MX2011001408A - Proceso para la preparacion de compuestos de insulina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la preparación de compuestos de insulina, incluyendo sus análogos o derivados de los mismos a partir de sus formas precursoras correspondientes mediante una reacción enzimática de una etapa que incluye el uso combinatorio y concurrente de cantidades óptimas de tripsina y carboxipeptidasa B que funcionan sinérgicamente al dirigir la reacción de una manera controlada para evitar la producción de subproductos no deseados aleatorios. Particularmente, las reacciones de conversión enzimática de la presente invención ofrecen ventajas de reducción en el número de etapas operacionales, y rendimiento y pureza más altos de los productos finales deseados.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACION DE COMPUESTOS DE INSULINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la preparación de compuestos de insulina incluyendo sus análogos o derivados de los mismos a partir de sus formas precursoras correspondientes por una reacción enzimática de una etapa que incluye el uso combinatorio y concurrente de cantidades óptimas de tripsina y carboxipeptidasa B que funcionan sinérgicamente dirigiendo la reacción de una manera controlada para evitar la producción de subproductos no deseados aleatorios . Particularmente, las reacciones de conversión enzimática de la presente invención ofrecen ventaj as de reducción en el número de etapas operacionales, rendimiento más alto y pureza de los productos finales deseados.

ANTECEDENTES Y TÉCNICA ANTERIOR DE LA INVENCIÓN Los métodos de ingeniería genética están permitiendo cada vez más que formas precursoras de insulina sean expresada en microorganismos (EP-A-347-78 1 , EP-A-367- 163). Las secuencias pre pro normalmente son cortadas química y/o enzimáticamente (DE-P-3 440 988 , EP-A-0264250). Los métodos de conversión enzimática conocidos se basan en el corte con tripsina y carboxipeptidasa B (Kemmler W. et al . J. Biol . Chem. , 246 ( 1 971 ) 6786-6791 , EP-A- 1 95 691 , EP-B-89007) . En el proceso típico de conversión de la molécula precursora de insulina a la molécula correspondiente, el péptido enlazador entre las cadenas A y B es removido. Las reacciones enzimáticas con tripsina son una reacción enzimática complej a que corta no sólo aquellos enlaces péptidos cuyo corte produce insulina humana o los productos finales deseados sino también, en una reacción competente, el corte en otros sitios susceptibles produce una pluralidad de subproductos no deseados.

Los métodos de la técnica anterior incluyen el uso de tripsina y una segunda enzima carboxipeptidasa de tal manera que la segunda enzima carboxipeptidasa se añada cuando el intermediario requerido se forme en la reacción. La desventaj a de estos métodos es la formación de grandes cantidades de subproductos de impurezas que pueden ser removidas de la solución de reacción sólo con dificultad. En el caso particular de la conversión de la forma precursora humana en insulina humana (insulina humana, HI), está la formación de grandes cantidades de des-Thr(B 30)-insulina humana (des-Thr(B30)-HI) .

A partir de lo anterior, es evidente que sería adecuado seguir un proceso de reacción enzimática más simpl e para el corte de compuestos de insulina precursores, sus análogos y derivados de los mismos a insulina a través de una etapa mucho más simple que remueva las posibles formaciones de impurezas poliméricas lo más completamente posible y, al mismo tiempo, incremente la concentración de producto final de insulina deseado lo más posible. Una condición adicional es la necesidad de asegurar alto rendimiento total que incremente la facilidad de operación, calidad así como la cantidad del producto final deseado.

Las desventaj as de los procesos conocidos han sido remediadas por las reacciones enzimáticas llevadas a cabo en la presente invención, y ha resultado que el incremento en rendimiento sin subproductos no deseados es relativo a la concentración óptica de tripsina y carboxipeptidasa usada baj o condiciones de reacción conductoras. Los inventores han intentado desarrollar un proceso de reacción enzimática de una etapa mejorado que incluye el uso combinatorio y concurrente de cantidades óptimas de tripsina y carboxipeptidasa B que funcionan sinérgicamente para proporcionar los productos finales deseados que incrementan la facilidad de operación, por ese rendimiento de los productos finales.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN El principal obj etivo de la presente invención es obtener un proceso para la preparación de compuestos de insulina y sus análogos o derivados a partir de sus precursores correspondientes con mínima formación de subproductos no deseados que se hagan posible por una reacción enzimática de una etapa que incluya el uso combinatorio y concurrente de cantidades óptimas de tripsina y carboxipeptidasa B que funcionen sinérgicamente para proporcionar los productos finales deseados.

Otro obj etivo principal de la presente invención es proporcionar un precursor análogo de insulina como el representado por SEQ IDs 1 , 2,3 , 4, 5 , 6, 7 y 8 que se puede usar como el material de partida, los precursores pueden estar ya sea en forma líquida o de cristal.

Otro obj etivo más de la presente invención es proporcionar un vector de expresión para la expresión de pro insulina y sus análogos o derivados que comprenda la secuencia de ADN respectiva que codifique para la molécula precursora.

Otro obj etivo más de la presente invención es proporcionar un microorganismo/anfitrión adecuado que se transforme con el vector de expresión y posteriormente proporcione un proceso para preparación compuestos de insulina respectivos, que comprende cultivar el microorganismo transformado en un medio de fermentación adecuado y condiciones de fermentación para producir formas de insulina precursoras.

Otro obj etivo más de la presente invención incluye el método para convertir las formas precursoras de compuestos de insulina en sus formas activas respectivas a través de una reacción enzimática de una sola etapa en la que tripsina y carboxipeptidasa se añaden juntas en cantidades óptimas que permitan una reacción sinérgica y controlada minimizando la producción de productos finales no deseados.

Otro obj etivo más de la presente invención es obtener un proceso para obtener una insulina o su análogo o derivados de los mismos a partir de sus contrapartes precursoras respectivas, que comprende llevar a cabo sucesivamente las etapas en un orden secuencial.

Otro obj etivo más de la presente invención es obtener una molécula de insulina.

Aún otro obj etivo de la presente invención es obtener una molécula de insulina seleccionada del grupo que comprende insulina, lispro, aspart, glulisina o IN- 105.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de compuestos de insulina y sus análogos o derivados a partir de sus precusores correspondientes, que comprende tratar el precursor con tripsina y carboxipeptidasa usados en forma combinatoria y concurrente siempre y cuando la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa sea de aproximadamente 5 : 1 a alrededor de 50: 1 ; un proceso para obtener una insulina o su análogo o derivados de la misma a partir de sus contrapartes precursoras respectivas, que comprende llevar a cabo sucesivamente las siguientes etapas en el siguiente orden secuencial (a) disolver una cantidad óptima del precursor de insulina o un derivado de insulina en una solución reguladora de pH; (b) preparar varias alícuotas de la solución precursora a escalas de pH de alrededor de 7.0 a 9. Ó; (c) introducir las enzimas tripsina y carboxipeptidasa junto con las diferentes alícuotas preparadas en la etapa (b) e incubar la mezcla durante alrededor de 4 a 1 0 horas; (d) precipitar el producto de insulina deseado mediante la adición de regulador de pH de ácido cítrico y ZnC12; una molécula de insulina preparada y una molécula de insulina seleccionada del grupo que comprende insulina, lispro, aspart, glulisina o IN- 1 05.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS LISTADOS DE SECUENCIAS ACOMPAÑANTES SEQ ID 1 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Aspart.

SEQ ID 2 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Aspart.

SEQ ID 3 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Aspart.

SEQ ID 4 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Lispro.

SEQ ID 5 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Lispro.

SEQ ID 6 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Lispro.

SEQ ID 7 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Glulisina.

SEQ ID 8 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Glulisina.

SEQ ID 9 : Secuencia de aminoácidos de la molécula precursora Glulisina.

DESCRIPCION DETALLA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de compuestos de insulina y sus análogos o derivados a partir de sus precursores correspondientes representados por la fórmula: (Bl) (87) (B19) (B27) en donde, R es hidrógeno o un residuo de aminoácido química o enzimáticamente cortable o un péptido química o enzimáticamente cortable que comprende al menos dos residuos de aminoácido; Ri es OH o un residuo de aminoácido, o Y i -Y2 en el cual Y es un residuo de aminoácido; las porciones A l a A21 corresponden a la cadena de insulina A y las porciones B l a B27 corresponden a la cadena de insulina B incluyendo substitución, supresión y/o adiciones de aminoácidos de la misma; R2 es Z i -Z2 en donde Zi se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu o Z i -Z2-Z3 en donde Zi se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu y Z3 es treonina o una porción péptida de al menos tres residuos de aminoácido con la condición de que el aminoácido que corresponda a B30 sea treonina; X es un polipéptido que conecta la cadena A a la cadena B que puede ser cortado enzimáticamente sin interrumpir ya sea la cadena A o la cadena B que porta al menos dos aminoácidos en donde el primero y el último aminoácido son lisina o arginina.

El proceso comprende tratar el precursor con tripsina y carboxipeptidasa usados en forma combinatoria o concurrente siempre y cuando la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa sea de aproximadamente 5 : 1 a alrededor de 50: 1 .

En otra modalidad de la presente invención la molécula precursora respectiva comprende una secuencia de aminoácidos que sea al menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ IDs 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 y 9.

En otra modalidad de la presente invención la cantidad relativa de tripsina a aquella del precursor de insulina varía de aproximadamente 1 : 10 a alrededor de 1 : 500.

En otra modalidad más de la presente invención la cantidad relativa de tripsina a la de precursor de insulina es de aproximadamente 1 : 100.

En otra modalidad más de la presente invención la cantidad relativa de carboxipeptidasa a aquella del precursor de insulina es de alrededor de 1 : 500.

En otra modalidad más de la presente invención la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa es de alrededor de 5 : 1 a aproximadamente 50: 1 .

En aún otra modalidad preferida de la presente invención la relación de concentración relativa de tripsina carboxipeptidasa es aproximadamente 5 : 1 .

En otra modalidad más de la presente invención la concentración de tripsina usada para la reacción de conversión es de al menos 0.01 mg/ml .

En aún otra modalidad de la presente invención la concentración de carboxipeptidasa usada para la reacción de conversión es de al menos 0.001 mg/ml.

En aún otra modalidad de la presente invención el precursor está ya sea en forma líquida o de cristal.

En otra modalidad más de la presente invención la reacción de conversión se lleva a cabo a un pH de 6.5 a 1 0.

En aún otra modalidad de la presente invención la reacción de conversión se lleva a cabo a un pH de 7 a 9.

En otra modalidad más de la presente invención la reacción de conversión se lleva a cabo a una temperatura que varía de alrededor de 2°C a 40°C.

En otra modalidad más de la presente invención la duración de la reacción de conversión enzimática es de aproximadamente 2 a 24 horas.

En otra modalidad más de la presente invención el medio de reacción contiene al menos 30% de agua o un solvente miscible en agua.

En aún otra modalidad de la presente invención el solvente miscible en agua se selecciona del grupo que comprende metanol, étanol, acetona o N,N-dimetilformamida.

En aún otra modalidad de la presente invención el medio de reacción comprende además una sal que actúa como un agente regulador de pH.

En otra modalidad más de la presente invención la sal se selecciona del grupo que comprende TRIS, etilendiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (ácido N-2-hidroxi-etilpiperazin-N ' -2-etansulfónico) .

En otra modalidad más de la presente invención la concentración de sal usada en el medio de reacción es de aproximadamente 1 0 mM a 1 M.

En otra modalidad más de la presente invención la concentración de sal usada en el medio de reacción es de alrededor de 0.6M.

La presente invención se refiere a un proceso para obtener una insulina o su análogo o derivados de la misma a partir de contrapartes precursoras respectivas, que comprende llevar a cabo sucesivamente las siguientes etapas en el siguiente orden secuencial : (a) disolver una cantidad óptima del precursor de insulina o un derivado de insulina en una solución reguladora de pH; (b) preparar varias alícuotas de la solución precursora a escalas de pH de alrededor de 7.0 a 9.0; (c) introducir las enzimas tripsina y carboxipeptidasa concurrentemente a las diferentes alícuotas preparadas como en la etapa (b) e incubar la mezcla durante alrededor de 4- 10 horas; (d) precipitar el producto de insulina deseado mediante la adición de regulador de pH de ácido cítrico y ZnC12.

La presente invención se refiere a una molécula de insulina preparada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

La presente invención se refiere a una molécula de insulina preparada de acuerdo con cualquiera de: las reivindicaciones anteriores seleccionada del grupo que comprende insulina, lispro, aspart, glulisina o IN- 1 05.

Se hará referencia ahora en detalle a las modalidades actualmente preferidas de la invención las cuales, junto con el siguiente ej emplo, sirven para explicar los principios de la invención.

Al describir y reclamar la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones mostradas > en la presente.

A menos que se defina lo contrario aquí, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos de capacidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se refiera de otra manera por contexto, términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas descritas en la presente son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica.

Según se usa en la presente "aminoácido" se refiere a secuencias de péptidos o proteínas o porciones de las mismas. Los términos "proteína,", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente.

Aquí, el término "insulina" cubre insulina de cualquier especie tal como insulina porcina, insulina bovina, e insulina humana y complej os de las mismas tales como complejos con zinc incluyendo díméros y oligómeros, por ej emplo, hexámeros de los mismos. Además, e término "insulina" cubre en la presente los llamados "análogos de insulina". Un análogo de insulina es una molécula de insulina que tiene una o más mutaciones, sustituciones, supresiones y/o adiciones de las cadenas de aminoácidos A y/o B en relación a la molécula de insulina humana nativa. Más específicamente, uno o más de los residuos de aminoácido pueden haber sido intercambiados con otro residuo de aminoácido y/o uno o más residuos de aminoácido pueden haber sido suprimidos y/o uno o dos residuos de aminoácido pueden haber sido añadidos, con la condición de que el análogo de insulina tenga suficiente actividad de insulina. Los análogos de insulina son de preferencia tales en los que uno o más residuos de aminoácido de origen natural, de preferencia, uno, dos o tres de ellos, han sido sustituidos por otro residuo de aminoácido codificable. Ejemplos de análogos de insulina se describen en las siguientes patentes y equivalentes de las mismas: US 5 ,61 8 ,9 1 3, EP 254,5 1 6, EP 280,534, US 5 ,750,497 y US 6,01 1 ,007. Ej emplos de análogos de insulina específicos son insulina aspart (es decir, AspB28 insulina humana) e insulina lispro (es decir, LysB28.ProB29 insulina humana) e "insulina glulisina" (Lys . B(3 ), Glu B (29) insulina humana.

Otro aspecto de la invención se refiere a compuestos precursores de insulina representados por la siguiente fórmula: X (Al) (A6) (All) (A21J R- NH- Phe Cys Cys (Bl) (B7) {B19} (B27) en donde, R es hidrógeno o un residuo de aminoácido químico o enzimáticamente cortable o un péptido química o enzimáticamente cortable que comprende al menos dos residuos de aminoácido ; Ri es OH o un residuo de aminoácido, o Y 1 -Y2 en el cual Y es un residuo de aminoácido; Las porciones Ai a A2i corresponden a la cadena A de insulina y las porciones Bj a B27 corresponden a la cadena B de insulina incluyendo sustitución, supresión y/o adiciones de aminoácidos de las mismas; R2 es Zi-Z2 en donde Z se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o glu o Zj-Z2-Z3 en donde Zi se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu y Z3 es treonina o una porción péptida de al menos tres residuos de aminoácido con la condición de que el aminoácido que corresponda a B30 sea treonina; X es un polipéptido que conecta la cadena A a la cadena B que puede ser cortada enzimáticamente sin romper ya sea la cadena A o la cadena B que porta al menos dos aminoácidos, en donde el primero y el último aminoácido son lisina o arginina.

Uno de los aspectos de la presente invención se refiere específicamente a la molécula IN- 105. IN- 1 05 es una molécula de insulina conjugada en el aminoácido épsilon lisina en la posición B29 de la cadena B de insulina con un oligómero anfifílico de fórmula estructural CH30- (C4H20)3 -CH2-CH2-COOH. La molécula puede ser monoconjugada en A l , B l y B29, di-conjugada en varias combinaciones de A l , B l y B29, o triconjugada en varias combinaciones de A l , B l y B29.

En un aspecto, la molécula precursora de insulina aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos aproximadamente 8 1 % de identidad de secuencia de ácido nucleico, , como alternativa al menos alrededor de 82% de identidad de secuencia de ! ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 83 % de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 85 % de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 87% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 88 % de identidad de secuencia de ácido nucjeico, como alternativa al menos alrededor de 89% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 91 % de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 93 % de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 97% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico, y como alternativa al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una molécula de polipéptido como la representada por SEQ IDs 1 , 2, 3 , 4, 5 y 6.

La tripsina es una serina proteasa típica e hidroliza una proteína o un péptido en la terminal carboxilo de un residuo de arginina o lisina (Enzymes, pág. 261 -262( 1979), ed., Dixon, M. & Webb, E. C , Longman Group Ltd. , Londres). En particular, una hidrólisis fácil ocurre en un sitio dibásico en donde dos residuos de arginina o lisina sucesivos existen, y se sabe que la hidrólisis ocurre más fácilmente en donde el sitio dibásico se ubica en o cerca de una estructura de vuelta ß (Rholam, M. , et al . , FEB S Lett., 207, 1 -6( 1986) . The Enzyme vol . II, 3a edición, Editor Boyer, Acad. Press NY. Pp. 249-275 ). Particularmente, la tripsina corta enlaces péptidos en los residuos de arginina (Arg) o lisina (Lys) C-terminales. El corte tríptico de moléculas precursoras de insulina puede ocurrir en diferentes sitios de corte simultáneamente. Debido a que los muchos lados de corte dentro de una molécula precursora de insulina específica, muchos subproductos no deseados pueden formarse durante la reacción de corte tríptico.

La tripsina pancreática porcina recombinante tiene un peso molecular de aproximadamente 23 ,000 daltons y un óptimo de actividad enzimática a pH 8.0. La tripsina se usa en el proceso industrial de producir insulina y análogos de insulina. La producción de estas biomoléculas se describe en la literatura y varios enfoques han sido seleccionados.

La carboxipeptidasa B hidroliza de preferencia los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina de la posición C-tefminal de los polipéptidos. Carboxipeptidasa B es una exopeptidasa que cataliza una liberación hidrolítica de los residuos de aminoácidos básicos C-terminales de arginina y lisina a partir de péptidos y proteínas.

El término "C-péptido" o "péptido enlazador" según se usa en la presente incluye todas las formas de C-péptido de insulina, incluyendo péptidos nativos o sintéticos. Estos C-péptidos de insulina pueden ser péptidos humanos, o pueden provenir de otras especies y géneros de animales, de preferencia mamíferos. De esta manera variantes y modificaciones de C-péptido de insulina nativo se incluyen siempre y cuando conserven la actividad del C-péptido de insulina. Se sabe en la técnica modificar las secuencias de proteínas o péptidos, mientras se conserva su actividad útil y esto se puede lograr usando técnicas que sean estándares en la técnica y descritas ampliamente en la literatura, por ej emplo, mutagénesis aleatoria o dirigida a sitio, corte y ligación de ácidos nucleicos, etc. De esta manera, las variantes o derivados funcionalmente equivalentes de secuencias de C-péptido de insulina nativa se pueden preparar fácilmente de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica, e incluyen secuencias de péptidos que tienen una actividad funcional, por ej emplo, una actividad biológica, de un C-péptido de insulina nativo. Todos estos análogos, variantes, derivados o fragmentos de C-péptido de insulina están incluidos especialmente en el alcance de esta invención, y se incluyen en el término "un C-péptido de insulina".

Los principales requerimientos de un C-péptido son que sea de suficiente longitud para permitir la formación de un enlace de disulfuro entre las cadenas A y B y que puedan cortarse del precursor de insulina llevando a formación de insulina. Un dipéptido típico usado como un C-péptido es -Arg-Arg- . Los C-péptidos pueden ser de cualquier longitud que inicie con Arg o Lys y concluya con Arg o Lys.

La invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica para cualquiera de los genes descritos en la presente. Células hospederas que comprenden cualquiera de estos vectores también son provistas. A manera de ejemplo, las células hospederas pueden ser bacterianas, fúngicas o de mamífero.

La invención emplea una célula hospedera recombinante en la cual se produce al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico que expresa el precursor de compuesto de insulina. Un sistema de expresión recombinante se selecciona a partir de hospederos procarióticos y eucarióticos. Los hospederos eucarióticos incluyen células de levadura (por ej emplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris), células de mamífero o células vegetales. Las células bacterianas o eucarióticas están disponibles de un número de fuentes diferentes incluyendo fuentes comerciales conocidas por aquellos expertos en la técnica, por ej emplo, la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC; Rockville, Md). Fuentes comerciales de células usadas para expresión de proteínas recombinantes también proporcionan instrucciones para uso de las células. La elección del sistema de expresión depende de las características deseadas para el polipéptido expresado.

Muy preferiblemente en relación con aspectos de la presente invención, las células hospederas que más se prefieren son levaduras metilotróficas. Cepas de una levadura metilotrófica que pueden modificarse usando la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cepas de levadura capaces de crecer en metanol, tales como levaduras de los géneros Pichia, Candida, Hansenula o Torulopsis . Las levaduras metilotróficas que se prefieren son del género Pichia. Las cepas de levadura metilotróficas que pueden modificarse usando los presentes métodos incluyen también aquellas cepas de levadura metilotróficas que han sido manipuladas para expresar una o más proteínas de interés heterólogas. La célula hospedera que más se prefiere de acuerdo con el aspecto de la presente invención es Pichia pastoris es GS 1 1 5. ¡ La célula u organismo hospedero puede manipularse para expresar proteínas o péptidos recombinantes usando técnicas estándares. Por ej emplo, proteínas recombinantes pueden ser expresadas a partir de un vector o de un gen exógeno insertado en el genoma del hospedero .

Los vectores que pueden usarse para expresar proteínas exógenas se conocen bien en la técnica y se describen abajo. Los vectores preferidos de la presente invención que portan los genes de la molécula precursora de insulina incluyen pero no están limitados a pPIC9 .

El aspecto más significativo de la presente invención se refiere a un proceso para convertir compuestos de insulina y sus análogos o derivados de sus precursores correspondientes representados por la fórmula Gly Cy* Cys— Cys— Cys Asn— Rx (Al) (A6) (All) |A21) R- NH- Phe Cys cys {Bl} (B7) (B19) (B27) en donde, R es hidrógeno o un residuo de aminoácido química o enzimáticamente cortable o un péptido química o enzimáticamente cortable que comprende al menos dos residuos de aminoácido; Ri es OH o un residuo de aminoácido, o Yi-Y2 en el cual Y es un residuo de aminoácido; Las porciones Al a A21 corresponden a la cadena de insulina A de insulina y las porciones Bl a B27 corresponden a la cadena B de insulina incluyendo substitución, supresión y/o adición de aminoácidos de los mismos; R2 es Zi-Z2 en donde se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu o Zi-Z2-Z3 en donde se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu y Z3 es treonina o una porción péptida de al menos tres residuos de aminoácido con la condición de que el aminoácido que corresponda a B30 sea treonina; X es un polipéptido que conecta la cadena A a la cadena B que puede ser cortado enzimáticamente sin interrumpir ya sea la cadena A o la cadena B que porta al menos dos aminoácidos en donde el primero y el último aminoácido sean lisina o arginina; que comprende tratar al precursor con tripsina y carboxipeptidasa usados en forma combinatoria y concurrente siempre y cuando la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa sea de aproximadamente 5 : 1 a alrededor de 50 : 1 .

La molécula precursora puede estar ya sea en una forma líquida o de cristal.

El proceso, de conversión de la molécula precursora de insulina en su molécula de insulina correspondiente se lleva a cabo en un medio acuoso que comprende al menos aproximadamente 40% de agua, sin embargo, no impide la presencia de al menos alrededor de 30%, o alrededor de 50% o aproximadamente 60% o alrededor de 70% o aproximadamente 80% de agua y también la presencia de solventes miscibles en agua tales como metanol, etanol, acetona, ?,?-dimetilformamida y similares.

El medio de reacción puede comprender además cualquier sal con propiedades de regulación de pH. De preferencia, el medio de reacción comprende Tris como una sal en la concentración que varía de 10 mM a 1 M. Más preferiblemente la concentración de Tris usada en el medio de reacción es 0.6M.

La conversión se lleva a cabo en cualquiera de la amplia gama de temperaturas, generalmente de alrededor de 0°C a 40°C. De preferencia la reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 1 0°C a alrededor de 30°C y más preferiblemente alrededor de 1 5°C a aproximadamente 25 °C .

El pH de la mezcla de reacción puede variar en cualquier lado de alrededor de 2 a aproximadamente 12. Sin embargo, se obtienen los mejores resultados mediante un control cuidadoso del pH de tal manera que la reacción progrese a una escala de pH de alrededor de 6.5 a 10. Preferiblemente la reacción ocurre a una escala de pH de 7 a 9.5, de preferencia alrededor de 8 a 9 y cuando se controle en forma precisa a pH " 8.5.

El control de pH se controla mediante el uso de un agente regulador de pH. Cualquiera de la amplia gama de reguladores de pH adecuados usados incluyen TRIS, etilendiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (ácido N-2-hidroxi-etilpiperazin-N'-2-etansulfónico), y similares.

La cantidad de tripsina y carboxipeptidasa B que se usa generalmente está relacionada tanto entre las dos enzimas como con la cantidad de molécula precursora de insulina. Las enzimas pueden ser incorporadas en las mezclas de reacción ya sea en solución o usando técnicas reconocidas tales como inmovilización en un soporte adecuado y de esta manera poner a disposición en el medio de reacción.

Sobre una base de peso:peso, la tripsina estará presente generalmente en una cantidad relativa a aquella del precursor de insulina que varíe de aproximadamente 1:10 a alrededor de 1:500, de preferencia, de aproximadamente 1:10 a alrededor de 1:200, más preferiblemente de aproximadamente 1:10 a alrededor de 1:100 ó 1:10 a alrededor de 1:50 o aproximadamente 1 : 10 a alrededor de 1 : 25. La concentración que mas se prefiere de tripsina en relación con la concentración de insulina empleada es 1 : 100. La concentración de tripsina usada para la reacción de conversión es de al menos 0.01 mg/ml.

Sobre una base de peso :peso, la carboxipeptidasa B generalmente estará presente en una cantidad en relación a aquella del precursor de insulina que varía de alrededor de 1 : 500 o aproximadamente 3 : 500. La concentración más preferida de carboxipeptidasa en relación con la concentración de insulina empleada es 1 : 500. La concentración de carboxipeptidasa usada para la reacción de conversión es de al menos 0.001 mg/ml.

De acuerdo con otro parámetro significativo de la presente invención está la relación de la tripsina a carboxipeptidasa B en la mezcla de reacción. Generalmente, sobre una base de peso, la relación de tripsina a carboxipeptidasa B está en una escala de 5 : 1 a 50: 1 . De preferencia, sobre una base de peso, la relación de tripsina a carboxipeptidasa B es de alrededor de 50: 3 a aproximadamente 5 : 3. La relación que más se prefiere de tripsina carboxipeptidasa B es de aproximadamente 5 : 1 .

La relación de la reacción puede variar de alrededor de 2 a 48 horas, preferiblemente la duración de la reacción es de aproximadamente 2 a 24 horas .

En consecuencia, la presente invención que se refiere a un proceso para obtener una insulina o sus análogos o derivados de la misma a partir de sus contrapartes precursoras respectivas comprende llevar a cabo sucesivamente las siguientes etapas en un orden secuencial como el provisto a continuación: (a) disolver una cantidad óptima del precursor de insulina o un derivado de insulina en una solución reguladora de pH; (b) preparar varias alícuotas de la solución precursora a escalas de pH de alrededor de 7.0 a 9.0 ; (c) introducir las enzimas tripsina y carboxipeptidasa concurrentemente a las diferentes alícuotas preparadas como en la etapa (b) e incubar la mezcla durante alrededor de 4- 10 horas; (d) precipitar el producto de insulina deseado mediante la adición de regulador de pH de ácido cítrico y ZnC12.

La modalidad preferida de la invención se describe a continuación en las figuras y descripción de las modalidades preferidas. Aunque estas descripciones describen directamente las modalidades anteriores, se entiende que los expertos en la técnica pueden concebir modificaciones y/o variaciones a las modalidades específicas mostradas y descritas en la presente. Cualquiera de estas modificaciones o variaciones que estén dentro del alcance de esta descripción se intenta que estén incluidas aquí también. A menos que se indique específicamente, la intención del inventor es que las palabras y frases en la descripción y reivindicaciones se les den los significados ordinarios y comunes a aquellos expertos en las técnicas aplicables. La descripción de una modalidad preferida y el mejor modo de la invención conocido por el solicitante en el momento de presentar la solicitud se ha presentado y está diseñada con el motivo de ilustración y descripción únicamente. No se intenta que sea exhaustiva o que limite la invención a la forma precisa descrita, y son posibles muchas modificaciones y variaciones en vista de las enseñanzas anteriores. La modalidad se seleccionó y describió para de esta manera explicar mej or los principios de la invención y su aplicación práctica y para hacer posible que otros capacitados en la técnica utilicen mejor la invención en varias modalidades y con varias modificaciones que sean adecuadas al uso particular contemplado.

La invención se elabora más con la ayuda de los siguientes ej emplos. Sin embargo, estos ej emplos no deben considerarse que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLO 1A Precursor Aspart (Seq ID 1, 2 y 3) Precursor Aspart de la fórmula X-[aspart B cadena (B1-B30)]-Y-[Aspart A cadena (A1-A21)], en donde X es una secuencia péptida líder, la cadena B es la secuencia de la cadena Aspart B de B1-B30, Y es una secuencia de péptidos enlazadores entre la cadena B y la cadena A, la cadena A es la cadena A de Aspart. La secuencia puede estar libre de un péptido líder o de otro péptido líder (por ejemplo, EEAEAEAEPR o GAVR). El péptido enlazador Y puede ser cualquiera del ejemplo R, yRDADDR. 1 La secuencia precursora es representada por SEQ IDs 1 y 2. El precursor puede producirse mediante cualquier sistema de expresión adecuado tal como Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc.

El precursor Aspart fue clonado en cuadro con el péptido de señal Mat-alfa en vector de expresión de Pichia, pPIC9K. La cepa hospedera GS115 de Pichia pastoris se transfirió con el plásmido recombinante para obtener el clon que expresaba el precursor Aspart.

El precursor Aspart es secretado por Pichia pastoris en el medio de cultivo. El caldo se centrifuga y las células se separan del sobrenadante. Hay varias opciones disponibles para la captura del precursor incluyendo cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba. Para esta invención se usaron cromatografía de intercambio catiónico y HIC para capturar el precursor específico.

EJEMPLO IB Precursor Lispro (Seq ID 3, 4 y 5) Precursor Lispro de la fórmula X- [Li spro cadena (B l -B 30)] -Y-[Lispro A cadena (A 1 -A21 )], en donde X es una secuencia péptida líder, la cadena B es la secuencia de la cadena Lispro B de B 1 -B 30, Y es una secuencia de péptidos enlazadores entre la cadena B y la cadena A, la cadena A es la cadena A de Lispro. La secuencia puede estar libre de líder u otro péptido líder. El péptido enlazador Y puede ser cualquiera del ej emplo R o RDADDR. La secuencia precursora es representada por SEQ IDs 3 y 4. El precursor puede producirse mediante cualquier sistema de expresión adecuado tal como Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc.

El precursor Lispro fue clonado en cuadro con el péptido de señal Mat-alfa en vector de expresión Pichia, pPIC9 . La cepa hospedera GS 1 1 5 de Pichia pastoris se transformó con el plásmido recombinante para obtener un clon que expresaba al precursor Lispro .

El precursor Lispro es secretado por Pichia pastoris en el medio. El caldo se centrifuga y las células se separan del sobrenadante.

Hay varias opciones disponibles para la captura del precursor incluyendo cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba. Para esta invención se usó la cromatografía de intercambio catiónico y HIC para capturar el precursor específico.

EJEMPLO 1C Precursor Glulisina (Seq ID 5, 6 y 7) El precursor Glulisina de la fórmula X-[Glulisina B cadena (Bl-B30)]-Y-[Glulisina A cadena (A1-A21)], en donde X es una secuencia de péptidos líderes, la cadena B es la secuencia de la cadena de Glulisina de B1-B30, Y es una secuencia de péptidos enlazadores entre la cadena B y la cadena A, la cadena A es la cadena A de Glulisina. La secuencia puede estar libre del líder o de otro péptido líder. El péptido enlazador Y puede ser cualquiera del ejemplo R, o RDADDR. La secuencia precursora se representa por SEQ IDs 5 y 6. El precursor puede producirse mediante cualquier sistema de expresión adecuado tal como Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, células CHO, etc. El precursor Glulisina fue clonado en cuadro con el péptido de señal Mat-alfa en el vector de expresión de Pichia, pPIC9K. La cepa hospedera GS115 de Pichia pastoris se transformó con el plásmido recombinante para obtener el clon que expresaba el precursor Glulisina.

El precursor Glulisina es secretado por Pichia pastoris en el medio de cultivo . El caldo se centrifuga y las células se separan del sobrenadante. Hay varias opciones disponibles para l a captura del precursor incluyendo cromatografía de intercambio iónico y cromatografí a hidrófoba. P ara esta invención se usó cromatografía de intercambio catiónico y HIC para capturar el precursor específico .

Cristalización de los precursores El diferente precursor de compuesto de insulina capturado del caldo de fermentación medi ante el uso de una etapa de cromatografía de intercambio catiónico fue cri stalizado con el propósito de remoción y almacenamiento de color. La cri stalización se llevó a cabo de tal manera que la concentración de precursor al inicio de la cristalización fuera de alrededor de 2 a 20 g/L, preferiblemente 8 a 1 4 g/L. La cri stalización se llevó a cabo al añadir ZnC12 y fenol y luego ajustando el pH a entre 3 .0 y 8.0, de preferencia entre 3 .5 y 5.5. Puede añadirse fenol a 0. 1 a 0.5 % del volumen del fondo de elución C IEX. Una solución de ZnC12 al 4% puede añadirse a 3 a 1 5 % del volumen del fondo de elución CIEX. El pH puede ajustarse mediante el uso de cualquier álcali, de preferencia NaOH o TRIS. El proceso de cri stalización se puede llevar a cabo a una temperatura de entre 2 y 30°C y la suspensión se almacena durante ci erto ti empo de tal manera que lo s cristales se formen completamente. Lo s cristal es precursores pueden separarse del sobrenadante ya sea por centrifugación o decantado .

EJEMPLO 2A E j emplo de la cristalización del precursor Lispro Se tomaron 463 mi del fondo de elución (concentración de precursor 1 3.8 g/L) y se añadieron 2.3 1 5 mi de fenol (0.5% de volumen EP) después de la descongelación adecuada. Esto fue seguido por la adición de 57.875 mi de solución de ZnC12 al 4% ( 12.5% de volumen EP). El pH fue de 4.08 en esta etapa y se ajustó a 4.8 al añadir 420 mi de NaOH 2.5N. El licor madre se mantuvo bajo condiciones de agitación neta durante 1 5 minutos y luego se transfirió a una habitación fría (2-8 °C), en donde se mantuvo durante la noche. Luego la mezcla completa se centrifugó a 5 ,000 rpm durante 20 minutos en una centrífuga Beckman Coulter Avanti J-26 XP. La pérdida de sobrenadante fue de 1 .55 %.

EJEMPLO 2B E jemplo de cristalización del precursor Aspart Se tomaron 500 mi de fondo de elución (concentración de precursor 2.9 g/L) y se añadieron 0.625 mi de fenol (0. 125% de volumen EP) después de la descongelación adecuada. Esto fue seguido por la adición de 1 5.625 mi de solución de ZnC12 al 4% (3. 1 25%) de volumen EP). El pH fue de 4.08 en esta etapa y se ajustó a 4.8 al añadir 3 1 5 mi de NaOH 2.5N. El licor madre se mantuvo baj o condiciones de agitación lenta durante 15 minutos y luego se transfirió a una habitación fría (2-8 °C), en donde se mantuvo durante 5 horas. Luego el sobrenadante se separó por centrifugación. La pérdida de sobrenadante fue de 4%.

EJEMPLO 2C Ejemplo de cristalización del precursr Glulisina 250 mi de fondo de elución de la corrida de Sp sepharose de precursor Glulisina (concentración de precursor 3.8 g/L) se tomaron y 0.3 1 mi de fenol (0.125% de volumen EP) se añadieron después de un descongelado adecuado . Esto fue seguido por la adición de 7 mi de solución de ZnC12 al 4% (3% de volumen EP). El pH fue de 4. 1 3 en esta etapa y se ajustó a 4.9 al añadir NaOH 2.5N. El licor madre se mantuvo bajo condiciones de agitación lenta durante 30 minutos y luego se transfirió a una habitación fría (2-8 °C), en donde se mantuvo durante 5 horas. Luego el sobrenadante se separó por centrifugación. La pérdida de sobrenadante fue de 7%.

EJEMPLO 3A Reacciones enzimáticas Diferentes compuestos de insulina pueden prepararse a partir de su precursor correspondiente a través de una conversión enzimáti ca. La conversión directa a partir del precursor en el producto final puede obtenerse mediante la presencia de dos enzimas proteasa. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en dos formas diferentes. Primero el precursor tiene que ser tratado con tripsina o enzimas tipo tripsina de origen recombinante vegetal, animal o microbiano . Cuando la reacción de tripsina concluye el intermediario en las mismas mezclas de reacción se trata con la segunda enzima proteasa carboxipeptidasa B o enzima similar de origen recombinante vegetal, animal o microbiano. La carboxipeptidasa B puede actuar en el aminoácido básico en el extremo C-terminal . Como alternativa, las enzimas tripsina y carboxipeptidasa fueron añadidas en la mezcla de reacción como un coctel (juntas) y las réacciones se dej aron continuar hasta que ocurriera la formación óptima de producto correspondiente.

EJEMPLO 4A Cuando sólo se añadió tripsina a la mezcla de reacción de precursores individuales Se solubilizaron 2 gm de cristales de precursor Aspart, Lispro y Glulisina individuales con 5 mi de solución TRIS 6M. La concentración de producto de la mezcla de reacción individual se mantuvo como 3 -5 mg/ml. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8.5. Se añadió tripsina a la mezcla de reacción individual a una concentración de 50 µg/ml. Las reacciones se llevaron a cabo tanto a 4±0.5 °C como a la temperatura ambiente (24±0.5°C). Se observó que el perfil cromatográfico al final de la mezcla de reacción no cambiaba con respecto a la temperatura de reacción sino que el tiempo para la conclusión de la reacción se reduce al incrementarse la temperatura. La temperatura para las reacciones se mantuvo a 24±0.5°C. Las reacciones se continuaron durante 8 horas y al final de las 8 horas las muestras fueron analizadas.

De manera similar al precursor individual de Aspart, Lispro y Glulisina fueron solubilizados en solución Tris y 50% del solvente dimetil formamida a una concentración de 3-5 mg/ml. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8.5 y la temperatura de la mezcla de reacción se mantuvo a 24±0.5°C. Se añadió tripsina a la mezcla de reacción individual a una concentración de 50 µ§,/p?\.

Observación: El precursor Aspart ha sido convertido en B-30 Des-Treonina Aspart y Des-Octapéptido Insulina. El porcentaje de Des-treonina Aspart fue 45%, desoctapéptido insulina fue 36%. La formación de intermediario requerido, Aspart con residuo de arginina extra en la posición B31, es de alrededor de 10-14%. De esta manera incluso la 2a enzima carboxipeptidasa B puede ser añadida a la mezcla de reacción, rendimiento total para hacer el producto final sería de <10-15%.

Un perfil de producto similar se encontró cuando la reacción se llevó a cabo con 50% de solvente. Sin embargo la velocidad de la reacción es muy lenta en presencia de solvente. Para lograr el tipo similar de perfil la reacción tiene que continuar durante casi 1 8 horas.

De esta manera la generación de Aspart a partir del precursor correspondiente a través de la reacción de proteasa sucesiva no pudo ser posible. De eta manera se entendió que B -29Lys de Aspart es el sitio más potente para el corte con tripsina y al continuar la reacción, el sitio B-22Arg también se vuelve propenso al corte con tripsina y al final de la reacción obtenemos una población mixta de B-30 des treonina y des-octapéptido en cada precursor individual. El producto de corte en B -3 1 arginina es muy baj o en todo el producto precursor.

El precursor Lispro, baj o condiciones similares, se convirtió en producto Lispro con residuo de arginina adicional en la posición B3 1 junto con una alta cantidad de Des-octapéptido insulina. Un tipo similar de observación se encontró cuando el precursor Glulisina fue tratado con tripsina baj o condiciones idénticas. Sin embargo los perfiles cromatográficos de la mezcla de reacción no fueron limpios en absoluto en el caso de precursor Lispro y Glulisina. Esto sugiere que incluso el producto final, Lispro y Glulisina, puede hacerse a través de la reacción sucesiva con la 2a proteasa carboxipeptidasa B pero el rendimiento total sería muy deficiente.

La presencia de 50% de Di-metil formamida sólo reduce la velocidad de reacción en el caso de Lispro así como el precursor de Glulisina.

Para revisar el tipo similar de concepto de la reacción de tripsina se intentó al precursor IN- 105 el residuo B-29Lys cuando el precursor fue bloqueado en el precursor In- 105 por la molécula PEG de cadena corta así como con la molécula precursora no conjugada. Se observó que en el caso de precursor IN- 105 conjugado, la tripsina corta más preferentemente en el extremo C-terminal de residuo de arginina del 3 1 ° aminoácido para generar IN- 1 05 con un residuo de arginina adicional ¡ en el extremo C-terminal de la cadena B . Junto con la B-3 1 arginina IN- 105 Des Octa insulina también se genera en esta mezcla de reacción. Sin embargo cuando el precursor IN- 1 05 no conjugado fue tratado con tripsina, la proteasa corta preferentemente en el residuo de lisina B-29 del extremo C-terminal para generar Des-treonina insulina. El perfil cromatográfico al final de la reacción es igual tanto en presencia como en ausencia de cualquier solvente en la mezcla de reacción. Se observó que la presencia de solvente hace más lenta la velocidad de reacción.

EJEMPLOS 4B En la siguiente fase de las condiciones experimentales, las reacciones se llevaron a cabo al añadir tripsina y carboxipeptidasa B juntos en una mezcla de reacción precursora individual .

La concentración del precursor fue generalmente alrededor de 5 a 50 g/L. La reacción se llevó a cabo a un pH de alrededor de 5 a 12, de preferencia a un pH de alrededor de 8 a 1 0. La temperatura de la reacción fue de alrededor de 0-40°C, preferiblemente alrededor de 2-25 °C. Trishidroxilmetilaminometano (TRIS) u otros sistemas reguladores de pH se usaron a diferentes concentraciones iónicas para mantener el pH requerido. El tiempo de reacción fue variable y fue afectado por otras condiciones de reacción. La reacción se continuó hasta que la pureza del producto empezara a reducirse debido a la hidrólisis del producto. Tarda aproximadamente 30 minutos a 24 horas y en la mayoría de los casos alrededor de 4 a 1 0 horas.

La concentración de enzimas se determinó dependiendo de la concentración de substratos y actividad enzimática. Por ej emplo, la tripsina cristalina disponible en el mercado se usó de preferencia a una concentración de alrededor de 1 0 a 1 00 mg/L.

EJEMPLO 4B (I) Se disolvieron 4 g del cristal de precursor Aspart en 20 mi de solución de TRIS 1 M. La concentración de producto de la solución se mantuvo a 5 mg/ml y la concentración de TRIS se mantuvo en 0.6M al añadir. Alícuotas de ciertas cantidades se tomaron al ajustar el pH de la mezcla de reacción por NaOH 2.5N o ácido acético glacial 2N. Alícuotas de la mezcla de reacción a pH 7.0, 7.5 , 8.0, 8.5 , 9.0 fueron preparadas. De esta mezcla de reacción se tomó 1 mi en cada tubo como una mezcla de reacción individual a diferentes condiciones. La reacción se llevó a cabo en todas las muestras al añadir tripsina y carboxipeptidasa B juntas a diferentes concentraciones. Los diferentes parámetros variados son tabulados.

Parámetros constantes: • Concentración de producto 5 g/L • Concentración de regulador de pH TRIS 0.6M Parámetros variados : ! • Concentración de tripsina: 25-500 mg/L • Concentración de carboxipeptidasa: 1 0-30 mg/L • pH : 7.0-9.0.

Concentración Rendimiento Concentración Concentración de Concentración de Tris (%)¡ de tripsina carboxipeptidasa pH de precursor mg/L B (mg/L) (g L) (M) 7.0 53 10 8.0 66 ; 9.0 17.5 500 7.0 54 30 8.0 64 9.0 16 7.0 51 10 8.0 59 9.0 24 7.0 28 ' 200 30 8.0 65 5 9.0 64 0.6 7.5 44 10 8.0 68 | 8.5 75 7.5 45 50 30 8.0 63 8.5 66 7.5 31 10 8.0 49 25 8.5 61 7.5 31 : 30 8.0 49 8.5 62 Re sultado s : Se observó que cuando tripsina y carboxipeptidasa fueron añadidas en la mezcla de reacción, tanto la forma Des octapéptido como la formación des-treonina no se observaron. Al final de la reacción Aspart es el principal producto de la reacción. La pureza y el rendimiento del Aspart generado varían en condiciones de reacción individuales. El mej or rendimiento de 75% de Aspart se observó bajo una concentración de tripsina de 50 mg/L, concentración de carboxipeptidasa de 10 mg/L y un pH de 8.5.

EJEMPLO 4B (II) Se disolvieron 5 mg del cristal precursor Lispro en 25 mi de solución TRIS 1 M. La concentración de producto de la solución se mantuvo a 5 mg/ml y la concentración de TRIS se mantuvo en 0.6M al añadir. Alícuotas de ciertas cantidades se tomaron al ajustar el pH de la mezcla de reacción en NaOH 2.5N o ácido acético glacial 2N. Alícuotas de la mezcla de reacción a pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 se prepararon. De esta mezcla de reacción se tomó 1 mi cada uno en cada tubo de ensayo y se marcó como muestra A, B , C, etc. La reacción se llevó a cabo en todas las muestras al añadir tripsina y carboxipeptidasa B juntas a diferentes concentraciones. Las diferentes concentraciones son tabuladas.

Parámetros constantes: • Concentración de producto 5 g/L • Concentración de regulador de pH TRIS 0.6M Parámetros variados: • Concentración de tripsina: 25-200 mg/L • Concentración de carboxipeptidasa: 1 0-30 mg/L • pH : 7.0-9.0.

Concentración Rendimiento Concentración Concentración de (%) de precursor Concentración de tripsina carboxipeptidas (g L) de Tris(M) mg/L a B (mg/L) pH 7.0 33 7.5 49 10 8.0 62 8.5 65 9.0 29 200 7.0 52 7.5 55 30 8.0 61 8.5 64 9.0 26 7.0 1 1 7.5 34 10 8.0 55 8.5 59 9.0 31 100 7.0 24 7.5 41 30 8.0 54 8.5 66 5 0.6 9.0 34 7.0 21 7.5 46 10 8.0 66 8.5 78 9.0 62 50 7.0 38 7.5 55 30 8.0 64 8.5 71 9.0 65 7.0 13 7.5 25 10 8.0 41 8.5 44 25 9.0 51 7.0 22 7.5 25 30 8.0 33 8.5 46 9.0 55 Resultados : Se observó que cuando tripsina y carboxipeptidasa fueron añadidas juntas en la mezcla de reacción, tanto la forma Des octapéptido como la formación de des-treonina no se observaron. El mej or rendimiento de 78 % de Lispro se observó bajo una concentración de tripsina de 50 fng/L, concentración de carboxipeptidasa de 10 mg/L y un pH de 8.5.

EJEMPLO 4B (III) Se disolvieron 5 g del cristal precursor de Glulisina en 25 mi de solución de TRIS 1 M. La concentración de producto en la solución se mantuvo en 5 mg/ml y la concentración de TRIS se mantuvo en 0.6M al añadir. Alícuotas de ciertas cantidades se tomaron al ajustar el pH de la I mezcla de reacción a NaOH 2.5N o ácido acético glacial 2N. Alícuotas de la mezcla de reacción a pH 7.0, 7.5 , 8.0, 8.5 , 9.0 fueron preparados. De esta mezcla de reacción se tomaron 1 mi cada uno en cada tubo de ensayo y se marcaron como la muestra A, B , C, etc. La reacción se llevó a cabo en todas las muestras al añadir tripsina y carboxipeptidasa B juntas á diferentes concentraciones . Las diferentes condiciones son tabuladas.

Parámetros constantes: • Concentración de producto 5 g7L • Concentración de regulador de pH TRIS 0.6M Parámetros vari ados : • Concentración de tripsina: 25-200 mg/L • Concentración de carboxipeptidasa: 1 0-30 • pH : 7.0-9.0.

Concentración Rendi-miento Concentración Concentración de % de precursor Concentración de Tripsina carboxipeptidas (R/L) de Tris(M) mg/L a B (mg/L) pH 7.0 29 5 7.5 56 10 8.0 49 8.5 61 9.0 49 200 7.0 44 7.5 59 30 8.0 42 8.5 29 9.0 21 7.0 25 7.5 33 0.6 10 8.0 47 8.5 61 9.0 64 100 7.0 ,41 7.5 62 30 8.0 65 8.5 71 9.0 49 7.0 28 7.5 46 10 8.0 68 8.5 78 9.0 70 50 7.0 36 7.5 44 30 8.0 59 8.5 69 9.0 72. 7.0 14 7.5 29 10 8.0 35 8.5 49 25 9.0 51 7.0 24 7.5 35 30 8.0 44 : 8.5 64 9.0 68 Resultados : El mejor rendimiento de 78% de Glulisina se observó bajo una concentración de tripsina de 50 mg/L, concentración de carboxipeptidasa de 1 0 mg/L y a pH 8.5.

EJEMPLO 5 Precipitación final Las mejores condiciones explicadas arriba para las reacciones enzimáticas para el precursor correspondiente de Lispro, Aspart y Glulisina fueron llevadas a cabo.

La mezcla de reacción de enzima final individual se precipitó al añadir regulador de pH de ácido cítrico y solución de ZnC12, y ajustando el pH . (El regulador de pH de ácido cítri co comprende 1 5.4 g/L de ácido cítrico (anhidro), 90 g/L de regulador de pH de ortofosfato di-sódico (anhidro), pH ajustádo a 6.3 +0. 1 , con ácido o-fosfórico) . La precipitación se llevó a cabo a una escala de pH de 4.0 a 10.0, preferiblemente 6.0 á 8.0. La concentración de producto fue preferiblemente de 1 - 1 0 g/L. Después de. , la precipitación el producto se separó del sobrenadante transparente ya sea por centrifugación o decantado del sobrenadante sin alterar el precipitado sedimentado . El precipitado obtenido de esta manera se lavó y se enfrió con agua para remover los iones no ligados presentes.

El rendimiento del proceso de precipitación es de 85 -90%.

La anterior descripción y ej emplos han sido dados para facilidad de entendimiento únicamente. No se deben entender limitaciones innecesarias de la misma, toda vez que las modificaciones son obvias para aquellos expertos en la técnica quienes reconocerán que la invención puede llevarse a la práctica con modificaciones y variaciones dentro del espíritu de las reivindicaciones anexas .

Las modalidades reportadas en la presente superan los problemas que se delinearon arriba y avance de la técnica al proporcionar un método de reacción que inhibe la pérdida de producto y tiene facilidad de operación en relación con otros métodos conocidos. Este sistema reduce los costos al usar metodologías descritas para lograr una eficiencia de conversión incrementada dada en relación a cualquier proceso conocido, superando así grandes desventaj as conocidas en este dominio de técnica.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1 . Un proceso para convertir compuestos de insulina y sus análogos o derivados a partir de sus precursores de insulina correspondientes representados por la fórmula: (Bl) (B7} (B19) {B27} en donde, R es hidrógeno o un residuo de aminoácido química o enzimáticamente cortable o un péptido química o enzimáticamente cortable que comprende al menos dos residuos de aminoácido; Ri es OH o un residuo de aminoácido, o Y i -Y2 en el cual Y es un residuo de aminoácido: las porciones A l a A21 corresponden a la cadena A de insulina y las porciones B l a B27 corresponden a la cadena B de insulina incluyendo sustitución, supresión y/o adiciones de aminoácidos de los mismos; R2 es Z 1 -Z2 en donde Z i se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu o Z i -Z2-Z3 en donde Zi se selecciona de Pro, Lys, Asp y Z2 se selecciona de Lys o Pro o Glu y Z3 es treonina o una porción péptida de al menos tres residuos de aminoácido con la condición de que el aminoácido que corresponda a B 30 sea treonina; X es un polipéptido que conecta la cadena A con la cadena B que pueden cortarse enzimáticamente sin romper ya sea la cadena A o la cadena B que porta al menos dos aminoácidos, en donde el primero y el último aminoácidos son Usina o arginina, los precursores se definen por una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % homologa a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ IDs 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 y 9, caracterizado porque comprende tratar el precursor con tripsina y carboxipeptidasa usadas de manera combinatoria y proporcionadas en forma concurrente de tal manera qtie la rel ación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa sea de aproximadamente 5 : 1 a alrededor de 50: 1 para proporcionar el compuesto de insulina correspondiente con un rendimiento de por lo menos 75%.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad relativa de tripsina con aquella del precursor de insulina varía de aproximadamente 1:10 a alrededor de 1:500.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad relativa de tripsina en comparación con aquella del precursor de insulina es de alrededor de 1:100.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad relativa de carboxipeptidasa en relación con la del precursor de insulina es de alrededor de 1:500.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa es de alrededor de 10:1.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la relación de concentración relativa de tripsina a carboxipeptidasa es de alrededor de 5:1.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la concentración de tripsina usada para la reacción de conversión es de al menos 0.01 mg/ml .

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la concentración de carboxipeptidasa usada para la reacción de conversión es de al menos 0.001 mg/ml .

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el precursor está ya sea en forma líquida o de cristal.

1 0. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de conversión se lleva a cabo a un pH de 6.5 a 10.

1 1 . El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de conversión se lleva a cabo a un pH de 7 a 9.

12. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la reacción de conversión se lleva a cabo á una temperatura que varía de alrededor de 2°C a 40°C.

1 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la duración de la reacción de conversión enzimática es de alrededor de 2 a 24 horas.

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el medio de reacción contiene por lo menos 30% de agua o un solvente miscible en agua.

1 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 5, caracterizado porque el solvente miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en metanol, etanol, acetona o N,N-dimetilformamida.

1 6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 5, caracterizado porque el medio de reacción comprende además una sal que actúa como un agente regulador de pH.

1 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 6, caracterizado porque la sal se selecciona del grupo que comprende TRIS, etilendiamina, trietanolamina, glicina, HEPES (ácido ?-2-hidroxi-etilpiperazin-N ' -2-etansulfónico).

1 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 6, caracterizado porque la concentración de sal usada en el medio de reacción es alrededor de 10 mM a 1 M.

1 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 8, caracterizado porque l a concentración de sal usada en el medio de reacción es de alrededor de 0.6M.

20. Un proceso para obtener una insulina o su análogo o derivados de la misma a partir de sus contrapartes precursoras respectivas, los precursores se definen por una secuenci a de aminoácidos que es al menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en S EQ IDs 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 y 9, caracterizado porque comprende llevar a cabo sucesivamente las siguientes etapas en el siguiente orden secuencial : (a) di solver una cantidad ópti ca del precursor de insulina o un derivado de insulina en una solución reguladora de pH ; (b) preparar varia's alícuotas de la solución precursora a escalas de pH de alrededor de 7.0 a 9.0; (c) introducir las enzimas tripsina y carbxipeptidasa juntas a una . relación de concentración relativa de alrededor de 5 : 1 a alrededor de 50 : 1 a las diferentes alícuotas preparadas en la etapa (b) e incubar la mezcla durante alrededor de 4- 1 0 horas; (d) precipitar el producto de insulina deseado por la adición de pH de ácido cítrico y ZnC12.