크로마토그래피 프로파일이 관측된다. 반응 온도는 24±0.5℃에서 유지된다. 반응은 8시간 동안 계속되고, 8시간의 마지막에 샘플이 분석된다.
유사한 방법으로, 각각의 아스파르트, 리스프로 및 글루리신의 전구체는 TRIS 용액 및 50%의 용매 디메틸 포름아미드에 농도 3-5mg/㎖로 가용화했다. 반응 혼합물의 pH는 8.5로 조절되고, 반응 혼합물의 온도는 24±0.5℃에서 유지되었다. 트립신은 50㎍/㎖의 농도로 각각의 반응 혼합물에 가했다.
관찰:
아스파르트 전구체는 B-30 Des-트레오닌 아스파르트 및 Des 옥타펩티드 인슐린으로 전환되었다. Des-트레오닌 아스파르트의 퍼센트는 45%, Des 옥타펩티드 인슐린은 36%이었다. 필요한 중간체, B31에 여분의 아르기닌 잔기를 갖는 아스파르트의 형성은 10-14%이다. 따라서 제 2 효소 카르복시펩티다아제 B는 반응 혼합물에 첨가되고, 최종 산물 제조의 전체 수율은 <10-15%이다.
유사 산물 프로파일은 반응이 50% 용매에서 행해질 때 발견된다. 그러나, 반응률은 용매의 존재하에 매우 느리다. 유사한 형태의 프로파일을 행하기 위해 반응은 거의 18시간 계속되어야 한다.
따라서, 계속적인 프로테아제 반응을 통해 대응하는 전구체로부터 아스파르트의 생성은 불가능하다. 따라서, 아스파르트의 B-29 Lys는 트립신 분열시 가장 강력한 부위이고, 반응이 계속됨에 따라 B-22 Arg 부위는 트립신 분열이 쉬워지고, 반응 마지막에 각각의 전구체에서 B-30 des 트레오닌 및 des-옥타펩티드의 혼합물을 얻는다. B-31 아르기닌의 분열 산물은 전체 전구체 산물에서 매우 적다.
유사한 조건하에서 리스프로 전구체는 많은 양의 Des- 옥타펩티드 인슐린과 함께 B31의 여분의 아르기닌 잔기를 갖는 리스프로 산물로 전환된다. 글루리신 전구체가 동일한 조건하에서 트립신으로 처리될 때 유사한 형태의 관측이 발견된다. 그러나, 반응 혼합물의 크로마토그래피 프로파일은 리스프로 및 글루리신 전구체의 모든 경우에 깨끗하지 않다. 이것은 가능한 최종 산물, 리스프로 및 글루리신 조차도 제 2 프로테아제 카르복시펩티다아제 B와 계속적인 반응을 통해 만들 수 있지만 전체 수율은 매우 나쁘다는 것을 나타낸다.
50%의 디메틸 포름아미드의 존재만으로 글루리신 전구체 뿐만 아니라 리스프로의 경우에 반응률을 저하한다.
개념을 확인하기 위해 트립신 반응의 유사한 형태는 전구체가 단쇄 PEG 분자 이외에도 콘쥬게이트 되지 않은 전구체 분자로 In-105 전구체에 블록킹될 때 IN-105전구체 B-29 Lys 잔기로 시도된다. 콘쥬게이트된 IN-105 전구체의 경우에, 트립신은 제 31 아미노산의 아르기닌 잔기의 c-터미널 말단에서 더욱 바람직하게 분열되어 B쇄의 C-터미널 말단에서 여분의 아르기닌 잔기를 갖는 IN-105가 생성된다는 것이 관측되었다. 또한, B-31 아르기닌 IN-105 Des 옥타 인슐린은 반응 혼합물에 생성된다. 그러나, 콘쥬게이트되지 않은 IN-105 전구체가 트립신으로 처리되면 프로테아제는 C-터미널 말단 B-29 리신 잔기에서 바람직하게 분열되어 Des-트리오닌 인슐린을 생성한다. 반응의 마지막에 크로마토그래피 프로파일은 반응 혼합물에서 임의의 용매의 존재 또는 부재하에서 동일하다. 용매의 존재는 반응률을 저하한다는 것이 관측되었다.
실시예 4B:
실험 조건의 다음 단계에 있어서, 반응은 각각의 전구체 반응 혼합물에 트립신 및 카르복시펩티다아제 B를 첨가함으로써 행해진다.
전구체의 농도는 일반적으로 약 5 내지 50g/L이다. 반응은 약 5 내지 12, 바람직하게는 약 8 내지 10에서 행해진다. 반응 온도는 약 0-40℃이고, 바람직하게는 약 2-25℃이다. 트리스히드록시메틸아미노메탄 (Trishydroxylmethylaminomethane) (TRIS) 또는 다른 완충 시스템은 다른 이온 강도에서 사용되어 필요한 pH를 유지한다. 반응 시간은 다른 반응 조건에 의해 변하고 영향받는다. 반응은 산물의 가수분해에 기인하여 산물의 순도가 감소하기 시작할 때까지 계속되었다. 일반적으로 약 30분 내지 24시간, 대부분의 경우에 약 4 내지 10시간이 걸렸다.
효소의 농도는 기판의 농도 및 효소 활성에 따라 결정된다. 예컨대, 시판되는 결정성 트립신은 약 10 내지 100mg/L의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
실시예: 4B (I)
아스파르트 전구체 결정 4gm을 1M TRIS 용액 20㎖에 용해했다. 용액의 산물 농도는 5mg/㎖로 유지되고, TRIS 농도는 첨가에 의해 0.6M로 유지되었다. 소정량의 분취량을 2.5N NaOH 또는 2N 빙초산으로 반응 혼합물의 pH를 조절함으로써 취했다. pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0에서 반응 혼합물의 분취량이 제조되었다. 각각의 반응 혼합물 1 ㎖는 다른 조건에서 각각의 반응 혼합물로서 각 튜브에 취했다. 반응은 다른 농도로 트립신 및 카르복시펩티다아제 B를 함께 첨가함으로써 모든 샘플에 행해졌다. 변화되는 다양한 파라미터를 표로 만들었다.
상수 파라미터(Constant Parameters):
· 산물 농도 5g/L
· TRIS 완충제 농도 0.6M
가변 파라미터(Varied Parameters):
· 트립신 농도: 25-500 mg/L
· 카르복시펩티다아제 농도: 10-30mg/L
· pH: 7.0-9.0
전구체
농도 (g/L) 		TRIS
농도 (M) 		트립신
농도 mg /L 		카르복시펩티다아제 B 농도 ( mg /L) pH 수율
(%)





5
 0.6 500 10 7.0 53
8.0 66
9.0 17.5
30 7.0 54
8.0 64
9.0 16


200		 10 7.0 51
8.0 59
9.0 24
30 7.0 28
8.0 65
9.0 64


50		 10 7.5 44
8.0 68
8.5 75
30 7.5 45
8.0 63
8.5 66

25		 10 7.5 31
8.0 49
8.5 61
30 7.5 31
8.0 49
8.5 62
결과:
트립신 및 카르복시펩티다아제가 반응 혼합물에 함께 첨가될 때, Des 옥타펩티드 형태 및 des-트레오닌 형태가 관측되지 않는다는 것이 관찰되었다. 반응 마지막에 아스파르트는 반응에서의 주요 산물이다. 생성된 아스파르트의 순도 및 수율은 각각의 반응 조건에 따라 다르다. 아스파르트의 75%의 최상의 수율은 트립신 농도 50mg/L, 카르복시펩티다아제 농도 10mg/L이고 pH 8.5에서 관찰되었다.
실시예 4B (II):
리스프로 전구체 결정 5gm을 1M TRIS 용액 25㎖에 용해했다. 용액의 산물 농도는 5mg/㎖로 유지되고, TRIS 농도는 첨가에 의해 0.6M로 유지되었다. 소정량의 분취량을 2.5N NaOH 또는 2N 빙초산으로 반응 혼합물의 pH를 조절함으로써 취했다. pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0에서 반응 혼합물의 분취량이 제조되었다. 각각의 반응 혼합물 1 ㎖는 각각의 반응 혼합물로서 각 튜브에 취하고 샘플 A, B, C 등으로 이름을 붙였다. 반응은 다른 농도로 트립신 및 카르복시펩티다아제 B를 함께 첨가함으로써 모든 샘플에 행해졌다. 다양한 조건을 표로 만들었다.
상수 파라미터(Constant Parameters):
· 산물 농도 5g/L
· TRIS 완충제 농도 0.6M
가변 파라미터(Varied Parameters):
· 트립신 농도: 25-200 mg/L
· 카르복시펩티다아제 농도: 10-30mg/L
· pH: 7.0-9.0
전구체
농도 (g/L) 		TRIS
농도 (M) 		트립신
농도 mg /L 		카르복시펩티다아제 B 농도 ( mg /L) pH 수율(%)
5
 0.6
 200 10 7.0 33
7.5 49
8.0 62
8.5 65
9.0 29
30 7.0 52
7.5 55
8.0 61
8.5 64
9.0 26
100 10 7.0 11
7.5 34
8.0 55
8.5 59
9.0 31
30 7.0 24
7.5 41
8.0 54
8.5 66
9.0 34
50 10 7.0 21
7.5 46
8.0 66
8.5 78
9.0 62
30 7.0 38
7.5 55
8.0 64
8.5 71
9.0 65
25
 10 7.0 13
7.5 25
8.0 41
8.5 44
9.0 51
30 7.0 22
7.5 25
8.0 33
8.5 46
9.0 55
결과:
트립신 및 카르복시펩티다아제가 반응 혼합물에 함께 첨가될 때, Des 옥타펩티드 형태 및 des-트레오닌 형태가 관측되지 않는다는 것이 관찰되었다. 아스파르트의 78%의 최상의 수율은 트립신 농도 50mg/L, 카르복시펩티다아제 농도 10mg/L이고 pH 8.5에서 관찰되었다.
실시예 4B (III):
글루리신 전구체 결정 5gm을 1M TRIS 용액 25㎖에 용해했다. 용액의 산물 농도는 5mg/㎖로 유지되고, TRIS 농도는 첨가에 의해 0.6M로 유지되었다. 소정량의 분취량을 2.5N NaOH 또는 2N 빙초산으로 반응 혼합물의 pH를 조절함으로써 취했다. pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0에서 반응 혼합물의 분취량이 제조되었다. 각각의 반응 혼합물 1 ㎖는 각각의 반응 혼합물로서 각 튜브에 취하고 샘플 A, B, C 등으로 이름을 붙였다. 반응은 다른 농도로 트립신 및 카르복시펩티다아제 B를 함께 첨가함으로써 모든 샘플에 행해졌다. 다양한 조건을 표로 만들었다.
상수 파라미터(Constant Parameters):
· 산물 농도 5g/L
· TRIS 완충제 농도 0.6M
가변 파라미터(Varied Parameters):
· 트립신 농도: 25-200 mg/L
· 카르복시펩티다아제 농도: 10-30mg/L
· pH: 7.0-9.0
전구체
농도 (g/L) 		TRIS
농도 (M) 		트립신
농도 mg /L 		카르복시펩티다아제 B 농도 ( mg /L) pH 수율 %
5










0.6








 200 10 7.0 29
7.5 56
8.0 49
8.5 61
9.0 49
30 7.0 44
7.5 59
8.0 42
8.5 29
9.0 21
100 10 7.0 25
7.5 33
8.0 47
8.5 61
9.0 64
30 7.0 41
7.5 62
8.0 65
8.5 71
9.0 49
50 10 7.0 28
7.5 46
8.0 68
8.5 78
9.0 70
30 7.0 36
7.5 44
8.0 59
8.5 69
9.0 72
25
 10 7.0 14
7.5 29
8.0 35
8.5 49
9.0 51
30
 7.0 24
7.5 35
8.0 44
8.5 64
9.0 68
결과: 글루리신의 78%의 최상의 수율은 트립신 농도 50mg/L, 카르복시펩티다아제 농도 10mg/L이고 pH 8.5에서 관찰되었다.
실시예 5:
최종 침전
리스프로, 아스파르트 및 글루리신의 대응하는 전구체의 효소 반응에 대한 상기 설명된 최상의 조건이 행해졌다. 각각의 최종 효소 반응 혼합물은 시트르산(citric acid) 완충제 및 ZnCl2 용액을 첨가하고, pH를 조절함으로써 침전시켰다(시트르산 완충제는 시트르산(무수물) 15.4 g/L, 디소듐 오르토포스페이트(di-sodium orthophosphate)(무수물) 완충제 90 g/L을 포함하고, o-포스폰산으로 pH 6.3+0.1로 조절됨). 침전은 4.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0의 pH 범위에서 행해진다. 산물 농도는 1-10g/L가 바람직하다. 침전 후, 산물은 고착된 침전을 흐트러뜨리지 않고 상청액을 원심분리 또는 디캔팅함으로써 깨끗한 상청액으로부터 분리된다. 이렇게 하여 얻어진 침전물을 냉수로 세정하여 존재하는 제한되지 않는 이온을 제거한다.
침전 단계의 수율은 85- 90%이다.
상기 설명 및 실시예는 이해를 쉽게 하기 위해서만 제공된다. 본 발명은 첨부되는 청구항의 정신 내에서 변형 및 변이될 수 있다는 것을 인정하는 당업자에 있어서 변형은 명백하므로 불필요한 한정되는 것으로 이해되지 않는다.
여기에 언급되는 수단은 산물의 손실을 억제하고 다른 공지의 방법에 비해 적용이 쉬운 반응 방법을 제공함으로써 상기 설명된 문제를 극복한다. 이 시스템은 임의의 공지 방법에 비해 향상된 전환 효율을 달성하기 위해 설명된 방법론을 사용하여 기술 분야에 알려진 주요 단점을 극복함으로써 비용을 줄인다.
SEQUENCE LISTING
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> Biocon Ltd Hazra, Partha <120> Process for the preparation of Insulin compounds <130> 200608 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 67 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(67) <400> 1 Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile 35 40 45 Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 50 55 60 Tyr Cys Asn 65 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(61) <400> 2 Gly Ala Val Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp 20 25 30 Lys Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr 35 40 45 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 3 <211> 57 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(57) <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr Arg Asp 20 25 30 Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 4 <211> 67 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(67) <400> 4 Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Arg Phe Val Asn Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile 35 40 45 Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 50 55 60 Tyr Cys Asn 65 <210> 5 <211> 61 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(61) <400> 5 Gly Ala Val Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys 20 25 30 Pro Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr 35 40 45 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 6 <211> 57 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(57) <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Asp 20 25 30 Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 7 <211> 67 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(67) <400> 7 Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Arg Phe Val Lys Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile 35 40 45 Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 50 55 60 Tyr Cys Asn 65 <210> 8 <211> 61 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(61) <400> 8 Gly Ala Val Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Glu Thr Arg Asp Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr 35 40 45 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 9 <211> 57 <212> PRT <213> Pichia pastoris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(57) <400> 9 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Asp 20 25 30 Ala Asp Asp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55

Claims (23)

  1. 이하 식으로 나타내는 대응하는 전구체로부터 인슐린 화합물 및 그 유사체 또는 유도체의 제조방법으로:

    Figure pct00010


    식 중, R은 수소 또는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 아미노산 잔기, 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 화학적으로 또는 효소적으로 쪼갤 수 있는 펩티드이다.

    R1은 OH 또는 아미노산 잔기 또는 Y1-Y2이고, Y는 아미노산 잔기이다.

    아미노산 치환, 제거 및/또는 첨가를 포함하는, A1 내지 A21 부위는 인슐린 A 쇄에 대응하고, B1 내지 B27 부위는 인슐린 B 쇄에 대응한다.

    R2는 Z1-Z2이고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu 또는 Z1-Z2-Z3으로부터 선택되고, Z1은 Pro, Lys, Asp로부터 선택되고, Z2는 Lys 또는 Pro 또는 Glu로부터 선택되고, Z3은 트레오닌 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기의 펩티드 부위이고, 단 B30에 대응하는 아미노산은 트레오닌이다.

    x는 적어도 2개의 아미노산을 갖는 A쇄 또는 B쇄를 간섭하지 않고 효소적으로 쪼갤 수 있는 A쇄와 B쇄를 연결하는 폴리펩티드이고, 최초 및 마지막 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다.

    상기 방법은 상기 전구체를 조합의 및 동시에 사용되는 트립신 및 카르복시펩티다아제로 처리하는 단계를 포함하고, 단 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 전구체 분자는 SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 시작하는 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 85% 상동인 아미노산 시퀀스를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 전구체에 대한 트립신의 상대적인 양은 약 1:10 내지 약 1:500의 범위인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인슐린 전구체에 대한 트립신의 상대적인 양은 약 1:100인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 전구체에 대한 카르복시펩티다아제의 상대적인 양은 약 1:500인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1 내지 약 50:1인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 카르복시펩티다아제에 대한 트립신의 상대적인 농도비는 약 5:1인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 전환 반응에 사용되는 트립신의 농도는 적어도 0.01mg/㎖인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 전환 반응에 사용되는 카르복시펩티다아제의 농도는 적어도 0.001mg/㎖인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 전구체는 액상 또는 결정 형태인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 전환 반응은 pH 6.5 내지 10에서 행해지는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 전환 반응은 pH 7 내지 9에서 행해지는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 전환 반응은 약 2℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 행해지는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 효소적 전환 반응 기간은 약 2 내지 24 시간인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 반응 배지는 적어도 30%의 물 또는 수혼합성 용매를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 수 혼합성 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 N,N-디메틸포름아미드를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 반응 배지는 완충제로서 작용하는 염을 더 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 염은 TRIS, 에틸렌디아민, 트리에탄올아민, 글리신, HEPES(N-2-히드록시-에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 반응 배지에 사용되는 염의 농도는 약 10mM 내지 1M인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 반응 배지에 사용되는 염의 농도는 약 0.6M인, 방법.
  21. 이하 순서로 이하 단계를 성공적으로 수행하는 단계를 포함하는 각각의 전구체의 짝으로부터 그 유사체 또는 유도체를 얻는 방법.
    (a) 완충 용액 내 인슐린의 전구체 또는 인슐린 유도체의 최적량을 용해하는 단계
    (b) 약 7.0 내지 9.0의 pH 범위에서 전구체 용액의 각종 분취량을 제조하는 단계
    (c) 단계(b)에서 제조되는 각종 분취량에 효소 트립신 및 카르복시펩티다아제를 동시에 도입하고, 약 4-10시간 동안 혼합물을 배양하는 단계
    (d) 시트르산 완충제 및 ZnCl2의 첨가에 의해 제조되는 바람직한 인슐린을 침전시키는 단계.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 인슐린 분자.
  23. 인슐린, 리스프로, 아스파르트, 글루리신 또는 IN-105를 포함하는 군으로부터 선택되는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 인슐린 분자.
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