JP2006513978A5

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Publication number: JP2006513978A5
Application number: JP2004525238A
Authority: JP
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2023-07-18

Description

プレプロインスリンは、式１で示されるタンパク質である；

上記式中、
Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ）であり、および、３個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も２個の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ）
であり、
Ｒ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する。

式中、Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ）であり、および、３個超のアミノ酸残基からなる場合、最初と最後がいずれの場合も２個の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ）
であり、
Ｒ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、および、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応し；

Claims

式１：

（式中、Ｘは、
ａ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、ここで、最初と最後がいずれの場合も塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇ）であり、そして、３個より多いアミノ酸残基
からなる場合、最初と最後がいずれの場合も２個の塩基性アミノ酸残基（特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ）
であり、
Ｒ¹は、
ａ）水素、
ｂ）遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチド
であり、
Ｒ²は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、そして、
残基Ａ１〜Ａ２０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応し、残基Ｂ１〜Ｂ３０は、ヒトインスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する）
で示されるプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法であって、プレプロインスリンの水溶液から、フロースルー式の陰イオン交換体での第一のクロマトグラフィー、および、それに続く吸着式の陽イオン交換体での第二のクロマトグラフィーによってより高分子量の物質が除去される、上記の方法。
プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号２）
を有する、式１で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。
プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号３）
を有する、式１で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。
プレプロインスリンは、以下のアミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号４）
を有する、式１で示される遺伝子操作されたプレプロインスリンのクロマトグラフィー精製方法。
インスリンの変性を誘導するプレプロインスリン溶液から外来物質を分離するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
第二のクロマトグラフィーは、ｐＨ３.０〜５.５で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
第二のクロマトグラフィーは、圧力１〜３０ｂａｒで行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
フォールディングされていないプレプロインスリンを発現することによってインスリンを製造する方法であって、
ａ）フォールディングされていないプレプロインスリンを発現する遺伝子操作された微生物を発酵させる工程、
ｂ）上記微生物を回収し、細胞を崩壊させる工程、
ｃ）未溶解のフォールディングされていないプレプロインスリンを含む封入体を単離する工程、
ｄ）ペプチド鎖が正しくフォールディングしたプレプロインスリンを溶解させ、同時に、ジスルフィド架橋を連結させ、プレプロインスリンを得て、続いて請求項１〜７に記載の方法を行う工程、
ｅ）プレプロインスリンを酵素で切断し、ヒトインスリンを得る工程、
ｆ）ヒトインスリンを精製する工程、
ｇ）ヒトインスリンを結晶化し、乾燥させる工程、
を含む、上記の方法。