MXPA05001042A

MXPA05001042A - Un metodo para purificar preproinsulina.

Info

Publication number: MXPA05001042A
Application number: MXPA05001042A
Authority: MX
Inventors: Chantalle Havenith
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 2002-08-01
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-04-08
Also published as: WO2004013176A1; ES2297223T3; EP1527097B1; JP4519646B2; EP1527097A1; DK1527097T3; AU2003254375A1; SI1527097T1; CA2493539A1; DE10235168A1; DE50309087D1; IL166438A; PT1527097E; ATE384742T1; CA2493539C; CY1108046T1; IL166438A0; US20060183666A1; US20050080000A1; JP2006513978A

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para la purificacion cromatografica de preproinsulinas, de conformidad con el cual, se separan sustancias de peso molecular superior a partir de una solucion acuosa de la preproirisulina por medio de una primera cromatografia sobre un intercambiador anionico en el modo de flujo directo, y una segunda cromatografia ulterior sobre un intercambiador cationico en el modo de adsorcion, y a un metodo para la produccion de insulinas, el cual comprende el metodo para producir preproinsulinas.

Description

UN MÉTODO PARA PURIFICAR PREPROINSULINA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Aproximadamente 12 millones de personas en el mundo padecen ia diabetes mellitus de tipo 1 , que se caracteriza por una producción indígena insuficiente de la hormona insulina. La sustitución de la falta de secreción de insulina endocrina mediante la aplicación de preparaciones de insulina es la única forma posible de terapia para este tipo de diabetes mellitus. Las preparaciones de insulina son preparaciones farmacéuticas cuya sustancia activa es la hormona insulina. En este caso, se utilizan análogos de insulina y derivados de insulina además de las insulinas que aparecen en la naturaleza. La insulina humana que se produce en el páncreas humano es un polipéptido que comprende 51 restos aminoácidos que se dividen en dos cadenas peptídicas: la cadena A, que tiene 21 restos aminoácidos, y la cadena B, que tiene 30 restos aminoácidos. La secuencia de los restos aminoácidos en ambas cadenas peptídicas se ha determinado genéticamente y es conocida. Ambas cadenas están conectadas entre sí mediante dos puentes disulfuro. Además, la cadena A también contiene un puente disulfuro intracatenario. Los análogos de insulina se diferencian de la insulina humana por la sustitución de al menos un resto aminoácido y/o la adición o eliminación de al menos un resto aminoácido. Los análogos de insulina pueden aparecer en la naturaleza en otras especies diferentes de la humana, o puede haberse preparado de modo artificial. Los derivados de insulina contienen restos aminoácidos químicamente modificados que contienen, por ejemplo, más grupos éster o amido, pero que en los demás aspectos muestran la secuencia de aminoácidos humana o de un análogo. Normalmente, los análogos de insulina o derivados de insulina muestran una cinética de acción alterada comparada con la insulina humana sin modificar. Durante algunos años, la insulina humana y los análogos de insulina o derivdos de insulina se han preparado mediante la técnica de DNA recombinante. En métodos industriales, por ejemplo, primero se prepara un precursor apropiado de fórmula 1 , la preproinsulina (PPI), a partir de la cual se prepara la insulina humana o los análogos de insulina mediante ruptura enzimática. Por ejemplo, un método genético para preparar insulina humana comprende las siguientes etapas de un método: a) Fermentación de microorganismos genéticamente modificados, b) Recoger dichos microorganismos y realizar la ruptura de las células, c) Aislamiento de los cuerpos de inclusión que contienen la proteína de fusión no disuelta, d) Disolver dicha proteína de fusión con el plegamiento correcto de la cadena peptídica y con el cierre simultáneo de los puentes disulfuro para producir preproinsulina, e) Ruptura enzimática de la preproinsulina para producir insulina humana, f) Purificación de la insulina humana, g) Cristalización de la insulina humana y secado del producto obtenido. Cuando se prepara un análogo de insulina, la secuencia de aminoácidos (de las cadenas A y B) en las regiones apropiadas de la preproinsulina ya se ha predeterminado. La ruptura enzimática de las diversas preproinsulinas se realiza utilizando proteasas como, por ejemplo, la enzima tripsina y además, si es necesario, la enzima carboxipeptidasa B. La preproinsulina es una proteína de fórmula 1 , R1-B1-B30-X-A1-A20-R2 (1) en la que X a) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o b) es un péptido que tiene de 2 a 35 restos aminoácidos, que comienza y finaliza, en cada caso, con un resto aminoácido básico, en particular Arg, y que, si consiste en más de 3 restos aminoácidos, comienza y finaliza, en cada caso, con dos restos aminoácidos básicos, en particular Arg y/o Lys, R a) es hidrógeno, b) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o c) es un péptido que tiene de 2 a 15 restos aminoácidos, R2 es un resto aminoácido genéticamente codificable, y y los restos A1 - A20 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana o de un ánalogo de insulina, y los restos B1 - B30 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana o de un análogo de insulina. La preproinsulina es, preferiblemente, una proteína de fórmula 1 en la que X es un péptido que tiene 35 restos aminoácidos con la secuencia de la cadena C de la insulina humana o insulina de simio, o es un péptido que tiene 29 aminoácidos de secuencia: Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gin-Lys-Arg (SEQ ID NO:1) R1 es un péptido que tiene de 2 a 15 restos aminoácidos, cuyo resto aminoácido carboxilo-terminal es Arg, R2 es el resto aminoácido Asn o Gly, y los restos A1 - A20 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana, y los restos B1 - B30 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena B de la insulina humana o de un análogo de la insulina, en el que Lys sustituye a Asn en la posición B3 y Glu sustituye a Lys en la posición B29. La etapa del proceso de disolver la proteína de fusión con el plegamiento correcto de la cadena peptídica y con el cierre simultáneo de los puentes disulfuro para producir preproinsulina, produce, además de la preproinsulina monomérica deseada, formas poliméricas de preproinsulina en una reacción competitiva. Dichas preproinsulinas poliméricas pueden detectarse, debido a su mayor peso molecular, mediante análisis de HPLC-GPC o mediante el método de dispersión de luz dinámica. Para reprimir esta reacción competitiva no deseada, la concentración inicial de la proteína de fusión debe ser lo más baja posible (De Bernadez et al., Meth. Enzym., 309:217, 1999). En la práctica, esta etapa del proceso produce preproinsulina a una concentración desde aproximadamente 0,5 a 1 g/l, encontrándose también aproximadamente 40% de proporciones de mayor peso molecular. Las proporciones de mayor peso molecular incluyen las preproinsulinas poliméricas. De forma sorprendente, se descubrió dentro del marco de trabajo de la presente invención que las formas poliméricas de las preproinsulinas afectan de forma adversa a la estabilidad de las insulinas en las posteriores etapas del proceso mediante la inducción de la desnaturalización de las insulinas nativas. Se sabe que, durante la cadena de las reacciones de desnaturalización, una primera etapa reversible produce, a partir de las moléculas de insulina monoméricas disueltas, agregados lineales en los que las fuerzas adhesivas físicas mantienen juntas a las unidades repetidas. Una reacción irreversible posterior produce, a partir de los agregados disueltos, haces de agregados insolubles estables (fibrillas) que, a su vez, inducen la desnaturalización de las insulinas nativas en un proceso autocatalítico. Estas fibras de insulina insolubles no sólo son biológicamente inactivas, sino que también pueden provocar el bloqueo de las agujas de inyección durante la aplicación de las preparaciones de insulina farmacéuticas. Ademas, también se las hace responsables de reacciones de incompatibilidad inmunológica, que a veces pueden producirse durante la terapia con preparaciones de insulina (J. Brange et al., J. Pharm. Se, 1997, 86, 517-525; R.E. Ratner et al., Diabetes, 39, 728-733, 1990). En la parte posterior del proceso de preparación de insulina, la preproinsulina se convierte en insulina humana con la ayuda de las enzimas tripsina y carboxipeptidasa B (véase Kemmler, W., Peterson, J.D. y Steiner, D.F., J. Biol. Chem., 246 (1971), 6786-6791). En este caso, se elimina el péptido conector entre las cadenas A y B (X en la fórmula 1) y la parte pre en el extremo amino de la cadena B (R1 en la fórmula 1). La reacción enzimática con la tripsina rompe no sólo aquellos enlaces peptídicos cuya ruptura produce insulina humana, sino además, en una reacción competitiva, otros enlaces peptídicos cuya ruptura produce una pluralidad de subproductos no deseados. La formación de insulina des-Thr debido a otra ruptura entre los restos aminoácidos B29 y B30 en la fórmula 1 (véase el documento EP 0 264 250 B1) resulta particularmente indeseable. La eliminación de este subproducto en las posteriores etapas de purificación produce grandes pérdidas de producto. Con el fin de reprimir esta reacción secundaria no deseada, la concentración inicial de preproinsulina debe ser lo más alta posible, es decir, en el intervalo de 8 - 25 g/l, que se corresponde con 1 - 3 m (véase el documento EP 0 264 250 B1). Este requerimiento contrasta con el requerimiento mencionado en el penúltimo párrafo. A partir de lo anterior, es evidente que resulta ventajoso introducir, entre la producción de la preproinsulina y la ruptura de la preproinsulina para producir insulina, otra etapa del proceso que elimine las preproinsulinas poliméricas de la manera más completa posible y, al mismo tiempo, aumente la concentración de la preproinsulina monomérica lo más posible. Otra condición es la necesidad de asegurar un rendimiento muy alto en esta etapa del proceso. Por tanto, se ha propuesto (documento EP 0 600 372 B1) concentrar la preproinsulina sobre una resina adsorbente hidrófoba. El solicitante fue capaz de demostra, en sus propios experimentos, que aunque puede lograrse un factor de concentración alto de F = 10 - 15, prácticamente no se produce ninguna eliminación de las preproinsulinas poliméricas. Otra propuesta (D.F. Steiner et al., Diabetes, 17 (1968), 725-736) menciona la purificación cromatográfica de la preproinsulina con la ayuda de una resina de intercambio iónico. En los experimentos de los inventores, sólo se logró un factor de concentración de F = 5, y una eliminación de las proporciones de mayor peso molecular hasta aproximadamente 5%, utilizando una resina de intercambio iónico. Aunque la utilización de una resina de intercambio catíónico eliminó las proporciones de mayor peso molecular hasta aproximadamente 1%, la capacidad de unión de la resina por la preproinsulina demostró no se satisfactoria. De forma sorprendente, después se descubrió que la combinación de una cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico en el modo de corriente con una cromatografía inmediatamente posterior sobre una resina de intercambio catíónico en el modo de absorción proporcionaba unos resultados diferenciadamente superiores. La presente invención, por tanto, se refiere a un método para eliminar, de forma eficaz, las sustancias de mayor peso molecular de una disolución acuosa de preproinsulina con una alta concentración simultánea de preproinsulina monomérica. Según la invención, una disolución acuosa diluida de una preproinsulina, como se produce durante el proceso de preparación de la insulina, se bombea desde pH 7,0 a 9,0, preferiblemente desde pH 7,5 a 8,5, y con una conductividad desde 5 a 7 mS/cm a través de una precolumna cargada con una resina de intercambio aniónico, por ejemplo Source 30 Q. En este caso, la preproinsulina monomérica no se une a la resina, sino que atraviesa la columna junto con el permeado. Por contraste, la mayoría de las sustancias de mayor peso molecular, incluyendo las preproinsulinas poliméricas, se adsorbe a la resina y, por tanto, se separa de la preproinsulina. El permeado de esta precolumna, que contiene la sustancia de interés, se ajusta en línea desde pH 3,0 a 5,5, preferiblemente desde pH 4,0 a 5,0, utilizando ácido clorhídrico, y después se bombea directamente sobre una segunda columna cargada con una resina de intercambio catiónico, por ejemplo Source 30 S. La preproinsulina se adsorbe a esta resina y la impurezas se eliminan mediante el lavado de la columna, junto con el permeado. La preproinsulina se desorbe con la ayuda de un tampón de elución que contiene cloruro de sodio a una concentración de crecimiento lineal desde 1 a 20 g/l, preferiblemente desde 2,5 a 15,0 g/l. La preproinsulina purificada se recoge en una fracción principal, mientras que otras impurezas se eliminan en una prefracción y una posfracción. En la fracción principal que contiene > 90% de la cantidad inicial de preproinsulina, se midió una concentración desde 15 a 20 g/l (factor de concentración F = 20 - 25). Las sustancias de mayor peso molecular se eliminaron hasta una proporción de < 0,1 %. La preproinsulina purificada de esta manera puede aislarse de la disolución de forma intermedia mediante cristalización, o la disolución puede introducirse directamente en la etapa del proceso de ruptura enzimática.

La presente invención, por tanto, se refiere a un método para la purificación cromatográfica de preproinsulina de fórmula 1 , - HN - Phe Cys " Cys -Thr (B1) <B7) (B3D) R1-B1-B3Q÷X-A1-A20-R2 (1 ) en la que a) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o b) es un péptido que tiene de 2 a 35 restos aminoácidos, que comienza y finaliza, en cada caso, con un resto aminoácido básico, en particular Arg, y que, si consiste en más de 3 restos aminoácidos, comienza y finaliza, en cada caso, con dos restos aminoácidos básicos, en particular Arg y/o Lys, R1 a) es hidrógeno, b) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o c) es un péptido que tiene de 2 a 15 restos aminoácidos, R¿ es un resto aminoácido genéticamente codificable, y y los restos A1 - A20 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana o de un ánalogo de insulina, y los restos B1 - B30 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana o de un análogo de insulina; en el que en dicho método se eliminan las sustancias de mayor peso molecular de una disolución acuosa de dicha preproinsulina mediante una primera cromatografía sobre un intercambiador aniónico en el modo de corriente, y una segunda cromatografía posterior sobre un ¡ntercambiador catiónico en el modo de adsorción; en el que dicha preproinsulina puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn; (SEQ ID NO:2) Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly; (SEQ ID NO: 3) Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Giy-Gly-Gly-Pro-Gly-AIa-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-IIe-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO:4). La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, para separar sustancias extrañas de las disoluciones de preproinsulinas que inducen la desnaturalización de la insulina. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, en el que se realiza una segunda cromatografía a un pH desde 3,0 a 5,5. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, en el que la segunda cromatografía se realiza bajo una presión desde 1 a 30 bar. La invención se refiere además a un método para preparar insulina mediante la expresión de preproinsulina no plegada, que comprende las etapas de: a) fermentación de microorganismos genéticamente modificados que expresan preproinsulina no plegada, b) recogida de dichos microorganismos y realización de la ruptura de las células, c) aislamiento de los cuerpos de inclusión que contienen preproinsulina no plegada y no disuelta, d) disolución de la preproinsulina con el plegamiento correcto de la cadena peptídica y el cierre simultáneo de los puentes disulfuro para producir preproinsulina, y posteriormente la realización de un método para la purificación cromatográfica de la preproinsulina de fórmula 1 , como se describió anteriormente, e) ruptura enzimática de la preproinsulina para producir insulina humana, f) purificación de la insulina humana, g) cristalización de la insulina humana y secado. La invención se ilustra con más detalle a continuación, sin estar limitada a esto. EJEMPLOS: La disolución de partida para la purificación de diversas preproinsulinas de fórmula 1 , descrita en los siguientes ejemplos 1 to 3, se preparó de la manera conocida (documento EP 0 489 780 y documento EP 0 600 372) como sigue, según las etapas del proceso a, b, c y d, mencionadas anteriormente: Durante la fermentación de los microorganismos (etapa del proceso a), las células de E. coli forman cuerpos de inclusión que contienen la proteína de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos de la preproinsulina. Después de terminar la fermentación, las células se aislan mediante centrifugación y se rompen mediante la homogeneización a alta presión habitual (etapa del proceso b). Los cuerpos de inclusión insolubles liberados en el proceso se aislaron mediante centrifugación y se lavaron con agua en la centrífuga (etapa del proceso c). En la posterior etapa del proceso d, los cuerpos de inclusión con la proteína de fusión se disolvieron en una disolución de hidrocloruro de guanidina 8 M a pH 10,8. Después de diluir con agua y de añadir hidrocloruro de cisteína, la proteína de fusión se plegó con el cierre de los tres puentes disulfuro a pH 10,8 y 4°C para producir la preproinsulina de fórmula 1. La disolución entonces se ajustó a pH 5 utilizando ácido clorhídrico de 10% de potencia, como resultado de lo cual las proteínas extrañas precipitaron y se eliminaron mediante centrifugación. El sobrenadante después de la centrifugación contenía de 0,6 a 0,8 g/l de preproinsulina monomérica. La pureza de la preproinsulina, según se determinó mediante un análisis de HPLC-RP, era aproximadamente 65% en área. El análisis de HPLC-GPC determinó una proporción de aproximadamente 45% en área de impurezas de mayor peso molecular. ANÁLISIS DE HPLC-RP Columna: LiChroCART 250-4 de Merck (Superspher 100- RP18e) Instrumento: Waters 2690 Programa informático: Waters Millenium Gradiente: A: acetonitrilo al 25% en volumen, NaCI 0,3 M en lampón fosfato 0,05 M pH 2,5 B: acetonitrilo al 65% en volumen, NaCI 0,05 M en tampón fosfato 0,05 M pH 2,5 El gradiente se caracteriza por las siguientes cantidades de tampón B, según los correspondientes tiempos de ensayo: 0 min al 4,0%; 20 min al 17,0%; 30 min al 37,0%; 40 min al 4,0% Temperatura: 35°C Volumen de carga 10 µ? Tiempo de ensayo total: 55 min Caudal: 1 ,0 ml/min Detección: 214 nm (Waters 2487) Para determinar el contenido en preproinsulina en la disolución de carga, el área del pico de la preproinsulina en la muestra analizada se dividió entre la correspondiente área del pico de una sustancia patrón. Para determinar el grado de pureza, el área del pico de la preproinsulina se dividió entre la suma de las áreas de los picos de todas las sustancias eluibles en la muestra analizada.

ANÁLISIS DE HPLC-GPC Columna: 2 columnas en serie, acero inoxidable L = 300 mm; DI = 7,8 mm Instrumento: bomba: Waters 510 / muestreador automático: Wisp 717 Programa informático: Waters Millenium Fase estacionaria: Shodex Protein KW 802,5, 120-7 diol Límites de separación: de 2.000 a 80.000 dalton Fase móvil: acetonitrilo al 30% en volumen, ácido acético 3,5 M, pH 3,0 ajustado con amoniaco acuoso Gradiente: ¡socrático Temperatura: temperatura ambiente Volumen de carga: 100 µ? Tiempo de ensayo total: 65 min Caudal: 0,5 ml/min Detección: 276 nm (Waters 2487) Para determinar la proporción de sustancias de mayor peso molecular, las áreas de los picos de todas las sustancias de mayor peso molecular que eluyeron antes de la preproinsulina monomérica se dividieron entre la suma de las áreas de los picos de todas las sustancias eluibles. Se determinó el tiempo de retención de la preproinsulina monomérica utilizando una sustancia patrón.

Ejemplo 1 Después de terminar las etapas del proceso a, b, c y d, mencionadas anteriormente, se obtuvo una disolución de preproinsulina que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, a partir de células E. coli modificadas genéticamente de forma apropiada: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gin-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Giy-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO:2) Dicha preproinsulina se corresponde con la fórmula 1 , en la que X es una cadena peptídica que tiene 35 restos aminoácidos con la secuencia del péptido C de simio, R1 es una cadena peptídica que tiene 10 restos aminoácidos con la secuencia: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO:5) R2 es el resto aminoácido Asn (idéntico a A21 de la cadena A de la insulina humana) A1-A20 es la cadena peptídica que tiene la secuencia (sólo de A1 a A20) de la cadena A de la insulina humana B1-B30 es la cadena peptídica que tiene la secuencia de la cadena B de la insulina humana.

La disolución de preproinsulina se purificó utilizando un aparato que comprende, principalmente, dos columnas de cromatografía dispuestas en serie y con un recipiente de agitación entre ambas. El recipiente de agitación se utilizó para cambiar el pH de la disolución en línea entre las dos columnas. En la primera columna de cromatografía (fabricante: Pharmacia, diámetro: 5 cm), se preparó un lecho de gel (altura del lecho: 14 cm, volumen del lecho: 275 mi) utilizando la resina de intercambio aniónico DEAE-Sepharose de flujo rápido (fabricante: Pharmacia Biotech; n° de producto 17-0709-05). La columna se hizo funcionar desde la parte superior a la inferior y a una presión atmosférica de 1 bar. El caudal era de 2.000 ml/h. Se instalaron una válvula de múltiples vías, una bomba de carga (Ismatec MV) y una trampa de burbujas corriente arriba de la columna. Las siguientes disoluciones se bombearon a la columna sucesivamente a través de la válvula de múltiples vías: 8,1 I de disolución de carga, 2, .3 I de tampón de desplazamiento, 1 ,4 I de tampón de lavado, 1 ,4 I de disolución de regeneración, 2 i de tampón de equilibrio. Una sonda de UV (275 nm, con registro de datos) y otra válvula de múltiples vías se instalaron corriente abajo de la columna. A través de la segunda válvula de múltiples vías se hicieron pasar aproximadamente 10,2 l de la fracción de permeado hacia el recipiente de agitación mencionado anteriormente y, posteriormente, se hizo pasar aproximadamente 1 l de la fracción de lavado hacia un recipiente de recogida. Los permeados remanentes se descargaron en el canal de residuos biológicos a través de la válvula de múltiples vías. La cromatografía de intercambio amónico se realizó en el modo de corriente, es decir, se eligieron las condiciones (pH 8,3; conductividad = 6,1 mS/cm) de forma que la sustancia valiosa, la preproinsulina, no se une al gel, sino que se lava a través de la columna junto con el permeado durante la aplicación del producto. Por contraste, las contaminaciones se adsorbieron al gel y se eliminaron con el tampón de lavado y la disolución regeneradora. Las disoluciones tenían la siguiente composición: Disolución de partida para la columna 1: Disolución de partida (sobrenadante de la 8,0 I centrifugación) Disolución de cloruro de sodio, potencia 100 mi 12,5 ml/l 25% (p/p) aprox. 4,5 mi Disolución de hidróxido de sodio, 10% (p/p) pH 8,3 Conductividad 6,1 mS/cm Temperatura aprox. 5 °C Agua purificada 1 1 Tris(hidroximetil)aminometano 4,0 g/l Cloruro de sodio 2,5 g/l aprox. 2,5 ml/l Ácido clorhídrico, potencia 25% (p/p) pH 8,0 Conductividad aprox. 5,7mS/cm Temperatura temperatura ambiente Agua purificada 1 I Tris(hidroximetil)am¡nornetano 5,0 g/l Cloruro de sodio 15 g/l aprox. 3 ml/l Ácido clorhídrico, potencia 25% (p/p) pH 8,0 Conductividad aprox. 24mS/cm Temperatura temperatura ambiente Disolución regeneradora para las columnas 1 y 2: Agua purificada 0,91 I Cloruro de sodio 40 g 40g/l Disolución de hidróxido de sodio, potencia 0,09 I 1 mol/I 33% (p/p) Tampón de equilibrio para la columna 1: Agua purificada 1 I Tris(hidroximetil)aminometano 5,0 g/l Cloruro de sodio 2,0 g/l aprox. 3 mi Ácido clorhídrico, potencia 25% (p/p) pH 8,0 Conductividad aprox. 5,1mS/cm Temperatura temperatura ambiente La fracción del permeado que contiene la sustancia valiosa, la preproinsulina, y la fracción de lavado que contiene la mayoría de las impurezas de mayor peso molecular se recogieron en la salida de la columna: 1. aproximadamente 10,2 I de la fracción del permeado (al comienzo de la disolución de carga, desde un valor de UV 20% (ascendente) hasta un valor de UV 35% (descendente), durante el desplazamiento del producto) 2. aproximadamente 1 1 de la fracción de lavado (durante la carga del tampón de lavado, desde un valor de UV 30% (pendiente ascendente) hasta un valor de UV 40% (descendiente)) Todos los demás permeados se descargaron en el canal de residuos biológicos. La figura 1 representa el diagrama de UV medido a la salida de la columna 1. La fracción del permeado de la primera columna se ajustó a pH 3,5 con ácido láctico de potencia 90% en línea en el recipiente intermedio (volumen nominal: 4 I, con agitación, sonda de pH y tubo de entrada), y después se bombeó directamente a la columna de la segunda cromatografía. En la columna de la segunda cromatografía (fabricante: Pharmacia, diámetro: 5 cm), se preparó un lecho de gel (altura del lecho: 10,5 cm, volumen del lecho: 206 mi) utilizando la resina de intercambio catiónico Source 30 S (fabricante: Pharmacia Biotech; n° de producto 17-1273-04). La columna se hizo funcionar desde la parte superior a la inferior y a una presión atmosférica de 1 bar. El caudal era de, forma similar, 2.000 ml/h. Se instalaron una válvula de múltiples vías, una bomba de carga y una trampa de burbujas corriente arriba de la columna. Las siguientes disoluciones se bombearon a la columna sucesivamente a través de la válvula de múltiples vías: 10,2 I de disolución de carga (= fracción del permeado de la columna 1 , ajustada a pH 3,5) 0,5 I de tampón de desplazamiento 3,0 I de tampón de elución A/B (cantidades iguales de A y B) 2,3 I de disolución regeneradora 2 I de tampón de equilibrio Una sonda de UV (275 nm, con registro de datos) y otra válvula de múltiples vías se instalaron corriente abajo de la columna. Aproximadamente 1 I de la fracción principal se condujo, mediante la segunda válvula de múltiples vías, hacia el recipiente de recogida. Los permeados remanentes se descargaron en el canal de residuos biológicos a través de la válvula de múltiples vías. La cromatografía de intercambio catiónico se realizó en el modo de adsorción, es decir, la sustancia valiosa, la preproinsulina, se adsorbió al gel durante la aplicación del producto, y (después de desplazar a la disolución de carga) se desorbió de nuevo utilizando el tampón de elución A/B. Par lograr un efecto de purificación óptimo, se aplicó un gradiente de cloruro de sodio de crecimiento lineal en el tampón de elución. Las disoluciones tenían la siguiente composición: Disolución de carga para la columna 2: Fracción del permeado de la columna 1 aprox. 10,2 1 14,3 mi Ácido láctico, potencia 90% pH 3,5 Conductividad aprox. 5,3 mS/cm Temperatura aprox. 5 °C Tampón de desplazamiento para la columna 2: Agua purificada 1 1 Ácido láctico, potencia 90% 8,3 mi 0,1 mol/I Cloruro de sodio 2,5 g 2,5 g/l aprox. Disolución de hidróxido de sodio, 8 mi potencia 10% (p/p) 3,5 pH Conductividad aprox. 8 mS/cm Temperatura temperatura ambiente Tampón de elución A para la columna 2: El tampón de elución A es Idéntico al tampón de desplazamiento para la columna 2.

Tampón de elución B para la columna 2: Agua purificada 1 1 Ácido láctico, potencia 90% 8,3 m/l 0,1 mol/l Cloruro de sodio 15,0 g 15,0 g/l aprox. Disolución de hidróxido de sodio, 7 mi potencia 10% (p/p) 3,5 pH Conductividad aprox. 25 mS/cm Temperatura temperatura ambiente Disolución regeneradora para las columnas 1 y 2: Agua purificada 0,91 I Cloruro de sodio 40 g 40g/l Disolución de hidróxido de sodio, 1 0,09 1 potencia 33% (p/p) mol/l Tampón de equilibrio para la columna 2: Agua purificada 1 1 Acido láctico, potencia 90% 8,3 g 0,1 mol/l Cloruro de sodio 2,9 g/l aprox. Disolución de hidróxido de sodio, 9 m! potencia 10% (p/p) 3,5 pH Conductividad aprox. 8,5 mS/cm Temperatura temperatura ambiente La fracción principal que contiene la sustancia valiosa, la preproinsulina, se recogió en la salida de la columna: aproximadamente 1 ,0 1 de la fracción principal (durante la elución, desde un valor de UV 65% (ascencente) hasta un valor de UV 76% (descendente)) Todos los demás permeados se descargaron en el canal de residuos biológicos. La figura 2 representa el diagrama de UV medido a la salida de la columna 2. En la disolución purificada (fracción principal de la columna 2), se midieron 15 g/l de preproinsulina con un grado de pureza de 89% en área (análisis de HPLC-RP). El rendimiento es de 91%, basado en la cantidad de preproinsulina en la disolución de partida. Se determinaron la proporciones de mayor peso molecular de 0,2% en área mediante análisis de HPLC-GPC. Ejemplo 2 Después de terminar las etapas del proceso a, b, c y d, mencionadas anteriormente, se obtuvo una disolución de preproinsulina que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, a partir de células E. coli modificadas genéticamente de forma apropiada: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-P e-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser- Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly (SEQ ID N0:3) Dicha preproinsulina se corresponde con la fórmula 1 , en la que X es una cadena peptídica que tiene 35 restos aminoácidos con la secuencia del péptido C de simio, R1 es una cadena peptídica que tiene 10 restos aminoácidos con la secuencia: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 5) R2 es el resto aminoácido Gly A1-A20 es la cadena peptídica que tiene la secuencia (sólo de A1 a A20) de la cadena A de la insulina humana B1-B30 es la cadena peptídica que tiene la secuencia de la cadena B de la insulina humana. La disolución de preproinsulina se purificó de nuevo utilizando un aparato que comprende, principalmente, dos columnas de cromatografía dispuestas en serie y con un recipiente de agitación entre ambas. El recipiente de agitación se utilizó para cambiar el pH de la disolución en línea entre las dos columnas. Los aparatos para la etapa de la segunda cromatografía se diseñaron para lograr una estabilidad de presión. La cromatografía en la columna 1 y el ajuste del pH en el recipiente intermedio se realizaron como se describe en el ejemplo 1 , de modo que la descripción y los valores no se repetirán en este punto. En la columna de la segunda cromatografía (fabricante: Prochrom, diámetro: 5 cm, material: acero inoxidable), se preparó un lecho de gel (altura del lecho: 10 cm, volumen del lecho: 196 mi) utilizando la resina de intercambio catiónico Source 30 S (fabricante: Pharmacia Biotech; n° de producto 17-1273-04). La columna se hizo funcionar desde la parte superior a la inferior y a una presión de trabajo de 10 bar. El caudal es de 3.500 ml/h. Se instalaron una válvula de múltiples vías, una bomba de carga (fabricante: Besta; tipo: HD2-300) corriente arriba de la columna. Las siguientes disoluciones se bombearon a la columna sucesivamente a través de la válvula de múltiples vías: 10,2 I de disolución de carga (= fracción del permeado de la columna 1 , ajustada a pH 4,6) 0,5 I de tampón de desplazamiento 3,0 I de tampón de elución A/B (cantidades iguales de A y B) 2,3 I de disolución regeneradora 2 I de tampón de equilibrio Una sonda de UV (275 nm, con registro de datos) y otra válvula de múltiples vías se instalaron corriente abajo de la columna. La fracción principal que contenía la preproinsulina purificada se condujo, mediante la segunda válvula de múltiples vías, hacia un recipiente de recogida. Los permeados remanentes se descargaron en el canal de residuos biológicos a través de la válvula de múltiples vías. La cromatografía de intercambio catiónico se realizó en el modo de adsorción, es decir, la sustancia valiosa, la preproinsulina, se adsorbió al gel durante la aplicación del producto, y (después de desplazar a la disolución de carga) se desorbió de nuevo utilizando el tampón de elución A/B. Para lograr un efecto de purificación óptimo, se aplicó un gradiente de cloruro de sodio de crecimiento lineal en el tampón de elución. Las disoluciones tenían la siguiente composición: Disolución de carga para la columna 2: Fracción del permeado de la columna 1 aprox. 10,2 I 12,2 mi Ácido láctico, potencia 90% 1,2 ml/l PH 4,6 Conductividad aprox. 6,7 mS/cm Temperatura aprox. 5 Tampón de desplazamiento para la columna 2: Agua purificada 1 1 Ácido láctico, potencia 90% 8,3 mi 0,1 mol/l Cloruro de sodio 2,5 g 2,5 g/l aprox. Disolución de hldróxido de sodio, 27 mi potencia 10% (p/p) 4,6 PH Conductividad aprox. 8 mS/cm Temperatura temperatura ambiente Tampón de elución A para la columna 2: El tampón de elución A es idéntico al tampón de desplazamiento para la columna 2.

Tampón de elución B para la columna 2: Agua purificada 1 I Ácido láctico, potencia 90% 8,3 m/l 0,1 mol/! Cloruro de sodio 15,0 g 15,0 g/l aprox. Disolución de hidróxido de sodio, 27 mi potencia 10% (p/p) 4,6 pH Conductividad aprox. 25 mS/cm Temperatura temperatura ambiente Disolución regeneradora para las columnas 1 y 2: Agua purificada 0,91 I Cloruro de sodio 40 g 40g/l Disolución de hidróxido de sodio, 1 0,09 1 potencia 33% (p/p) mol/1 Tampón de equilibrio para la columna 2: Agua purificada 1 I Ácido láctico, potencia 90% 8,3 g 0,1 mol/l Cloruro de sodio 2,9 g/l aprox. Disolución de hidróxido de sodio, 26 mi potencia 10% (p/p) 4,6 pH Conductividad aprox. 8,7 mS/cm Temperatura temperatura ambiente La fracción principal que contiene la sustancia valiosa, la preproinsulina, se recogió en la salida de la columna: aproximadamente 0,9 I de la fracción principal (durante la elución, desde un valor de UV 65% (ascencente) hasta un valor de UV 76% (descendente)) Todos los demás permeados se descargaron en el canal de residuos biológicos. En la disolución purificada (fracción principal de la columna 2), se midieron 17 g/l de preproinsulina con un grado de pureza de 93%> en área (análisis de HPLC-RP). El rendimiento es de 92%, basado en la cantidad de preproinsulina en la disolución de partida. Se determinaron la proporciones de mayor peso molecular de <0,1 % en área mediante análisis de HPLC-GPC. Ejemplo 3 Después de terminar las etapas del proceso a, b, c y d, mencionadas anteriormente, se obtuvo una disolución de preproinsulina que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, a partir de células E. coli modificadas genéticamente de forma apropiada: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-GIu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-GIn-Val-GIu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu-Glu-Asn- Tyr-Cys-Asn (SEQ ID N0:4) Dicha preproinsulina se corresponde con la fórmula 1 , en la que X es una cadena peptídica que tiene 29 restos aminoácidos con la secuencia: Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg (SEQ ID NO:1) R1 es una cadena peptídica que tiene 10 restos aminoácidos con la secuencia: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO:5), R2 es el resto aminoácido Asn (A21 de la cadena A de la insulina humana), A1-A20 es una cadena peptídica que tiene la secuencia (sólo de A1 a A20) de la cadena A de la insulina humana, B1-B30 [lacuna] es una cadena peptídica con una secuencia similar a la cadena B de la insulina humana, es decir, con Lys que sustituye a Val en la posición B3, y Glu que sustituye a Lys en la posición B29. La disolución de preproinsulina se purificó utilizando el mismo aparato que se empleó en el ejemplo 1. Esta vez, se usó la resina de intercambio aniónico Source 30 Q (fabricante: Pharmacia Biotech; n° de producto: 17-1275-04) para la cromatografía en la columna 1. La regeneración de este gel requiere el doble de cantidad de disolución regeneradora, comparado con los ejemplos 1 y 2. El resto de los parámetros de la primera cromatografía, como la composición y el volumen de las disoluciones, son los mismos que los descritos en los ejemplos 1 y 2. De forma similar, el ajuste de pH en el recipiente intermedio se realizó como se describe en el ejemplo 1. La segunda cromatografía se realizó esta vez con una presión de trabajo de 15 bar. Todos los demás parámetros de la segunda cromatografía son idénticos a los descritos en el ejemplo 2. En la disolución purificada (fracción principal de la columna 2), se midieron 17 g/l de preproinsulina con un grado de pureza de 92,5% en área (análisis de HPLC-RP). El rendimiento es de 91%, basado en la cantidad de preproinsulina en la disolución de partida. Se determinaron la proporciones de mayor peso molecular de <0,1% en área mediante análisis de HPLC-GPC. ENSAYO DE DESNATURALIZACIÓN El ensayo de desnaturalización (tabla 1) muestra que las formas poliméricas de mayor peso molecular de preproinsulinas, según se producen durante la reacción de plegamiento, pueden inducir la desnaturalizacióln de la insulina nativa. En el ensayo de desnaturalización, la insulina nativa glargina, un producto de Aventis Deutschland GmbH, que se obtiene después de la ruptura enzimática de la preproinsulina descrito en el ejemplo 2, se cristalizó. De forma sorprendente, los inventores fueron capaces de demostrar en todos los experimentos que, bajo las condiciones de cristalización de la insulina glagina (pH 6,1 y 26°C), se produce la desnaturalización de la insulina nativa cuando las sustancias que pueden inducir la desnaturalización de la insulina se añaden a la mezcla de cristalización. Se preparó una disolución patrón con la siguiente composición para las mezclas de cristalización: Insulina glargina 5 g/l Ácido cítrico 5,2 mmol l Cloruro de cinc 3 mmol/l Cloruro de sodio 0,5 g/l n-propanol 7 % (v/v) Agua purificada hasta 500 mi utilizando ácido clorhídrico 1 N, pH 3 La disolución se filtró a través de un filtro de membrana con una anchura de poro de 0,1 µ?t?. En el ensayo de desnaturalización, esta disolución patrón ácida se mezcló con disoluciones de las diversas sustancias de ensayo: la fracción de lavado de la columna 1 , que contiene las formas poliméricas retiradas de preproinsulinas a una concentración de 5 g/l, o la fracción principal de la columna 2 que contiene la preproinsulina purificada a una concentración de 15 y, respectivamente, 17 g/l. Para obtener más evidencias de que los fenómenos observados estaban provocados por la desnaturalización de la insulina, se añadieron 10 mi de una disolución madre de 0,1 % de potencia de poloxámero 171. Se sabe que el poloxámero 171 es capaz de suprimir la desnaturalización de la insulina en interfases hidrófobas (H, Thurow y K.

Geisen, Diabetologia (1984), 27, 212-218, y el documento EP 0 018 609). Las disoluciones entonces se calentaron hasta 26°C y se ajustaron a pH 6,1 con una disolución de hidróxido de sodio de 10% de potencia con agitación, dando como resultado la precipitación de la insulina amorfa. La suspensión amorfa se agitó a 26°C durante 50 horas. Después de este tiempo, todas las mezclas contenían cristales de insulina. Las mezclas se analizaron mediante la evaluación de las muestras bajo el microscopio, observando el aspecto de las partículas amorfas (velos) en el fondo o entre los cristales de insulina. Además, cada mezcla se dividió en dos partes de aproximadamente el mismo tamaño. La primera parte se introdujo en un cilindro medidor de 250 mi para investigar el comportamiento de sedimentación, y después de dejar las muestras a temperatura ambiente durante 60 min, se evaluó el volumen del sedimento y la transparencia del sobrenadante. La segunda parte se ajustó a pH 3 con ácido clorhídrico 1 N, y después de que se disolvieran los cristales de insulina, se evaluó la transparencia de la disolución resultante. La tabla 1 muestra el resultado del ensayo de desnaturalización. En las muestras control 174 A y 188 A sin la adición de la fracción del polímero, no se observó desnaturalización. Bajo el microscopio, los cristales resultaban visibles contra un fondo claro. Después de 60 minutos, los cristales habían sedimentado, dando como resultado un sedimento compacto y un sobrenadante transparente. Después de disolver los cristales a pH 3, se produjo una disolución transparente. Por contraste, las muestras 174 B, 188 B y 174 C, en las que habían añadido 1 mi y, respectivamente, 5 mi de la fracción del polímero a la mezcla de cristalización, mostraban una desnaturalización diferenciada de la insulina glargina. Bajo el microscopio, un velo amorfo resultaba visible entre los cristales. En el ensayo de sedimentación, se produjeron unos sedimentos voluminosos con un volumen de sedimento desde 50 a 90 mi (a partir de 250 mi de suspensión de cristales). Después de redisolver los cristales a pH 3, se produjeron suspensiones amorfas más o menos opacas. En presencia de 20 ppm de poloxámero 171 , no se observó desnaturalización con la adición de 1 mi de disolución de polímero (188 C). En las mezclas de ensayo 174 D, 174 E y 174 F, que se habían mezclado con preproinsulinas purificadas (fracción principal de la columna 2 de los ejemplos 1 , 2 y 3), de forma similar no se observó desnaturalización de la insulina glargina. Unos resultados similares, que no aparecen en la presente, se obtuvieron en un ensayo de desnaturalización análogo, en el que cristalizó insulina humana.

Tabla 1 Influencia de las impurezas de mayor peso molecular en la desnaturalización de la insulina glargina n° de Adiciones a la Aspecto del fondo de la imagen Aspecto después de Comportamiento de 5 mezcla mezcla de microscópica (entre cristales disolver los cristales a sedimentación de la de cristalización cristalización rombohédricos) pH 3 suspensión de cristales 174 A Ninguna transparente transparente +++ 1 mi de fracción de 174 B partículas amorfas ligeramente opaco + .. lavado, columna 1 * 10 5 mi de fracción de 174 C más partículas amorfas opaco . .. lavado, columna 1 * 1 mi de la fracción 174 D transparente transparente +++ principal, ejemplo 1 ** 15 1 mi de la fracción 174 E transparente transparente +++ principal, ejemplo 2 *** 1 mi de la fracción 174 F principal, ejemplo 3 transparente transparente +++ **** 188 A Ninguna transparente transparente +++ 1 mi de fracción de 188 B partículas amorfas opaco ... lavado, columna 1 * 1 mi de fracción de residuos, columna 1 * 188 C partículas amorfas ocasionales transparente + + + y 20 ppm de poloxámero 171 Mezclas de cristalización, en cada caso, de 500 mi con 2.500 mg de insulina glargina (= 5 g/l) +++ = Después de aproximadamente 60 min, 3 a 5 mi de sedimento a partir de 250 mi de suspensión.

— = Después de aproximadamente 60 min, hasta 90 mi de sedimento a partir de 250 mi de suspensión.

* La fracción de lavado de la columna 1 del ejemplo 2 contiene 5 g/l de proteína. ** La fracción principal de la columna 2 del ejemplo 1 contiene 15 g/l de preproinsulina. *** La fracción principal de la columna 2 del ejemplo 2 contiene 17 g/l de preproinsulina. **** La fracción principal de la columna 2 del ejemplo 3 contiene 7 g/.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> <130> <160> 4 <170> Patentln versión 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: péptido C <400> 1 Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu GLy Qly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Leu Oír Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lya Arg 20 25 <210> 2 <211> 96 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial preproinsulina I Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln Hie Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Ley v¾l Cys Gly Glu Arg 20 25 JO Gly ?he Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Aap Pro Gln 35 40 45 val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln 50 55 60 Pro Leu Al* Leu Glú Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly lie Val Glu Gln SS 70 75 80 Cys Cys h Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Giu Asn Tyr Cys Asn 85 90 SS <210> 3 <211> 96 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial preproinsulina II Ala Thr Thr Se Thr Cly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asa Gla His Leu 1 5 10 1? Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gla 35 A0 45 al Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly. Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln 50 5S eo pro Leu Ala Leu Glu Gly ser Leu Gln Lya Arg Gly lie Val Glu Gln 65 70 75 80 Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gl Aan Tyr Cys Gly 8S 90 95 <210> 4 <211> 90 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> . Descripción de la secuencia artifici preproinsulina III <400> 4 Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser Hís Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 2S 30 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu 35 40 45 Gly Gly Gly Pro Gl ,Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly 50 55 5 Ser Leu Gln Lys Arg Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys e5 70 75 · 80 Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn as so

Claims

REIVINDICACIONES

1 .- Un método para la purificación cromatográfica de preproinsulina de fórmula 1 ,

- Phe Cys " • Cys~ Thr (B1) (B7) (B19)

R -B1-B30-X-A1-A20-R2 (1) en la que a) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o b) es un péptido que tiene de 2 a 35 restos aminoácidos, que comienza y finaliza, en cada caso, con un resto aminoácido básico, en particular Arg, y que, si consiste en más de 3 restos aminoácidos, comienza y finaliza, en cada caso, con dos restos aminoácidos básicos, en particular Arg y/o Lys, R1 a) es hidrógeno, b) es un resto aminoácido genéticamente codificable, o c) es un péptido que tiene de 2 a 15 restos aminoácidos, R2 es un resto aminoácido genéticamente codificable, y y los restos A1 - A20 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de ia cadena A de la insulina humana o de un análogo de insulina, y los restos B1 - B30 se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana o de un análogo de insulina; en el que en dicho método se eliminan las sustancias de mayor peso molecular de una disolución acuosa de dicha preproinsulina mediante una primera cromatografía sobre un intercambiador aniónico en el modo de corriente, y una segunda cromatografía posterior sobre un intercambiador catiónico en el modo de adsorción. 2. - Un método para la purificación cromatográfica de la preproinsulina genéticamente modificada de fórmula 1 , en el que dicha preproinsulina tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Giu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO:2). 3. - Un método para la purificación cromatográfica de la preproinsulina genéticamente modificada de fórmula 1 , en el que dicha preproinsulina tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly (SEQ ID NO:3). 4. - Un método para la purificación cromatográfica de la preproinsulina genéticamente modificada de fórmula 1 , en el que dicha preproinsulina tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ala-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Giu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Arg-Asp-Val-Pro-Gln-Val-Glu-Leu-Giy-Gly-Giy-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO:4).

5. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para separar sustancias extrañas de las disoluciones de preproinsuíinas que inducen la desnaturalización de la insulina.

6. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la segunda cromatografía se realiza a un pH desde 3,0 a 5,5.

7. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la segunda cromatografía se realiza a una presión desde 1 a 30 bar.

8.- Un método para preparar insulina mediante la expresión de preproinsuiina no plegada, que comprende las etapas de: a) fermentar microorganismos genéticamente modificados que expresan preproinsuiina no plegada, b) recoger dichos microorganismos y realizar la ruptura de las células, c) aislar los cuerpos de inclusión que contienen preproinsuiina no plegada y no disuelta, d) disolver la preproinsuiina con el plegamiento correcto de la cadena peptídica y el cierre simultáneo de los puentes disulfuro para producir preproinsuiina, y posteriormente realizar un método como se reivindica en las reivindicaciones 1 - 7 e) realizar la ruptura enzimática de la preproinsuiina para producir insulina humana, f) purificar la insulina humana, g) cristalizar la insulina humana y secar.