CN101226808A - 表面修饰Cu2+的纳米磁性材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种表面修饰Cu²⁺的磁性材料及其制备方法和应用。该磁性纳米材料是先合成表面富含氨基的四氧化三铁的磁性纳米材料，采用Cu²⁺对其进行表面化学修饰。该固定Cu²⁺的磁性纳米粒子作为微吸附剂，比表面积大，可对生物体中具有的肽段进行富集，方法简单有效。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

表面修饰Cu2+的纳米磁性材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种表面修饰Cu²⁺的磁性材料及其制备方法和应用。

背景技术

众所周知，蛋白质组成具有多样性和可变性，即在同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期，其蛋白质组成都是在不断变化的，造成蛋白质组成异常复杂。同时由于蛋白质存在翻译后修饰，所以一个mRNA往往对应多个蛋白质，也就是说，蛋白质的数量远远多于基因的数量，蛋白质在大小、相对丰度、酸碱度和疏水性方面差异很大，仅在相对丰度上，高丰度蛋白质与低丰度蛋白质相差六个数量级甚至更高；而且，由于蛋白质无法像DNA一样被“扩增”，这些都造成许多含量低的蛋白质在大规模的检测中很难被检测到。低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识。因此要从分子水平上，深入研究生命过程的规律，探索生命现象的奥秘，必须对一些具有重要生理功能的低丰度蛋白质进行分析监测，这对目前的分析技术和手段不能不说是一个严峻的挑战。

低丰度蛋白的有效浓缩是实现其准确分析和鉴定的重要条件之一。实际上在蛋白质组学研究过程中许多方面都涉及到样品的有效富集，以胶内酶解样品的分析为例：酶解肽段提取液的体积太大，在质谱分析前必须浓缩。目前最常用的样品浓缩方法有溶剂蒸发法和色谱浓缩法。溶剂蒸发法费时费力，在干燥过程中容器表面的吸附会造成大量的肽段损失，同时无机盐等杂质也会被浓缩，影响质谱鉴定的灵敏度。色谱浓缩法是利用样品与吸附剂之间的色谱相互作用对样品进行浓缩，吸附剂一般是采用烷基链修饰的硅胶。该方法能实现在对样品进行有效浓缩的同时，去除样品中的盐分和其他杂质。尤其是在液相色谱与质谱联用时，为了防止样品中的盐分等杂质进入质谱影响信号检测，都是采用了在分离柱前连接一根短小的反相预柱，以实现对样品浓缩和除盐的效果。被人们广泛采用的进行样品除盐浓缩的商品化产品Zip-tip和Zip-plate，也都是基于色谱浓缩法的原理。分别是在枪头管尖或是九十六孔板孔的底部填充少许反相填料，操作相对繁琐；且由于填料很少，因此能富集浓缩的样品量很有限。近年来，纳米材料以其发展快速和应用潜力而被越来越多地应用于在蛋白质组学分析中。杨芃原教授小组等成功地将沸石纳米粒子应用于痕量肽段的富集，但是该方法需要高速离心分离样品和沸石混合物，操作相对繁琐。因此发展一种简单便捷而又有效的分离富集蛋白和肽段的方法成为蛋白质组学研究的一个重要方面。

磁性聚合物微球以其易于表面修饰、溶液分散性好以及灵敏的磁场感应性为其应用于蛋白质组学分析中痕量肽段的分离富集方面提供了可能。本研究合成了四氧化三铁磁性聚合物微球，进而合成了新型的表面修饰Cu²⁺的磁性聚合物材料。利用该磁性聚合物材料作为吸附剂，进行痕量多肽的分离富集以及MALDI-TOF/MS直接分析并初步应用于实际血样中多肽的富集。从而简化了低浓度多肽的分析测定程序，解决了痕量样品的分析困难；也为磁性聚合物微球的应用开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对多肽进行富集的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料及其制备方法和应用。

本发明提供的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料，是先采用水热法合成胺基修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，然后分别与己二酰氯、亚氨基二乙酸反应，再用Cu²⁺对其表面进行化学修饰，生成表面修饰Cu²⁺金属离子的磁性纳米材料，其结构如下式所示：

其中M为带有氨基的四氧化三铁纳米粒子。

上述表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料的制备方法如下：

(1)用水热法合成表面带有氨基的四氧化三铁(Fe₃O₄)的超顺磁性纳米粒子：采用3.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以80-90mL乙二醇为分散体系，添加6-12克无水乙酸钠，10-20克1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是20-100nm；

(2)将由步骤(1)合成的Fe₃O₄氨基磁性粒子反复用去离子水洗涤，以除去水溶性杂质，再将产物以40-50℃真空干燥得到黑色粉末。然后对Fe₃O₄氨基磁性纳米粒子进行表面修饰。先将纳米粒子磁球表面用己二酰氯修饰。取干燥的100mL两颈瓶，加入25-30mL无水氯仿，称取100毫克干燥的Fe₃O₄氨基磁性纳米粒子粉末，得到纳米粒子的分散液。将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时。然后通过酰氯在粒子上接亚氨基二乙酸(IDA)。先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入25-30mL无水氯仿分散。在分散液中加入300-500毫克IDA粉末，机械搅拌5-6小时，停止搅拌，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的IDA，并收集合成好的磁性纳米材料，40-50℃烘干。

(3)用铜离子修饰纳米磁性粒子表面，称取10毫克步骤(2)制备的纳米材料黑色粉末，将其分散在1-2mL 1mol/L的硫酸铜溶液中浸泡过夜。然后用去离子水洗去硫酸铜溶液，并将所得的磁性纳米材料重新分散在1mL去离子水中。

本发明合成的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料，合成方法简单有效并具有很好的磁场感应性，可直接放入肽段中，无需特殊处理，络合到磁性纳米材料上后，无需离心分离，采用简单磁场作用即可实现肽段的富集。

本发明提供的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料可应用于生物体中低丰度蛋白或肽段的富集，并扩展了磁性纳米材料的实际应用，在生物分析研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1为表面修饰Cu²⁺的磁性纳米粒子的合成方法图示。

图2为水热法合成的表面修饰氨基的Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜图(a)和扫描电镜图(b)。它具有很好的均一性和分散性。

图3(a)为表面修饰Cu²⁺的磁性纳米材料的表面照片，(b)为材料的表面元素分析图，(c)为材料的表面元素分析结果，由图及下面表格可得，纳米粒子表面平均铜含量约0.9％，可见本发明成功制备了表面修饰Cu²⁺的磁性钠米材料。

取样点编号	氧原子百分比	铁原子百分比	铜原子百分比
				12345678910	52.5546.2547.1252.0240.9647.5146.5947.3446.2648.41	46.6252.951.5547.1558.2151.7551.7452.2153.0650.69	0.830.851.330.830.830.741.670.450.670.89

图4为表面修饰Cu²⁺的磁性纳米材料对标准蛋白酶解肽溶液的富集效果，对比(a)未富集；(b)富集后；(c)在含1mol/L氯化钠溶液中的富集情况，可知，该材料可以很好地富集低丰度的肽，并且在溶液中有盐存在时同样可以得到好的富集效果。

图5为表面修饰Cu²⁺的磁性纳米材料对血清肽段的富集。图中标出了血清中部分标志性肽，可见该材料对血清这样复杂的实际样品也有良好的富集效果。

具体实施方式

实施例是对本发明所提供的超顺磁性的表面修饰Cu²⁺的磁性材料以及进行低丰度肽段的分离富集分析过程的进一步说明。

实施例1表面修饰Cu²⁺的磁性材料的合成

表面修饰Cu²⁺的磁性材料的合成共分为三步。

用水热法合成表面带有氨基的四氧化三铁的超顺磁性纳米粒子：采用3.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以80-90mL乙二醇为分散体系，添加6-12克无水乙酸钠，10-20克1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是20-100nm；

首先，将由步骤(1)合成Fe₃O₄氨基磁性微球反复用去离子水洗涤，以除去水溶性杂质，最后将产物以40-50℃真空干燥得到黑色粉末。其次，对Fe₃O₄氨基磁性微球进行表面修饰，先将磁球表面用己二酰氯修饰。取干燥的100mL两颈瓶，加入25-30mL无水氯仿，称取100毫克干燥的Fe₃O₄氨基磁性微球粉末，得到纳米粒子的分散液。将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时。然后通过酰氯在磁球上接亚氨基二乙酸(IDA)，先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入25-30mL无水氯仿分散。在分散液中加入300-500毫克IDA粉末，机械搅拌5-6小时，停止搅拌，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的IDA，并收集合成好的磁性纳米材料，40-50℃烘干备用。

用铜离子修饰纳米磁性微球表面，称取10毫克烘干的纳米材料黑色粉末，将其分散在1-2mL 1mol/L的硫酸铜溶液中浸泡过夜。然后用去离子水洗去硫酸铜溶液，并将所得的磁性纳米材料重新分散在1mL去离子水中。

实施例2表面修饰Cu²⁺的磁性材料用于肽段富集

(1)蛋白溶液酶解：

取1.0mg蛋白样品，包括牛血清白蛋白(BSA)、细胞色素C(Cytochrome C)、马心肌蛋白(Myoglobin)、牛β-酪蛋白(β-casein)分别溶于1.0mL水中，加热变性后，往溶液中加入碳酸氢铵溶液调节体系PH约为8，以1∶50(酶和蛋白之间的质量比)加入25μg胰蛋白酶。在37℃的温度下，酶解12小时后终止酶解，酶解液置于-80℃冰箱冷冻待用。

(2)肽段的分离富集：

将20μL浓度为2mg mL^-1的磁性材料分散液分别加入到1mL浓度为5 fmol μL^-1标准肽段或是标准蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37℃，振荡90min。在外加磁场作用下去除上清后，用纯水反复清洗三次；然后分散在5μL CHCA(5mg/mL；溶于50％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)TFA中)将1μL含有被富集肽段的分散液点到靶板上，待干后进行MALDI-TOF MS分析。

(3)盐溶液中肽段的富集：

将20μL浓度为10mg mL^-1的磁性材料分散液分别加入到1mL浓度为5 fmol μL^-1Myoglobin蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37℃，振荡60min。在外加磁场作用下去除上清后，用20μL纯水清洗2次；然后分散在5μLCHCA(5mg/mL；溶于50％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)TFA中)将1μL含有被富集肽段的分散液点到靶板上，待干后进行MALDI-TOF MS分析。

(4)MALDI-TOF-MS的检测

取1μL富集有肽段的磁性微球分散液点于MALDI靶板上，然后再点上0.5μLCHCA。待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行MALDI-TOF质谱测定。MALDI-TOF MS质谱实验在4700 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems)上完成；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF条件下检测。

实施例3表面修饰Cu²⁺的磁性材料用于人血清中肽段的富集

取10μL成人血清，加入20μL PBS缓冲溶液稀释后，再加入2μL浓度为10mg/mL的表面修饰Cu²⁺的磁性材料；用移液枪吹打5次，30s后，磁分离去除上清。将富集了肽段的材料用PH为7.0的PBS缓冲溶液清洗三次，上清去除；加入5μL 50％(v/v)乙腈水溶液将富集在材料上的肽段洗脱下来，磁分离得洗脱液；将0.5μL含有被富集肽段的洗脱液点到靶板上，干后再点0.5μL CHCA(5mg/mL；溶于50％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)TFA中)。待干后进行MALDI-TOF MS分析。

Claims (3)

1.一种表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料，其特征在于由下述方法制备获得：

先采用水热法合成胺基修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，然后分别与己二酰氯、亚氨基二乙酸反应，再用Cu²⁺对其表面进行化学修饰，生成表面修饰Cu²⁺的磁性纳米材料，其结构如下式所示：

其中，M为带有氨基的四氧化三铁纳米粒子。

2.一种如权利要求1所述的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)用水热法合成表面带有氨基的四氧化三铁的超顺磁性纳米粒子：采用3.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以80-90mL乙二醇为分散体系，添加6-12克无水乙酸钠和10-20克1，6-己二胺，反应温度为195-200℃，反应时间为4-6小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是20-100nm；

(2)修饰已二酰氯和亚氨基二乙酸：将由步骤(1)合成的Fe₃O₄氨基磁性纳米粒子用去离子水洗涤，以除去水溶性杂质，再将产物以40-50℃真空干燥，得到黑色粉末；然后，对Fe₃O₄氨基磁性纳米粒子进行表面修饰：

取干燥的100mL两颈瓶，加入25-30mL无水氯仿，称取100毫克干燥的Fe₃O₄氨基磁性纳米粒子粉末，得到纳米粒子的分散液，将两颈瓶置于冰水浴中密封搅拌20-30分钟，保持冰水浴，向瓶中滴入0.2-0.3mL己二酰氯，继续密封搅拌4-5小时，先在磁铁辅助下用无水氯仿洗去未反应的己二酰氯，再加入25-30mL无水氯仿分散，在分散液中加入300-500毫克亚氨基二乙酸粉末，搅拌5-6小时，在磁铁辅助下用丙酮和水洗掉多余的亚氨基二乙酸，并收集合成好的磁性纳米材料，40-50℃烘干；

(3)最后用铜离子修饰纳米磁性粒子表面：称取10mg步骤(2)的纳米粒子，将其分散在1mL 1mol/L的硫酸铜溶液中浸泡过夜，然后用去离子水洗去硫酸铜溶液，并将所得的磁性纳米材料重新分散在1mL去离子水中。

3.如权利要求1所述的表面修饰Cu²⁺的纳米磁性材料在富集生物体中低丰度蛋白或肽段中的应用。

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