CN113621043B - 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法 - Google Patents

一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113621043B
CN113621043B CN202110960009.7A CN202110960009A CN113621043B CN 113621043 B CN113621043 B CN 113621043B CN 202110960009 A CN202110960009 A CN 202110960009A CN 113621043 B CN113621043 B CN 113621043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
pressure
myofibrillar protein
myofibrillar
treating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110960009.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113621043A (zh
Inventor
吴文锦
汪兰
熊光权
孙智达
陈梦婷
丁安子
李新
石柳
乔宇
王俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences filed Critical Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202110960009.7A priority Critical patent/CN113621043B/zh
Publication of CN113621043A publication Critical patent/CN113621043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113621043B publication Critical patent/CN113621043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物活性肽制备技术领域。一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；步骤2、提取肌原纤维蛋白；步骤3、利用0.6mol/L KCl‑Tris‑马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体；步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液利用超高压处理、高压均质处理、超高压后高压均质处理、高压均质后超高压处理技术下所得的肌原纤维蛋白溶液；步骤5、酶解；步骤6、真空浓缩；步骤7、干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。该方法所得高抗氧化性生物活性肽清除自由基、螯合金属离子效果好。

Description

一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物活性肽制备技术领域，具体涉及一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法。
背景技术
科学研究表明，过量的自由基会产生氧化效应，氧化损伤会导致许多慢性疾病，包括糖尿病、阿尔茨海默病、关节炎、心脏病和癌症等。人工合成抗氧化剂存在成本高、潜在毒性风险等缺点，因此，从动物蛋白中提取的天然抗氧化肽因环保、可持续、低成本、无毒副作用等优点而受到世界各国的广泛关注。从生物资源可持续开发利用的角度看，动物加工过程中产生的副产物或废弃物中的蛋白质资源具有很大的生物活性肽生产潜力。众多淡水鱼废弃鱼肉加工过程中多被丢弃，利用淡水鱼废弃鱼肉提取肌原纤维蛋白制备生物活性肽可提高废弃物的营养利用价值，节约能源，保护环境。
目前，用来制备生物活性肽的众多方法中，酶解法因易控制、成本低、能耗低、能制备特定的易于分离的活性肽等优点被广泛应用。然而，酶解法存在得率低等缺点。为提高酶解得率，研究者将多种酶联用来提高活性肽得率，但是存在着酶的最佳酶解条件不易控制等缺点；也有研究者在酶解前将蛋白用化学试剂对蛋白进行前处理，但是化学试剂会导致蛋白质共价键特别是肽键断裂，使得蛋白质聚集，不利于后续的酶解。为解决这些问题，不添加任何试剂的物理前处理手段被广泛应用。但是当前存在的物理前处理方法手段单一，对后续酶解得率的促进效果不明显。
发明内容
本发明的目的提供一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，该方法所得高抗氧化性生物活性肽清除自由基、螯合金属离子效果好。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％～5％的肌原纤维蛋白溶液，0～4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：
(1)100～500MPa(优选250～350MPa，进一步优选300MPa)压力下用超高压设备处理5～25min(优选15～25min，进一步优选20min)；
(2)200～500bar(优选250～350bar，进一步优选300bar)压力下高压均质设备处理1～4个(进一步优选2个)循环(该循环指的是高压均质中的处理次数，即200～500bar压力下高压均质设备处理1～4次；2个循环即在相同压力下将溶液通过高压均质设备两次；以下相同)；
(3)在100～500MPa(优选250～350MPa，进一步优选300MPa)压力下用超高压设备处理5～25min(优选15～25min，进一步优选20min)，再在200～500bar(优选250～350bar，进一步优选300bar)压力下高压均质处理2个循环(高压均质采用高压均质设备，或称高压均质机)；
(4)在200～500bar(优选250～350bar，进一步优选300bar)压力下高压均质处理1～4个循环，再在100～500MPa(优选250～350MPa，进一步优选300MPa)压力下用超高压设备处理5～25min(优选15～25min，进一步优选20min)；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为50～70wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
按照上述技术方案，所述步骤2中提取肌原纤维蛋白的方法为：
1)溶液的配制：
0.1mmol/L马来酸缓冲液：5.8035g马来酸定容到500mL；
A液(20mmol/L)：3.7275g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
B液(0.6mol/L)：44.73g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
2)提取(实验步骤)：所有提取均在4℃的冰浴环境中开展，
10倍体积A液提取两次：10g肉+100mL的A液，混合液均质1min，300目纱布过滤后留沉淀；所得沉淀再重复上述操作一次；
5倍体积B液提取一次：50mL的B液加入到沉淀中，在4℃冰箱搅拌浸提过夜；
浸提液混匀，在4℃12000rpm下离心20min，留上清，得到肌原纤维蛋白盐溶液；
上清(即肌原纤维蛋白盐溶液)+10倍体积4℃去离子水，4℃、12000rpm下离心20min，留沉淀，沉淀重复操作水洗两次，得到肌原纤维蛋白。
按照上述技术方案，所述步骤3中0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液的制备方法为：44.73gKCl+2.4228g Tris定容到1L，利用0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH至6.95～7.05。
步骤5中选用的蛋白酶、蛋白酶用量、酶解时间均是在预实验的基础上筛选得到的较佳条件。
本发明利用超高压结合高压均质处理淡水鱼肌原纤维蛋白制高抗氧化性生物活性肽，能提高淡水鱼肌原纤维蛋白的酶解效率和抗氧化活性的物理前处理，所得高抗氧化活性肽清除自由基、螯合金属离子效果好，且得到的产品纯度高，操作简单的，从而为鱼肉及其副产物的相关研究提供一定的技术支撑。
本发明的有益效果是：本发明方法利用超高压处理、高压均质处理、超高压后高压均质处理、高压均质后超高压处理技术下所得的肌原纤维蛋白溶液，与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到64.02％、59.24％、65.90％、63.22％；铁离子螯合能力由11.89％提升到20.74％、22.26％、27.14％、21.65％，还原能力由0.26％提升至0.29、0.3、0.33、0.32％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中，所述步骤2中提取肌原纤维蛋白的方法为：
1)溶液的配制：
0.1mmol/L马来酸缓冲液：5.8035g马来酸定容到500mL；
A液(20mmol/L)：3.7275g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
B液(0.6mol/L)：44.73g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
2)提取(实验步骤)：所有提取均在4℃的冰浴环境中开展，
10倍体积A液提取两次：10g肉+100mL的A液，混合液均质1min，300目纱布过滤后留沉淀；所得沉淀再重复上述操作一次；
5倍体积B液提取一次：50mL的B液加入到沉淀中，在4℃冰箱搅拌浸提过夜；
浸提液混匀，在4℃12000rpm下离心20min，留上清，得到肌原纤维蛋白盐溶液；
上清+10倍体积4℃去离子水，4℃、12000rpm下离心20min，留沉淀，沉淀重复操作水洗两次，得到肌原纤维蛋白。
所述步骤3中0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液的制备方法为：44.73g KCl+2.4228g Tris定容到1L，利用0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH至6.95～7.05。
实施例1：
一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)100MPa压力下用超高压设备处理5min；(2)200bar压力下高压均质设备处理1循环；(3)在100MPa压力下用超高压设备处理5min，再在200bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在200bar压力下高压均质处理1个循环，再在100MPa压力下用超高压设备处理5min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为50wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到64.02；铁离子螯合能力由11.89％提升到20.74％，还原能力由0.26％提升至0.29％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
实施例2：
一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)250MPa压力下用超高压设备处理15min；(2)250bar压力下高压均质设备处理2循环；(3)在250MPa压力下用超高压设备处理15min，再在250bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在250bar压力下高压均质处理2个循环，再在250MPa压力下用超高压设备处理15min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为60wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到59.24％；铁离子螯合能力由11.89％提升到22.26％，还原能力由0.26％提升至0.3％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
实施例3：
一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)300MPa压力下用超高压设备处理20min；(2)300bar压力下高压均质设备处理2个循环；(3)在300MPa压力下用超高压设备处理20min，再在300bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在300bar压力下高压均质处理2个循环，再在300MPa压力下用超高压设备处理20min。
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为60wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到65.90％；铁离子螯合能力由11.89％提升到27.14％，还原能力由0.26％提升至0.33％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
实施例4：
一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)350MPa压力下用超高压设备处理25min；(2)350bar压力下高压均质设备处理2个循环；(3)在350MPa压力下用超高压设备处理25min，再在350bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在350bar压力下高压均质处理2个循环，再在350MPa压力下用超高压设备处理25min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为70wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到63.22％；铁离子螯合能力由11.89％提升到21.65％，还原能力由0.26％提升至0.32％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
实施例5：
一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为5％的肌原纤维蛋白溶液，0～4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)500MPa压力下用超高压设备处理5min；(2)500bar压力下高压均质设备处理4个循环；(3)在500MPa压力下用超高压设备处理5min，再在500bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在500bar压力下高压均质处理4个循环，再在500MPa压力下用超高压设备处理5min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为70wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
与未经前处理的进行对比，DPPH自由基清除率由54.50％提升到61.2％；铁离子螯合能力由11.89％提升到23.6％，还原能力由0.26％提升至0.32％。说明经过了预处理的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于未经预处理的；在不同的前处理方式中，先超高压后高压均质处理所得的肌原纤维蛋白酶解液的抗氧化活性大于其他预处理方式下的；另外，本发明方法使蛋白质内部的疏水性基团部分暴露，蛋白颗粒尺寸减小、蛋白质构象结构改变，蛋白质结构松散，不会破坏肌原纤维蛋白的营养成分。
对比例1(无超高压处理、高压均质处理步骤)：
一种生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤5、将步骤4所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为60wt％的浓缩液；
步骤6、将步骤5所得浓缩液进行冷冻干燥，即得生物活性肽。DPPH自由基清除率、铁离子螯合能力、还原能力见表1。
对比例2(超高压处理)：
一种生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液在：250MPa压力下用超高压设备处理15min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为60wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得生物活性肽。DPPH自由基清除率为、铁离子螯合能力、还原能力见表1。
对比例3(高压均质处理)：
一种生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液在：300bar压力下高压均质设备处理2个循环；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为60wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得生物活性肽。DPPH自由基清除率为、铁离子螯合能力、还原能力见表1。
对比例4(高压均质后超高压)：
一种生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％的肌原纤维蛋白溶液，4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)350MPa压力下用超高压设备处理25min；(2)350bar压力下高压均质设备处理2个循环；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为70wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得生物活性肽。DPPH自由基清除率为、铁离子螯合能力、还原能力见表1。
1、DPPH自由基清除率测量方法：
(1)溶液配制：
准确称取7.92mgDPPH，用质量浓度为95％乙醇溶解并定容到100mL，配置成0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液(用去离子水配置酶解液)；
(2)测定步骤：
取2mL样品+2.0mLDPPH乙醇溶液混合均匀，黑纸包裹暗处反应放置30min后测517nm处的吸光值，计为Ai；
取2mL样品+2.0mL 95％乙醇溶液混合摇匀测定517nm处的吸光值，读数计为Aj；
取2mL DPPH乙醇溶液+2mL蒸馏水混合摇匀测定517nm处的吸光值，读数计为Ac；
取2mL95％乙醇溶液+2mL蒸馏水混合摇匀作为空白调零。
所有测定值均为三次平均值，清除率计算公式：
R＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％
2、铁离子螯合能力测定方法：
(1)溶液配制：
2mM FeCl2：称取0.02g FeCl2·4H2O，定容至50mL。
5mM菲洛嗪：称取0.05g菲洛嗪，定容至20mL。
10％柠檬酸：称取5g柠檬酸，定容至50mL
(2)测定步骤：
在试管中分别加入1mL样品，加蒸馏水3.7mL，同时加入0.1mL 2mM的FeCl2和0.2mL5mM的菲洛嗪溶液，反应10min后于562nm下测定吸光值。空白管以水代替样品。
亚铁离子鳌合能力％＝[(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值]*100。
3、还原能力测定方法：
(1)溶液配制：
0.2M磷酸缓冲液(pH6.6):1.95g NaH2PO4·2H2O，2.68g Na2HPO4·12H2O，定容至100mL。
1％铁氰化钾：0.5g铁氰化钾，定容至50mL。
10％三氯乙酸：5g三氯乙酸，定容至50mL。(避光)
0.1％三氯化铁：0.05g三氯化铁，定容至50mL。
(2)测定步骤：
在试管中分别加入0.5mL的样品。同时加入2.5mL的磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 1％的铁氰化钾溶液。混合物50℃水浴20min后加入2.5mL 10％的三氯乙酸，3000r/min离心10min。取2.5mL上清，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1％氯化铁溶液。反应10min后测定700nm处吸光值，该值越高说明样品的还原性越强。
表1
Figure BDA0003221911540000081
Figure BDA0003221911540000091
本发明超高压处理、高压均质处理的压力、时间，其上限、下限、中间取值等都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims (5)

1.一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、将新鲜淡水原料鱼或流水解冻后的冷冻原料鱼粉碎并混匀，制成肉糜状样；
步骤2、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏状固体；
步骤3、利用0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液溶解肌原纤维蛋白膏状固体，得到质量浓度为2％～5％的肌原纤维蛋白溶液，0～4℃保存；
步骤4、将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)100～500MPa压力下用超高压设备处理5～25min；(2)200～500bar压力下高压均质设备处理1～4个循环；(3)在100～500MPa压力下用超高压设备处理5～25min，再在200～500bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在200～500bar压力下高压均质处理1～4个循环，再在100～500MPa压力下用超高压设备处理5～25min；
步骤5、将步骤4预处理后得到的肌原纤维蛋白溶液用4000u/g的胃蛋白酶在55℃下酶解6h，灭酶，离心，收集上清液；
步骤6、将步骤5所得到的上清液真空浓缩至固形物质量分数为50～70wt％的浓缩液；
步骤7、将步骤6所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化性生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于：将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)250～350MPa压力下用超高压设备处理15～25min；(2)250～350bar压力下高压均质设备处理2个循环；(3)在250～350MPa压力下用超高压设备处理15～25min，再在250～350bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在250～350bar压力下高压均质处理2个循环，再在250～350MPa压力下用超高压设备处理15～25min。
3.根据权利要求1或2所述的一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于：将步骤3得到的肌原纤维蛋白溶液分别在：(1)300MPa压力下用超高压设备处理20min；(2)300bar压力下高压均质设备处理2个循环；(3)在300MPa压力下用超高压设备处理20min，再在300bar压力下高压均质处理2个循环；(4)在300bar压力下高压均质处理2个循环，再在300MPa压力下用超高压设备处理20min。
4.根据权利要求1所述的一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中提取肌原纤维蛋白的方法为：
1)溶液的配制：
0.1mmol/L马来酸缓冲液：5.8035g马来酸定容到500mL；
20mmol/L的A液：3.7275g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
0.6mol/L的B液：44.73g KCl+2.4228g Tris定容到1L，0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH＝7；
2)提取：所有提取均在4℃的冰浴环境中开展，
10倍体积A液提取两次：10g肉+100mL的A液，混合液均质1min，300目纱布过滤后留沉淀；所得沉淀再重复上述操作一次；
5倍体积B液提取一次：50mL的B液加入到沉淀中，在4℃冰箱搅拌浸提过夜；
浸提液混匀，在4℃12000rpm下离心20min，留上清，得到肌原纤维蛋白盐溶液；
上清+10倍体积4℃去离子水，4℃、12000rpm下离心20min，留沉淀，沉淀重复操作水洗两次，得到肌原纤维蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中0.6mol/L KCl-Tris-马来酸溶液的制备方法为：44.73g KCl+2.4228g Tris定容到1L，利用0.1mmol/L马来酸缓冲液调pH至6.95～7.05。
CN202110960009.7A 2021-08-20 2021-08-20 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法 Active CN113621043B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110960009.7A CN113621043B (zh) 2021-08-20 2021-08-20 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110960009.7A CN113621043B (zh) 2021-08-20 2021-08-20 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113621043A CN113621043A (zh) 2021-11-09
CN113621043B true CN113621043B (zh) 2023-05-05

Family

ID=78386956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110960009.7A Active CN113621043B (zh) 2021-08-20 2021-08-20 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113621043B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120160A (zh) * 2014-06-10 2014-10-29 中国计量学院 一种小球藻抗氧化肽的制备方法
CN110100942A (zh) * 2019-05-14 2019-08-09 浙江万里学院 一种调控海鱼肌原纤维蛋白对风味化合物吸附能力的方法
CN110923287A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 集美大学 鲍鱼肌肉蛋白肽的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797183B (zh) * 2019-02-28 2020-12-29 江南大学 一种具有抗油脂氧化功能的活性肽及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120160A (zh) * 2014-06-10 2014-10-29 中国计量学院 一种小球藻抗氧化肽的制备方法
CN110100942A (zh) * 2019-05-14 2019-08-09 浙江万里学院 一种调控海鱼肌原纤维蛋白对风味化合物吸附能力的方法
CN110923287A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 集美大学 鲍鱼肌肉蛋白肽的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘伟 ; 宋弋 ; 张洁 ; 林琼 ; 吴杰 ; 孙倩倩 ; 王志东 ; .高压均质在食品加工中的研究进展.食品研究与开发.2017,(24),全文. *
张颖利 ; .超高压对肌原纤维蛋白酶解特性的影响.肉类工业.2017,(06),全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113621043A (zh) 2021-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104774896B (zh) 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法
CN106967169B (zh) 一种鱼胶原蛋白的提取方法
CN101851300B (zh) 硫酸软骨素提取工艺
CN103773830A (zh) 一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法
CN108866134B (zh) 一种蚕蛹蛋白多肽螯合钙的制备方法
CN103392902A (zh) 利用花生粕制备强抗氧化肽的方法
CN112608968B (zh) 一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法
CN112608966A (zh) 一种超声辅助矿物质螯合杏仁肽及其制备方法和应用
CN102875697A (zh) 一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺
CN105603032A (zh) 一种灵芝蛋白肽-硒螯合物的制备方法
CN113621043B (zh) 一种高抗氧化性生物活性肽的制备方法
CN108642111A (zh) 一种鱼皮胶原蛋白肽螯合亚铁的制备方法
CN103601814B (zh) 从猪皮中提取透明质酸的方法
CN104839741A (zh) 一种抗疲劳铁肽的制备方法
CN107619411B (zh) 一种血红素提取方法
CN102827906B (zh) 一种ii型胶原和硫酸软骨素的综合提取工艺
CN109776694B (zh) 褐藻多糖铜、铁、锌三联螯合物的制备方法及其应用
CN109180829A (zh) 一种葛根总黄酮及多糖提取物的制备方法及应用
CN102936611B (zh) 一种从带鳞黑鲽鱼皮中提取的胶原及其应用
CN104892750A (zh) 一种酸溶性鱼鳞胶原蛋白的制备方法
CN104945501B (zh) 一种带鱼鱼骨铁螯合胶原肽
CN105817205B (zh) 一种吸附重金属离子的纳晶纤维素磁性粒子的制备方法
CN101704853A (zh) 欧李仁中苦杏仁苷的提取与纯化方法
CN103965352A (zh) 一种从大豆乳清废水中提纯Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的方法
CN109354600A (zh) 一种牛磺酸修饰的新型阿拉斯加鳕鱼多功能肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant