CN108164594B - 一种去b链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法 - Google Patents
一种去b链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法,包括:对胰岛素前体使用胰蛋白酶进行酶切;将二价金属离子加入到酶切后的反应体系中;调节反应体系的pH值至反应产物的等电点附近;收集获得的沉淀,酶切条件为30℃,1~2h,二价金属离子为具有水溶性的二价金属离子,包括Ni2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Mn2+,二价金属离子与胰岛素前体的摩尔比为0.5:1~4:1,pH为4.0~6.0,沉淀温度为0~30℃,沉淀时间为0~12h。使用本发明所提供的方法,不需要对酶切的反应体系进行处理,直接进行等电点沉淀,简化了生产工艺。相比目前已有的报道,上清液中产物残留率可以降低10倍以上,优势明显。
Description
技术领域
本发明属于重组人胰岛素的制备领域,具体涉及一种胰岛素前体沉淀的回收方法。
背景技术
胰岛素及其类似物是治疗糖尿病最直接和最有效的药物,尤其是对I型和II型晚期糖尿病患者。目前仍然没有替代的药物,开发安全有效、使用方便的胰岛素及新型类似物一直是生物药物开发的一个热点。而随着生物技术的发展,采用重组技术生产的胰岛素已逐渐取代原有的动物提取胰岛素。重组胰岛素的生产过程一般是先通过微生物如大肠杆菌或酵母菌等表达胰岛素原,然后通过胰蛋白酶或赖氨酰内切酶酶切获得去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体(DesB30胰岛素)固体粉末,最后通过对此前体的修饰等反应获得不同的胰岛素衍生物。例如通过对此前体进行转肽反应等工艺可以获得重组人胰岛素;对此前体进行脂肪酸侧链的修饰可以获得长效的地特胰岛素和德谷胰岛素。因此如何提高DesB30胰岛素的收率对于提高重组胰岛素的产率至关重要。
针对酶切过程的优化已经有较多报道。CN105111304A公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法,该发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清液用阳离子层析柱进行纯化,在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤,更快速的进行目的蛋白的洗脱,缩短洗脱时间,减少目的蛋白沉淀,同时减少洗脱样品体积,在洗脱时采用pH值7.0~9.0的洗脱液进行洗脱,洗脱后的产物不需进行换相操作,直接加入胰蛋白酶进行酶切转换,酶切转换效率在95%以上,简化了生产工艺,节约了成本,然而由于酶切体系中含有较多的酶以及发酵杂质等,后续一般通过利用等电点沉淀回收的原理从酶切后的反应体系中回收酶切产物DesB30,由于各厂商胰岛素原的纯化方式不一样,导致酶切体系中的物质也千差万别,采用等电点沉淀并不能使DesB30完全沉淀下来,仍会有部分DesB30存在上清液中,导致工艺收率损失较大。
刘海峰(《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》,华东理工大学,2014)证实了胰岛素前体单链蛋白上的三个酶切位点在酶切时存在先后顺序,胰蛋白酶首先将胰岛素前体的间隔肽片断迅速去除,生成单链胰岛素前体,随后,单链胰岛素前体在连接肽AAK的后面被进一步酶切,生成双链胰岛素前体,最后,该双链产物再经一次酶切去除连接肽,生成了Des B30胰岛素。这三步的酶切速率差别很大,第一步酶切速率很快,第二步相对较慢,第三步则不能完全反应,即使过夜酶切还有近20%的双链胰岛素前体无法转变为Des B30胰岛素。胰岛素前体形成的聚体空间结构是造成DesB30收率不能进一步提高的原因,论文中在有机溶剂乙腈的存在下进行酶切,酶切后直接采用等电点沉淀,难以将DesB30沉淀出来,其采用先高温旋转蒸发出乙腈再等电点沉淀,仍有6.3%的产物无法回收,而且高温下旋转蒸发会有明显的降解产物出现影响后续的工艺步骤。
综上所述,目前尚缺乏有效的方法来提高DesB30胰岛素的收率。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本发明提供了一种胰岛素前体沉淀的回收方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法,包括:
(1)对胰岛素前体使用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行酶切;
(2)将二价金属离子加入到步骤(1)酶切后的反应体系中;
(3)调节反应体系的pH值至反应产物的等电点附近;
(4)收集步骤(3)获得的沉淀。
优选地,步骤(1)所述的酶切条件为30℃,1~30h。
优选地,步骤(2)所述的二价金属离子为具有水溶性的二价金属离子,包括Ni2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Mn2+。
进一步优选地,所述的二价金属离子为Cu2+和Fe2+中的一种或两种。
优选地,所述的二价金属离子与胰岛素前体的摩尔比为(0.5~4):1。
进一步优选地,所述的二价金属离子与胰岛素前体的摩尔比优选为4:1、3:1和2:1中的一种。
优选地,步骤(3)所述的pH为4.0~6.0。
进一步优选地,步骤(3)所述的pH为4.4~4.8。
优选地,步骤(4)所述的沉淀温度为0~30℃。,优选的为0~20℃。摄氏度,更优的为2~10摄氏度。
进一步优选地,步骤(4)所述的沉淀温度为0~20℃。
更进一步优选地,步骤(4)所述的沉淀温度为2~10℃。
优选地,步骤(4)所述的沉淀时间为0~12h,优选的为0~4h,更优的为0~1h。
进一步优选地,步骤(4)所述的沉淀时间为0~4h。
更进一步优选地,步骤(4)所述的沉淀时间为0~1h。
与现有技术先调pH再加入金属离子不同,本发明先加入金属离子后再调节pH值,可以保证沉淀体系的pH值为最佳。而先调pH再加入金属离子,由于金属离子本身溶解后会对pH值有影响,因此可能导致加入金属离子后的pH值不是最佳pH值,影响沉淀效率。在进行相同样品的不同的沉淀体系(如含有机溶剂和不含有机溶剂或者含缓冲盐等)试验时,后调pH可以实现较稳定的沉淀残留率,而后加入金属离子对pH值影响差异更大,可能导致沉淀率虽然有提升,但针对不同的体系波动较大。
本发明的有益效果
1.本发明提高了DesB30的沉淀效率,相比对照例可以将上清液中产物残留率最大降低36倍,大大提高了产物的收率。相比目前已有的报道,上清液中产物残留率可以降低10倍以上,具有明显的优势;
2.本法明不需要对酶切的反应体系进行处理,直接进行等电点沉淀,简化了生产工艺。
附图说明
图1为实施例2的不添加金属离子沉淀DesB30前后的HPLC对比图;
图2为实施例3的4:1摩尔比加入Fe2+沉淀DesB30前后的HPLC对比图;
图3为实施例4的4:1摩尔比加入Cu2+沉淀DesB30前后的HPLC对比图;
图4为实施例11在有机溶剂纯在的情况下,按照金属离子:DesB30的摩尔比为4:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素的HPLC对比图;
图5为实施例13和14的不同方式沉淀DesB30胰岛素进行德谷胰岛素制备的HPLC对比图;
图6为实施例15的不同pH值对沉淀效率影响的HPLC对比图;
图7为实施例16的不同沉淀时间对沉淀效率影响的HPLC对比图。
具体实施方式
实施例1
本实施例制备了沉淀前的DesB30酶切反应体系。发酵上清的制备参考《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》,刘海峰,华东理工大学,博士学位论文(2013)。发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍,称取适量柠檬酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。
离子层析纯化采用CM SepharoseFF(XK26/200,50ml)在层析工作站上进行。
平衡液为20mmol/L柠檬酸+0.01mol/L NaCl。
洗涤液A为20mmol/L柠檬酸+0.1mol/L NaCl。
洗涤液B为5mmol/L盐酸,洗脱液为0.1mol/L碳酸氢铵缓冲液。
除洗脱液外,所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0,洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至8.0,保持柱子温度为20~25℃。纯化过程体积流速范围为4~16ml/min,最优流速为12ml/min,检测波长为280nm。
具体步骤为:
(1)采用平衡液平衡柱子4CV(CV是ColumnVolume的缩写,为纯化柱柱床体积);
(2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样,上样结束继续采用平衡液平衡4CV;
(3)采用洗涤液A洗涤4CV,收集洗涤峰;
(4)采用洗涤液B洗涤4CV;
(5)采用洗脱液进行洗脱,收集目的蛋白洗脱峰;
(6)称取胰蛋白酶,按照目的蛋白:胰蛋白酶为200:1的比例加入洗脱峰中混匀,30℃酶切1.5小时。
实施例2
不添加金属离子沉淀DesB30胰岛素。
沉淀前的DesB30酶切反应体系参照实施例1制备,HPLC检测上清中DesB30的浓度为3.20g/L。将酶切后的反应体系用盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.69g/L,上清中的DesB30胰岛素残留率为21.56%。图1为本实施例不添加金属离子沉淀DesB30前后的HPLC对比图。
实施例3
按照金属离子:DesB30的摩尔比为4:1添加Fe2+沉淀DesB30胰岛素。
参照实施例1的制备方法,取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入11.23ml0.2mol/L的FeSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.29g/L,上清中的DesB30胰岛素残留率为9.06%,相比未添加金属离子,上清中DesB30胰岛素残留率降低2.4倍。图2为本实施例沉淀DesB30前后的HPLC对比图。
实施例4
按照金属离子:DesB30的摩尔比为4:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
参照实施例1的制备方法,取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入11.23ml0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量。HPLC未检出DesB30胰岛素残留。图3为本实施例沉淀DesB30前后的HPLC对比图。
实施例5
按照金属离子:DesB30的摩尔比为3:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
参照实施例1的制备方法,取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入8.4ml0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.016g/L。上清中的DesB30胰岛素残留率为0.5%,相比未添加金属离子,上清中DesB30胰岛素残留率降低43倍。
实施例6
按照金属离子:DesB30的摩尔比为2:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
参照实施例1的制备方法,取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入5.6ml0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.019g/L。上清中的DesB30胰岛素残留率为0.59%,相比未添加金属离子,上清中DesB30胰岛素残留率降低36倍。
实施例7
按照金属离子:DesB30的摩尔比为1:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
参照实施例1的制备方法,取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入2.8ml0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.068g/L。上清中的DesB30胰岛素残留率为2.1%,相比未添加金属离子,上清中DesB30胰岛素残留率降低10倍。
实施例8
本实施例制备了含乙腈的DesB30酶切反应体系。
实验样品为发酵胰岛素前体经CM-Sepharose FF离子交换层析和C18反相层析后得到的冻干粉末,用30%乙腈把胰岛素前体蛋白粉末配制成2.0mg/ml的溶液。按胰蛋白酶与胰岛素前体为1:200(W/W)的比例,加入胰蛋白酶,混匀。分别在酶切0.0h(加酶混匀后立即取样)、0.25h、0.5h、1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、8.0h和24.0h取样。不同酶切时间样品取样后,立刻加入2倍体积的1.0mol/L乙酸终止酶反应,并标记酶切时间。
C18反相层析条件为:流动相A为0.1%TFA,流动相B为0.1%TFA+100%乙腈,超声脱气20min,进样量20ul,流速1.0ml/min,15%B平衡,线性梯度洗脱程序为0~20min,15~50%(B),酶切样品进行HPLC检测。
实施例9
本实施例通过旋转蒸发去除有机溶剂,再等电点调沉后,上清中的DesB30胰岛素残留率为6.3%。
实施例10
本实施例在有机溶剂存在的情况下,按照金属离子:DesB30的摩尔比为4:1添加Ni2+沉淀DesB30胰岛素。
含乙腈的DesB30酶切反应体系制备方法和实施例6相同,HPLC检测上清中DesB30的浓度为4.95g/L。取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入11.23ml 0.2mol/L的NiSO4水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.187g/L。上清中的DesB30胰岛素残留率为3.78%,与实施例7相比,在添加金属离子的情况下,上清中DesB30胰岛素残留率降低1.67倍。
实施例11
在有机溶剂纯在的情况下,按照金属离子:DesB30的摩尔比为4:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
含乙腈的DesB30酶切反应体系制备方法和实施例6相同,HPLC检测上清中DesB30的浓度为4.95g/L。取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入11.23ml 0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.024g/L。上清中的DesB30胰岛素残留率为0.48%,与实施例7相比,在添加金属离子的情况下,上清中DesB30胰岛素残留率降低13倍。图4为本实施例沉淀前后DesB30胰岛素的HPLC对比图。
实施例12
在有机溶剂纯在的情况下,按照金属离子:DesB30的摩尔比为1:1添加Cu2+沉淀DesB30胰岛素。
含乙腈的DesB30酶切反应体系制备方法和实施例6相同,HPLC检测上清中DesB30的浓度为4.95g/L。取1L沉淀前的DesB30酶切反应体系,加入2.8ml 0.2mol/L的CuSO4·7H2O水溶液,搅拌均匀后用6M盐酸调节pH至4.5,4℃沉淀1h后,取2.12%,与实施例6相比,在添加金属离子的情况下,上清中DesB30胰岛素残留率降低3倍。
表1实施例中各金属离子对沉淀DesB30胰岛素的影响
实施例13
本实施例为不添加金属离子沉淀回收的DesB30胰岛素进行德谷胰岛素制备。
将实施例2中的沉淀离心获得DesB30胰岛素固体,真空干燥后用以德谷胰岛素制备。
将DesB30胰岛素固体约0.087mmol溶解于50ml的0.1M的Na2CO3溶液(pH10.2)中,然后加入45ml乙腈,磁力搅拌均匀,用NaOH调节pH至11。将0.105mol的十六烷二酰基-Glu(OSu)溶解于5ml乙腈中,然后在10~20℃加入到上述溶液中,反应1h。反应结束后取200ul样品加入800ul水稀释后,通过HPLC进行检测分析,德谷胰岛素的浓度为3.03g/L。
实施例14
添加Cu离子沉淀回收的DesB30胰岛素进行德谷胰岛素制备。
将实施例4中的沉淀离心获得DesB30胰岛素固体,真空干燥后用以德谷胰岛素制备。
将获得的DesB30胰岛素固体约0.087mmol溶解于50ml的0.1M的Na2CO3溶液(pH10.2)中,然后加入45ml乙腈,磁力搅拌均匀,用NaOH调节pH至11。将0.105mol的十六烷二酰基-Glu(OSu)溶解于5ml乙腈中,然后再10~20℃加入到上述溶液中,反应1h。反应结束后取200ul样品加入800ul水稀释后,通过HPLC进行检测分析,德谷胰岛素的浓度为3.12g/L。与实施例11相比,金属离子沉淀DesB30胰岛素对德谷胰岛素制备无影响。图5为实施例13和本实施例的不同方式沉淀DesB30胰岛素进行德谷胰岛素制备的HPLC对比图。
实施例15
本实施例比较了未加金属离子时,不同pH值对沉淀效率的影响。
沉淀前的DesB30酶切反应体系参照实施例1制备,HPLC检测上清中DesB30的浓度为3.36g/L。将酶切后的反应体系用盐酸调节pH至4.4、4.6、4.8、5.0 4℃沉淀20h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.72g/L、0.68g/L、0.83g/L、1.17g/L,上清中的DesB30胰岛素残留率为21.43%、20.24%、24.70%和34.82%。图6为本实施例的不同pH值对沉淀效率影响的HPLC对比图。
实施例16
本实施例比较了未加金属离子时,不同沉淀时间对沉淀效率的影响。
沉淀前的DesB30酶切反应体系参照实施例1制备,HPLC检测上清中DesB30的浓度为3.36g/L。将酶切后的反应体系用盐酸调节pH至4.64℃沉淀1h、10h、20h后,取上清液HPLC检测上清液中DesB30的含量为0.73g/L、0.72g/L、0.68g/L,上清中的DesB30胰岛素残留率为21.73%、21.43%、20.24%。图7为本实施例的不同沉淀时间对沉淀效率影响的HPLC对比图。
Claims (3)
1.一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法,包括:
(1)对胰岛素前体使用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行酶切;
(2)将二价金属离子加入到步骤(1)酶切后的反应体系中;
(3)调节反应体系的pH值至反应产物的等电点附近;
(4)收集步骤(3)获得的沉淀;
所述的二价金属离子为Cu2+和Fe2+中的一种或两种;
所述的二价金属离子与胰岛素前体的摩尔比为4:1或3:1;
步骤(3)所述的pH为4.4~4.8;
步骤(4)所述的沉淀时间为0~12h。
2.根据权利要求1所述的去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法,其特征在于,步骤(1)所述的酶切条件为30℃,1~30h。
3.根据权利要求1所述的去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法,其特征在于,步骤(4)所述的沉淀温度为0~30℃。
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