JP2014050402A - インスリン化合物の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インスリンのA鎖とB鎖のいずれも分裂させることなく酵素的に切断可能な結合を含む前駆体を、指向反応に相乗的に作用する最適量のトリプシン及びカルボキシペプチダーゼBの組合せ又は同時使用で処理することにより、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ及びインスリングルリジンへ転換する方法。
【効果】前記の酵素的転換反応は、操作工程数の削減、所望最終生成物の高い収率及び純度の点で利点を有する。
【選択図】なし
Description
配列番号1:アスパルト前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号2:アスパルト前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号3:アスパルト前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号4:リスプロ前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号5:リスプロ前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号6:リスプロ前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号7:グルリジン前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号8:グルリジン前駆体分子のアミノ酸配列。
配列番号9:グルリジン前駆体分子のアミノ酸配列。
R1は、OH、若しくはアミノ酸残基又はY1−Y2(Yはアミノ酸残基)であり、
A1〜A21部分はインスリンA鎖に対応し、そしてB1〜B27部分はインスリンB鎖に対応し、そのアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を含み、
R2はZ1−Z2(Z1はPro、Lys、Aspから選択され、そしてZ2はLys又はPro又はGluから選択される)若しくはZ1−Z2−Z3(Z1はPro、Lys、Aspから選択され、そしてZ2はLys又はPro又はGluから選択され、そしてZ3はスレオニン又はB30に対応するアミノ酸がスレオニンである条件で少なくとも3個のアミノ酸残基からなるペプチド部分)であり、
Xは、A鎖をB鎖に結合し、A鎖とB鎖のいずれも分裂させることなく酵素的に切断可能であり、少なくとも2個のアミノ酸(最初と最後のアミノ酸はリジン又はアルギニンである)を持つポリペプチドである〕
により表される対応の前駆体からインスリン化合物及びその類似体又は誘導体の調製方法である。
(a)インスリン又はインスリン誘導体の前駆体の適量を緩衝溶液に溶解し、
(b)前駆体溶液のさまざまなアリコットを約7.0〜9.0のpHの範囲で調製し、
(c)酵素トリプシン及びカルボキシペプチダーゼを同時に、工程(b)で調製したさまざまなアリコットに導入し、そして、混合物を約4〜10時間インキュベートし、
(d)クエン酸緩衝液及び塩化亜鉛の添加により所望のインスリン生成物を沈殿させる、
で順々に実行することを含む、前記方法に関する。
(a)インスリン又はインスリン誘導体の前駆体の適量を緩衝溶液に溶解する。
(b)前駆体溶液のさまざまなアリコットを約7.0〜9.0のpHの範囲で調製する。
(c)酵素トリプシン及びカルボキシペプチダーゼを同時に、工程(b)で調製したさまざまなアリコットに導入し、そして、混合物を約4〜10時間インキュベートする。
(d)クエン酸緩衝液及び塩化亜鉛の添加により所望のインスリン生成物を沈殿させる。
これらの説明は、直接、上記実施態様を記載するけれども、当業者は、本明細書に示されそして記載された特定の実施態様に対する改変及び/又は変更の修正を発想し得ると理解される。この説明の範囲に入るそのようなすべての改変又は変更は、本明細書にも含まれると意図される。特に言及しない限り、明細書及び請求項内の単語及びフレーズは、適用分野の通常の技術を有する者に対して通常かつ慣用の意味を与えることが発明者の意図である。本願出願時に出願人が知る本発明の好適な実施態様及び最良の形態の説明が表されており、かつ説明及び記載のみの目的が意図される。開示された詳細な形態に本発明を徹底し又は限定する意図はなく、多くの改変及び変更が上記教示に照らして可能である。実施態様は、本発明の原則及びその実用を最もよく説明し、そして、当業者に本発明をさまざまな実施態様において、さらに期待される特定の用途に適するようなさまざまな改変をもって最もよく活用できるようにするために選択及び記載された。
アスパルト前駆体(配列番号1、2及び3)
式X−[アスパルトB鎖(B1−B30)]−Y−[アスパルトA鎖(A1−A21)](式中、Xはリーダーペプチド配列であり、B鎖はB1−B30のアスパルトB鎖配列であり、YはB鎖とA鎖との間のリンカーペプチド配列であり、A鎖はアスパルトのA−鎖である)のアスパルト前駆体。この配列は、リーダー又は他のリーダーペプチド(例えばEEAEAEAEPRやGAVR)が欠落していてもよい。リンカーペプチドは、例えばR及びRDADDRに由来するいずれでもあり得る。
(コメント:リンカーペプチド中の“RR”は除去されている。もし、間違って失っているなら、他の場所で除かれたい。)
リスプロ前駆体(配列番号3、4及び5)
式X−[リスプロB鎖(B1−B30)]−Y−[リスプロA鎖(A1−A21)]〔式中、Xはリーダーペプチド配列であり、B鎖はB1−B30のリスプロB鎖配列であり、YはB鎖とA鎖との間のリンカーペプチド配列であり、A鎖はリスプロのA−鎖である〕のリスプロ前駆体。この配列は、リーダー又は他のリーダーペプチドが欠落していてもよい。リンカーペプチドYは、例えばR及びRDADDRに由来するいずれでもあり得る。前駆体配列は、配列番号3及び4により表される。前駆体は、すべての適当な発現系、例えばEscherichia coli、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、CHO細胞等により産生され得る。
グルリジン前駆体(配列番号5、6及び7)
式X−[グルリジンB鎖(B1−B30)]−Y−[グルリジンA 鎖(A1−A21)]〔式中、Xはリーダーペプチド配列であり、B鎖はB1−B30のグルリジン鎖配列であり、YはB鎖とA鎖との間のリンカーペプチド配列であり、A鎖はグルリジンのA−鎖である〕のグルリジン前駆体。この配列は、リーダー又は他のリーダーペプチドが欠落していてもよい。リンカーペプチドYは、例えばR及びRDADDRに由来するいずれでもあり得る。前駆体配列は、配列番号5及び6により表される。前駆体は、前駆体は、すべての適当な発現系、例えばEscherichia coli、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、CHO細胞等によって産生され得る。グルリジン前駆体を、Pichia発現ベクターpPIC9K中のMat−alfaシグナルペプチドを持ったフレーム内でクローン化した。グルリジン前駆体を発現するクローンを得るために、組換型プラスミドでPichia pastoris宿主株GS115を形質転換した。
陽イオン交換クロマトグラフィ工程を用いて発酵ブロスから捕獲した異なるインスリン化合物前駆体を、着色除去と保存の目的で結晶化した。結晶化は、結晶化初期の前駆体濃度が約2〜20g/L、好ましくは8〜14g/Lになるように行った。結晶化は、塩化亜鉛及びフェノールを添加することにより行い、それから、pHを3.0〜8.0、好ましくは3.5〜5.5の間に微調整した。フェノールは、CIEX溶出プール容積の0.1〜0.5%にて添加することができる。4%塩化亜鉛溶液は、CIEX溶出プール容積の3〜15%にて添加することができる。pHは、すべてのアルカリ、好ましくはNaOHやTRISを使用することにより微調整可能である。結晶化プロセスは、2〜30℃の温度にて行うことができ、そして、結晶が完全に形成されるようにスラリーをある時間保持する。前駆体結晶を遠心分離又はデカンテーションのいずれかで上澄から分離し得る
リスプロ前駆体の結晶化例
463mlの溶出プール(前駆体濃度13.8g/L)を取り出し、ほどよい流動化後、2.315mlのフェノール(EP容積の0.5%)を添加した。これに続いて、57.875mlの4%塩化亜鉛溶液(EP容積の12.5%)を添加した。この段階で、pHは4.08であり、420mlの2.5N NaOHを添加することによりpH4.8に微調整した。母液を低速撹拌条件下に15分間維持した後、低温室(2〜8℃)に移し、そこで、一晩維持した。その後、全混合物をBeckman Coulter Avanti J−26 XP遠心機内で、5000rpmで20分間遠心処理した。上澄内のロスは、1.55%であった。
アスパルト前駆体の結晶化例
500mlの溶出プール(前駆体濃度2.9g/L)を取り出し、ほどよい流動化後、0.625mlのフェノール(EP容積の0.125%)を添加した。これに続いて、15.625mlの4%塩化亜鉛溶液(EP容積の3.125%)を添加した。この段階で、pHは4.08であり、315mlの2.5N NaOHを添加することによりpH4.8に微調整した。母液を低速撹拌条件下に15分間維持した後、低温室(2〜8℃)に移し、そこで、5時間維持した。その後、上澄を遠心分離により分離した。上澄内のロスは、4%であった。
コメント:番号の変更(アスパルトを2A、そしてリスプロを2B)は可能か?他の場所では、A:アスパルト、B:リスプロ、そしてC:グルリジンの配列を維持することによって実施例を提供する。
グルリジン前駆体の結晶化例
グルリジン前駆体のSpセファロース展開から250mlの溶出プール(前駆体濃度3.8g/L)を取り出し、ほどよい流動化後、0.31mlのフェノール(EP容積の0.125%)を添加した。これに続いて、7mlの4%塩化亜鉛溶液(EP容積の3%)を添加した。この段階で、pHは4.13であり、2.5N NaOHを添加することによりpH4.9に微調整した。母液を低速撹拌条件下に30分間維持した後、低温室(2〜8℃)に移し、そこで、5時間維持した。その後、その後、上澄を遠心分離により分離した。上澄内のロスは7%であった。
酵素反応
異なるインスリン化合物を、対応の前駆体を酵素的転換から調製することが可能である。前駆体から最終生成物への直接転換は、二種のプロテアーゼ酵素の存在により得ることができる。酵素反応を二種の異なる方法で行った。第一は、前駆体を、植物、動物又は微生物起源のトリプシン又はトリプシン様酵素で処理せねばならない。トリプシン反応が終わるとき、同じ反応混合物内の中間体を、植物、動物又は微生物起源の第二のプロテアーゼ酵素カルボキシペプチダーゼB又は同様の酵素で処理した。カルボキシペプチダーゼBは、C−末端の先端で塩基性アミノ酸に作用することができる。別法として、のトリプシン及びカルボキシペプチダーゼ酵素を反応混合物にカクテル(一緒)で添加し、そして最適な対応生成物の形成が生起するまで、反応を継続させた。
個々の前駆体反応混合物にトリプシンのみを添加した場合
2gの個々のアスパルト、リスプロ及びグルリジン前駆体結晶を、5mlの6M TRIS溶液で溶解させた。生成物濃度個々の反応混合物を、3〜5mg/mlに保持した。反応混合物のpHを8.5に微調整した。トリプシンを、個々の反応混合物へ濃度50μg/mlにて添加した。反応は、4±0.5℃と室温(24±0.5℃)の両方で行った。反応混合物の終末のクロマトグラフィプロファイルは、反応温度に関して変化がなかったが、反応が完了するための時間は温度の増大とともに減少したことが観測された。反応温度を24±0.5℃に維持した。反応を8時間継続し、そして8時間の終わりに、試料を分析した。
アスパルト前駆体は、B−30 Des−スレオニンアスパルト及びDesオクタペプチドインスリンに転換されている。Desスレオニンアスパルトの比率は45%であり、desオクタペプチドインスリンは36%であった。必要とする中間体であるB31位に余分のアルギニン残基を持ったアスパルトの形成は、およそ10〜14%である。したがって、第二酵素のカルボキシペプチダーゼBを反応混合物に添加しても、最終生成物を作製するための全体収率は、<10〜15%である。
実験条件の次のフェーズでは、個々の前駆体混合物内にトリプシン及びカルボキシペプチダーゼBを一緒に添加することにより反応を行った。
4gのアスパルト前駆体結晶を、20mlの1M TRIS溶液に溶解させた。溶液の生成物濃度を5mg/mlに維持し、そして、TRIS濃度を添加により0.6Mに維持した。2.5N NaOH又は2N氷酢酸によって反応混合物のpHを微調整することにより一定量のアリコットを取った。pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0にて反応混合物のアリコットを調製した。異なる条件の個々の反応混合物として、この反応混合物1mlをそれぞれ各チューブに入れた。すべての試料に異なる濃度のトリプシン及びカルボキシペプチダーゼBを一緒に添加することにより、反応を行った。変更した異なるパラメータを表にする。
・生成物濃度5g/L
・TRIS緩衝液濃度0.6M
可変パラメータ:
・トリプシン濃度:25〜500mg/L
・カルボキシペプチダーゼ濃度:10〜30mg/L
・pH:7.0〜9.0
トリプシン及びカルボキシペプチダーゼを一緒に反応混合物に添加したときは、Desオクタペプチド形態及びdes−スレオニン形態の両方とも観測されなかった。反応終期には、アスパルトが反応の主生成物である。生成したアスパルトの純度及び収率は、個々の反応条件で変わる。アスパルト最高収率75%は、トリプシン濃度50mg/L、カルボキシペプチダーゼ濃度10mg/L及びpH8.5で観測された。
5gのリスプロ前駆体結晶を、25mlの1M TRIS溶液に溶解させた。溶液の生成物濃度を5mg/mlに維持し、そして、TRIS濃度を添加により0.6Mに維持した。2.5N NaOH又は2N氷酢酸によって反応混合物のpHを微調整することにより一定量のアリコットを取った。pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0にて反応混合物のアリコットを調製した。この反応混合物のそれぞれ1mlを各チューブに入れ、試料A、B、C等とラベルした。すべての試料に異なる濃度のトリプシン及びカルボキシペプチダーゼBを一緒に添加することにより、反応を行った。変更した異なるパラメータを表にする。
・生成物濃度5g/L
・TRIS緩衝液濃度 0.6M
可変パラメータ:
・トリプシン濃度:25〜200mg/L
・カルボキシペプチダーゼ濃度:10〜30mg/L
・pH:7.0〜9.0
トリプシン及びカルボキシペプチダーゼを一緒に反応混合物に添加したときは、Desオクタペプチド形態及びdes−スレオニン形態の両方とも観測されなかった。リスプロ最高収率78%は、トリプシン濃度50mg/L、カルボキシペプチダーゼ濃度10mg/L及びpH8.5で観測された。
5gのグルリジン前駆体結晶を、25mlの1M TRIS溶液に溶解させた。溶液の生成物濃度を5mg/mlに維持し、そして、TRIS濃度を添加により0.6Mに維持した。2.5N NaOH又は2N氷酢酸によって反応混合物のpHを微調整することにより一定量のアリコットを取った。pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0にて反応混合物のアリコットを調製した。この反応混合物のそれぞれ1mlを各チューブに入れ、試料A、B、C等とラベルした。すべての試料に異なる濃度のトリプシン及びカルボキシペプチダーゼBを一緒に添加することにより、反応を行った。変更した異なるパラメータを表にする。
・生成物濃度5g/L
・TRIS緩衝液濃度0.6M
可変パラメータ:
・トリプシン濃度:25〜200mg/L
・カルボキシペプチダーゼ濃度:10〜30mg/L
・pH:7.0〜9.0
グルリジン最高収率78%は、トリプシン濃度50mg/L、カルボキシペプチダーゼ濃度10mg/L及びpH8.5で観測された。
最終沈殿
リスプロ、アスパルト及びグルリジンに対応する前駆体の酵素反応について上記で説明した最高条件を実行した。
Claims (17)
- 式:
R1は、OH、若しくはアミノ酸残基又はY1−Y2(Yはアミノ酸残基)であり、
A1〜A21部分はインスリンA鎖に対応し、そしてB1〜B27部分はインスリンB鎖に対応し、そのアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を含み、
R2はZ1−Z2(Z1はPro、Lys、Aspから選択され、そしてZ2はLys又はPro又はGluから選択される)若しくはZ1−Z2−Z3(Z1はPro、Lys、Aspから選択され、そしてZ2はLys又はPro又はGluから選択され、そしてZ3はスレオニン又はB30に対応するアミノ酸がスレオニンである条件で少なくとも3個のアミノ酸残基からなるペプチド部分)であり、
Xは、A鎖をB鎖に結合し、A鎖とB鎖のいずれも分裂させることなく酵素的に切断可能であり、少なくとも2個のアミノ酸(最初と最後のアミノ酸はリジン又はアルギニンである)を持つポリペプチドである〕
により表される対応の前駆体からインスリンアスパルト、インスリンリスプロ及びインスリングルリジンへ転換する方法であって、
前記前駆体分子は、配列番号1、2又は3に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%相同であるアミノ酸配列であって、そのような前駆体のA及びB鎖は、アスパルトのA及びB鎖に一致する;
前記前駆体分子は、配列番号4、5又は6に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%相同であるアミノ酸配列であって、そのような前駆体のA及びB鎖は、リスプロのA及びB鎖に一致する;又は
前記前駆体分子は、配列番号7、8又は9に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%相同であるアミノ酸配列であって、そのような前駆体のA及びB鎖は、グルリジンのA及びB鎖に一致する;
により規定され、
前記方法は、組合せ又は同時使用されるトリプシン及びカルボキシペプチダーゼで前記前駆体を処理する行為を含み、ただし、トリプシンとカルボキシペプチダーゼの相対濃度比は5:6〜50:1にあって、少なくとも50%のアスパルト、リスプロ又はグルリジンをそれぞれ、des−オクタペプチド及びdes−スレオニンを含むことなく得ることを特徴とする、前記方法。 - トリプシンの相対量とインスリン前駆体の相対量が1:10〜1:500の範囲にある、請求項1に記載の方法。
- トリプシンの相対量とインスリン前駆体の相対量が、1:100である、請求項2に記載の方法。
- カルボキシペプチダーゼの相対量とインスリン前駆体の相対量が、1:500である、請求項1に記載の方法。
- トリプシンとカルボキシペプチダーゼの相対濃度比が、5:1である、請求項1に記載の方法。
- 転換反応のために使用するトリプシンの濃度が、少なくとも0.01mg/mlである、請求項1に記載の方法。
- 転換反応のために使用するカルボキシペプチダーゼの濃度が、少なくとも0.001mg/mlである、請求項1に記載の方法。
- 前駆体は液体又は結晶形態のいずれかである、請求項1に記載の方法。
- 転換反応をpH7〜9で行う、請求項1に記載の方法。
- 転換反応を2℃〜40℃の範囲の温度で行う、請求項1に記載の方法。
- 酵素的転換反応の期間は2〜24時間である、請求項1に記載の方法。
- 反応培地は、少なくとも30%の水又は水混和性溶媒を含む、請求項1に記載の方法。
- 水混和性溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン又はN,N−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる、請求項12に記載の方法。
- 反応培地は、緩衝剤として作用する塩をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記塩は、TRIS、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、グリシン、HEPES(N−2−ヒドロキシ−エチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸)からなる群から選ばれる、請求項14に記載の方法。
- 反応培地中で使用する塩の濃度は、10mM〜1Mである、請求項14に記載の方法。
- 反応培地中で使用する塩の濃度は、0.6Mである、請求項16に記載の方法。
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