CN107941971B - 基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。该方法将植物内源油菜素内酯经过溶剂提取，提取液直接与硼亲和材料作用，内源油菜素内酯吸附于材料表面，经淋洗去除基质杂质后，再通过氧化－水解－反相洗脱的策略将吸附在硼亲和材料上的油菜素内酯洗脱而得。该方法操作简便，选择性好、回收率高，去除基质干扰彻底，可实现植物材料中痕量油菜素内酯类化合物的高灵敏度定量分析，在植物遗传学、作物科学等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。
背景技术
油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)是一类重要的植物激素，在极低的浓度下参与调控植物的生长发育过程，包括调控花期、花粉发育、器官分化等；除了对生长发育的直接调控作用外，BRs还参与植物体对非生物、生物应激产生的应答，包括盐、干旱、极端温度等。内源BRs的准确定量分析对于研究BRs作用的分子机理具有重要的意义。但是由于BRs在植物中含量极低，并且植物基质复杂，高灵敏度BRs定量分析方法的建立一直是植物学家与分析化学家需要面对的难题。
目前，由于其良好的分离能力和较高的灵敏度，LC-MS/MS技术成为BRs定量检测最主要的手段。LC-MS/MS技术的应用使BRs检测的灵敏度得到大幅度提高，但是仍不能满足一些极端条件下的需求，如一些珍稀突变体植物的特殊部位，样品量极少，难以收集足够量的样品，因此，改进BRs样品前处理方法成为解决这一问题的最佳选择。
由于对BRs具有良好的选择性，硼亲和材料越来越多的被用于BRs的富集与纯化，硼亲和材料的应用有效地提高了前处理过程中对BRs的选择性，从而显著提高了BRs检测的灵敏度。但是，目前硼亲和材料纯化BRs的过程中通常存在以下问题：(1)需要与其他机理的固相萃取材料配合使用，一起用于BRs的除杂：如植物提取液一般需要先经过反相或者正相的固相萃取材料除杂，再与硼亲和材料作用；(2)植物提取液与硼亲和材料作用前需要除水：如植物材料冻干后提取、新鲜植物材料提取液吹干后再复溶、提取液中加入无水盐；(3)洗脱过程的回收率低：常用的洗脱体系包括酸性洗脱或者酯交换洗脱，效率较低；或者即使选择洗脱能力较强的氧化-水解体系洗脱，但是由于氧化-水解过程与洗脱过程同时进行，氧化-水解产生的硼酸残留会影响后续衍生化的效率，从而导致检测的灵敏度降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于硼亲和固相萃取的植物内源油菜素内酯的纯化方法。
本发明提供的纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：
1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；
所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；
所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；
或者，
向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；
所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；
2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物。
上述方法的步骤1)中，提取溶剂为质量百分浓度为60％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为60％-100％的乙腈水溶液；所述甲醇水溶液的浓度具体可为90％；
所述油菜素内酯类化合物具体为含有邻二醇基团的油菜素内酯类化合物；
所述植物原料具体可为植物的叶片、茎、花、穗花、种子或果荚；所述植物具体可为水稻或拟南芥；
所述植物原料的用量不超过100mg或不超过50mg或不超过10mg；具体可为2mg-100mg，具体可为2mg-50mg，更具体可为2mg-10mg；
所述植物原料与提取溶剂的用量比为10mg：0.1-1mL；
所述植物原料与硼亲和材料的用量比为10mg：1-100mg；所述非磁性硼亲和材料为表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料，粒径为50纳米至50微米级；；所述非磁性硼亲和材料具体可为Bond Elut PBA、Benzeneboronic acid，polymer-supported；上述两种材料均可购自Agilent；
所述磁性硼亲和材料为超顺磁性的表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料；粒径为50纳米至5微米级；所述磁性硼亲和材料具体可为Poly(VPBA-co-EDMA)@Fe3O4)；
所述提取步骤中，提取方法为各种常规方法，如超声、离心或磁分离等；当所用硼亲和材料为磁性硼亲和材料时，提取方法优选磁分离；
处理a或b的目的是将提取液中的BRs萃取结合到磁性或非磁性硼亲和材料上。
当所用硼亲和材料为磁性硼亲和材料时，硼亲和材料既可以萃取植物提取液中的BRs，也可以与植物材料、提取溶剂直接混合，故可同时进行溶剂提取和固相萃取；
由步骤1)可知，该方法的样品前处理过程只需硼亲和材料这一种固相萃取材料进行纯化，无需与其他的固相萃取材料配合使用，并且硼亲和材料可以直接与新鲜植物样品或者新鲜植物提取液直接作用，无需将植物材料冻干或者复杂的除水步骤。
所述步骤2)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂；具体选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液中的至少一种。该步骤的目的是为了尽可能除去以非硼亲和机理吸附的杂质。所述甲酸水溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；所述含甲酸的甲醇溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；所述含甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％，更具体为5％；
所述淋洗具体为用质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗；
所述步骤2)氧化水解步骤中，所述氧化水解可一步完成或先氧化后水解；
所述氧化水解一步完成时，所用试剂为含有过氧化氢的氨水溶液；其中，过氧化氢含量为5-30％，具体为10％或15％或25％；氨含量为5-25％，具体为10％；
所述氧化水解为先氧化后水解时，所用氧化试剂为过氧化氢的水溶液；所述过氧化氢的水溶液中，过氧化氢的质量百分浓度为5-30％，具体为10％；
所用水解试剂为氨水溶液；所述氨水溶液中，氨含量为5-25％，具体为10％。
所述步骤2)去除硼酸步骤为用水淋洗所述氧化水解步骤所得产物；
所述用有机溶剂进行洗脱步骤中，有机溶剂为反相洗脱溶剂；具体选自质量百分浓度为80-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为80-100％的乙腈水溶液。
另外，上述方法在油菜素内酯类化合物的定量分析中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种定量分析内源油菜素内酯类化合物的方法，该方法包括如下步骤：
将前述方法所得纯化产物溶于溶剂中，再加入衍生化试剂进行硼酸基团与醇羟基的成酯反应，将所得衍生化产物进行LC-MS/MS检测。
上述方法中，所述溶剂选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的至少一种；
所述衍生化试剂为含有胺基或者季胺基的有机硼酸类化合物，具体选自6-甲氧基-3-吡啶硼酸(MPyBA)、3-(二甲氨基)-苯硼酸(DMAPBA)、4-(二甲氨基)-苯硼酸和2-溴吡啶-5-硼酸中的至少一种；
所述衍生化步骤中，温度为10-60℃，具体为40℃；时间为0.1-2h，具体为1h。该衍生化的目的是为了提高BRs在检测时的质谱响应，以提高BRs检测的灵敏度。
本发明提供的方法简单、快速、易操作，样品使用量较现有方法大大降低，因而显著提高了灵敏度。该方法对富集植物内源BRs表现出高选择性，能有效地去除植物提取液中的杂质，在10mg及以下鲜重植物材料中便可实现内源BRs的定量分析。
附图说明
图1为油菜素内酯标准品谱图。
图2为本方法检测的植物内源油菜素内酯谱图。A是10mg野生型水稻日本晴穗花中检测到的油菜素内酯色谱图，B是10mg日本晴水稻叶片样品，C是10mg野生型拟南芥Wassilewskija-2花样品，D是拟南芥Wassilewskija-2叶片样品，E是1个拟南芥果荚样品(2－3mg)。
图3为纯化后的拟南芥花样品的LC-QTof-MS谱图，m/z 582.4峰为CS的衍生化产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。所述浓度如无特别说明，均为质量百分浓度。
实施例1、水稻日本晴花期穗中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(野生型水稻日本晴花期穗)10mg放入2mL离心管中，加入1mL提取溶剂质量百分浓度为60％的甲醇水溶液，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液上样至硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，BondElut PBA，Agilent)，以用质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用5％过氧化氢氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，再用5％的氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μg 6-甲氧基-3-吡啶硼酸(MPyBA)在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如附图2A所示，可检测到五种内源性BRs，信噪比均在10以上，达到定量水平。
实施例2、水稻日本晴叶片中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(水稻日本晴叶片)10mg放入2mL离心管中，加入1mL80％甲醇，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，Bond Elut PBA，Agilent)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用10％过氧化氢氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，再用10％的氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgMPyBA在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如附图2B所示，可检测到五种内源性BRs，四种达到定量水平。
实施例3、水稻日本晴茎中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(水稻日本晴茎)10mg放入2mL离心管中，加入1mL甲醇，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与5mg分散固相萃取的硼亲和材料(Benzeneboronic acid，polymer-supported，硼酸基团含量2.6-3.2mmol/g，Alfa Aesar)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用含5％过氧化氢的5％氨水溶液氧化水解BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，再用水淋洗除去生成的硼酸，最后用甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgMPyBA在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。
实施例4、水稻日本晴种子中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(水稻日本晴种子)10mg放入2mL离心管中，并称2mg的分散磁性硼亲和固相萃取材料(Poly(VPBA-co-EDMA)@Fe3O4)，硼酸基团含量56μmol/g)于离心管中，加入1mL甲醇，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。超声提取1h，使得溶剂提取过程和固相萃取过程同时进行。磁分离去除植物残渣及上清液后，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗磁性硼亲和材料，然后用含10％过氧化氢的10％氨水溶液氧化水解BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，再用水淋洗除去生成的硼酸，最后用甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgMPyBA在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。
实施例5、拟南芥Wassilewskija-2花中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(拟南芥Wassilewskija-2花)10mg放入2mL离心管中，加入1mL 90％甲醇，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，Bond Elut PBA，Agilent)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用15％过氧化氢溶液氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，然后用15％氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用80％甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgMPyBA在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如附图2C所示，可检测到五种内源性BRs，信噪比均在10以上，达到定量水平。如图3所示，经纯化后，CS化合物峰强度占总离子流的90％以上，表明CS峰纯度非常高，纯化效果非常好。
实施例6、拟南芥Wassilewskija-2果荚中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(拟南芥Wassilewskija-2果荚)10mg放入2mL离心管中，加入1mL80％乙腈，然后加入稳定同位素内标25-100pg及2mg磁性硼亲和材料(Poly(VPBA-co-EDMA)@Fe3O4)，硼酸基团含量30μmol/g)，混合均匀。常温下超声提取1h。磁分离去除植物残渣及上清液后，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗，然后用25％过氧化氢溶液氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，25％氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用90％甲醇反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgMPyBA在40℃下衍生化1h，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如附图2D所示，可检测到五种内源性BRs，四种达到定量水平。
实施例7、拟南芥Wassilewskija-2叶片中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(拟南芥Wassilewskija-2叶片)10mg放入2mL离心管中，加入1mL 80％乙腈，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，Bond Elut PBA，Agilent)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用10％过氧化氢溶液氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，然后用10％氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用80％乙腈反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μg3-(二甲氨基)-苯硼酸(DMAPBA)在40℃下衍生化5min，最后5μL进入LC-MS/MS分析。
实施例8、拟南芥Wassilewskija-2茎中油菜素内酯的测定
称取研磨好的植物样品(拟南芥Wassilewskija-2茎)10mg放入2mL离心管中，加入1mL乙腈，然后加入稳定同位素内标25-100pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，Bond Elut PBA，Agilent)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用25％过氧化氢溶液氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，然后用25％氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用乙腈反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μgDMAPBA在40℃下衍生化5min，最后5μL进入LC-MS/MS分析。
实施例9、拟南芥Wassilewskija-2单个果荚中油菜素内酯的测定
在拟南芥Wassilewskija-2生长的植株上取一个果荚2-3mg于2mL离心管中，研磨后，加入1mL乙腈，然后加入稳定同位素内标10-50pg，混合均匀。常温下超声提取1h。离心取上清液，将上清液与硼亲和固相萃取柱(1CC，100mg，Bond Elut PBA，Agilent)相互作用，以质量百分浓度为5％的甲酸水溶液、甲酸质量百分浓度为5％的甲酸的甲醇溶液、甲醇和水依次淋洗固相萃取柱，然后用25％过氧化氢溶液氧化BRs与硼亲和材料结合形成的复合物，然后用25％氨水溶液水解氧化产物，以水淋洗除去生成的硼酸后，最后用乙腈反相洗脱BRs，收集的洗脱液吹干后，用50μL乙腈复溶，并加入30μg MPyBA在40℃下衍生化5min，最后5μL进入LC-MS/MS分析。结果如附图2E所示，可检测到五种内源性BRs，四种达到定量水平。
以上实施例揭示了本发明的具体操作内容，但是本发明不局限于上述实施方式和实施例，在不脱离本发明的精神和范围内，任何本领域技术人员还可以做些修改和完善。
Claims (8)
1.一种纯化内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：
1)向植物原料中加入提取溶剂和油菜素内酯化合物的同位素内标，混匀进行提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a或b，得到结合物I；
所述处理a为将所述提取液上样于装填有非磁性硼亲和材料的固相萃取柱；
所述处理b为将所述提取液分散于非磁性硼亲和材料中；
或者，
向植物原料中加入提取溶剂、同位素内标和磁性硼亲和材料混匀后进行提取，得到结合物II；
所述植物原料中含有油菜素内酯类化合物；
2)将步骤1)所得结合物I或结合物II依次进行淋洗和氧化水解，去除氧化水解产物中的硼酸后，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到纯化产物；
所述步骤2)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂；
所述步骤2)去除硼酸步骤为用水淋洗所述氧化水解步骤所得产物；
所述用有机溶剂进行洗脱步骤中，有机溶剂为反相洗脱溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，提取溶剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液；
所述甲醇水溶液或乙腈水溶液的质量百分浓度具体为60％-100％；
所述植物原料的用量不超过100mg或不超过50mg或不超过10mg；
所述植物原料与提取溶剂的用量比为10mg：0.1-1mL；
所述植物原料与硼亲和材料的用量比为10mg：1-100mg；
所述非磁性硼亲和材料为表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料，粒径为50纳米至50微米级；
所述磁性硼亲和材料为超顺磁性的表面含硼酸基团的聚合物基或硅胶基材料；粒径为50纳米至5微米级。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述淋洗溶剂选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、质量百分浓度为0.1-10％的甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液、质量百分浓度为0.1-10％的甲酸的甲醇溶液、甲酸的乙腈溶液或质量百分浓度为0.1-10％的甲酸的乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)氧化水解为一步完成或先氧化后水解；
所述氧化水解为一步完成时，所用试剂为含有过氧化氢的氨水溶液；其中，过氧化氢含量为5-30％；氨含量为5-25％；
所述氧化水解为先氧化后水解时，所用氧化试剂为过氧化氢的水溶液；所述过氧化氢的水溶液中，过氧化氢的质量百分浓度为5-30％；
所用水解试剂为氨水溶液；所述氨水溶液中，氨含量为5-25％。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述反相洗脱溶剂选自80-100wt％的甲醇水溶液或80-100wt％的乙腈水溶液。
6.权利要求1-5中任一所述方法在油菜素内酯类化合物的定量分析中的应用。
7.一种定量分析内源油菜素内酯类化合物的方法，包括如下步骤：
将权利要求1-5中任一方法所得纯化产物溶于溶剂中，再加入衍生化试剂进行硼酸基团与醇羟基的成酯反应，将所得衍生化产物进行LC-MS/MS检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述溶剂选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的至少一种；
所述衍生化试剂为含有胺基或者季胺基的有机硼酸类化合物、6-甲氧基-3-吡啶硼酸、3-(二甲氨基)-苯硼酸、4-(二甲氨基)-苯硼酸或2-溴吡啶-5-硼酸；
所述衍生化步骤中，温度为10-60℃；时间为0.1-2h。
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