CN106794156B - 微粒化胰岛素、微粒化胰岛素类似物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种制备适用于肺部递送的可吸入胰岛素的方法，该方法包括：在酸性溶液中溶解胰岛素原材料以形成溶解的胰岛素溶液；使用缓冲溶液滴定所述溶解的胰岛素溶液以形成包含微粒化胰岛素颗粒的悬浮液；以及稳定所述微粒化胰岛素颗粒。

Description

微粒化胰岛素、微粒化胰岛素类似物及其制备方法

相关申请的交叉引用：

本申请要求于2014年7月8日在美国专利和商标局提交的美国临时申请号为62/022,026的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。

领域

本发明的实施方案一般涉及人胰岛素和/或人胰岛素类似物的肺部递送，以及用于微粒化供肺部递送的人胰岛素和/或人胰岛素类似物的工艺。本公开文本的实施方案方面一般还涉及包含具有改进的颗粒特性的微粒化人胰岛素和/或微粒化人胰岛素类似物的组合物。

背景

已经越来越注意到用于非侵入性给药和全身施用治疗制剂(主要是肽和蛋白质)的肺吸收途径的潜力，因为肺能够提供大的吸收表面积(高达100m²)以及具有非常或极其薄的吸收性粘膜(例如，具有约0.1μm-0.2μm的厚度)，并且具有良好的血液供给。肺表面上的非常薄的肺泡毛细管和支气管毛细血管屏障允许人胰岛素颗粒被快速吸收到受试者的血流中，速度类似于用速效人胰岛素类似物实现的速度，速效人胰岛素类似物是人胰岛素的改变形式，不同于自然发生的人胰岛素，但仍以类似于人胰岛素的方式在人体中起作用，但在血糖控制方面具有更好的性能。

胰岛素制剂可以通过皮下或静脉内注射施用。吸入型胰岛素似乎与注射短效胰岛素一样有效。发展了肺部递送技术以便吸入型胰岛素可有效地到达其被吸收的位置是肺毛细血管。

人肺气道含有支气管，其对胰岛素以及肺泡是不可渗透的。吸入型胰岛素可通过肺泡吸收并进入循环系统。吸入型哮喘药物在到达肺泡之前沉积。装置可以通过缓慢均匀地呼吸将人胰岛素颗粒递送到肺泡中，以及人胰岛素可被释放到循环系统中。

吸入型人胰岛素可以用于I型和/或II型糖尿病患者的餐前胰岛素递送。它的使用还可以促进对由于反应(例如炎症、瘀伤、焦虑等)而厌恶胰岛素注射的人的胰岛素治疗的早期引入。

简述

根据本发明公开的一个实施方案，制备适合于肺部递送的可吸入人胰岛素的方法包括：将胰岛素原材料溶解在酸性溶液中以形成溶解的人胰岛素溶液；用缓冲溶液滴定溶解的胰岛素溶液以形成包含微粒化胰岛素颗粒的悬浮液；以及稳定所述微粒化胰岛素颗粒。

所述酸性溶液可以包括水、有机溶剂或其混合物。

基于酸性溶液的总体积计，所述酸性溶液可以包括含量为10体积％至90体积％的所述有机溶剂。

所述酸性溶液可以包括含量大于酸性溶液总体积的0体积％至90体积％的所述有机溶剂。

所述有机溶剂可以包括醇。

所述醇可以包括甲醇、乙醇或其混合物。

所述缓冲溶液可以具有3至10的pH。

所述稳定微粒化胰岛素颗粒可以包括向悬浮液中添加稳定制剂。

所述稳定制剂可以具有中性pH，且可以与水是混溶的。

所述稳定制剂可以包括醇、酮或其混合物。

所述稳定可以增加微粒化胰岛素颗粒的产量。

所述微粒化胰岛素颗粒可以在3至9的pH下制备。

所述微粒化胰岛素颗粒可以在4.5至7.5的pH下制备。

所述微粒化胰岛素颗粒可以包括体积平均直径为约1.2至2μm的大致上球形的颗粒。

基于所述微粒化胰岛素颗粒的总体积计，所述微粒化胰岛素颗粒可以包括高达99体积％的粒径小于5μm的颗粒。

所述酸性溶液可以具有1.0至3.0的pH范围。例如，所述酸性溶液可以具有1.8至2.2的pH范围。

所述酸性溶液可以具有约2的pH，且可以包括水和基于酸性溶液的总体积计的10体积％至90体积％的包括甲醇、乙醇或其混合物的有机溶剂。

所述微粒化胰岛素颗粒可以为大致上球形的形状，且可以具有小于5μm的粒径。

所述微粒化胰岛素颗粒可以包括胰岛素(包括人胰岛素、动物胰岛素、胰岛素类似物或其混合物)。

所述胰岛素类似物可以包括门冬胰岛素、甘精胰岛素或其混合物。

所述溶解、所述滴定和/或所述稳定步骤可以在室温下进行。

所述胰岛素原材料可以包括结晶胰岛素(包括结晶人胰岛素、结晶动物胰岛素、结晶胰岛素类似物或其混合物)。

结晶胰岛素类似物可以包括结晶门冬胰岛素、结晶甘精胰岛素或其混合物。

根据本公开文本的实施方案，所述微粒化胰岛素颗粒包括大致上球形的包含选自人胰岛素、动物胰岛素、胰岛素类似物及其混合物的胰岛素的颗粒。

所述大致上球形的颗粒可以具有约1.2μm至2μm的体积平均直径。

基于微粒化胰岛素颗粒的总体积计，高达99体积％的大致上球形的颗粒可以具有小于5μm的颗粒尺寸。

所述胰岛素类似物可包括门冬胰岛素、甘精胰岛素或其混合物。

本公开文本实施方案的前述描述不意指为详尽的概述，因为从以下详细描述中，本发明公开的另外相关方面对于本领域技术人员将是显而易见的，独立地或与附图和表格结合，其中描述和示出了本发明的一个或多个实施方案。

附图说明

所附附图与说明书一起阐明本发明公开的实施方案，并且与描述一起用于解释本发明公开的原理。

图1是说明用于微粒化胰岛素和/或胰岛素类似物的工艺的实施方案的流程图。

图2是根据本发明公开的实施方案制备的微粒化人胰岛素颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图3是示出根据图1的实施方案制备的微粒化人胰岛素颗粒的粒度分布的图。

图4是示出了根据本发明公开的实施方式微粒化前后的人胰岛素杂质分布的图。

图5是根据本发明公开的实施方案制备的溶解的微粒化胰岛素颗粒的高效液相色谱(HPLC)色谱图。

图6和图7的图表显示了来自根据本发明公开的实施方案制备的填充罐所递送的人胰岛素颗粒的安德森级联冲击器研究的数据。

图8是根据本发明公开的实施方案制备的微粒化甘精胰岛素颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图9是根据图1的实施方案制备的溶解的微粒化甘精胰岛素颗粒的HPLC色谱图。

图10和11的图表显示了根据本发明公开的实施方案制备的填充罐所递送的甘精胰岛素的安德森级联冲击器研究的结果。

图12是根据本发明公开的实施方案制备的微粒化门冬胰岛素颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图13是根据图1的实施方案制备的溶解的微粒化门冬胰岛素颗粒的HPLC色谱图。

图14和图15的图表显示了来自根据本发明公开的实施方案制备的填充罐所递送的门冬胰岛素颗粒的安德森级联冲击器研究的结果。

图16是根据喷射研磨法制备的人胰岛素颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。

图17是如根据实施例2所述制备的微粒化胰岛素颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。

详细说明

以下所提供的详细描述仅是为了说明本发明公开的某些特定实施方案，而不是为了限制本发明的范围。替代实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的，并意在包括在本发明的范围内。此外，在本申请的上下文中，术语“胰岛素”在广义上使用并包括可用于治疗人或动物的任何形式的胰岛素或胰岛素类似物。例如，本文所用的术语“胰岛素”包括天然或合成的人胰岛素、天然或合成的动物胰岛素和胰岛素类似物(例如门冬胰岛素、甘精胰岛诸如此类)。

制备用于肺部递送的可吸入胰岛素颗粒的微粒化过程的实施方案包括：在酸性环境(例如在酸性溶液中溶解以促进胰岛素原材料的溶解)中溶解胰岛素原材料(例如结晶胰岛素和/或结晶胰岛素类似物)以形成溶解的胰岛素溶液；用缓冲溶液滴定溶解的胰岛素溶液以形成包括微粒化胰岛素颗粒的悬浮液；以及添加稳定制剂(例如有机溶剂和/或共溶剂)以稳定微粒化胰岛素颗粒(例如在纯化和干燥之前增加微粒化胰岛素颗粒的产量)。该过程的实施方案在室温下进行，并避免或减少引入热量和/或机械力，诸如通过冻干、微球和喷射研磨法引入的那些。进行该过程的一些实施方案中不向酸性环境添加聚合物(例如辅料聚合物)，包括溶解的胰岛素溶液和/或悬浮液。

本发明的实施方案提供了适合于肺部递送的可吸入胰岛素的生产工艺。该工艺实施方案利用可以具有毫米范围的粒径的原始结晶胰岛素，以提供作为用于肺部递送的活性药物成分(API)的具有微米范围的颗粒尺寸的可吸入胰岛素颗粒，具有改进的特性，包括更加的球形的形状以及改进的平滑度。如本文所述，除非另有说明，粒径或颗粒直径(例如体积平均直径)可以通过激光衍射法测量。

药物颗粒的肺部递送受药物颗粒的特性影响，药物颗粒的特性包括颗粒大小、颗粒形状、表面粗糙度、溶解度、流动性和/或诸如此类。由于可吸入胰岛素和/或胰岛素类似物是活性药物成分，而不仅仅是被动载体，本发明公开的实施方案在微粒化胰岛素和胰岛素类似物同时维持或大致上维持了生物活性。

具有＜5μm的粒径(或空气动力学直径)的颗粒允许所吸入的药物被肺吸收。具有合适的空气动力学直径或颗粒尺寸的颗粒具有良好的流动性能，以及更容易分散到下呼吸道(支气管区和肺泡区)中，在该处通过肺的肺泡毛细管表面吸收进入血流得到改善或优化。另一方面，过大尺寸的药物颗粒(例如，具有空气动力学直径或粒径＞5μm的颗粒)将主要在上呼吸道诸如咽喉和气管中通过惯性碰撞而被捕获。过大尺寸的颗粒大致上不被吸收，因为它们在上呼吸道中累积，该上呼吸道不具有薄的可穿透的肺泡毛细血管。累积的药物颗粒可能触发肺部防御系统，这可能促使巨噬细胞增加。刺激或过度刺激巨噬细胞可能导致其它炎性细胞的募集并可能最终引起次生组织损伤、再生和纤维化。

药物粒径可在肺部递送中起决定性作用。为了制造粒径＜5μm的颗粒，可以使用多种的一步微粒化方法诸如喷雾干燥和机械研磨技术，这样使得起始的原胰岛素粉末颗粒在加工后(其一般具有毫米范围的直径)具有用于肺部递送的微米范围的直径。

然而，用于微粒化胰岛素颗粒的那些工艺涉及在胰岛素微粒化加工期间引入热量和/或辅料聚合物，这可能引起胰岛素的聚集和丧失活性，并且可能阻碍药物制造。此外，尽管辅料聚合物有助于稳定制剂并增加加工期间的溶解度，但是辅料聚合物可能引入难以去除的杂质。

冻干处理可用于将胰岛素颗粒从毫米尺寸范围(例如原始胰岛素)转化为微米尺寸范围。使用冷冻的一个原因在于1-5μm范围内的颗粒的生产是该方法的尺寸减缩能力的极限。聚合物也可以作为惰性物质或辅料引入制剂中以改进稳定性和溶解度。

然而，冻干微粒化工艺可能对大分子诸如胰岛素具有潜在危害。例如，在冻干加工期间，向分子供应热量以升华水，这可能导致胰岛素的构象改变，甚至可能使胰岛素变性。

此外，限定冻干工艺(多温过程)的冷却速率以控制微粒的尺寸和形状，但是所述冻干法可能导致由胰岛素和聚合物形成的胰岛素微粒过度干燥，并且可导致化学或物理稳定性降低。胰岛素还更易于在干燥粉末状态下聚集。

另外已经发现，当聚合物用在形成胰岛素微粒的工艺中时，胰岛素微粒通过在接近胰岛素等电点的pH下溶解结晶胰岛素而形成。各种合适类型的聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA.)以及生物粘附机制可用于该工艺。当将聚合物添加到缓冲溶液中时，它可帮助进一步增加结晶胰岛素的溶解度。然而，在加工后所添加的聚合物可能不能被有效、完全地去除。未去除的残留聚合物可降低药物效力，增加毒性，并增加杂质水平。

其它涉及含有胰岛素的微球的生产工艺引入辅料聚合物诸如PVP或PEG以帮助在酸性环境中溶解胰岛素。由这种工艺生产的微球暴露于可能危险或损害胰岛素的相对高的温度下。这样的加工结束时，用于洗涤聚合物的有机溶剂(其对胰岛素具有低溶解度)可能引起小胰岛素颗粒的聚集。此外，前述有机溶剂可使微球中包含的胰岛素分子变性，并且当施用于人或动物时也可能有毒。

除了本发明公开的实施方案的那些之外，胰岛素微粒的制造过程利用有机溶剂，并且需要苛刻的灭菌条件。所述有机溶剂(除了本发明公开的那些之外)可能影响药物纯度，如果残留的有机溶剂保留在微球中，则可能在体内是有害的。此外，由有机溶剂引起的多孔结构可能导致释放剂量不一致。通过热、化学或辐射处理的灭菌可能引起聚合物和/或包封在微球中的药物降解。灭菌溶液也可增加存在的杂质的量。

胰岛素控释制剂可含有微球，该微球是使用可生物降解聚合物材料通过微囊化胰岛素的均匀微晶(例如经由表面活性剂)获得的。然而，这样的组合物可具有低的胰岛素含量，例如，基于胰岛素颗粒的总重量，平均的胰岛素颗粒可含有小于10％w/w。

本发明公开的实施方案致力于克服上述困难。制备可吸入胰岛素或胰岛素类似物的方法的实施方案可包括以下三(3)步措施：

(1)在酸性环境中溶解胰岛素原料(例如结晶胰岛素或胰岛素类似物)以促进胰岛素原料的溶解，从而形成溶解的胰岛素溶液。酸性环境可以包括酸性溶液。例如，酸性环境可以包括含有水、有机溶剂(例如醇，诸如甲醇)或其的混合物的酸性溶液。

可以利用在酸性环境中的胰岛素的行为来溶解胰岛素。在一些实施方案中，所述酸性环境具有约1.0至3.0的pH，例如1.8至2.2，以提供良好的溶解条件。

(2)用缓冲溶液滴定溶解的胰岛素溶液直至达到悬浮液状态(例如直至获得悬浮液)。利用溶解的胰岛素溶液的滴定以改变溶解的胰岛素的溶解度，并且引起溶解的胰岛素作为微粒化胰岛素颗粒沉淀，形成悬浮液。例如，可以改变所述溶液的pH值以影响胰岛素的溶解度。胰岛素包括酸性和碱性官能团。构成胰岛素的氨基酸(例如氨基和羰基)可具有正电荷、负电荷或者可以是中性的，并且一起为胰岛素提供其的总电荷。在低于其等电点(IEP)的pH下，胰岛素携带净正电荷，而高于其IEP时，胰岛素携带净负电荷。因此，可以滴定溶解的胰岛素溶液至接近胰岛素的IEP值，以降低胰岛素的溶解度，并使胰岛素从溶解的胰岛素溶液中作为具有微米范围的粒径的小的或微小的颗粒固化并沉淀出来。

随着胰岛素沉淀，溶解的胰岛素溶液从透明的或大致澄清的溶液变为乳白色的和发白的悬浮液(例如悬浮液包括微粒化胰岛素颗粒)。

(3)通过添加稳定制剂(例如有机溶剂和任选的共溶剂)稳定微粒化胰岛素颗粒，以在纯化和干燥之前增加微粒化胰岛素颗粒的产量。

可以添加稳定制剂(例如有机溶剂和/或共溶剂)以增加微粒化胰岛素颗粒的产量。所使用的稳定制剂(例如有机溶剂和任选的共溶剂)可以根据胰岛素的类型而变化，并将在下面的部分中进一步描述。

本发明公开的实施方案提供以下特征：与冻干法、聚合物和微球方法相比，更简单、更安全的制造和/或获得产物；不需要辅料聚合物(其可能引入另外的杂质)；微粒化加工可在约室温下进行；没有或大致没有损失胰岛素的分子活性；并且由于不需要额外的热量，所述胰岛素的聚集和/或降解较少。

用于根据本发明公开的用于肺部递送的在室温下微粒化胰岛素和胰岛素类似物的新工艺的实施方案包括以下三步主要措施。首先，溶解具有毫米范围的粒径的胰岛素原料；其次，微粒化(例如胰岛素颗粒的沉淀，这使得包括胰岛素颗粒的溶液成为包括微粒化胰岛素颗粒的悬浮液)；第三，稳定微粒化胰岛素颗粒；以及第四，从所述液体溶液中分离胰岛素颗粒。胰岛素颗粒从液体溶液分离之后可以经洗涤、干燥和纯化，以完成制造可吸入胰岛素或胰岛素类似物API的工艺的实施方案。

在第一步措施中，胰岛素原料可以溶解在包括水和极性有机溶剂的酸性环境(例如酸性溶液)中，其具有小的分子量并且与是水可混溶的。基于所述溶液的总体积，甲醇和/或乙醇可以以高达90体积％(体积％)的量包括在溶液中，以控制胰岛素的起始溶解度。例如，甲醇和/或乙醇可以以优选大约90体积％(基于酸性溶液的总体积)的量包含于酸性溶液中，但是大于0至高达90体积％的任何量可以预期并可以使用。

所述酸性溶液可被置于搅拌板的顶部。整个过程可以采用约40至200转/分钟(rpm)的稳定的、连续的或大致连续的搅拌直到溶液变得完全或大致上完全澄清。使用过高的搅动速率和/或搅拌速度可能引起湍流和不均匀的混合，而使用过低的搅动速率或搅拌速度可能导致具有不期望的粒径(例如超过或大于5μm的粒径)的胰岛素颗粒。当胰岛素从固相解离为液相时(例如当所述胰岛素溶解以形成溶解的胰岛素溶液时)，所述溶液变得澄清或大致上澄清。所述胰岛素的溶解可以在酸性环境中进行。

在第二步措施中，所述搅拌速度可以减慢至约30至100rpm，例如50至75rpm或50至60rpm。所述溶解的胰岛素溶液被滴定或用缓冲溶液缓慢滴定，并随着溶解的胰岛素溶液从澄清或大致上澄清的溶液变为包括微粒化胰岛素颗粒的乳状白色悬浮液时逐渐出现胰岛素沉淀。

所述胰岛素和/或胰岛素类似物可以在3至9的pH例如4.5至7.5的pH下微粒化。所述缓冲溶液可制备为具有3至10的pH。因此，通过滴定溶解的胰岛素溶液形成可具有3至9的pH的悬浮液。

在第三步措施中，使用具有中性pH并与水可混溶的稳定制剂。稳定制剂的实例包括醇和/或酮。例如，所述醇可包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物，但所述醇不限于此。所述酮可以包括丙酮，但是所述酮不限于此。所述稳定制剂稳定所述微粒化胰岛素颗粒。

可以在分离微粒化胰岛素颗粒之后进行纯化和/或干燥工艺。可以使用本领域可用的任何合适的纯化和/或干燥工艺，并对于本领域普通技术人员应当是显而易见的。

图1是说明在室温下微粒化胰岛素和/或胰岛素类似物的方法的实施方案的工艺流程图。在图1中，如图1所示，用于微粒化胰岛素的工艺100的实施方案包括溶解胰岛素原料102，沉淀胰岛素以形成和稳定悬浮液104，以及分离胰岛素106。

现在将参考实例描述本发明公开的实施方案来进行说明。然而，本发明的公开不限于本文所描述的实例。

实施例1：在90体积％甲醇溶液中制备可吸入胰岛素颗粒

在40ml小瓶中，将70mg生物合成人胰岛素(来自Sigma-Aldrich的重组胰岛素)原料粉末溶解于具有约1.9pH、并含有90体积％(基于所述酸性溶液的总体积)的甲醇(另外10体积％包含水和HCl)的7.7ml酸性溶液中。将所述小瓶置于搅拌板的顶部，稳定地搅拌所获得的溶液直至所述溶液完全或大致完全澄清以形成溶解的胰岛素溶液。然后，将搅拌减慢至更慢模式(例如约75rpm的旋转速度)，并逐滴添加1.75ml的pH为5.64的0.1M乙酸钠(NaAc)缓冲溶液以缓慢滴定所述溶解的胰岛素溶液。所述澄清的溶解的胰岛素溶液转变为乳白色和淡黄色的包括微粒化胰岛素颗粒的悬浮液。所述滴定完成或大致完成后，向悬浮液中加入约10ml乙醇。继续再搅拌30分钟。微粒化胰岛素颗粒作为固体从悬浮液的上清液中被分离出来，该固体经乙醇洗涤两次以除去甲醇和盐。该固体在室温下真空干燥。

图2是示出根据实施例1所述方法生产的可吸入人胰岛素API的扫描电子显微镜(SEM)图像。在本申请中，使用JEOL CarryScope JCM-5700SEM仪器获得所有的SEM图像。图3是说明根据实施例1所述所制备的可吸入胰岛素API(微粒化胰岛素)的粒度分布的图。从图2和图3可以得出结论，根据实施例1所述所制备的可吸入胰岛素API(微粒化胰岛素)，例如具有粒径＜5μm的可吸入胰岛素API(微粒化胰岛素)的粒径适合于肺部给药。例如，从图3可看出，实施例1的微粒化胰岛素的平均粒径D50小于2μm。D50为基于所述样品的总体积计在最大颗粒直径以下有50体积％的样品具有较小颗粒的直径，且在最大颗粒直径以上有50体积％的样品具有较大颗粒的直径。

实施例2：用于在90体积％甲醇溶液中制备可吸入胰岛素颗粒的批生产过程

在包括离心搅拌器或搅拌棒的400ml容器中，将1克生物合成人胰岛素API粉末(即来自Sigma-Aldrich的重组胰岛素)溶解于110ml的具有约1.9的pH及含有90体积％(基于所述酸性溶液的总体积)甲醇(另外10体积％含有水和HCl)的酸性溶液中。搅拌所得溶液直到所述胰岛素溶液完全或大致完全澄清以形成溶解的胰岛素溶液。然后，减慢搅拌至更慢模式(例如约50rpm的旋转速度)，并逐滴添加25ml的0.1M NaAc缓冲溶液(具有5.64的pH)以滴定溶解的胰岛素溶液。所述澄清的溶解的胰岛素溶液变成乳白色和淡黄色的包括微粒化胰岛素颗粒的悬浮液。滴定完成或大致完成后，向所述悬浮液中添加约135ml乙醇，再继续搅拌30分钟。

微粒化胰岛素颗粒作为固体从悬浮液的上清液中被分离出，并且该固体经乙醇洗涤两次以除去甲醇和盐。该固体在室温下真空干燥。产物重量用于计算回收率。使用激光衍射粒径分析仪(即JEOL CarryScope JCM-5700SEM仪器)分析粒径。

上述步骤重复四(4)次用于微粒化胰岛素各批次。

表1显示了根据实施例2所述所制备的四(4)批次的回收率的再现性。从表1可看出，实施例2的回收率高于86％。

表1

批次ID	回收率％
		1	86.4
2	86.1
		3	86.8
4	86.2
		平均	86.4
标准偏差	0.3
		相对标准偏差％	0.4

表2示出了在实施例2分批生产的微粒化人胰岛素颗粒的粒径分布的再现性。从表2得出结论，根据如实施例2所述制备的微粒化胰岛素的粒径，例如具有＜5μm的粒径适合于肺部递送。例如，在表2中能够看到，对于实施例2的微粒化胰岛素，平均粒径D50为1.54μm，平均粒径D10为0.75μm，平均粒径D90为3.04μm，其适合于肺部递送。D50为基于所述样品的总体积计在最大颗粒直径以下有50体积％的样品具有较小颗粒的直径，且在最大颗粒直径以上有50体积％的样品具有较大颗粒的直径。D10为基于所述颗粒的总体积计10体积％的颗粒的颗粒直径比D10的颗粒直径较小。D90为基于所述颗粒的总体积计90体积％的颗粒的颗粒直径比D90的颗粒直径较小。

表2

根据美国药典(USP)的<621>章和用于人胰岛素专题论文的杂质检测的USP方法，通过高效液相色谱(HPLC)检测加工前后的胰岛素的化学稳定性。图4是表示胰岛素在实施例2所述的微粒化工艺前后的杂质分布图。如图4所示，在微粒化工艺期间，所述胰岛素中的杂质，例如胰岛素二聚体、高分子量蛋白质、A-21脱氨胰岛素或相关化合物的量没有统计学显著变化。

图5是根据实施例2所述所制备的溶解的胰岛素颗粒的高效液相色谱(HPLC)色谱图。图5的HPLC色谱图示出了微粒化胰岛素的保留时间相对于原始胰岛素原料的保留时间没有表现出统计学显著变化。从微粒化胰岛素颗粒的分析得到的证据表明，在微粒化工艺期间，所述胰岛素的化学完整性得以保持或大致上保持。

使用来自Sympatec Gmbh的激光衍射CUVETTE CUV-50ML/US仪器评估微粒化胰岛素颗粒的粒径分布。在乙醇介质(乙醇溶液)中检测微粒化胰岛素颗粒。获得的数据显示，基于所述颗粒的总体积计，超过99体积％的颗粒具有小于5μm的粒径，以及所有的四(4)个批次的体积平均直径的平均值为1.79μm，如表2所示。因此，基于所述微粒化胰岛素颗粒的总体积计，所述微粒化胰岛素颗粒可包括99体积％或更多(例如99至100体积％)的具有小于5μm的粒径的颗粒。在一些实施方案中，基于微粒化胰岛素颗粒的总体积计，所述微粒化胰岛素颗粒可包括高达99体积％的具有小于5μm的粒径的颗粒。

图6是示出了分别使用包括1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A)、1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227)、或HFA 134A及HFA 227的混合物的推进剂从三个定量雾化吸入器递送的人胰岛素(如根据实施例2所述生产的API)的安德森级联冲击器研究的图表。所述定量雾化吸入器如下文根据实施例11所述来制备。从图6所示的数据可以得出结论，当三种不同的推进剂(HFA 134A、HFA 227、以及HFA 134A和HFA 227的混合物)与根据实施例2所述所生产的微粒化人胰岛素一起使用时，提供了可比较的结果。

图7是进一步示出了在使用三种不同的推进剂(分别为HFA134a、HFA227、HFA127、或HFA 134A和HFA 227的混合物)从定量雾化吸入器递送的人胰岛素(如实施例2所述的关于生产的API)的三个不同阶段分类的安德森级联冲击器分析结果的图表。所述定量雾化吸入器如下文根据实施例11所述制备。从图7所示的数据可以得出结论，当所述三种不同的推进剂与根据实施例2所述所生产的微粒化人胰岛素一起使用时，提供了可比较的结果。

实施例3：在100体积％水溶液中制备可吸入胰岛素颗粒的方法

根据如实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是使用pH为2.0(包括纯化水和足以提供pH为2.0量的酸的溶液)的大致100体积％的纯水溶液以替换含有实施例1的90体积％的甲醇的酸性溶液。如实施例2所述来分析生成的可吸入人胰岛素颗粒的粒径分布。粒径分布分析的结果表明，可吸入人胰岛素颗粒具有2.01μm的体积平均直径。如上所述，根据如实施例1所述制备的可吸入人胰岛素颗粒具有小于2μm的粒径D50，所有4个批次的根据如实施例2(其也使用包含90体积％甲醇的酸性溶液来制备)所述制备的可吸入人胰岛素颗粒的体积平均直径的平均值为1.79μm。因此，可看出所述溶剂的组成(例如甲醇比水)可改变所产生的微粒化人胰岛素的尺寸。

实施例4：在低浓度的甲醇溶液中制备可吸入人胰岛素颗粒的方法

根据实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是，使用约2.0pH(另外50体积％含有水和HCl)的基于所述酸性溶液的总体积计含有50体积％甲醇的酸性溶液或含有10体积％的甲醇(另外90体积％含有水和HCl)的酸性溶液来替换用于溶解实施例1的人胰岛素原材料的所述含有90体积％的甲醇的酸性溶液。

表4显示了如实施例1、3和4所述的关于微粒化人胰岛素颗粒的粒径分布数据。

表4

因此得出结论，利用起始溶剂(例如甲醇溶液比水)和溶剂浓度(例如基于所述酸性溶液总体积计，10体积％、50体积％或90体积％的甲醇)来溶解人胰岛素(原材料)可以影响所述微粒化人胰岛素颗粒的粒径。

实施例5：在10体积％乙醇溶液中制备可吸入人胰岛素颗粒的方法

根据实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是使用2.0pH的基于所述酸性溶液的总体积计含有10体积％乙醇(另外90％体积％含有水和HCl)的酸性溶液以替换含有90体积％的用于溶解实施例1的胰岛素的甲醇的酸性溶液。如实施例2所述分析生成的可吸入人胰岛素颗粒的粒径分布。粒径分析结果表明，可吸入人胰岛素颗粒具有1.36μm的体积平均直径。

实施例6：使用90体积％甲醇溶液在不同pH下微粒化人胰岛素为可吸入颗粒的方法

根据实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是利用一系列含有具有3至9pH的NaOH的缓冲溶液来替代利用具有5.64pH的缓冲溶液。根据实施例2所述分析所述生成的人胰岛素颗粒的粒径分布。也使用NaOH调节所述溶液的pH。滴定后所述粒径分布分析结果和相应的缓冲溶液的pH的示于表5中。从表5所示的数据可以得出结论，使用具有3至9的pH的缓冲溶液适合于微粒化工艺的实施方案。

表5

实施例7：使用异丙醇共溶剂制备可吸入人胰岛素颗粒的方法

根据实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是在滴定完成或大致完成后，使用异丙醇来替代实施例1的乙醇添加至所述悬浮液。生成的可吸入人胰岛素颗粒的粒径分布如实施例2所述进行分析。所述粒径分布分析的结果示出了所述可吸入人胰岛素的体积平均直径为1.27μm。

实施例8：使用丙酮共溶剂制备可吸收的人胰岛素颗粒的方法

根据实施例1所述制备可吸入人胰岛素颗粒，不同的是在所述滴定完成或大致完成后，使用丙酮来替代实施例1的添加至所述悬浮液的乙醇。生成的可吸入人胰岛素颗粒的粒径分布如实施例2所述进行分析。所述粒径分布分析的结果示出了所述可吸入人胰岛素的体积平均直径为1.32μm。

实施例9：微粒化甘精胰岛素类似物为可吸入颗粒的的方法

甘精胰岛素是长效人胰岛素类似物。本文使用的甘精胰岛素是通过商购得到的甘精胰岛素

超滤获得的。甘精胰岛素在使用前经洗涤并冻干。将70mg的经洗涤和冻干的甘精胰岛素溶解在7.7ml的pH为约2.2且包括基于所述酸性溶液的总体积计90体积％甲醇(另外10体积％包括水和HCl)的酸性溶液中，以形成包含甘精胰岛素的溶解的胰岛素溶液。逐滴添加1.75ml的pH为6.9的磷酸盐缓冲溶液，以在所述甘精胰岛素完全或大致上完全溶解后滴定溶解的甘精胰岛素溶液。向溶液加入10ml的乙醇。上述溶解、滴定和添加醇在稳定(大致连续)的搅拌下进行。澄清的溶解的甘精胰岛素溶液成为包括微粒化甘精胰岛素颗粒(微粒化甘精胰岛素颗粒)的乳白色悬浮液。分离、清洗并干燥微粒化甘精胰岛素颗粒。使用根据实施例2所述的激光衍射检测分析微粒化甘精胰岛素颗粒的粒径分布。颗粒分布分析显示，所述微粒化甘精胰岛素颗粒的体积平均直径为2.27μm。图8是微粒化甘精胰岛素颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。图9是溶解的微粒化甘精胰岛素颗粒的HPLC色谱图。图9所示的HPLC结果的保留时间表明所述甘精胰岛素的化学性质在微粒化期间没有改变(或大致上没有改变)。图10和11是显示由使用HFA 134A作为推进剂的定量雾化吸入器递送的甘精胰岛素颗粒的安德森级联冲击器研究的结果的图表。定量雾化吸入器如下文根据实施例11所述制备。图10和11显示的研究结果证实一致或基本一致的模式。

实施例10：微粒化门冬胰岛素类似物为可吸入颗粒的方法

门冬胰岛素是一种速效胰岛素类似物。本文使用的门冬胰岛素通过超滤

(从Novo Nordisk，

Denmark获得)获得。所述超滤的门冬胰岛素在使用前经清洗并冻干。将70mg的经清洗和冻干的门冬胰岛素溶解在7.7ml的pH为约2的并且包括HCl的酸性溶液中，以形成包含门冬胰岛素的溶解的胰岛素溶液。逐滴添加4.2ml的pH为5.64的乙酸盐缓冲溶液，以在门冬胰岛素完全或大致完全溶解后滴定溶解的门冬胰岛素溶液。向所述溶液添加78ml的乙醇以获得悬浮液。在稳定(基本连续)的搅拌下进行上述溶解、滴定和添加乙醇。澄清的溶解的门冬胰岛素溶液变为包含微粒化门冬胰岛素颗粒(微粒化门冬胰岛素颗粒)的乳白色悬浮液。分离、清洗并干燥门冬胰岛素颗粒。利用根据实施例2所述激光衍射检测来分析微粒化门冬胰岛素颗粒的粒径分布。颗粒分布分析显示微粒化门冬胰岛素颗粒的体积平均直径为2.72μm。图12是微粒化门冬胰岛素颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。图13是溶解的微粒化门冬胰岛素颗粒的HPLC色谱图。图13所示的HPLC结果的保留时间表明在微粒化期间所述门冬胰岛素的化学性质没有改变(或大致上没有改变)。

图14和15是显示由使用HFA 134A作为推进剂的定量雾化吸入器递送的甘精胰岛素颗粒的安德森级联冲击器研究的结果的图表。定量雾化吸入器如下文根据实施例11所述制备。图14和图15显示的研究结果证实一致或基本一致的模式。

实施例11：用于体外安德森级联冲击器检测的定量雾化吸入器的制备

定量雾化吸入器(MDI)根据以下工艺制备。将合适的或适量的微粒化人胰岛素API(例如微粒化人胰岛素颗粒或微粒化人胰岛素类似物颗粒)和乙醇填充到吸入器罐中。然后通过使用VWR Aquasonic应用超声能量混合所述罐的内容物5分钟，以获得均匀的或大致上均匀的悬浮液。添加不同的推进剂，例如HFA 134A、HFA 227或其混合物，并且利用合适的阀通过夹紧来密封罐。

将微粒化人胰岛素(例如微粒化人胰岛素颗粒或微粒化胰岛素类似物颗粒)作为活性成分填充至定量雾化吸入器(MDI)中。吸入器中人胰岛素或胰岛素类似物的浓度为3mg/g。图7、图11和图15所示的安德森级联冲击器数据与使用激光衍射粒径分析仪观察到的粒径分布结果良好地对应。在本文提供的安德森级联冲击器数据中，释放剂量是指沉积在安德森级联冲击器上的人胰岛素或胰岛素类似物的百分比。

通过本文公开的工艺实施方案微粒化的人胰岛素颗粒的表面的形状和粗糙度(或平滑度)是非常合适的或有利的(例如合适于或有利于肺部递送)。通过喷射研磨的微粒化是将颗粒从毫米尺寸范围研磨至更小的微米尺寸范围的常用方法。喷射研磨过程涉及颗粒之间的频繁碰撞以及由高速气流引起的与研磨室的壁的碰撞。通过气流的圆周运动和离心力从喷射研磨产生的微粒化颗粒从研磨室中提取。这些机械力可能损坏微粒化颗粒的表面和形状，例如，如下面根据比较例1所述的，其可能不利于或不合适于肺部给药。

比较实施例1：通过喷射研磨制备人胰岛素颗粒

利用75PSI的研磨N₂压力以及约1g/min的进料速率通过喷射研磨来制备人胰岛素颗粒。图16是利用所述喷射研磨方法微粒化的人胰岛素颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。如图16可看出，通过喷射研磨制备的人胰岛素颗粒具有粗糙的以及不规则的(或不均匀的)外观。

图17是根据实施例2所述所微粒化的可吸入人胰岛素颗粒的APM图像。由于本文公开的工艺实施方案在室温下进行并且不涉及机械力和/或热量(或大致上没有机械力和/或热量)，所述微粒化人胰岛素颗粒具有更合适或更优选用于人肺部给药的形状和表面。

虽然已经结合特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于所公开的实施方案，而相反旨在涵盖在其所附权利要求的精神和范围内的各种变形和等效安排。在整个文本和权利要求中，所有如相关领域的普通技术人员所理解的，术语“约”和“大致上”用作近似的术语，而不是程度的术语，并且反映与测量、有效数字和可互换性相关联的固有变差。此外，应当理解，除非另有说明，在本发明所公开的以及所附的权利要求中，即使数值前没有术语“约”，其也被该术语隐含地修饰。

Claims (17)

1.一种制备适用于肺部递送的可吸入胰岛素的方法，该方法包括：

在酸性溶液中溶解胰岛素原材料以形成溶解的胰岛素溶液，其中所述酸性溶液包含选自水、醇及其混合物中的一种并且具有1.0至3.0的pH，并且其中所述胰岛素原材料是结晶胰岛素；

使用缓冲溶液滴定所述溶解的胰岛素溶液以形成包含微粒化胰岛素颗粒的悬浮液；以及

在滴定所述溶解的胰岛素溶液后通过向所述悬浮液添加稳定制剂稳定所述微粒化胰岛素颗粒，

其中所述稳定制剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮及其混合物，并且

其中所述方法在不向所述酸性溶液、所述胰岛素溶液或所述悬浮液添加辅料聚合物的情况下进行。

2.权利要求1的方法，其中基于所述酸性溶液的总体积计，所述酸性溶液包含含量为10体积％至90体积％的所述醇。

3.权利要求1的方法，其中基于所述酸性溶液的总体积计，所述酸性溶液包含含量大于0体积％至90体积％的所述醇。

4.权利要求1的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇及其混合物。

5.权利要求1的方法，其中所述缓冲溶液具有3至10的pH。

6.权利要求1的方法，其中所述稳定制剂具有中性pH，且与水是可混溶的。

7.权利要求1的方法，其中所述稳定增加所述微粒化胰岛素颗粒的产量。

8.权利要求1的方法，其中所述微粒化胰岛素颗粒在pH 3至9下微粒化。

9.权利要求1的方法，其中所述微粒化胰岛素颗粒在pH 4.5至7.5下微粒化。

10.权利要求1的方法，其中所述微粒化胰岛素颗粒包含具有约1.2μm至2μm的体积平均直径的大致上球形的颗粒。

11.权利要求1的方法，其中基于所述微粒化胰岛素颗粒的总体积计，所述微粒化胰岛素颗粒包含高达99体积％的具有小于5μm的粒径的颗粒。

12.权利要求1的方法，其中所述酸性溶液具有1.8至2.2的pH。

13.权利要求1的方法，其中所述酸性溶液具有约2的pH，且包含水和基于所述酸性溶液的总体积计10体积％至90体积％的选自甲醇、乙醇及其混合物的有机溶剂。

14.权利要求1的方法，其中所述微粒化胰岛素颗粒为大致上球形的形状且具有小于5μm的粒径。

15.权利要求1的方法，其中所述微粒化胰岛素颗粒包含选自人胰岛素、动物胰岛素、胰岛素类似物及其混合物的胰岛素，并且其中所述胰岛素类似物选自门冬胰岛素、甘精胰岛素及其混合物。

16.权利要求1的方法，其中选自所述溶解、所述滴定、所述稳定及其组合中的一种在室温下进行。

17.权利要求1的方法，其中所述结晶胰岛素选自结晶人胰岛素、结晶动物胰岛素、结晶胰岛素类似物及其混合物，并且其中所述结晶胰岛素类似物选自结晶门冬胰岛素、结晶甘精胰岛素及其混合物。

Images