JPH11130798A - 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 - Google Patents
正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法Info
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Abstract
ンまたはインスリン誘導体の前駆体をシステインまたは
システイン塩酸塩およびカオトロピック補助剤の存在下
に取得する方法の工程数の減少および収率の上昇。 【解決手段】 最初に、インスリンまたはインスリン誘
導体の前駆体の水性懸濁液をその前駆体のシステイン残
基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の1〜15
SH残基を生じる量のシステインまたはシステイン塩酸
塩と混合し、ついでpH約8〜約11.5、温度約15
〜約55℃においてカオトロピック補助剤の4〜9モル
溶液に前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有
懸濁液を導入し、得られた混合物をこの温度に約10〜
60分保持し、pH約8〜約11.5、温度約5〜約3
0℃で混合物を混合物中のシステインまたはシステイン
塩酸塩の濃度を約1〜5mM、カオトロピック補助剤の
濃度を0.2〜1.0Mに希釈する量の水に導入する各工
程を連続的に実施することからなる方法。
Description
スチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の
前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオ
トロピック補助剤の存在下に得る改良された方法に関す
る。
酸残基を有する2個のアミノ酸鎖からなるタンパク質で
ある。2個のアミノ酸鎖中には6個のシステイン残基が
見出され、それぞれ2個のシステイン残基は互いにジス
ルフィド橋を介して結合している。生物活性ヒトインス
リンでは、AおよびB鎖は互いに2個のシスチン橋を介
して結合し、さらに1個のシスチン橋がA鎖中に見出さ
れる。ヒトインスリン分子内には、統計学的にみて、ジ
スルフィド橋の形成には15の可能性がある。生物活性
ヒトインスリンには、15の可能性中の1個のみが認め
られる。ヒトインスリンでは、以下のシステイン残基が
互いに連結している。 A6−A11 A7−B7 A20−B19 AおよびBの文字はそれぞれのインスリンアミノ酸鎖を
示し、数字はそれぞれのアミノ酸鎖のアミノ末端からカ
ルボキシル末端に向けて数えたアミノ酸残基の位置を表
す。ジスルフィド橋は2個のヒトインスリン分子の間に
形成されることも可能で、無数に多数の異なるジスルフ
ィド橋が容易に生成できる。
ロインスリンの使用に基づくものである。ヒトプロイン
スリンは86アミノ酸残基の直鎖状アミノ酸鎖を有する
タンパク質であり、ヒトインスリンのBおよびA鎖は3
5個のアミノ酸残基を有するCペプチドを介して互いに
結合している。ヒトインスリンに見出されるジスルフィ
ド結合の形成は、ヒトインスリンのシステイン残基が硫
黄保護基たとえばS−スルホネート(−S−SO3 -)基
で提供される中間体を介して起こる(EP 0 037255
号)。正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリ
ンを得る方法も同じく知られていて(Biochemistry, 6
0, 1968;622−629)、システイン残基がチオール残基
(−SH)として存在するブタ膵臓から得られるプロイ
ンスリンに出発する。「正しく結合したシスチン橋」の
語は哺乳動物からの生物活性インスリン中に見出される
ジスルフィド橋を意味するものと理解すべきである。
スリン誘導体の前駆体、とくにヒトプロインスリンまた
はヒトインスリンとは異なるアミノ酸配列および/また
はアミノ酸鎖長を有するプロインスリンの微生物におけ
る製造を可能にする。遺伝子修飾された大腸菌細胞から
調製されるプロインスリンは正しく結合したシスチン橋
をもたない。大腸菌を用いてヒトインスリンを取得する
方法は以下の工程に基づくものである(EP 0 055 945
号)。すなわち、微生物の発酵−細胞の破砕−融合タン
パク質の単離−融合タンパク質のシアノーゲンハライド
による切断−プロインスリン配列を有する切断生成物の
単離−プロインスリンのシスチン残基のS−スルホネー
ト基による保護−S−スルホネートのクロマトグラフィ
ーによる精製−正しく結合したシスチン橋の形成−プロ
インスリンの脱塩−正しく結合したシスチン橋を有する
プロインスリンのクロマトグラフィーによる精製−プロ
インスリン溶液の濃縮−濃縮されたプロインスリン溶液
のクロマトグラフィーによる精製−プロインスリンの酵
素的切断によるヒトインスリンの取得−得られたヒトイ
ンスリンのクロマトグラフィーによる精製である。
ける損失によるインスリンの低収率である。多段階過程
経路のために、かなりの損失を見込まねばならない。単
離された融合タンパク質のシアノーゲンハライドによる
切断、スルフィトリシスおよびプロインスリンの精製の
段階から、プロインスリンの40%までの損失が見込ま
れる(EP 0 055 945号)。同様に、以後の精製工程から
最終生成物までの経過で多量の損失が起こり得る。
減らすことがでれば、ヒトインスリンまたはインスリン
誘導体の組換えDNA法による製造の収率の上昇を達成
することができる。
号)および EP 0 668 292 A2号には、インスリンまたは
インスリン誘導体を得る適切に改良された方法におい
て、シスチン橋が正しい連結型で存在しないインスリン
前駆体またはインスリン誘導体の前駆体を、メルカプタ
ンたとえばシステイン、ならびに少なくとも1種のカオ
トロピック補助剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩
の存在下に反応させて正しく結合したシスチン橋を有す
るインスリン前駆体またはインスリン誘導体の前駆体を
得る方法が開示されている。この既知の方法において
は、これらのタンパク質は最初1種のカオトロピック補
助剤または様々なカオトロピック補助剤の混合物の水溶
液にきわめて低濃度で溶解される。タンパク質混合物は
ついでメルカプタン水溶液と混合される。
を最初の工程でカオトロピック補助剤を用いて溶液にせ
ず、最初にメルカプタンを導入することにより、すなわ
ちシステインまたはシステイン塩酸塩を前駆体の水性懸
濁液中に導入し、前駆体を溶解させたのちに初めて、次
の工程でカオトロピック補助剤の水溶液中に導入し、最
後に、混合物を適当な量の水に導入して好ましいシステ
インまたはシステイン塩酸塩濃度に希釈して正しくフォ
ールディングした前駆体に導くと、正しくフォールディ
ングしたインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の
収率を上昇させ、フォールディング過程の反応時間を短
縮できることが見出されたのである。
スチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の
前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオ
トロピック補助剤の存在下に得る方法において、(a)
インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁
液を、その前駆体のシステイン残基あたりシステインま
たはシステイン塩酸塩の1〜15SH残基を生じる量の
システインまたはシステイン塩酸塩と混合し、(b) p
H約8〜約11.5、温度約15〜約55℃においてカ
オトロピック補助剤の4〜9モル溶液中に、前駆体のシ
ステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液を導入し、
得られた混合物をこの温度に約10〜60分間保持し、
(c) pH約8〜約11.5、温度約5〜約30℃の混
合物を、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩
の濃度を約1〜5mM、カオトロピック補助剤の濃度を
0.2〜1.0Mに希釈する量の水に導入する各工程を連
続的に実施することからなる方法に関する。
おいては、システインまたはシステイン塩酸塩の量は前
駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイ
ン塩酸塩の1〜6SH残基を生じる量に相当し、工程
(b)においては、前駆体のシステインまたはシステイン
塩酸塩含有懸濁液をpH8〜11、温度30〜45℃に
おいてカオトロピック補助剤の4〜9モル溶液中に導入
し、得られた混合物をこの温度に約20〜40分間保持
し、工程(c)においては、混合物をpH8〜11、温度
15〜20℃で、混合物中のシステインまたはシステイ
ン塩酸塩の濃度を約1〜5mM、カオトロピック補助剤
の濃度を0.2〜1.0Mに希釈する量の水に導入する方
法である。
て水素橋を破壊する化合物であり、たとえば硫酸アンモ
ニウム、グアニジン塩酸塩、エチレンカルボネート、チ
オシアナート、ジメチルスルホキシドおよび尿素であ
る。
ピック補助剤は、好ましくはグアニジン、グアニジン塩
酸塩、またはとくに好ましくは尿素である。
ピック補助剤の濃度は好ましくは7.0〜9Mであり、
工程(b)の温度は好ましくは40℃であり、工程(b)に
おけるpHは好ましくは10〜11である。
pHは好ましくは10〜11である。本発明の工程(c)
においては、混合物が導入される水の量は好ましくは混
合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を
2.5〜3mM、カオトロピック補助剤の濃度を0.5M
に希釈するように選択される。
(b)におけるカオトロピック補助剤の濃度は約8Mであ
り、工程(b)における温度は約40℃であり、工程(b)
におけるpHは約10.6であり、工程(c)におけるp
Hは約10.6であり、工程(c)における水の量は混合
物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約
2.5〜3mM、カオトロピック補助剤の濃度を0.5M
に希釈する方法である。
インスリン誘導体の前駆体であり、とくにそのシスチン
橋が正しく結合したプロインスリンである。
スリンすなわちヒトインスリン(配列表参照、配列番
号:1=ヒトインスリンのA鎖、配列番号:2=ヒトイ
ンスリンのB鎖)または動物インスリンの誘導体であ
り、天然に存在するアミノ酸残基の少なくとも1個の置
換および/または少なくとも1個のアミノ酸残基および
/または有機残基の付加によって異なり、相当する他の
点では天然に存在するインスリンと同一の誘導体であ
る。
合したシスチン橋を有するインスリンまたはインスリン
誘導体の前駆体から最終的に EP 0 600 372 A1号(また
はUS5,473,049号)または EP 0 668 292 A2号に記載の
方法に従い、トリプシンまたはトリプシン様酵素を用
い、また所望によりさらにカルボキシペプチダーゼBを
用いる酵素分解ついで吸着樹脂上での精製により、正し
く結合したシスチン橋を有するインスリンまたはインス
リン誘導体を調製することができる。
ンスリン誘導体は、好ましくは式I:
基であり、Zは、 a)His、ArgおよびLysよりなる群からのアミノ酸残
基であるか、 b)ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基Argま
たはLysからなる2または3個のアミノ酸残基を有する
ペプチドであるか、 c)遺伝子によってコ−ド可能な2〜35個のアミノ酸
残基を有し、1〜5個のヒスチジン残基からなるペプチ
ドであるか、 d)OHであり、R1は、フェニルアラニン残基(Ph
e)または共有結合であり、R3は、遺伝子によってコ−
ド可能なアミノ酸残基であり、ヒトインスリンのA鎖の
アミノ酸配列の残基A2−A20(式Iの簡略化のために
示していない)は動物インスリンまたはインスリン誘導
体に相当し、ヒトインスリンのB鎖のアミノ酸配列の残
基B2−B29(式Iの簡略化のため示していない)は動
物インスリンまたはインスリン誘導体に相当する]によ
って記載することができる。
は、アミノ酸鎖のN−末端から前方に指示される。括弧
内の式Iの細部たとえばA6、A20、B1、B7または
B19はインスリンのAまたはB鎖におけるアミノ酸残基
の位置に相当する。
基」の語は、アミノ酸Gly、Ala、Ser、Thr、Val、
Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、A
rg、Lys、His、Tyr、Phe、Trp、Proおよびセレノ
システインを表す。
び「残基B2−B29」の語はたとえば、ウシ、ブタまた
はニワトリからのインスリンのアミノ酸配列の意味とし
て理解される。インスリン誘導体の「残基A2−A20」
および「残基B2−B29」の語はアミノ酸の遺伝子によ
ってコ−ド可能な他のアミノ酸による置換によって形成
されるヒトインスリンの相当するアミノ酸配列を表す。
(Asn)、R1はフェニルアラニン(Phe)、Yはスレオ
ニン(Thr)、ZはOHである。
群からのアミノ酸残基、または c)ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基リジン
(Lys)またはアルギニン(Arg)である2〜45個の
アミノ酸残基を有するペプチドであり、R1は、フェニ
ルアラニン残基(Phe)または共有結合であり、(B2−
B29) は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはこれ
らの位置の1個または2個以上が任意に変化したインス
リン誘導体のB鎖の位置B2−B29におけるアミノ酸残
基であり、Yは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸
残基であり、Xは、 a)リジン(Lys)およびアルギニン(Arg)よりなる
群からのアミノ酸残基であるか、または b)ペプチドのN−末端およびカルボキシル末端はアミ
ノ酸残基リジン(Lys)またはアルギニン(Arg)であ
る2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドである
か、または c)遺伝子によってコ−ド可能な2〜35個のアミノ酸
を有し、1〜5個のヒスチジン残基からなるペプチドで
あり、(A2−A20) は、ヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはこれらの位置の1個または2個以上が任意に変
化したインスリン誘導体のB鎖の位置A2−A20におけ
るアミノ酸残基であり、R3は、遺伝子によってコ−ド
可能なアミノ酸残基である]を有し、そのシスチン橋
(式IIには示していない)が正しくフォールデフィング
されているインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体
の取得にとくに適している。
ニン(Arg)である2〜25個のアミノ酸残基を有する
ペプチドであり、R1は、フェニルアラニン残基(Ph
e)であり、(B2−B29) は、ヒトインスリンのB鎖の
位置B2−B29におけるアミノ酸残基であり、Yは、ア
ラニン(Ala)、スレオニン(Thr)およびセリン(S
er)よりなる群からのアミノ酸残基であり、Xは、アミ
ノ酸残基(Arg)であるか、ヒトインスリンのC鎖のア
ミノ酸配列を有するペプチドであり、(A2−A20) は、
ヒトインスリンのB鎖の位置A2−A20におけるアミノ
酸残基であり、R3は、アスパラギン(Asn)、セリン
(Ser)およびグリシン(Gly)よりなるアミノ酸残基
である。
15個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、R
1は、フェニルアラニン残基(Phe)であり、(B2−B2
9) は、ヒトインスリンのB鎖の位置B2−B29における
アミノ酸残基であり、Yは、スレオニン残基(Thr)で
あり、Xは、アミノ酸残基アルギニン(Arg)、または
ペプチドの最初および末端に2個の塩基性アミノ酸残基
とくにアルギニン(Arg)および/またはリジン(Ly
s)がある2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、(A2−A20) は、ヒトインスリンのB鎖の位置
A2−A20におけるアミノ酸残基であり、R3は、アミノ
酸残基、アスパラギン(Asn)またはグリシン(Gly)で
ある。
の残基Zは、一般に、式IIの前駆体のXのアミノ酸配列
の部分であり、プロテアーゼたとえばトリプシン、トリ
プシン様酵素またはカルボキシペプチダーゼBの活性に
より生成する。基R3はインスリンのA鎖の位置A21に
存在するアミノ酸残基である。基YはインスリンのB鎖
の位置B30に存在するアミノ酸残基である。
ギニンまたはリジン残基でアミノ酸鎖を切断するプロテ
アーゼである。カルボキシペプチダーゼBはアミノ酸鎖
のカルボキシル末端に存在するArgまたはLysのような
塩基性アミノ酸を除去するエキソプロテアーゼである
(Kemmlerら、J. Biol. Chem., 246:6786-6791)。
く連結したシスチン橋を有する式I(式中、Y、R1、R
2、R3、A2−A20 およびB2−B29 は項1において述
べた意味を有し、Zは、アルギニン残基(Arg)、ペプ
チド残基Arg−Arg、または−OHである)のインスリ
ンまたはインスリン誘導体を得ることができる。
く連結したシスチン橋を有する式I(式中、Y、R1、R
2、R3、A2−A20 およびB2−B29 は項2において述
べた意味を有し、Zは、アルギニン残基(Arg)、ペプ
チド残基Arg−Arg、もしくはLys−Lysまたは−OH
である)のインスリンまたはインスリン誘導体を得るこ
とができる。
いて微生物中で形成させることができる(EP 0 489 780
号、EP 0 347 781号、EP 0 453 969号)。遺伝子構築体
は大腸菌または放線菌のような微生物の発酵時に発現さ
れる。形成されるタンパク質は微生物の内部に沈積する
か(EP 0 489 780号)、または発酵溶液中に分泌され
る。
はインスリン誘導体の前駆体を、細胞破砕後直ちに、発
酵溶液および微生物に由来する多数のタンパク質が夾雑
したまま使用することができる。しかしながら、式IIの
前駆体はたとえば沈殿またはクロマトグラフィー精製後
の前精製型で使用することもできる。
の式において、Xは、ヒトインスリンからのC−ペプチ
ド(配列番号:3)であり、Yは、Thr(B30)であ
り、R1は、Phe(B1)であり、R2は、10アミノ酸
残基を有するペプチドであり、R3は、Asn(A21)で
あり、A2−A20は、ヒトインスリンのA鎖のアミノ酸
配列(アミノ酸残基2〜20)であり、B2−B29はヒト
インスリンのB鎖のアミノ酸配列(アミノ酸残基2〜2
9)である。
合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。
発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、
慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放
出された融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
融合タンパク質封入体20kg(凍結乾燥後の乾燥材料に
基づく。インスリン含有融合タンパク質の割合はHPL
Cを用いて測定する。50%)をpH10.6で8M尿
素溶液550Lに溶解する。必要に応じて濁りを生じる
少量の物質を遠心分離したのち、澄明な溶液をpH1
0.6、温度4℃で9000Lのシステイン(システイ
ン塩酸塩水和物5kg)の水溶液中に攪拌しながら加え
る。24時間後、フォールディング反応が完結したの
ち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有する
プロインスリン配列1の含量は、分析用HPLCを用い
て3.0kgと測定され、30%の変換に相当する。
いてpH5.0に調整して分離する。ついで1N水酸化
ナトリウム溶液を加えてpHを9にセットする。この溶
液にトリプシン3gを加える。HPLCで測定すると、
2−カルボキシ末端アルギニン残基を有するインスリン
1.25kgが得られる。
たのち、ヒトインスリンが得られ、これをクロマトグラ
フィー法を用いてさらに精製する。ヒトインスリンは式
Iに相当し、この式において、Yは、Thr(B30)であ
り、Zは、OHであり、R1は、Phe(B1)であり、
R3は、Asn(A21)であり、A2−A20は、ヒトインス
リンのA鎖のアミノ酸配列(アミノ酸残基2〜20)で
あり、B2−B29はヒトインスリンのB鎖のアミノ酸配
列(アミノ酸残基2〜29)である。
から構成され、それらは互いに正しく結合したシスチン
橋を介して連結している。EP 0 668 292号に記載されて
いるように、溶液を濃縮し、吸着樹脂を用いて精製す
る。インスリン2を含有する溶出液は、水で希釈し、p
Hを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカ
ラム上で精製することができる。
Mのグアニジン塩酸塩、50mM Tris、pH8.5、
5mMエチレンジアミン四酢酸塩(EDTA)、1%の
1,2−メルカプトエタノール、10mMジチオスレイ
トールの溶液40ml中に95℃で2分間溶解し、ついで
14000gで20分間遠心分離した。澄明な上清0.
02mlを高速液体クロマトグラフィーカラムに適用す
る。 カラム:Nucleogel(登録商標)RP 300−5/46(Macher
ey & Nage, Aachen, Germany) 勾配: 緩衝液A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA) 緩衝液B:アセトニトリル中0.09%TFA 温度:55℃ 総溶出時間:40分 勾配は、相当する溶出時間後に緩衝液Bの以下の量によ
って設定する:10分 25%、12分 60%、13分
90%、15分 100% 流速:1ml/分 検出:215nm インスリンの保持時間:約19分
により、実施例1に示したアミノ酸配列を有する融合タ
ンパク質を調製する(プロインスリン配列1、配列番
号:4)
合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。
発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、
慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放
出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
乾燥によって測定)を含有する融合タンパク質の水性懸
濁液に5kgのシステイン塩酸塩水和物を加える。プロイ
ンスリン配列1を有する懸濁液(インスリン含有融合タ
ンパク質の割合はHPLCで測定する。50%)を40
℃、pH10.2で8M尿素溶液550Lに溶解する。
澄明な溶液をpH10.6、温度15℃で9000Lの
水に攪拌しながら加える。約5時間後、フォールディン
グ反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合した
シスチン橋を有するプロインスリン配列1の含量は分析
用HPLCを用いて10.0kgと測定され、50%の変
換に相当する。
いてpH5.0に調整して分離する。ついで1N水酸化
ナトリウム溶液を加えてpHを9にセットする。この溶
液にトリプシン10gを加える。2−カルボキシ末端ア
ルギニン残基を有するインスリン4kgが得られる。カル
ボキシペプチダーゼBを使用して切断すると、ヒトイン
スリン(正しく結合したシスチン橋を有する配列番号:
1および2)が生じる。
る。ヒトインスリンを含有する溶出液は水で希釈し、p
Hを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカ
ラム上で精製することができる。
の式において、Xは、ヒトインスリンのC−ペプチド
(配列番号:3)であり、Yは、Thr(B30)であり、
R1は、Phe(B1)であり、R2は、10アミノ酸残基
を有するペプチドであり、R3は、Gly(A21)であ
り、A2−A20は、ヒトインスリンのA鎖のアミノ酸配
列(アミノ酸残基2〜20)であり、B2−B29はヒトイ
ンスリンのB鎖のアミノ酸配列(アミノ酸残基2〜2
9)である。
合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。
発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、
慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放
出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
融合タンパク質封入体20kg(凍結乾燥後の乾燥材料に
基づく。インスリン含有融合タンパク質の割合はHPL
Cを用いて測定する。50%)を、20℃、pH10.
6において8M尿素溶液550Lに溶解する。澄明な溶
液をpH10.6、温度4℃で9000Lのシステイン
(システイン塩酸塩水和物5kg)の水溶液中に攪拌しな
がら加える。24時間後フォールディング反応が完結し
たのち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有
するプロインスリン配列2の含量は分析用HPLCを用
いて3.0kgと測定され、30%の変換に相当する。
いてpH5.0に調整して分離する。ついで1N水酸化
ナトリウム溶液を加えてpHを9にセットする。この溶
液にトリプシン3gを加える。HPLCで測定すると、
2−カルボキシ末端アルギニン残基を有するインスリン
誘導体0.98kgが得られる。このインスリン誘導体は
式Iに相当し、この場合、Yは、Thr(B30)であり、
Zは、Arg−Argであり、R1は、Phe(B1)であ
り、R3は、Gly(A21)であり、A2−A20は、ヒトイ
ンスリンのA鎖のアミノ酸配列(アミノ酸残基2〜2
0)であり、B2−B29はヒトインスリンのB鎖のアミ
ノ酸配列(アミノ酸残基2〜29)であり、これらは互
いに正しく結合したシスチン橋を介して連結する配列番
号:6および7から構成される。
る。インスリン誘導体を含有する溶出液は、水で希釈
し、pHを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフ
ィーカラム上で精製することができる。
により、実施例3に従ってプロインスリン配列2(配列
番号:5)を有する融合タンパク質を調製する。
合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。
発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、
慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放
出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
乾燥によって測定)を含有する融合タンパク質の水性懸
濁液に5kgのシステイン塩酸塩水和物を加える。プロイ
ンスリン配列2を有する懸濁液(インスリン含有融合タ
ンパク質の割合はHPLCで測定する。50%)を40
℃、pH10.2で8M尿素溶液550Lに溶解する。
澄明な溶液をpH10.6、温度15℃で9000Lの
水に攪拌しながら添加する。約5時間後、フォールディ
ング反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合し
たシスチン橋を有するプロインスリン配列Iの含量は分
析用HPLCを用いて10.0kgと測定され、50%の
変換に相当する。
いてpH5.0に調整して分離する。ついで1N水酸化
ナトリウム溶液を加えてpHを9にセットする。この溶
液にトリプシン10gを加える。2.8kgのインスリン
誘導体が生じ、これらは互いに正しく結合したシスチン
橋を介して連結する配列番号:6および7から構成され
る。
る。インスリン誘導体を含有する溶出液は、水で希釈
し、pHを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフ
ィーカラム上で精製することができる。
Claims (13)
- 【請求項1】 (a) インスリンまたはインスリン誘導
体の前駆体の水性懸濁液をその前駆体のシステイン残基
あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の1〜15S
H残基を生じる量のシステインまたはシステイン塩酸塩
と混合し、 (b) pH約8〜約11.5、温度約15〜約55℃に
おいてカオトロピック補助剤の4〜9モル溶液に前駆体
のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液を導入
し、得られた混合物をこの温度に約10〜60分保持
し、ついで (c) pH約8〜約11.5、温度約5〜約30℃で混合
物を混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃
度を約1〜5mM、カオトロピック補助剤の濃度を0.
2〜1.0Mに希釈する量の水に導入する各工程を連続
的に実施することからなる、正しく結合したシスチン橋
を有するインスリンのまたはインスリン誘導体の前駆体
をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピ
ック補助剤の存在下に取得する方法。 - 【請求項2】 工程(a)において、システインまたはシ
ステイン塩酸塩の量は前駆体のシステイン残基あたりシ
ステインまたはシステイン塩酸塩の1〜6SH残基を生
じる量に相当し、 工程(b)において、前駆体のシステインまたはシステイ
ン塩酸塩含有懸濁液をpH8〜11、温度30〜45℃
でカオトロピック補助剤4〜9モル溶液に導入し、得ら
れた混合物をこの温度に約20〜40分保持し、 工程(c)において、混合物をpH8〜11、温度15〜
20℃で、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸
塩の濃度を約1〜5mM、カオトロピック補助剤の濃度
を0.2〜1.0Mに希釈する量の水に導入する請求項1
に記載の方法。 - 【請求項3】 カオトロピック補助剤はグアニジンまた
はグアニジン塩酸塩である請求項1または2に記載の方
法。 - 【請求項4】 カオトロピック補助剤は尿素である請求
項1または2に記載の方法。 - 【請求項5】 工程(b)におけるカオトロピック補助剤
の濃度は7.0〜9Mである請求項1〜4のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項6】 工程(b)における温度は40℃である請
求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 工程(b)におけるpHは10〜11であ
る請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 工程(c)におけるpHは10〜11であ
る請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 工程(c)における水の量は混合物中のシ
ステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を2.5〜3m
M、カオトロピック補助剤の濃度を0.5Mに希釈する
請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 工程(b)におけるカオトロピック補助
剤の濃度は約8Mとし、工程(b)における温度は約40
℃であり、工程(b)におけるpHは約10.6であり、
工程(c)におけるpHは約10.6であり、工程(c)に
おける水の量は混合物中のシステインまたはシステイン
塩酸塩の濃度を約2.5〜3mM、カオトロピック補助
剤の濃度を0.5Mに希釈する請求項2〜9のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項11】 インスリンまたはインスリン誘導体の
前駆体は式II: R2−R1−(B2−B29)−X−Y−Gly−(A2−A20)−R3 (II) [式中、 R2は、 a)水素原子、 b)リジン(Lys)およびアルギニン(Arg)よりなる
群からのアミノ酸残基、または c)ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸残基はリジ
ン(Lys)またはアルギニン(Arg)である2〜45個
のアミノ酸残基を有するペプチドであり、 R1は、フェニルアラニン残基(Phe)または共有結合
であり、 (B2−B29) は、ヒトインスリン、動物インスリンまた
はこれらの位置の1個または2個以上が任意に変化した
インスリン誘導体のB鎖の位置B2−B29におけるアミ
ノ酸残基であり、 Yは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であ
り、 Xは、 a)リジン(Lys)およびアルギニン(Arg)よりなる
群からのアミノ酸残基であるか、または b)ペプチドのN−末端およびカルボキシル末端におけ
るアミノ酸残基はリジン(Lys)またはアルギニン(A
rg)である2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチド
であるか、または c)遺伝子によってコ−ド可能な2〜35個のアミノ酸
を有し、1〜5個のヒスチジン残基からなるペプチドで
あり、 (A2−A20) は、ヒトインスリン、動物インスリンまた
はこれらの位置の1個または2個以上が任意に変化した
インスリン誘導体のB鎖の位置A2−A20におけるアミ
ノ酸残基であり、 R3は、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であ
る]の配列を有する請求項1〜10のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項12】 式IIにおいて、 R2は、 a)水素原子、または b)ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基アルギ
ニン(Arg)である2〜25個のアミノ酸残基を有するペ
プチドであり、 R1は、フェニルアラニン残基(Phe)であり、 (B2−B29) は、ヒトインスリンのB鎖の位置B2−B2
9におけるアミノ酸残基であり、 Yは、アラニン(Ala)、スレオニン(Thr)およびセ
リン(Ser)よりなる群からのアミノ酸残基であり、 Xは、アミノ酸残基アルギニン(Arg)またはヒトイン
スリンのC鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、 (A2−A20) は、ヒトインスリンのB鎖の位置A2−A2
0におけるアミノ酸残基であり、 R3は、アスパラギン(Asn)、セリン(Ser)および
グリシン(Gly)よりなる群からのアミノ酸残基であ
る、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 式IIにおいて、 R2は、 a)水素原子、または b)カルボキシル末端はアルギニン(Arg)である2〜
15個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、 R1は、フェニルアラニン残基(Phe)であり、 (B2−B29) は、ヒトインスリンのB鎖の位置B2−B2
9におけるアミノ酸残基であり、 Yは、スレオニン残基(Thr)であり、 Xは、アミノ酸残基アルギニン(Arg)であるかまたは
ペプチドの最初および末端に2個の塩基性アミノ酸残基
とくにアルギニン(Arg)および/ またはリジン(Ly
s)がある2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドで
あり、 (A2−A20) は、ヒトインスリンのB鎖の位置A2−A2
0におけるアミノ酸残基であり、 R3は、アミノ酸残基アスパラギン(Asn)またはグリ
シン(Gly)である、請求項11記載の方法。
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