JP2006513978A - プレプロインスリンの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
b)前記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
c)未溶解の融合タンパク質を含む封入体を単離する工程、
d)ペプチド鎖が正しくフォールディングされた前記融合タンパク質を溶解させ、同時にジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得る工程、
e)プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
f)ヒトインスリンを精製する工程、
g)ヒトインスリンを結晶化し、得られた生成物を乾燥させる工程。
Xは、
a)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
b)2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基(特にArg)であり、および、3個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も2個の塩基性アミノ酸残基(特にArgおよび/またはLys)
であり、
R1は、
a)水素、
b)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
c)2〜15個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
R2は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応し、残基B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応する。
Xは、35個のアミノ酸残基を有し、ヒトインスリンまたはサルのインスリンのC鎖配列を含むペプチド、または、29個のアミノ酸を有するペプチドであり、その配列は以下の通り:
Arg−Asp−Val−Pro−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg(配列番号1)、
R1は、2〜15個のアミノ酸残基を有し、そのカルボキシル末端アミノ酸残基がArgであるペプチドであり、
R2は、アミノ酸残基AsnまたはGlyであり、および、
残基A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖のアミノ酸配列に対応し、
残基B1〜B30は、B3位のAsnをLysで置換し、B29位のLysをGluで置換しているヒトインスリンのB鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応する。
a)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
b)2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基(特にArg)であり、および、3個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も2個の塩基性アミノ酸残基(特にArgおよび/またはLys)
であり、
R1は、
a)水素、
b)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
c)2〜15個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
R2は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応し、残基B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応し;
ここで、前記プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列を有し得る:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr
−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn;(配列番号2)
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Gly;(配列番号3)
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Lys−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Glu−Thr−Arg−Asp−Val−Pro−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn(配列番号4)。
a)フォールディングされていないプレプロインスリンを発現する遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
b)前記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
c)未溶解のフォールディングされていないプレプロインスリンを含む封入体を単離する工程、
d)ペプチド鎖が正しくフォールディングしたプレプロインスリンを溶解させ、同時にジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得て、それに続いて、上述の式1で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法を行う工程、
e)プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
f)ヒトインスリンを精製する工程、
g)ヒトインスリンを結晶化し、乾燥させる工程。
以下で本発明をより詳細に説明するが、これに限定されない。
微生物の発酵(プロセス段階a)の間、E.coli細胞は、プレプロインスリンのアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む封入体を形成した。発酵終了後、この細胞を遠心分離で単離し、通常の高圧ホモジナイズによって崩壊させた(プロセス段階b)。このプロセスで放出された不溶性の封入体を遠心分離で単離し、遠心分離機中で水で洗浄した(プロセス段階c)。それに続くプロセス段階dで、融合タンパク質の封入体を8M塩酸グアニジン溶液(pH10.8)に溶解させた。水で希釈し、塩酸システインを加えた後、3個のジスルフィド架橋をpH10.8、4℃で連結させて融合タンパク質をフォールディングさせ、式1で示されるプレプロインスリンを得た。次に、この溶液を10%濃度の塩酸を用いてpH5に調整し、その結果として外来タンパク質を沈殿させ、この沈殿を遠心分離で除去した。遠心分離後の上清は、0.6〜0.8g/lの単量体プレプロインスリンを含んでいた。プレプロインスリンの純度は、HPLC−RP分析で測定したところ、面積で約65%であった。HPLC−GPC分析により、より高分子量の不純物は、面積で約45%の割合と測定された。
上述のプロセスの段階a、b、cおよびdが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたE.coli細胞から得た:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn(配列番号2)。
Xは、サルのCペプチドの配列を含む35個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R1は、配列:Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg(配列番号5)の10個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R2は、アミノ酸残基Asnであり(ヒトインスリンのA鎖のA21と同一)、
A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖の配列を有する(A1〜A20のみ)ペプチド鎖であり、
B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖の配列を有するペプチド鎖である。
fast flow)(製造元:ファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech);製品番号17−0709−05)を用いて製造した。カラムを上から下へ大気圧1barで稼動させた。流速は2000ml/hとした。多重バルブ、ローディングポンプ(Ismatec MV)、および、バブルトラップをカラムの上流に取り付けた。以下の溶液を連続的にカラムに多重バルブを介して送り出した:
8.1Lのローディング溶液、
2.3Lの置換用緩衝液、
1.4Lの洗浄緩衝液、
1.4Lの再生溶液、
2Lの平衡緩衝液。
1.約10.2L 透過液画分
(生成物を置換する間、溶液ローディングの開始時はUV値20%から始め(上昇)、UV値35%にする(下降))
2.約1L 洗浄画分
(洗浄緩衝液のローディングの際はUV値30%から始め(上昇勾配)、UV値40%にする(下降))。
10.2L ローディング溶液(=カラム1の透過液分画,pH3.5に調節)
0.5L 置換用緩衝液当量
3.0L 溶出緩衝液A/B(等量のAおよびB)
2.3L 再生溶液
2L 平衡緩衝液。
溶出緩衝液Aはカラム2用の置換用緩衝液と同一である。
約1.0L 主画分
(溶出中、UV値65%から始め(上昇)、UV値76%(下降)にする)。
上述のプロセスの段階a、b、cおよびdが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたE.coli細胞から得た:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr−Arg−Arg−Glu−Aia−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Gly(配列番号3)。
式中、
Xは、サルのCペプチドの配列を含む35個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R1は、配列:Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg(配列番号5)の10個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R2は、アミノ酸残基Glyであり、
A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖の配列を有する(A1〜A20のみ)ペプチド鎖であり、
B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖の配列を有するペプチド鎖である。
10.2L ローディング溶液(=カラム1の透過液分画,pH4.6に調節)
0.5L 置換用緩衝液
3.0L 溶出緩衝液A/B(等量のAおよびB)
2.3L 再生溶液
2L 平衡緩衝液。
溶出緩衝液Aは、カラム2用の置換用緩衝液と同一である。
約0.9L 主画分(溶出中、UV値65%から始め(上昇)、UV値76%(下降)にする)
その他全ての透過液を、生物学的廃棄物チャンネルに排出した。
上述のプロセスの段階a、b、cおよびdが完了した後、以下のアミノ酸配列を有するプレプロインスリンの溶液を、適切に遺伝子操作されたE.coli細胞から得た:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Lys−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Glu−Thr−Arg−Asp−Val−Pro−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu
−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn(配列番号4)。
式中、
Xは、配列:Arg−Asp−Val−Pro−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg(配列番号1)の29個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R1は、配列:Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg(配列番号5)の10個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、
R2は、アミノ酸残基Asn(ヒトインスリンのA鎖のA21)であり、
A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖の配列を有する(A1〜A20のみ)ペプチド鎖であり、
B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖と類似した配列を有する、すなわちB3位のValをLysで置換し、B29位のLysをGluで置換したペプチド鎖である。
変性分析(表1)により、フォールディング反応中に生産されたより高分子量のポリマー状のプレプロインスリンが、天然インスリンの変性を誘導できることを示す。
インスリングラルギン 5g/L
クエン酸 5.2ミリモル/L
塩化亜鉛 3ミリモル/L
塩化ナトリウム 0.5g/L
n−プロパノール 7 %(v/v)
純水で500mlにし、
1N塩酸を用いて、pH3にした。
Claims (8)
- 式1:
a)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
b)2〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基(特にArg)であり、そして、3個より多いアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も2個の塩基性アミノ酸残基(特にArgおよび/またはLys)
であり、
R1は、
a)水素、
b)遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
c)2〜15個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
R2は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、そして、
残基A1〜A20は、ヒトインスリンのA鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応し、残基B1〜B30は、ヒトインスリンのB鎖またはインスリン類似体のアミノ酸配列に対応する)
で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法であって、プレプロインスリンの水溶液から、フロースルー式の陰イオン交換体での第一のクロマトグラフィー、および、それに続く吸着式の陽イオン交換体での第二のクロマトグラフィーによってより高分子量の物質が除去される、上記の方法。 - プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His
−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn(配列番号2)
を有する、式1で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。 - プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Lys−Thr−Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Gly(配列番号3)
を有する、式1で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。 - プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列:
Ala−Thr−Thr−Ser−Thr−Gly−Asn−Ser−Ala−Arg−Phe−Val−Lys−Gln−His−Leu−Cys−Gly−Ser−His−Leu−Val−Glu−Ala−Leu−Tyr−Leu−Val−Cys−Gly−Glu−Arg−Gly−Phe−Phe−Tyr−Thr−Pro−Glu−Thr−Arg−Asp−Val−Pro−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−Leu−Gln−Lys−Arg−Gly−Ile−Val−Glu−Gln−Cys−Cys−Thr−Ser−Ile−Cys−Ser−Leu−Tyr−Gln−Leu−Glu−Asn−Tyr−Cys−Asn(配列番号4)
を有する、式1で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。 - インスリンの変性を誘導するプレプロインスリン溶液から外来物質を分離するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第二のクロマトグラフィーは、pH3.0〜5.5で行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第二のクロマトグラフィーは、圧力1〜30barで行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- フォールディングされていないプレプロインスリンを発現することによってインスリンを製造する方法であって、
a)フォールディングされていないプレプロインスリンを発現する遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
b)上記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
c)未溶解のフォールディングされていないプレプロインスリンを含む封入体を単離する工程、
d)ペプチド鎖が正しくフォールディングしたプレプロインスリンを溶解させ、同時に、ジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得て、続いて請求項1〜7に記載の方法を行う工程、
e)プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
f)ヒトインスリンを精製する工程、
g)ヒトインスリンを結晶化し、乾燥させる工程、
を含む、上記の方法。
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