CN106093254B - 一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法，该方法是将以多壁碳纳米管为原料合成的磁性纳米材料加入到农产品的样品提取液中，进行毒素吸附，用磁铁将含有玉米赤霉烯酮类毒素的磁性纳米材料聚集，移去上清液，加入解吸附溶液解吸付后即获得含目标物的浓缩液。本发明的玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法稳定、快速、成熟，能够适用于玉米中的六种玉米赤霉烯酮类毒素的同时富集净化，适用范围广，净化效果好。

Description

一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法
技术领域
本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮类毒素是一类由镰刀菌产生的真菌毒素，主要包括玉米赤霉烯酮(ZEN)及其衍生物玉米赤霉酮(ZAN)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)六种。这类毒素主要存在于玉米、小麦、大麦、大米等作物及其制品中，有较强的生殖毒性，可引起动物雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，给畜牧业带来经济损失，在食品中的污染可引起儿童性早熟。
现有的食品、农产品中玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法主要是固相萃取柱净化，商业化的固相萃取柱主要有HLB柱、免疫亲和柱等。但是，商品化的固相萃取柱价格昂贵，大多针对某一种毒素净化，无法实现多种毒素同时净化的目的，并且固相萃取柱大多需要上样、淋洗、洗脱等多步操作，过程繁琐，费时费力。目前，尚缺乏一种价格低廉、操作简便、快速的富集净化方法，可以同时、有效地富集净化农产品中的六种玉米赤霉烯酮类毒素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法，该方法包括如下步骤：
将以多壁碳纳米管为原料合成的磁性纳米材料加入到农产品的样品提取液中，进行毒素吸附，用磁铁将含有玉米赤霉烯酮类毒素的磁性纳米材料聚集，移去上清液，加入解吸附溶液解吸付后即获得含目标物的浓缩液；
该方法可以同时富集净化农产品如玉米中的六种玉米赤霉烯酮类毒素。
其中所述的多壁碳纳米管为多种型号的多壁碳纳米管(如型号(8nm i.d.,10-30μm length,500m2/g)及其相当者)；
其中所述的磁性纳米材料是通过如下方法制备得到的：
多壁碳纳米管中加入水(多壁碳纳米管与水的质量/体积比(mg/ml)为：1：0.1-10)，超声0.1-2h后，转移到30-80℃恒温水浴锅中，边搅拌边通氮气0.1-2h；然后加入六水合氯化铁和四水合氯化亚铁，其中多壁碳纳米管、六水合氯化铁、四水合氯化亚铁的用量比例为1-500:0.1-100:0.1-100(m/m/m)，反应0.1-2h后，调节pH至10-14，继续反应0.1-5h；整个反应过程中，都保持30-80℃恒温、搅拌及通氮气；反应完成后，容器下方用磁铁吸附，弃上层液体，加水清洗沉淀物，最后将沉淀物烘干，研磨成粉末，即为所需的磁性纳米材料。
其中所述的样品提取液为：将样品加入乙腈水溶液声提取1-3h，氮气吹至近干，再加入吸附液，得样品提取液；其中吸附液为甲醇水溶液或乙腈水溶液；其中乙腈水溶液或甲醇水溶液中甲醇或乙腈的体积比例为0.1-50％；
其中毒素吸附时间为1-60min；
毒素吸附的方式为涡旋、震荡或超声中的一种或两种；
解吸附溶液为含0.1-5％(v/v)甲酸的甲醇、含0.1-5％(v/v)甲酸的乙腈或者含0.1-5％(v/v)甲酸的丙酮；
解吸附时间为1-60min；
解吸附的方式为涡旋、震荡或超声中的一种或两种。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)首次采用具有大比表面积的磁性纳米材料作为吸附材料，用于同时富集净化农产品如玉米中的六种玉米赤霉烯酮类毒素。该磁性纳米材料对目标物具有很好的吸附性能，能够显著除去干扰杂质；
(2)自制的新型磁性纳米材料合成步骤简单，不依赖特殊仪器，常规实验室内均可制备；
(3)磁性固相萃取遵循通用的吸附、解吸付步骤，属于常规使用方法，一般实验人员简单培训即可使用，不需要特殊仪器设备，实用性强；
(4)与固相萃取相比，磁性固相萃取操作更为简便，不需要上柱、淋洗、洗脱等步骤，不需要固相萃取仪，只需一块磁铁和烧杯即可完成，实验流程较快，整个过程不超过1小时；
(5)多壁碳纳米管、六水合氯化铁以及四水合氯化亚铁均可以商品化得到，价格低廉，若以单次磁性固相萃取使用量为20mg，那单次材料价格不超过5元，与现有的商品化固相柱相比，在保证净化效果的同时，大大节约了时间、节省了成本；
(6)本发明的净化方法稳定、快速、成熟，能够适用于玉米中的六种玉米赤霉烯酮类毒素的同时富集净化，适用范围广，净化效果好。
附图说明
图1为发明实例中自制的新型磁性纳米材料透射电镜图。
图2为发明实例中磁性固相萃取的步骤图。
图3为发明实例中玉米未通过和通过磁性固相萃取净化表观特征的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
用于玉米赤霉烯酮类毒素净化富集的磁性固相萃取步骤见图2，主要为吸附和解吸附过程。
实施1：玉米中六种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化
第一步，合成磁性纳米材料：300mg多壁碳纳米管(8nm i.d.,10-30μm length,500m2/g)(南京先丰纳米材料科技有限公司)中加入250mL去离子水，超声1h后，转移到60℃恒温水浴锅中，边搅拌边通氮气0.5h以排尽反应环境中的氧气。加入0.81g六水合氯化铁和0.30g四水合氯化亚铁反应0.5h后，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至12，继续反应2h。整个反应过程中，都保持60℃恒温、持续搅拌及通氮气。反应完成后，容器下方用磁铁吸附，弃上层液体，加适量去离子水清洗沉淀物，反复三次，最后将沉淀物在80℃烘干，研磨成粉末，即为磁性纳米材料。
第二步，制备样品提取液：取2g粉碎的玉米样品粉末(上海市售随机样本)置于50mL离心管，加10mL乙腈水溶液(84/16，v/v)超声提取1h，取5mL提取液氮气吹至近干，加入5mL的乙腈/水溶液(5/95，v/v)，得样品提取液；
第三步，吸附：向上述样品提取液中加入20mg第一步制备得到的磁性纳米材料，涡旋3min，离心管底部放置一块磁铁，使吸附剂聚集，弃去上层液体；
第四步，解吸附：向离心管中加入5mL含0.5％甲酸的丙酮溶液，涡旋0.5min，超声3min，用磁铁聚集吸附剂，收集上清液，重复此步骤，合并两次共10mL解吸附液，氮气吹干，用1mL乙腈定容，过膜后进LC-MS/MS分析；
第五步，检测：采用高效液相色谱串联质谱仪(UHPLC-XEVO TQ-S，waters公司，美国)对样品进行检测。液相条件为：流动相为(A)5mmol/L的醋酸铵水溶液；(B)甲醇。线性梯度洗脱：初始：50％B，4min 70％B，6-7min 75％B，7.2min 50％B，平衡1.8min，总运行时间为9min。进样体积为3μL。质谱条件为：离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气和脱溶剂气流量分别是30和1000L/h。采用MRM法检测，具体各个毒素的检测参数见表1。
表1.玉米赤霉烯酮类毒素的质谱参数
*表示定量离子。
结果：
(1)材料表征：磁性纳米材料的透射电镜图如图1所示：100nm尺寸下可见中空的细管(多壁碳纳米管)上均匀分布着小黑点(具有磁性的四氧化三铁纳米粒子)，说明成功合成了磁性纳米材料；
(2)表观特征：如图3所示：从表观上看，经过以磁性纳米材料为吸附剂的磁性固相萃取过程净化后的玉米样品液，与未净化样品液相比，明显澄清透明，且经过净化的样品液，完全可以除去色素等大多数干扰杂质，可以达到净化的目的；
(3)样品净化后基质干扰去除情况：基质的干扰情况采用信号增益或抑制程度(SSE)进行评估，分别配制浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200和500ng/mL的六种毒素的乙腈溶液和玉米基质溶液，测线性，其斜率之比为SSE。净化前后的玉米基质溶液中六种毒素SSE范围分别为69.9-127.6％和92.1-103.8％，表明净化过程有效消除了基质干扰；
(4)方法的回收率验证：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，向玉米样品中添加低、中、高三个浓度水平(5μg/kg,50μg/kg和200μg/kg)的六种真菌毒素标准品，以原样本为对照组，各平行三份实验。样品按照上述步骤净化后检测，回收率结果为75.8-104.1％；
(5)方法的精密度验证：在同一天内，平行5份样品进行试验，纯化检测后得到日内精密度：3.4-11.2％；连续3天，每天平行5份样品进行试验，检测计算后得到日间精密度：3.2-13.2％。
综上可见，本发明的磁性固相萃取方法，可以有效的对玉米中的六种玉米赤霉烯酮类毒素富集净化，具有明显的净化效果，每份所用的磁性纳米材料制备成本不超过5元，经净化后的玉米样品基本不受基质干扰，明显优于现有的分析方法，并且回收率高，精密度好。与现有的商品化固相萃取柱相比，在保证甚至优于其准确度和重现性的前提下，极大的简化了净化步骤，缩短了时间，节省了成本，显著的降低了基质干扰，明显提高了方法灵敏度。
本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法，其特征在于该方法为：
将以多壁碳纳米管为原料合成的磁性纳米材料加入到农产品的样品提取液中，进行毒素吸附，用磁铁将含有玉米赤霉烯酮类毒素的磁性纳米材料聚集，移去上清液，加入解吸附溶液解吸附后即获得含目标物的浓缩液；
其中所述的样品提取液为：将样品加入乙腈水溶液中超声提取1-3h，氮气吹至近干，再加入吸附液，得样品提取液；其中吸附液为甲醇水溶液或乙腈水溶液；其中吸附液中乙腈水溶液或甲醇水溶液中甲醇或乙腈的体积比例为0.1-50％；
其中解吸附溶液为含0.1-5％甲酸的甲醇、含0.1-5％甲酸的乙腈或者含0.1-5％甲酸的丙酮；
其中所述的磁性纳米材料是通过如下方法制备得到的：
300mg多壁碳纳米管中加入250mL去离子水，超声1h后，转移到60℃恒温水浴锅中，边搅拌边通氮气0.5h以排尽反应环境中的氧气；加入0.81g六水合氯化铁和0.30g四水合氯化亚铁反应0.5h后，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至12，继续反应2h；整个反应过程中，都保持60℃恒温、持续搅拌及通氮气；反应完成后，容器下方用磁铁吸附，弃上层液体，加适量去离子水清洗沉淀物，反复三次，最后将沉淀物在80℃烘干，研磨成粉末，即为磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮类毒素的富集净化方法，其特征在于：
其中毒素吸附时间为1-60min；
毒素吸附的方式为涡旋、震荡或超声中的一种或两种；
解吸附时间为1-60min；
解吸附的方式为涡旋、震荡或超声中的一种或两种。
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