JPH013198A

JPH013198A - インターリューキン−２の精製方法

Info

Publication number: JPH013198A
Application number: JP63-121679A
Authority: JP
Inventors: パスカル　ベイロン; ジョン　エドワード　スマート; デビッド　ビンセント　ウェーバー
Original assignee: エフ．ホフマン　―　ラ　ロシュ　アーゲー
Priority date: 1987-05-19
Filing date: 1988-05-18
Publication date: 1989-01-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はインターリューキン−２の精製方法に関する。

インターリューキン−２の可溶性レセプターは組換えＤ
ＮＡ技術を用いて生産され、固体担体に固定化した。こ
のようにして得られた固定化レセプターを用いて生物活
性があシ、凝集していない高度精製インターリューキン
＝２を調製した。

近年、重要な生物活性分子が天然から単離され、或いは
組換えＤＮＡ技術により生産されてきている。

これらの分子の多くは特異的な細胞レセプターと結合す
るポリペプチド或いはタンパク質である。

これらのポリペプチドやタンパク質を精製するために調
製用電気泳動、デル濾過クロマトグラフィー、塩または
有機溶媒分画、イオン交換クロマトグラフィー等の従来
からよく知られる方法が用いられてきた。これらの従来
の技術を使用する際の問題は、それらの方法が一般に目
的のタンパク質に特異的でない点である。その結果、実
質的に純粋なタンパク質を得るには通常これらの方法の
多数を組合せて使用しなければならない。分析のだめの
試料の損失および各精製ステップでの回収が完全でない
ことより、このような何段口もの精製工程では全体の収
量が低下することが多い。

さらに最近では、精製しようとするタンパク質に特異的
なポリクローナル或いはモノクローナル抗体を含有する
抗体アフィニティーカラムを使用することにより結果は
改良されてきた。例えば、Ｋｕｎｇ　、米国特許／Ｉ６
４，４７６，０４９、は組換えヒト免反インターフェロ
ンを精製するためにヒト免疫インターフイロンのカルボ
キシル末端に特異的な固定化モノクローナル抗体を使用
した。抗体アフイニテイ力ラムを使用することにより精
製度の高い、均質タンパク質調製物さえ得ることが出来
るが、このようにして精製したタンパク質は完全な元来
の生物活性を保有してないかも知れない。

Ｐｅ５ｔｋａ　、米国特許４４，６２５，６２１、は重
要な生物活性を有するポリペプチドおよびタンパク質の
多くは凝集性を有し、二量体、二量体およびそれ以上の
多量体を形成することを明かにしている。

そのような凝集が起るとポリペプチドまたはタンパク質
は生物活性が低下するか、完全に活性を失なう。さらに
そのような凝集物質は、それを治療に用いた場合、患者
が抗体を形成するなどの悪い副作用を起す可能性がある
。抗体アフィニティーカラムはポリペプチドおよびタン
パク質の凝集体と非凝集体（単量体）とを必ずしも区別
しない。

目的のポリペプチドおよびタンパク質が凝集する可能性
は、天然で生産されている時には起ることのないような
条件下および濃度で組換え技術によって宿主細胞中に生
産され、細胞抽出物から単離される場合に特に高くなる
。そのような条件下で分子間Ｓ−Ｓ結合、他の共有結合
、或いは非共有結合を介して凝集しやすくなる。

全てではないにしても、大部分の生物活性ポリペプチド
およびタンパク質は特異的な細胞レセプターと結合して
作用するため、最近そのようなレセプターの性状研究が
多く成されてきた。最近ではそれらレセプター分子を研
究するために組換えＤＮＡ技術を利用してそれらの分子
を生産する方法が用いられている。インターリューキン
−２のレセプターをコードする遺伝子がこの方法でクロ
ーン化され、発現された。

インターリューキン−２は抗原性または分裂誘導により
ある補のＴ−リンパ細胞が分泌するホルモン様タンパク
性生育因子である。ＩＬ−２の作用は、活性化された、
休眠状態でないリンパ細胞の膜に存在する特異的な高親
和性レセプターにＩＬ−２タンパク質が結合することに
より仲介さ才りる。

Ｍｉｌｌｅｒら［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１５４巻、
４２１２−４２１７頁（ｉ９８５年）〕およびＳｈｉｍ
ｉｚｕら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｄ、　１
５巻、１５０５−１５１６頁（ｉ９８５年）〕はマウス
ＩＬ−２レセプターをコードするネズミｍＲＮＡからの
ｃＤＮＡをクローン化し、発現した。Ｌｅｏｎａｒｄら
［Ｎａｔｕｒｅ　５１１巻、６２６−６５１頁（ｉ９８
４年）〕およびＮ１ｋａｉｄ。

ら［Ｎａｔｕｒｅ　５１１巻、６６１〜６６５頁（ｉ９
８４年）〕はヒトＩＬ−２レセプターをコードするｃ　
ＤＮＡのクローニングおよび発現を報告している。

これらの研究は全て、ＩＬ−２レセプターをコードする
挿入配列を有するシラスミドでＣＯ８細胞をトランスフ
ェクトしている。そしてトランスフェクトした細胞を特
異抗体またはＩＬ−２結合により細胞膜中でのＩＬ−２
レセプターの発現を確認している。これらの研究ではレ
セプター分子が培養液中に分泌している示唆はなかった
。

さらに最近、Ｔｒｅｉｇｅｒら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　１６６巻、４０９９〜４１０５頁（ｉ９８６年）〕
は分泌型ヒ）ＩＬ−２レセプターの発現を開示した。

この分泌型レセプターはｊＬ−２レセノターのｃ　ＤＮ
Ａ全長を含有するプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Ｎａｅ　Ｉで切断して得られた。これにより完全なレセ
プター分子中の細胞質内部分および膜内部分と思われる
大部分が欠失した。得られる修飾ｃ　ＤＮＡを改良型マ
ウスＬ細胞にトランスフェクトシ、発現させた。このよ
うにして生産されたポリペプチドは「アンカー」成分が
欠損しているために培地中に分泌された。

本発明は固体担体に固定化した可溶性ＩＬ−２レセプタ
ー分子より成るＩＬ−２レセプタ一−アフイニテイ吸着
物およびその調製方法を提供する。

さらに本発明はそのようにして得られた吸着体を用いて
ＩＬ−２を精製する方法に関する。その精製方法は化学
合成されたもの、或いは天然から得られたもの、または
組換えＤＮＡ発現系により得られたものなど、如何なる
由来の工Ｌ−２に対してもその精製に応用される。

本発明の具体態様では、ヒトまたは動物細胞により生産
されたＩＬ−２を含有する溶液或いは調整液中のＩＬ−
２を次のような方法で精製する。

（ａ）　　該溶液または調整液を固体（不溶性）担体に
固定化した可溶性Ｉ　Ｌ−２レセノタ一分子を含有し、
該固定化レセプター分子がＩＬ−２と特異的に結合でき
るようなレセプターーアフイニテイ吸盾体と接触させて
ＩＬ−２を特異的に吸着体と結合させ、（ｂ）　　吸着体を洗滌して非結合混在物を除去し、（
ｃ）　　洗滌吸着体からＩＬ−２を遊離させ、（ｄ）’
　　遊ｉｘ　Ｌ　−２からレセプターーアフイニテイ吸
着体を分離する。

本発明のもう一つの実施態様としては、バクテリア発現
系を用いて生産した組換えＩＬ−２を次のような方法で
精製する。

（ａ）ＩＬ−２の発現を指示することの出来るベクター
により形質転換したバクテリアの培養細胞を破砕して細
胞溶菌物を作製し、（ｂ）　　溶菌物から不溶性画分を単離し、（ｃ）　　
溶菌物から単離した不溶性画分をおよそ４Ｍから７Ｍの
グアニジン塩酸の溶液で抽出してＩＬ−２含有抽出物を
得、（ｄ）ＩＬ−２含有抽出物をグアニジン塩酸非含有溶液
でおよそ１０倍から１，０００倍に希釈し、（ｅ）ＩＬ
−２含有の希釈抽出物を固体（不溶性）担体に固定化し
た可溶性ＩＬ−２レセプター分子を含み、該固定化レセ
プター分子がＩＬ−２と特異的に結合することの出来る
ようなレセプターーアフイニテイ吸着体と接触させ、Ｉ
Ｌ−２を吸着体に特異的に結合させ、（ｆ）　　吸着体を洗滌して非結合の混在物質を除去し
、（ｇ）　　洗滌吸着体よ、？ＩＬ−２を遊離して（ｈ）
　　遊離したＩＬ−２よりレセプターーアフイニテイ吸
着体を分離する。

ステツプ（ｄ）に於ける希釈の程度はおよそ１０倍から
１０００倍の範囲にあるが、およそ３０倍から５０倍の
希釈が望ましい。

また、本発明の別の具体態様では、バクテリアの発現系
により生産した組換えＩＬ−２を上記と同じように精製
するが、ステップ（ｃ）の抽出の前に細胞由来の混在物
質を抽出する前抽出ステップを行なう。前抽出のステッ
プは、溶菌物から単離した不溶性画分を（ｉ）緩衝塩溶液、および（ｉｎ　　１−７５　Ｍから２Ｍのグアニジン塩酸溶液
で抽出することより成る。

さらに本発明の他の具体態様では、バクテリアの発現系
で生産した組換えＩＬ−２を上述のように精製するが、
ステップ（ｄ）の希釈の次に希釈抽出液をおよそ４時間
から６日間以上の期間静置する。

好ましくは、希釈抽出液をおよそ１日から６日間静置す
る。

本発明は以下の詳細なる説明および次の図面を参考にさ
らに容易に理解できよう。

第１図はＩＬ−２レセプターーアフイニテイークロマト
グラフイーの原理を図示したものである。

ＩＬ−２はステップＩでＩＬ−２レセゾタ一分子（ＩＬ
−２Ｒ）を固定したマトリックスＭ（ｃルビーズ）に特
異的に吸着される。混在するタンパク質ＰはステップＨ
の洗滌で除去され、ＩＬ−２はマトリックスから遊離さ
れ（ステップＷ）で再生ビーズと精製ＩＬ−２を得る。

第２図はＷ、　ｃｏｌｉで生産し、レセプターーアフイ
ニテイークロマトグラフイーで精製した組換えヒトＩＬ
−２のセファデックス■Ｇ−５０カラムの浴出プロフィ
ルを示す。横軸：分画（Ｆ）；縦ｍ：２８０　ｎｍにお
ける吸収（Ａ２８０）。

第６図は動物細胞で生産され、レセプター−アフイニテ
イークロマトグラフィーにより精製した組換エヒトＩＬ
−２のセファデックＪＫＩ　ｏ　−５０カラムの溶出プ
ロフィルを示す。横軸二分画（Ｆ）；縦軸：　２８０　
ｎｍにおける吸収（Ａｌ　ｅ　ｏ　）。

第４図はＥ、ｃｏｌｉで生産され、抗体アフィニティー
クロマトグラフィーにより精製した組換えヒトＩＬ−２
のセファデックス■Ｇ−５０カラムの溶出プロフィルを
示す。横軸二分画（Ｆ、）；縦軸＝２８０ｎｍに於ける
吸収（Ａ２１１０）。

第５図は非還元状態下における５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動分析の結果を示す。試料は：標準分子
量マーカー混合物（Ｓ）；組換えＥ。

ｃｏｌｉ抽出物（ｉ列）　；　Ｆ、　ｃｏｌｉ抽出物の
レセプター−アフイニテイ力ラムの非吸着区分（２列）
：Ｅ、　ｃｏｌｉ抽出物からレセプターーアフイニテイ
カラム精製した組換え工ｔ、−２（６列）：組換えＩＬ
−２を生産するトランスフェクトした動物細胞からの調
整液（４列）：および調整液からのレセノターーアフイ
ニテイ精製した組換えＩＬ−２（５列）。ゲルの右端に
示した数字はマーカータンパク質の分子量をキロダルト
ン（＝１０００ダルトン）で表わしたものである。

第６図は、還元下（Ｒ）および非還元下（ＮＲ）に於け
る５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル電気泳動分析の結果
を示す。試料は：標準分子量マーカータンパク質混合物
（Ｓ）　；　［ｄｅｓ−Ａｌａ’−８ｅｒ”５］　−Ｉ
Ｌ−２を含むＲ，Ｃｏ１１抽出物（ｉ列）；アフイニテ
イ精製した［　ｄｅｓ−Ａｌａ’−８ｅｒ１２５）　−
１Ｌ　−２（２列）：［Ｌｙｅ２０）−Ｉ　Ｌ　−２を
含むＦ、、　ｃｏｌｉ抽出物（６列）；アフイニテイ精
製したＣＬｙ日２°）−ＩＬ−２（４列）：野生型組換
えヒ）ＩＬ−２を含むＰ、ｃｏｌｉ抽出物（５列）：お
よびアフイニテイ精製した野生型組換えヒ）ＩＬ−２（
６列）である。ゲルの左端の数字はマーカータンパク質
の分子量をキロダルト／（＝　１，０００ダルトン）で
表わしたものである。

本発明は第１図に図示した方法のレセプター−アフイニ
テイークロマトグラフィーを使用することにより優れた
精製を達成できる。この方法ではバクテリアの抽出物ま
たはＩＬ−２を含む溶液または調整培地をＩＬ−２の精
製した可溶性レセプターを固定化した不溶性担体と接触
させる。）ｆルビーズに結合したＩ　Ｌ−２Ｈ分子を矢
印で示す。

抽出物、溶液または培地中のＩＬ−２のみが固定化レセ
プターと特異的な高い親和性を有するため、ＩＬ−２の
みがビーズと結合（またはビーズに吸着）する。その結
果、そのように高い親和性を持たない混在タンパク質は
全て結合しないで残り、容易に洗滌除去できる。次にビ
ーズに特異的に結合したＩＬ−２は適当な方法で遊離さ
れ、再生ビーズと精ｊＪ　Ｉ　Ｌ　−２が得られる。

本発明の方法により精製され得るＩＬ−２は種種の方法
で入手できる。例えば、ヒトＩＬ−２の報告されている
アミノ酸〜配列ＣＴａｎｉｇｕｃｈｉ　　ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０２巻、５０５−６１０頁（ｉ９８５年）〕に
基づいて液相或いは固相法にょシ化学的に合成すること
が出来る。不ズミＩｎ、−２のアミノ酸へ配列はＹｏｋ
ｏｔａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ：１．　Ａｃａｄ、８ｃ
ｉＵＳＡ　８２巻、６８〜７２頁（ｉ９８５年）によ）
報告されている。ＩＬ−２はまたＩｎ、−２遺伝子の既
知配列に基づく組換えＤＮＡ技術を用いてバクテリア或
いは動物細胞の発現系により生産される。

組換えＩＬ−２を生産する形質転換したバクテリアは通
常、本技術で知られる方法を使用して破砕しなければな
らない。そのための方法の例としては、音波処理、フレ
ンチプレスまたは他の物理的方法による細胞破砕、浸透
圧処理、或いは凍結−融解のくシ返えしなどがある。

リンパ細胞またけＴ細胞株も工Ｌ−２の材料となる。例
えば、Ｇ１１ｌｌら、Ｊ、Ｆ、ｘｐ、　Ｍｅｄ−１５２
巻、１７０９〜１７１９頁（ｉ９８０年）は培養したマ
ウス、ラッテ或いはヒトリンパ細胞、または白血病ネズ
ミ或いはヒトＴ細胞株により調整培地中にＩＬ−２が生
産されることを記載している。

このような培養細胞は通常、植物性血球凝集素（フイト
ヘムアグルチニン）またはコンカナバリンＡによｊ５Ｉ
Ｌ−２生産が誘導されている。本発明によるレセプター
−アフイニテイー吸着体は多量の培地からＩＬ−２を選
択的に除去することが出来るため、このような調整培地
に対して特に有効である。

本発明のＩＬ−２レセプターは可溶性であってＩＬ−２
に特異的であるものならどんなレセプターでもよい。好
ましい実施態様では、Ｔｒｅｉｇｅｒら、前述が記載す
るヒトＩＬ−２レセプターの「アンカー欠失」修飾物が
使用される。この分子はカルボキシル末端の２８個のア
ミノ酸残基が欠失しているために可溶性である。それに
よＪＩＬ−２Ｒ生産細胞の膜への分子の保持が阻止され
る。ヒトＩＬ−２Ｈの全遺伝子がクローン化され、配列
決定されているので［Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　
６１２巻；７６８〜７７１頁（ｉ９８４年）］、それよ
りアミノ酸残基が少ない、或いは多い変異種で目的の性
状を有するものをよく知られる有機合成法、或いは組換
えＤＮＡ技術により容易に生産できる。

マウスのＩＬ−２レセプターの配列データも知られてい
るのでＣｍ１ｌＱｒら、前述〕、ヒトレセプターと同様
にこれらのレセプターの可溶型も調製することができる
。

ネズミとヒトＩ　Ｌ−２Ｈのアミノ酸醜配列の間には６
１％の相同性がある（　Ｍｉｌｌｅｒら、前述〕。

この事はこれらの種から得られるＩＬ−２およびＩＬ−
２レセプターは交叉反応性を示す可能性を示唆している
。事実、ネズミ組換えＩＬ−２はと）ＩＬ−２Ｈレセゾ
タ一−アフイニテイー吸着体に結合し、従ってこの吸着
体を利用して精製することが出来る。

本発明で使用されるレセプターは好ましくは以下の性状
を有する：１、　精製、好ましくは均質までの精製ができるように
可溶性であること、２、それらをコーＶする遺伝子のクローニングおよび高
レベルの発現が可能で、かなジの量が入手できること、
および６．適当な固体担体に固定化されても、ＩＬ−２を認識
し、高い親和性で結合すること。

使用できる固体担体の例としては、アガロースデル；架
橋化アガロ〜スゲル：均質孔径のガラスピーズ、好まし
くは非特異的なタンパク質の吸着を阻止するためにグリ
セロールおよびグリセロール様構造で被覆したもの；セ
ルロース粒子：ポリアクリルアミドゲルのビーズおよび
セファデックス■のような架橋デキストランなどがある
が、これらに限定されるものではない。以下に記載する
ように、修飾ポリヒ「ロキシシリカ担体が好ましい。

本発明による可溶性１：Ｌ−２レセプターは固体担体と
直接結合することが出来るが、また公知の種々のリンカ
−分子の一つを介して担体に結合することも出来る。使
用できるリンカ−分子の例は、例えばＬｏｗｅら、Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｂｐｍ、　１５巻、６６〜４０頁
（ｉ９８１年）により記載されている。

ＩＬ−２レセプターを不溶性担体に共有結合するだめの
試薬の選択は使用する担体の性状に依る。

アガロース或いはセルロースのような炭化水素では、水
性アルカリ中での臭化シアンとの反応を用いて活性化担
体を得、それにタンパク質またはポリペプチドを直ぐに
結合する。臭化シアンで活性化したアガロースは市販さ
れている。この目的にビスオキシラン類およびエピハロ
ヒドリン類も使用することが出来る（　Ｐｏｒａｔｈら
、Ｊ　、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。

３０巻：１６７〜１７７頁（ｉ９７１年）：ＮｉＮ１８
ｈｉｋａら、Ｊ、　５ｏｌｉｄ−ｐｈａＥｌｅ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　７巻：５５Ｎ４９頁（ｉ９７６年）〕。

ポリアクリルアミドデル誘導体はヒドラジンでの処理に
より調製することが出来、それに続いて各種アシル化剤
およびアルキル化剤を用いてさらに化学変換する（　Ｉ
ｎｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８巻：４０７
４−４０８２頁Ｃ１９６９年）〕。

孔径調整ガラスピーズはγ−アミノプロピルトリエトキ
シシランで処理してタンパク質の非特異吸着を起すシラ
ノール基を変換する。γ−アミノプロピル基はＩＬ−２
レセプターが結合できる結合部位を提供する。グリセロ
ール−またはグリコール相被覆ガラスピーズの誘導体は
過沃素酸ナトリウムによる処理で得られる（　５ａｎｄ
ｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ−８巻：１６６〜
１６８頁（ｉ９７１年）〕。

結合反応に関する一般総説はＷｅ　ｌ　ｉ　ｋｙら、Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ−２巻；２９６〜６２２頁（ｉ９６
５年）およびＧｕｉｌｆｏｒｄ　、　Ｃｈｅｍ、　８ｏ
ｃ、　Ｒｅｖ、　２巻：２４９〜２７０頁（ｉ９７，５
年）を参照のこと。

本発明によるＩＬ−２レセプター−アフイニテイー吸着
体は以下に記載するように、カラムクロマトグラフィー
手法またはバッチ法に使用できる。

バッチ法は、吸着体での流速が遅い時、カラム操作でつ
まるような時、或いはＩＬ−２結合を完全にするために
長時間の接触が必要な時などに使用するのが好ましい。

バッチ操作では、固定化ＩＬ−２ＲをＩＬ−２含有抽出
物、溶液または調整培地中に振とう或いは攪拌しながら
必要な時聞けん濁するだけでよい。

その後、吸着体を濾過、沈降、または吸着体を沈めてか
ら液体層を傾斜または吸引することにょ）分離する。次
に吸着体を洗滌してから結合しているＩＬ−２を遊離で
きる。

「ティーバッグ」バッチと呼ばれるバッチ法の変法も使
用できる。この方法ではＩＬ−２レセプター−アフィニ
ティー吸着体を繊維または他の材料で出来ている多孔質
の袋の中に入れる。次にバッグをＩＬ−２含有抽出物、
溶液、或いは調整培地に入れて適当な時間浸し、その後
、ティーバッグのように取シ出す。本性の利点は吸着体
の分離が容易で操作が簡単なことである。

ＩＬ−２がＩＬ−２レセプター−アフィニティー吸着体
と結合し、吸着体を洗滌して混在物質を除去した後はＩ
Ｌ−２を遊離させねばならない。

好ましい実施態様では、０．２Ｎの酢酸および０．２Ｍ
　Ｎａ（ｊを含有する低…の遊離溶液を用いる。−般に
、…、イオン強度或いは溶媒組成（例えば水親和性有機
溶媒やカオトロピック剤を添加することによる）を変化
させることによりＩＬ−２を吸着体から遊離することが
出来る。そのような変化はＩＬ−２と固定化ＩＬ−２Ｒ
の間の相互作用の強度を低下させて結合ＩＬ−２を遊離
（溶出）させるものと思われる。しかし、遊離の条件が
ＩＬ−２の不可逆的変性を起す程に厳しくならないよう
に注意しなければならない。また、遊離条件が不可逆的
にＩＬ−２Ｒを変性させることがなく、従って吸着体が
くり返えし使用できることが望ましい。

例特に記載をしない限シ、タンパク質の定量はＬｏｗｒｙ
らの方法、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９６巻：
２６５−２７５頁（ｉ９５１年）、に従い、ウシ血清ア
ルブミンを標準として用いた。この方法で得られた値を
アミノ酸分析定量により確認した。

アミノ酸分析は、Ｐａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＭｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ　（５ｈｉｖｅｌｙら編集）、Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ
ａ　ｐｒｅｓｓ　Ｌｎｃ、、　＝　ニーシャーシー州り
リフトン：１０５頁（ｉ９８６年）に記載される方法に
より、試料を４％チオグリコール酸含有の６Ｎ塩酸中に
て１１０℃、２０〜２４時間真空下で加水分解した後に
行なった。プロリンおよびシスティン値は過ギ酸酸化の
後に定量した。ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｎ２）ポリ
アクリルアミドデル電気泳動け１２％のゲル中でＬａｅ
ｍｍｌｉ　、Ｎａｔｕｒｅ２２７巻；６８０／−６８５
頁（ｉ９７０年）にょシ記載されるように行なった。

ＩＬ−２の生物活性はＧ１１ｌｉｓら、Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

１２０巻；２０２７〜２０６２頁（ｉ９７８年）の方法
の比色定量改良法を用いて測定した。この活性測定では
、生育がＩＬ−２に依存しているネズミ細胞傷害リンパ
様細胞株であるＣＴＬＬ細胞［Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ、　
Ｆｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４６巻；４６８〜４８２頁（ｉ
９７７年）〕を標的細胞として使用した。ＣＴＬＬ細胞
はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｇｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　、　１２５０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ
、ｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２
、Ｕ、Ｓ、Ａ、　（ｃ’ＴＬＬ−２、ＡＴＣＣＴＩＢ　
２１４　）、或いはＩｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、。

５ｅａｔｔｌｅ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｕ、Ｓ、
Ａ、より入手可能である。細胞は５％（ｖ／ｖ）ウシ胎
児血清（Ｇｉｂｃｏ）、２５　ｍＭ　ＨＦＰＥ５緩イ荀
液、５０μｇ／ｍｌデンタマイシン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ
　／　Ｐｌｏｕｇｈ　Ｉｎｃ、、　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌ
ｄ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）および２０
０年位／−の粗ヒトＩ　Ｌ−２を添加したＲＲＭＩ−１
６４０培地（Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ　　ｌ５ｌａｎ
ｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）中で維持した。

また標的細胞としてヒトＰＨＡ−芽球を使用することも
出来る。ヒトＰＨＡ−芽球はヒト末梢血液リンパ球をマ
イト−ジエンであるファイトヘムアグルチニン（ＰＨＡ
）で少なくとも５日間誘導することにより得られる。

アッセイの際には、ＩＬ−２含有培地よりＣＴＬＬ細胞
をベックマン遠心機Ｊ−６Ｂ型にて５００／ｇ１０分間
遠心分離して集め、ＭＬ−２非含有ＨＢ１０１培地（Ｈ
ａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌθ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ
。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）で２回洗滌す
る。細胞を５０μｇ　／　ｍｌのデンタマイシン含有の
ＨＢ１０１培地に再けん濁し、細胞濃度を２　Ｘ　１０
５個／ｄに調整する。測定試料を半面積マイクロタイタ
ー希釈して終容量０．１コとした。次の穴はＱ、Ｑ５＋
＋＋／のＨＢｌｏｌに試料０．０５−を＃加えて２倍希
釈とし、次々に最後の穴まで倍々希釈液を作製した。Ｉ
Ｌ−２を含有しない０．０５ｄの培地のみの穴が陰性対
照となる。全てのウェル（穴）に細胞けん濁液を０．０
５ｍ１添加し、プレートをプラコノアッセイは誘導細胞
でのグルコース代謝ノ最終産物として生成する乳酸（Ｌ
Ａ）の比色定量に基づいている。このＬＡの比色定量に
使用する試薬はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
＋米国ミズーリー州セントルイス、から入手した。溶液
Ａは０．６Ｍ−グリシン、８０　ｍＭヒドラジン緩衝液
、ｐ）］　９．２、中に１−６ｍ９／ｍ１ｃｒ）β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび０．０６％
（ｗ／ｖ　）のゼラチンを含有する。溶液Ｂは水を溶剤
として１６６年位／　ｍｌの乳酸デヒドロゲナーゼ、ｏ
、５η／　ｍｌのｐ−沃素ニトロテトラゾリウムバイオ
レットおよび０．０５η／　ｒｎｌの７エナジンメタス
ルホン酸を含有する。

シん酸緩衝塩溶液で希釈したＬＡ標準溶液をアッセイの
陽性対照とした。０．５５　Ｎ塩酸溶液を用いて反応を
停止した。各ウェル中に０−０５ｍＡ！の耐液Ａを含有
する９６−穴マイクロタイタープレート（ＤＹｎａｔｅ
ｃｈ　）を反応プレートとして使用し、生物活性アッセ
イ用プレートの対応するウェルから得られる０、０１５
ｍ１の試料が含有するＬＡ量を測定した。

反応プレートの各ウェルに０．０５ｍ１の溶液Ｂを添加
することにより反応を開始した。テトラゾリウム色素の
還元に十分な時間の後に、各ウェルに０．０５　ｍｌ　
ＨＣＪ溶液を添加して反応を停止した。反応プレートの
各ウェルの５５　Ｏｎ、ｍに於ける吸光度をマイクロプ
レート分光光度計（Ａｒｔｅｋモデル２００）で測定し
た。

ＩＬ−２活性の１単位はアッセイでの最大値の手分を示
すＺＬ−２の量と定義する。、ＴＬ−２の濃度は５０％
を示すウェルの希釈の逆数として計算する。Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｉｕ日ｔｉｔｕｔｅ日ｏｆ　ＨｅａｌｔｈのＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｍｏｄｉｆｒ
ｅｉｓ局（ＢＲＭＰ）のヒ）　工Ｌ　−２（Ｊｕｒｋａ
ｔ）対照試薬を標準として使用した。

ＩＬ−２レセプター測定はＲｕｂ　ｉ　ｎら、Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕ−ｎｏｌ、　１５５巻；５１７２〜５１７７頁（
ｉ９８５年）の二重エピトーゾＦＬＩＳＡ法を用いて行
なった。

ＩＬ−２レセプター活性の単位はＲｕｂ、ｉｎ　ら、Ｊ
。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１５５巻；”４１７２〜６１７７頁
（ｉ９８５年）、により定義されるとおシで、こ＼に引
用文献として採用される。

糖鎖非結合の組換えヒ）、ＩＬ−２は形質転換１−だＦ
、、　ｃｏｌｉにより、また糖鎖結合の組換えヒトＩＬ
−２はトランスフェクトした動物細胞により当技術で知
られる方法［：　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　　ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３０２巻；３０５−５１０頁（ｉ９８５年）：ヨー
ロッパ特許出願、公開番号Ａ９１５３９、公開８１９８
５年１Ｄ月１９日：これらを引用文献として採用する〕
を用いて生成する。バクテリア細胞および動物細胞調整
培地の溶解物からのＩＬ−２は以下に記載するようにし
て精製した。

好ましい実施態様では、組換えＩＬ−２はＴａｎｉｇｕ
ｃｈｉらのＤＮＡ配列（Ｎａｔｕｒｅ　３０２巻：３０
５〜３１０頁（ｉ９８６年）：り１用文献として採用〕
に基づく合成オリゴヌクレオチドを用いてヒトエＬ−２
ＱコードするｃＤＮＡを単離してＥ。

ｃｏｌｉ中で生成する。次にＣＤＮＡクローンを用いて
発現プラスミドｐＲ０２５６／　Ｉ　Ｌ　−２／Δｔｅ
ｔを構築する。本プラスミドおよびその構築に関する詳
細は引用文献として採用するＪｕら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃ’ｈｅｍ、　２６２巻；５７２６勺５７５１Ｎ（ｉ９
８７年）に記載されている。プラスミドを保有する形質
転換株は標準条件下で培養した。

他の好ましい実施態様では、ヒ）ＩＬ−２遺伝子でトラ
ンスフェクトしたジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損のチャ
イニーズハムスターオバリー細胞株（’　ＣＨＯ／　ｄ
ｈｆｒ−）を用いて組換えＩＬ−２を生産した。遺伝子
は真核細胞発現ベクターｐＥＣ１２ＭＩ（本シラスミＶ
を保有すルＦ、、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１ＣＤ状態で
１９８６年５月７日にＡｍｅｒｉｃａｎ　　ＴｙｐｅＣ
ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにブタペスト条約
に基づいて寄託され、寄託番号はＡＴｃｃ／１６６７１
ｏ９である）。このようにして得られるベクター１）Ｂ
Ｃ１２／　Ｒ８Ｖ　／　工Ｌ　−２／　ｄｈｆｒをＣＨ
Ｄ　ａ胞にトランスフェクトし、ＩＬ−２遺伝子は日本
特許出願鷹１７４５７８／８７．１９８７年１２月６日
に公開（公開番号２７８９９４／８７）されたようにし
て発現した。本特許は引用文献として採用。

３、組換え可溶性ＩＬ−２レセプターの生産と精ヒ）Ｉ
Ｌ−２レセプターの分泌型は本技術で知られる方法を用
いて動物細胞中で生産させた。

Ｔｒｅｉｇｅｒら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ−１５６巻；
４０９９Ｎ４１０５（ｉ９Ｂ６年）を参照のこと。本文
献は引用文献として採用。細胞培養からの培地を集め、
それから分泌型ＩＬ−２レセプターを精製した。

好ましい実施態様では、Ｔｒｅ　ｉｇｅｒら〔上述〕に
より記載されるプラスミドｐ　Ｉ　Ｌ２Ｒ，５を制限酵
素Ｎａｅ　Ｉで切断して全８１６　ｂｐのＩＬ−２Ｒコ
一ド配列に５′側に２４　ｂｐそして６′に６９　ｂｐ
の非翻訳配列が結合して含有する８　７９　ｂｐのＩＬ
−２Ｒ遺遺伝子片を切シ出した。Ｉ　Ｌ　−２ＲｃＤＮ
ＡをフレナラＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端とし
、上述の発現ベクターｐＢＣ７２ＭＨの平滑末端Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩおよびＢａｍ　Ｈｉの間にＴ４リガーゼを用
いて挿入した。このようにして得られた正しい方向に目
的のＩ　Ｌ　−２ＲｃＤＮＡの挿入を有する発現ベクタ
ーをｐＢＣ１２／ＩＬ−２Ｒと命名した。

ベクターｐＢＣ１２／ＩＬ−２ＲをＩ　Ｌ−２Ｒ遺伝子
の特有なＮａｅ　ｒ部位およびベクターの特有Ｓｍａ　
Ｉ部位で切断し、全ての６種の読みワクで終止コドンを
含む１４ｂｐのオリゴヌクレオチド（５’　−ＴＴＡＡ
Ｇ’ｒＴＡＡＣＴＴＡＡ−＋’　）を挿入してベクター
ｐＢ０１２　／　Ｉ　Ｌ　−２ＲＮａｅを得た。ベクタ
ーｐＢＣｌ　２／　Ｉ　Ｌ　−２ＲＮａｅはカルボキシ
ル末端の２８アミノ酸残基を欠き（Ｔｒｅｉｇｅｒら、
前述、の遺伝子と類似）、ロイシンおよびセリンのコド
ン（５′−ＴＴＡＡＧＴ−５’　）が付加した短かいＩ
Ｌ−２Ｒをコードする。

シラスミドｐＢＣ１２／　Ｉ　Ｌ　−２ＲＮａｅを用い
てＣｕｌ　１　ｅ　ｎの方法１：　Ｃｅ１ｌ　４６巻；
９７６−９８２頁（ｉ９８６年）〕により　ＣＨＯ／　
ｄｈｆｆ−細胞をトランスフェクトした。そのようなト
ランスフェクトした細胞の培養物で調整された培地中に
組換えＩＬ−２Ｒが生成された。

トランスフェクトしたＣ’ＨＯ細胞からの調整培地をミ
リボーアＰａ１ｌｉｃｏｎ■システム中にて１０．００
０ダルトン以上の分子量の分子を保持するＰＴＧＣカセ
ットを用いてダイアフィルトレージョンにより１０倍に
濃縮した。濃縮上澄液（ｉ，２００−）をポリヒドロキ
シＮｕ　Ｇｅ１−ＡＦ■担体（５ｅｐａｒａｔｉｏｎＩ
ｎｄｕ８ｔｒｉｅＳ、　Ｍｅｔｕｃｈｅｎ　、米国＝ニ
ーシャーシー州）に結合度４．７η／　ｕ／　）Ｆ″ル
で共有結合した糖鎖非結合の成熟組換えヒ）ＩＬ−２を
含有するＩＬ−２７フイニテイーカラム（４，４×６．
５ｃＩｎ）にのせた。ポリヒドロキシＮｕ　Ｇｅ１−Ａ
　４は次の式の６−Ｃ６−Ｃ２，６−ジヒドロキシ）ゾ
ロポキシ〕プロピル基を有するポリマーシリカの修飾物
である。

Ｈ固体担体物質は先ず過沃素酸で酸化した。次にＩＬ−２
を固体担体物質にＲｏｙら、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ３０６巻：２２５〜２２８頁（ｉ９８４年）によりｄ
己載されるようにシアノポロヒドリドナトリウムの存在
下で還元アミン化により結合した。

非吸着性混在物質はシん酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）による
洗滌にて除去し、特異結合したＩＬ−２ＲはＰＢＳ中６
ＭのＫＳＣＮで遊離した。アフィニティーカラム溶出物
をＰＢＳに対して透析後、４．４　Ｘ　２０．５ｃＩｎ
ＤＦＡＦ−シリカカラム（Ｎｕ　Ｇｅｌ　ｐ−ＤＦ　２
００■、５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
　）にのせた。ＩＬ−２ＲはカラムよりＰＢＳ中０．２
　Ｍ　Ｍａ　Ｃ！で溶出した。強力に結合した主要混在
物は続（ｌ　Ｍ　ＮａＣｊ溶出ステップで溶出した。　
　　　− 精製したＩＬ−２Ｒは還元下および非還元条件下でのＳ
ＤＳポリアクリルアミドデル電気泳動による分析で、単
量体および還元性二量体の混合物であることがわかった
。ＩＬ−２Ｈのこれら二つの型はＰＢＳを溶出液とした
５ｅｐｈａｃｒｙｌ■Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）によるゲ
ル濾過で相互に分離された。′ｅＩｔ製Ｉ　Ｌ−２Ｒの
単量体は比活性が６．５×１０８単位／■タンパクであ
った。

４、ＩＬ−２レセノターの固定化精製した単量体ＩＬ−２ＲをＮｕ　Ｇｅｌ　ｐ−ＡＦ■
ポリ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｐＮＨ８；５０
０Ａ、４０〜３０　μｍ　；　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　
Ｉｎｄｕ８−ｔｒｉｅｓ　）。Ｎｕ　Ｇｅｌ　ｐ−ＡＦ
■ポリ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドはな式の、５−（２−［［２−［（２，５−ジオキソ−１
−ピロリジニル）オキシ〕−２−オキンエチル〕アミン
〕エトキシ〕プロピル基を有する修飾ポリマーシリカで
ある。

次の操作を用いた。２０グラムの乾燥ＰＮＨ８（膨潤デ
ルの２８ゴに相当）を５００ｄ容の粗ガラス濾過器にと
り、２８ｍ１の冷水で６回手早く洗う。

洗滌したデルの全量を０．１ＭＮａＣｌ含有の０．１Ｍ
）ん酸カリ、ｐ）１７．０、中２．１■／ｄのＩＬ−２
Ｒ溶液を２８−入れた１００ｍ１の栓つき三角フラスコ
に移す。混合物を４℃で１６時間静かに振とうし、その
後反応液を濾過して未結合のＩＬ−２Ｒを集める。デル
を２８１Ｊ容のｐＢｓで２回洗滌する。

濾液と洗液を合わせて２リツトルのｐＢｓに対して４℃
で一晩透析する。

洗滌後直ちにゲルを２８ｒＩＬｌの１００　ｍＭエタノ
ールアミン−塩酸、ＰＩ−１７，０と合わせて１時間振
とうしてもし残存していたら未反応のＮＨ３−エステル
基を中和する。ＩＬ−２Ｒデルは２８　ｒｎｌ容のｐＢ
ｓで５回洗滌してから０．１％のアジドナトリウム含有
の同じ緩衝液中にて４℃で保存する。

透析液の容量を秤量し、タンパク量を２８０　ｎｍの分
光光度的に、この波長に於ける吸光度１．６５が１ｍ９
／ｍＩ！のＩＬ−２Ｒ溶液として測定した。最初に使用
Ｌ＆ＩＬ−２Ｒ（５８，８１ｎ９）と透析液中に回収サ
レタ未結合ＩＬ−２Ｒ（２９，４ｍ９）の差からの計算
で、ＩＬ−２Ｈの結合割合が１．０５〜タンパク／ｄ膨
ホ１デルとわかった。

５、　　Ｅ、ｃｏｌｉからの組換えＩＬ−２の精製と）
ＩＬ−２遺伝子を含むプラスミドで形質転換したＥ、　
ｃｏｌｉの細胞を、５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸
（ＥＤＴＡ　）を含有する３　０　ｍＭ　トリス−塩酸
、ｐＨ８，０、に均質にけん濁し〔緩衝液Ａ、　４ＩＲ
ｔ１ｇ細胞〕、２Ｎ８℃で攪拌した。けん濁液をＧａｕ
ｌｉｎホモジナイデ−（ＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ　、　Ｅ
ｖｅｒｅｔｔ。

米国マサチュセツッ州）を７．０００　ｐｓｉ　（およ
そ４．８　ｘ　１０７パスカル）の圧力下、ホモジナイ
ず−の出口の温度を二重コイルで２〜８℃に維持して２
〜６回通過させた。

溶菌物を５ｏｒｏａｌｌ　ＲＣ−５β遠心分離機でＧＳ
Ａローター（ＤｕＰｏｎｔ、米国プラウエア州つイルミ
ングトン）を用いて２４，０００　Ｘ　ｇにて１時間遠
心分離した。可溶性タンパク質を含む上澄液を捨てた。

ペレットを緩衝液Ａ（細胞１．ｌｉ’当た〕４ａ）にけ
ん濁し、４℃にて３０〜３０分間攪拌した。

上述の遠心分離のステップの後、上澄液を捨てた。

ペレットを１．７５　Ｍグアニジン・塩酸にけん濁しく
４１１Ｊ／、ｌ、前述のように３０分から１時間混合し
た。上澄液を捨て、ペレットを７Ｍグアニジン・塩酸に
けん濁しく４＃ＩＡ、＃ａ胞）、１時間攪拌した。抽出
物を上述のように遠心分離し、得られた上澄液をＰＢＳ
で４ｏ倍に希釈して４℃で２４時間靜靜置た。溶液を静
置している間に凝集粒子が生成してきた。希釈上澄液を
注意深く傾斜して沈降凝集粒子から除去してからＭｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ　−Ｐｅｌｌｊｃｏｎシステムを用いて２
０倍に濃縮した。

ＩＬ−２レセノターーアフイニテイーカラムは上述の固
定化ＩＬ−２Ｒｒルを２個のアダプターをもつＡｍｊｃ
ｏｎＧ−１６Ｘ２５０カラムに充填して調製した。カラ
ムはＰＢＳで平衡した。次に１゜ｇのＥ、　ｃｏ１ｉ細
胞由来の濃縮抽出物１３０１１Ｌｇをカラムにのせた。

カラムは流速が４１Ｌｌ／分で行なった。溶出液はＫｉ
ｐｐｅｎ　Ｚｏｎｅｎレコーダーに接続したＧ１１ｓｏ
ｎ　１１　Ｂ　　ＵＶ検出器（Ｇ１１ｓｏｎ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　、　Ｉｎｃ、、米国ウ
ィスコンシン州ミドルタウン）で追跡した。

カラムはその５倍容量のＰＢＳ　、或いは溶出液の２８
０　ｎｍにおける吸収がベースラインに戻るまで洗滌し
た。次にカラムに結合したＩ　Ｌ　＝　２を０．２Ｍ食
塩含有の０．２Ｎ酢酸の１〜２倍容でカラムから溶出し
た。集めた工Ｌ−２分画をＹＭ５メンブレンを用いた攪
拌Ａｍｊｃｏｎ　＠縮器で濃縮した。

精製工程の各分画でのＩＬ−２活性およびタンパク量を
測定した。その結果を第１表に示す。

第１表ｇ、ｃｏ’ｌｊからの組換えＩＬ−２の精製分画容量　
タンパク　活性　回収　比活性抽出物　１３０　８０．
０　　４１６　　１００　　　０．５２溶出ｉ　　１７
０　　６１．４　　２５０　　　３０　　　０．４１第
１表で最初の抽出物をカラムに吸着しなかった物質（溶
出液）およびカラムに特異的に吸着して酢酸で溶出し７
’（ＩＬ−２と比較した。第１表のデーターはバクテリ
アの溶菌物の不溶画分のグアニシン・塩酸抽出物中のＩ
Ｌ−２活性のおよそ４６％のみがカラムに特異的に結合
し、カラムにかけた残シはカラムを直接通過したことを
示している。溶出液のポリアクリルアミドデル電気泳動
分析（第５図、２列目）の結果、そこに含まれているＩ
Ｌ−２は凝集した高分子体であることがわかった。しか
し、前述のように希釈抽出液を２４時間でなく数日間静
置すると、単量体重Ｌ−２の割合が増加した。このよう
に処理した抽出物をＩＬ−２レセプターーアフイニテイ
ーカラムにかけると、ＩＬ−２の全活性の９０％以上が
特異的にカラムに結合した。

調整細胞培養培地６リツトルを上述のＩＬ−２レセプタ
ー−アフイニテイーカラムにかけ、Ｅ。

ｃｏｌｉからの組換えＩＬ−２で記載したように動物細
胞ＩＬ−２を精製した。

精製工程の各分画に於けるＩＬ−２活性およびタンパク
量を測定し、第２表に示す。

Ｚ　精製ＩＬ−２の分析アフィニティー分画で得られた組換えＩＬ−２の重合の
程度を調べるために、動物およびバクテリアの組換えＩ
Ｌ−２をスーパーファインの５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ　
−５０のｒル濾過にかけた。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｋ　２６　／　４０カラムにベツ
ド長さ３５σに充填した。カラムを２００　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１および５Ｆ＋＋９　／　ｄ　マ：トール（ｉＣ１Ａ
ｍｅｒｉｃａｓ　、　Ｉｎｃ−米国デラウエア州、ウイ
ルミングトン）含有の５３ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化
した。

カラムにのせる前にアフィニティー分画（容量：１４〜
１６ＩＩＬｌ）を６−に濃縮した。カラムは上述の平衡
化緩衝液を用い、流速０．５　Ｉｌｌ　／　ｍｉｎで流
した。１０分毎の分画をＬＫＢ　Ｕｌｔｒａ　Ｒａｃ　
＝　７００−０フラクシヨンコレクター（ＬＫＢ　−Ｐ
ｒｏｄｕｋｔｅｒ　、スウェーデンＢｒｏｍｍｅｒ　）
にて集めた。溶出液はＫｉｐｐｅｎ　Ｚｏｎｅｎ記録計
に接続した（）ｉｌｓｏｎ　ＭｏｄｅｌｌｌｌＢ　　Ｕ
Ｖ検出器を用いて２８０　ｎｍで追跡した。その結果を
第２図（Ｅ、ｃｏｌｉからの組換えＩＬ−２）および第
３図（動物細胞からの組換えＩＬ−２）に示す。

第２図および第６図から、組換えＩＬ−２の大部分はお
よそ分画８６付近のピークに集中していることがわかる
。この溶出プロフィルの位置は予想される単量体の位置
である。いずれの図でも高分子量物質（および分画５７
のピーク）は非常に少量しか認められなかった。従って
、組換えヒトＩＬ−２は、バクテリアの発現系で生成し
たものでも動物細胞の系からのものでも、ＩＬ−２レセ
プターーアフイニテイーカラムから溶出されると本質的
に集合せずに単量体として得られる。これと大きく異な
って、バクテリアで生成した組換えＩＬ−２を免疫アフ
ィニティーカラムで精製すると、高度に凝集した分子を
含んでいる。

ヒ）ＩＬ−２のＮ−末端１２個のアミノ酸残基に相当す
るアミノ酸内配列を有するドデカペプチドに対して生成
した５Ｂ１と命名するネズミのモノクローナル抗体を、
Ｃｈｉｚｚｏｎｉ　ｔｅが欧州特許出願番号４２３８９
７１．１９８７年９月３０日公開、に記載する方法に従
って調製した。本特許は引用文献として採用する。モノ
クローナル抗体５Ｂ１はＥＡＬＢ　／　Ｃ−ｑウスの腹
水液より、Ｓ　ｔａｅｈｅｌｉｎら、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　２５６巻；　９７５０−９７５４頁（ｉ
９８１年）、により記載されているように、硫酸アンモ
ニウム沈澱および続いて陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによ）精製した。

精製した抗体はＩＬ−２Ｈの結合で既に記載したと同様
に、１ａのｒル当１１．８〜の抗体量でＮｕｇｅｌ　Ｐ
−ＡｐＩ　！Ｊ　−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに固
定した。本抗体アフィニティー吸着体を充填した３、２
Ｘ１３ｃｍのカラムを用いて、ＩＬ−２のレセプター−
アフイニテイーカラムでの精製で記載したプロトコール
に従い、Ｅ、ｃｏｌｊで発現した組換えヒ）ＩＬ−２を
精製した。

本カラムで精製した組換えＩＬ−２を上述のように５ｅ
ｐｈａａｅ７　Ｇ　−５Ｑのｒル濾過にかけた。第４図
に示すように、免疫アフィニティーで精製したＩＬ−２
の多くは（ビーク１）高分子量の凝集数量体として溶出
した。凝集していない単量体ＩＬ−２はビーク２である
。

ＩＬ−２レセプター−アフイニテイーカラムと特異的に
結合し、後にカラムから溶出した物質が本当にＩＬ−２
であることを確認するため、アフィニティー分画からの
試料をアミノ酸分析にかけた。その結果は第６表に示す
。

第６表ＩＬ−２の由来アスパラギン酸　　　１２．６　　１１．７　　　１２
スレオニン　　　　　１２．５　　１２．３　　１３セ
リン　　　　　　７．２　　７．３　　　８グルタミン
酸　　　　１８．５　　１７．２　　　１８プロリン　
　　　　　　５．１　　　３．９　　　　５グリシン　
　　　　　２．３　　３．０　　　２アラニン　　　　
　　５．５　　４．７　　　５システイン　　　　　３
．０　　３．４　　　３バリン　　　　　　４．０　　
３．７　　　４メチオニン　　　　　４．５　　３．９
　　　４イソロイシン　　　　８．ロ　　８．１９０イ
シン　　　　　　２２．１　　２３．４　　　２２チロ
シン　　　　　　３．０　　３．７　　　３フエニルア
ラニン　　６．９　　６．５　　　６ヒスチジン　　　
　　３．１　　３．１　　　３リジン　　　　　　　１
０．３　　１１．３　　　１１アルヤニン　　　　　４
．０　　４．２　　　４トリプトフアン　　　　０．９
　　　１．３　　　　１合計　　１３３　１３３　１３
３＊２回の分析の平均値第６表に示すように、精製した組換えＩ　Ｌ　−２８の
アミノ酸組成は両者共、ＩＬ−２で予想される値と近似
していた。

レセプター−アフイニテイーで精製した組換えＩＬ−２
８の純度の確認のため、５ＤＳ−ポリアクリルアミドデ
ル電気泳動分析を行ない、第５図に示す。分析は非還元
条件下（即ち、β−メルカプトエタノール非存在下）で
行なった。タンパクのバンドを検出するためにｒルをク
マシーゾルーで染色した。

第５図で列Ｓは、ホスフオリラーゼＢ　（９４Ｋｄ）、
ウシ血清アルブミン（６７Ｋｄ）、卵アルブミン（４３
Ｋａ　）　、カルボニックアンヒドラーゼ（３０Ｋｄ）
、大豆トリプシンインヒビター（２１ｘｄ）およびリゾ
チーム（ｉ４，３ｘａ　）を含む分子量マーカータンパ
ク質の混合物である。列１−５はそれぞれ２０μｙのタ
ンパク量のＩＬ−２を生成している組換えＬ　ｃｏｌｉ
からの全抽出物；　Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物のレセプター−
アフイニテイーカラムによる精製の溶出液；　Ｅ、ｃｏ
ｌｉ抽出物からのレセプター−アフイニテイー力うム精
製組換えＩ　Ｌ　−２；組換えＩＬ−２を生成している
トランスフェクトした動物細胞からの調整培地および調
整培地からレセプター−アフイニテイーカラムで精製し
た組換えＩＬ−２である。マーカータンパク質の分子量
をキロダルトン（＝１，０００ダルトン）でｒルの右側
に示しである。

第５図より、レセプター−アフイニテイー精製ステップ
を用いるだけでバクテリアの粗抽出物中の組換えＩＬ−
２はデル上で主要バンドと移動度のより小さい薄いバン
ド（列６）とに精製されることがわかる。第５図は甘だ
、同じアフィニティー精製ステラｆを使用することによ
）動物細胞調整培地中の組換えＩＬ−２は主要バンドと
、デル上で移動度がより大きい薄いバンド（列５）とに
精製されることを示している。ウェスタンプロット分析
の結果、列６および列５に観察されるバンドは全てＩＬ
−２を含有していることがわかった。

ウェスタンプロット分析はＢｕｒｎｅｔｔｅ　（Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２巻；１９５〜２０３頁（ｉ９
８１年）〕およびＴｏｖ’ｂｊ　ｎら［Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ、’１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　７６巻；４３５０〜４３５４頁（ｉ
９７９年）〕により記載されるように行なった。使用し
た抗体は欧州特許出願、公開査号Ａ　２３８９７１に記
載されているモノクローナル抗体１３Ａ６お！ヒ１７Ａ
１　（グリコジル化および非グリコジル化ＩＬ−２の両
方に特異性含有す）、および５Ｂ１（非グリコジル化Ｉ
Ｌ−２のみに特異性）である。

Ｊｕら〔前述〕により記載されているように、部位特異
変異処理および組換えＤＮＡ法を用いて組換えヒ）　Ｉ
Ｌ−２のアナログ類をコードするプラスミドを調製し、
Ｅ、ｃｏｌｉで発現させた。アナログの一つは、アミノ
末端のアラニンを欠失し、１２５位のシスティン残基が
セリンにより置換されていた（　（ｄｏｓ−Ａｔａｌ−
８ｅｔ”’：）−ＩＬ−２）。他のアナログは、２０査
目のアスパラヤン酸残基がリジンで置換した（　［Ｌｙ
ｓ２０）−■Ｌ−２）。以下に記載するように精製した
後の組換え［ｄｅｓ−Ａｔａｌ−８ｅｒ↓２５〕−およ
び［Ｌｙｓ”０）−ＩＬ−２の生物活性の比活性はそれ
ぞれ１．７　Ｘ　１０７および２．２　Ｘ　１０’単位
／ηタンパクであった。

［ｄｅｓ−Ａｔａ’−８ｅｒ”５〕−ＩＬ−２および［
Ｌｙｓ”〕−ＩＬ−２を前記ＩＬ−２レセプター−アフ
イニテイーカラムで精製し、アフィニティー分画を前と
同じようにして５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル電気泳
動で分析した。結果は第６図に示す。第６図で各列は、
分子量マーカータンパク質の混合物（列Ｓ〕、［：ｄｅ
ｓ−Ａｔａｌ−８ｅｒ”）−ＩＬ−２を含有するＥ、ｃ
ｏｌｊ抽出物（列１）、アフィニティー−吸着体で精製
した［ｄｅｓ−Ａｔａ”−８ｅｒま２５）−ＩＬ−２（
列２　）、　（Ｌｙ　ｓ　２０　〕−ＩＬ−２を含有す
るＥ、　ｃｏｌｉ抽出物（列６）、アフィニティー吸着
体で精製した（Ｌｙｓ”）−ＩＬ−２（列４）、野生型
組換えヒ）ＩＬ−２を含有するＥ、　ｃｏｌｉ抽出物（
列５）、およびアフィニティー吸着体で精製した野生型
組換えヒ）ＩＬ−２（列６）を示す。

ＩＬ−２を含有する試料は示すように還元下および非還
元下の条件で分析（β−メルカプトエタノールによる還
元の有無）した。

第６図が示すように、本発明によるＩＬ−２レセプター
−アフイニテイー吸着体は野生型のＩＬ−２およびＩＬ
−２の変異種の精製に使用できる。

これらのＩＬ−２変異種はアミノ酸の欠失および／また
は置換で野生型と異なり、生物活性も本質的に異なるこ
ともある。これらの全てのＩＬ−２でアフィニティーに
より精製した物質は本質的に凝集していない単量体で高
活性である。

本技術分野の熟練者に明かなように、本発明の精神およ
び範囲から逸脱することなく、本発明の修飾および変化
を行なうことが出来る。本明細書に記載する具体的態様
は例示のためのみであシ、本発明は併記する特許請求の
範囲によってのみ限定されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２レセプター−アフイニテイークロマト
グラフィーの原理を図示したものである。第２図はＬｃｏｌｉで生産してレセプターアフィニティ
ークロマトグラフィーで精製した組換えヒ）ＩＬ−２の
ｒル濾過カラム溶出プロフィルを示すグラフである。第６図は動物細胞で生産してレセプターアフィニティー
クロマトグラフィーで精製した組換えヒトＩＬ−２のｒ
ル濾過カラム溶出プロフィルを示すグラフである。第４図はＥ、ｃｏｌｉで生産して抗体アフイニテイ−ク
ロマトグラフイーで精製した組換えヒトＩＬ−２のｒル
濾過カラム溶出プロフィルを示すグラフである。第５図は粒子の構造を示す写真であって、Ｅ。ｃｏｌｉおよび動物細胞により生産された組換えＩＬ−
２の精製過程の試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル
電気泳動分析の結果を示すクロマトグラムである。第６図は粒子の構造を示す写真であって、組換えヒトＩ
Ｌ−２アナログのレセプターアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーによる精製前後の試料のＳＤＳポリアク
リルアミドデル電気泳動（還元および非還元下）分析の
結果を示すクロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】１）可溶性ＩＬ−２レセプター分子を固体担体に固定し
たものより成り、その固定化ＩＬ−２レセプター分子が
ＩＬ−２と特異的に結合することが出来るようなＩＬ−
２レセプター−アフイニテイー吸着体。２）可溶性ＩＬ−２レセプター分子を固体担体に固定化
することを特徴とする特許請求の範囲第１）項に記載の
ＩＬ−２レセプター−アフイニテイー吸着体の調製方法
。３）以下より成り、ヒトまたは動物細胞により生産され
たＩＬ−２を含有する溶液、或いは調整培地中からのＩ
Ｌ−２の精製方法。（ａ）可溶性ＩＬ−２レセプター分子を固体担体に固定
化して成り、該固定化ＩＬ−２レセプター分子がＩＬ−
２と特異的に結合できるレセプター−アフイニテイー吸
着体を該溶液または調整培地に接触させ、ＩＬ−２を特
異的に吸着体に結合させ、（ｂ）吸着体を洗滌して非結合の混在物質を除去し、（ｃ）洗滌した吸着体よりＩＬ−２を遊離させ、（ｄ）
遊離ＩＬ−２をレセプター−アフイニテイー吸着と分離
する。４）以下より成り、細菌発現系により生産した組換えＩ
Ｌ−２の精製方法。（ａ）ＩＬ−２の発現を指示することの出来るベクター
により形質転換した培養バクタリア細胞を破砕して細胞
溶菌物を得、（ｂ）溶菌物より不溶性区分を単離し、（ｃ）溶菌物より得た不溶区分を４から７Ｍのグアニジ
ン塩酸溶液で抽出してＩＬ−２含有抽出物を得、（ｄ）ＩＬ−２含有抽出物をグアニジン塩酸非含有溶液
にて１０から１０００倍に希釈し、（ｅ）可溶性ＩＬ−２レセプター分子を固体担体に固定
化して成り、該固定化ＩＬ−２レセプター分子が特異的
にＩＬ−２と結合することの出来るレセプター−アフイ
ニテイー吸着体を希釈ＩＬ−２含有抽出物に接触させて
ＩＬ−２を特異的に吸着体に結合させ、（ｆ）吸着体を洗滌して非結合の混在物質を除去し、（ｇ）洗滌吸着体よりＩＬ−２を脱着し、（ｈ）遊離ＩＬ−２よりレセプター−アフイニテイー吸
着体を分離する。５）ステップ（ｃ）で抽出物をおよそ３０から５０倍に
希釈する特許請求の範囲第４）項記載の方法。６）抽出ステップ（ｃ）に於いて、その前に混在する細
胞由来物質を（ｉ）緩衝塩溶液；および（ｉｉ）およそ１．７５から２Ｍのグアニジン塩酸溶液にて溶菌物から得た単離不溶性区分を抽出することによ
り予備抽出するステップを行なう特許請求の範囲第４）
項または５）項記載の方法。７）ステップ（ｄ）で得られる希釈抽出物をおよそ４時
間から３日間以上の期間静置する特許請求の範囲４）か
ら６）項のいずれかに記載の方法。８）ステツプ（ｄ）で得られる希釈抽出物をおよそ１か
らおよそ３日間の期間静置する特許請求の範囲第４）か
ら６）項のいずれかに記載の方法。９）ＩＬ−２の精製のためへの特許請求の範囲第１）項
に記載のＩＬ−２レセプター−アフイニテイー吸着体の
使用。１０）特許請求の範囲第２）項に記載の方法により調製
したＩＬ−２レセプター−アフイニテイー吸着体。