CN114457063A - 一种降解花生中黄曲霉毒素b1的固定化酶制备方法 - Google Patents

一种降解花生中黄曲霉毒素b1的固定化酶制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，属于黄曲霉毒素B1降解技术领域。包括如下步骤：将氯化铁和氯化亚铁进行混合，添加氨水或氢氧化钠作为沉淀剂，使Fe3+和Fe2+以水合氧化物或氢氧化物的形式生成沉淀，最后得到Fe3O4磁性微球。将Fe3O4溶解到壳聚糖溶液中后添加磷酸三苯酯溶液后超声波处理；用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，用乙醇洗涤几次后在真空干燥箱内干燥，得到固定化载体。本发明使用磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS固定化漆酶，可以高效降解花生中的黄曲酶毒素，并且可以实现反应完全后酶的快速回收和重复利用。

Description

一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素B1降解技术领域，具体涉及一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是玉米、花生等谷物中常见的真菌毒素，是目前发现的化学致癌物中最强的物质之一，主要通过损害肝脏导致肝癌，还可诱发直肠癌、乳腺癌和骨癌等，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强。
目前黄曲霉毒素B1的脱毒方法主要有化学、物理、生物法。化学法是采用酸、碱、氧化剂、醛或亚硫酸气体以改变黄曲霉毒素B1的结构，缺点是可能会对食品的营养价值和风味产生影响，且存在化学物残留的安全隐患。物理脱毒法是采用吸附剂将毒素进行脱除，缺点是稳定性差，且目前商品化的吸附剂对黄曲霉毒素B1的脱除效果仍有待加强。生物法脱毒包括微生物法和生物酶法。微生物脱毒法是利用微生物对毒素的吸附或代谢能力，实现毒素的脱除。生物酶脱毒法是从微生物中发掘降解毒素的关键基因，利用基因技术构建生物酶的高效表达工程菌，分离获得纯酶以进行食品和饲料中真菌毒素的脱除。与微生物脱毒法相比，生物酶法脱毒具有更好的重复性、均一性和操作简单等特点。
漆酶是一种含有铜离子的多酚氧化酶。漆酶具有广泛的底物特异性，但是氧化还原电势大多较低，只有在介体的参与下漆酶才能氧化一些氧化还原电势较高的底物。已有研究表明，漆酶能高效降解黄曲霉毒素B1。然而大多数情况下漆酶降解黄曲霉毒素B1的特异性催化反应是在水溶液中进行的，反应后残留于溶液中，分离回收困难，无法重复多次使用，增加了生产成本，这已成为其工业应用的主要限制。而利用固定化技术，将酶固定在载体上，是实现酶回收利用的有效方法。
固定化酶技术中，载体的使用非常重要。目前，磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS一方面具有生物高分子微粒的特性，如通过共价键来结合细胞、酶等活性物质，一方面因具有磁响应性，可在外加磁场的作用下分离回收。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，使用磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS固定化漆酶，可以高效降解花生中的黄曲酶毒素，并且可以实现反应完全后酶的快速回收和重复利用。固定化酶可重复使用5次以上，降低了生产成本，具有很高的市场价值和应用潜力。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明的技术方案是提供一种磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS固定漆酶以用于降解花生中黄曲霉毒素B1的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤一、固定化载体的制备：
将氯化铁和氯化亚铁进行混合，添加氨水或氢氧化钠作为沉淀剂，使Fe3+和Fe2+以水合氧化物或氢氧化物的形式生成沉淀，最后得到Fe3O4磁性微球。将Fe3O4溶解到壳聚糖溶液中后添加磷酸三苯酯溶液后超声波处理。用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，用乙醇洗涤几次后在真空干燥箱内干燥，得到固定化载体；
步骤二、漆酶的固定化：
磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与赤霉素溶液混合活化，用磁铁将其分离并用醋酸钠缓冲液洗涤。将激活的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS浸入漆酶溶液中进一步反应并不断搅拌，反应完全后用醋酸钠缓冲液洗涤得到所述的固定化酶；
步骤三、固定化酶降解受黄曲霉毒素B1污染的花生：
将固定化酶与受黄曲霉毒素B1污染的花生进行反应，进行黄曲霉毒素B1的降解，并用磁铁分离固定化酶。取部分固定化酶处理前和处理后的花生粉碎后使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生)对样品进行检测。
优选的，所述步骤一中壳聚糖溶液浓度为2～10mg/mL，磷酸三苯酯溶液浓度为0.5～1.0mg/mL，超声时间为20～60min。
优选的，所述步骤二中赤霉素质量分数为2～8％，活化时间为2～5小时。
优选的，所述步骤二中磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与漆酶溶液反应时间为2～8小时，反应温度为10～30℃，酶浓度为0.1～0.8mg/mL。
优选的，所述步骤二中漆酶是NCBI Protein～ID为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
优选的，所述步骤三中添加的固定化酶与受污染的花生的比例为1～5g：50g。
优选的，所述步骤三中降解黄曲霉毒素B1的反应温度为20～40℃，反应时间为6～12小时。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明使用磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS固定化漆酶，可以高效降解花生中的黄曲酶毒素，并且可以实现反应完全后酶的快速回收和重复利用。固定化酶可重复使用5次以上，降低了生产成本，具有很高的市场价值和应用潜力。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
实施例1
步骤一、磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS材料的制备
将6.12g七水硫酸亚铁和11.88g六水氯化铁溶解在100mL去离子水中，加入氢氧化钠调节pH为10.0。在氮气的保护下，将混合物在80℃条件下剧烈搅拌一小时。冷却至室温后，用磁铁分离沉淀即Fe3O4，并用去离子水洗涤。将5g氧化铁扩散到1000mL浓度为6.0mg/mL壳聚糖溶液中，然后，添加500mL浓度为1.0mg/mL磷酸三苯酯溶液，并在室温下通过超声波处理60min。用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，并用乙醇洗涤后在40℃下真空干燥。
步骤二、漆酶的固定化
将步骤一中得到的5g磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与质量分数为6％的200mL赤霉素溶液混合，在25℃条件下活化3小时。用醋酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS。活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与酶浓度为0.4mg/mL的漆酶溶液在25℃条件下反应4小时并不断搅拌，用醋酸钠缓冲液洗涤得到的固定化酶。
步骤三、固定化酶降解花生中的黄曲霉毒素B1
将2g固定化酶添加到50g受污染的花生中，加入50mL浓度为0.1mol/L丁香醛作为反应介体，25℃条件下反应6小时，用磁铁分离固定化酶。取10g固定化酶处理前和处理后的花生样品，粉碎后使用甲醇:水(体积比6:4)溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生)对样品进行检测。
实施例2
步骤一、磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS材料的制备
将6.12g七水硫酸亚铁和11.88g六水氯化铁溶解在100mL去离子水中，加入氢氧化钠调节pH为10.0。在氮气的保护下，将混合物在80℃条件下剧烈搅拌一小时。冷却至室温后，用磁铁分离沉淀即Fe3O4，并用去离子水洗涤。将5g氧化铁扩散到1000mL浓度为6.0mg/mL壳聚糖溶液中，然后，添加500mL浓度为1.0mg/mL磷酸三苯酯溶液，并在室温下通过超声波处理60min。用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，并用乙醇洗涤后在40℃下真空干燥。
步骤二、漆酶的固定化
将步骤一中得到的5g磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与质量分数为6％的200mL赤霉素溶液混合，在25℃条件下活化3小时。用醋酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS。活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与酶浓度为0.5mg/mL的漆酶溶液在30℃条件下反应4小时并不断搅拌，用醋酸钠缓冲液洗涤得到的固定化酶。
步骤三、固定化酶降解花生中的黄曲霉毒素B1
将2g固定化酶添加到50g受污染的花生中，加入50mL浓度为0.1mol/L香草醛作为反应介体，30℃条件下反应8小时，用磁铁分离固定化酶。取10g固定化酶处理前和处理后的花生样品，粉碎后使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生)对样品进行检测。
实施例3
步骤一、磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS材料的制备
将6.12g七水硫酸亚铁和11.88g六水氯化铁溶解在100mL去离子水中，加入氢氧化钠调节pH为10.0。在氮气的保护下，将混合物在80℃条件下剧烈搅拌一小时。冷却至室温后，用磁铁分离沉淀即Fe3O4，并用去离子水洗涤。将5g氧化铁扩散到1000mL浓度为6.0mg/mL壳聚糖溶液中，然后，添加500mL浓度为1.0mg/mL磷酸三苯酯溶液，并在室温下通过超声波处理60min。用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，并用乙醇洗涤后在40℃下真空干燥。
步骤二、漆酶的固定化
将步骤一中得到的5g磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与质量分数为6％的200mL赤霉素溶液混合，在25℃条件下活化3小时。用醋酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS。活化后的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与酶浓度为0.6mg/mL的漆酶溶液在35℃条件下反应4小时并不断搅拌，用醋酸钠缓冲液洗涤得到的固定化酶。
步骤三、固定化酶降解花生中的黄曲霉毒素B1
将2g固定化酶添加到50g受污染的花生中，加入50mL浓度为0.1mol/L咖啡酸作为反应介体，35℃条件下反应10小时，用磁铁分离固定化酶。取10g固定化酶处理前和处理后的花生样品，粉碎后使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生)对样品进行检测。
黄曲霉毒素B1降解率(％)＝(固定化酶处理前花生样品中黄曲霉毒素B1含量-固定化酶处理后花生样品中黄曲霉毒素B1含量)/固定化酶处理前花生样品中黄曲霉毒素B1含量×100。
表1固定化酶处理前后花生中黄曲霉毒素B1含量及降解率
Figure BDA0003542593000000051
可见，固定化酶处理后花生样品中黄曲霉毒素B1含量远低于国家对饲料的限量要求(≤20μg/kg)，适合应用于对受黄曲霉毒素B1污染的花生的工业化脱毒处理。
对实施例1～3中，用磁铁分离固定化酶后对花生中黄曲霉毒素B1降解进行重复性利用测试，具体测试方法如下：
每次反应完后，用磁铁分离固定化酶，用醋酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤三次，真空干燥。继续按照实施例1～3中步骤三进行反应，循环使用5次。
表2循环使用5次后固定化酶对花生中黄曲霉毒素B1的降解率
Figure BDA0003542593000000061
从上表中可以看到，固定化漆酶循环使用5次后还能保持对黄曲霉毒素B1较高的降解率，说明该固定化酶的循环利用性能较好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 安徽黑娃食品科技有限公司
<120> 一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法
<130> 2022.3.3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 514
<212> PRT
<213> SEQ ID No.1
<400> 1
Lys Met Thr Leu Glu Lys Phe Val Asp Ala Leu Pro Ile Pro Asp Thr
1 5 10 15
Leu Lys Pro Val Gln Gln Ser Lys Glu Lys Thr Tyr Tyr Glu Val Thr
20 25 30
Met Glu Glu Cys Thr His Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg
35 40 45
Leu Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Glu Val Lys
50 55 60
Arg Asn Glu Asn Val Tyr Val Lys Trp Met Asn Asn Leu Pro Ser Thr
65 70 75 80
His Phe Leu Pro Ile Asp His Thr Ile His His Ser Asp Ser Gln His
85 90 95
Glu Glu Pro Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr
100 105 110
Pro Asp Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe
115 120 125
Glu Gln Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn
130 135 140
Gln Gln Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu
145 150 155 160
Thr Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His
165 170 175
Asp Pro Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Asp Glu Tyr Asp Val
180 185 190
Pro Leu Leu Ile Thr Asp Arg Thr Ile Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe
195 200 205
Tyr Pro Ser Ala Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asn Pro Ser
210 215 220
Ile Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val
225 230 235 240
Trp Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Val Ile
245 250 255
Asn Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Asn Leu Ser Leu Asp Asn Gly Gly
260 265 270
Asp Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val
275 280 285
Lys Leu Asn Ser Phe Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Ile
290 295 300
Ile Asp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly Glu Ser Ile Ile Leu Ala Asn Ser
305 310 315 320
Ala Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met
325 330 335
Gln Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Ala Gln Lys Asp Glu Ser Arg Lys
340 345 350
Pro Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Ser Val Gln His Glu Arg Ile Gln
355 360 365
Asn Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ala Gly Thr Gln Asp Glu Tyr Gly Arg
370 375 380
Pro Val Leu Leu Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu
385 390 395 400
Thr Pro Lys Val Gly Thr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr
405 410 415
Arg Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Arg Val Leu
420 425 430
Asp Arg Arg Pro Phe Asp Ile Ala Arg Tyr Gln Glu Ser Gly Glu Leu
435 440 445
Ser Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp
450 455 460
Lys Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Leu Arg Ile Ala Ala
465 470 475 480
Thr Phe Gly Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu
485 490 495
Glu His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Ile Thr Asp Pro
500 505 510
His Lys

Claims (7)

1.一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、固定化载体的制备：
将氯化铁和氯化亚铁进行混合，添加氨水或氢氧化钠作为沉淀剂，使Fe3+和Fe2+以水合氧化物或氢氧化物的形式生成沉淀，最后得到Fe3O4磁性微球。将Fe3O4溶解到壳聚糖溶液中后添加磷酸三苯酯溶液后超声波处理；用磁铁分离磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS，用乙醇洗涤几次后在真空干燥箱内干燥，得到固定化载体；
步骤二、漆酶的固定化：
磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与赤霉素溶液混合活化，用磁铁将其分离并用醋酸钠缓冲液洗涤。将激活的磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS浸入漆酶溶液中进一步反应并不断搅拌，反应完全后用醋酸钠缓冲液洗涤得到所述的固定化酶；
步骤三、固定化酶降解受黄曲霉毒素B1污染的花生：
将固定化酶与受黄曲霉毒素B1污染的花生进行反应，进行黄曲霉毒素B1的降解，并用磁铁分离固定化酶；取部分固定化酶处理前和处理后的花生粉碎后使用甲醇与水的体积比为6:4的溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱对样品进行检测。
2.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤一中壳聚糖溶液浓度为2～10mg/mL，磷酸三苯酯溶液浓度为0.5～1.0mg/mL，超声时间为20～60min。
3.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤二中赤霉素质量分数为2～8％，活化时间为2～5小时。
4.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤二中磁性壳聚糖复合微粒Fe3O4@CS与漆酶溶液反应时间为2～8小时，反应温度为10～30℃，酶浓度为0.1～0.8mg/mL。
5.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤二中漆酶是NCBI Protein～ID为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤三中添加的固定化酶与受污染的花生的比例为1～5g：50g。
7.根据权利要求书1所述的一种降解花生中黄曲霉毒素B1的固定化酶制备方法，其特征在于，所述步骤三中降解黄曲霉毒素B1的反应温度为20～40℃；反应时间为6～12小时。
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Citations (14)

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