MXPA00006509A - Un proceso para preparar proinsulina humana - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para preparar proinsulina humana que se representa como la fórmula química (I) en donde R es un residuo de aminoácido o un péptido que es enzimáticamente o químicamente degradable;y X es un enlace de un grupo amino de A-1 en la cadena de insulina A y un grupo carboxilo de B-30 en la cadena de insulina B que se puede separar enzimáticamente o químicamente de la cadena A o de la cadena B, a condición de que una región de A-1 hasta A-21 sea la cadena de insulina A y una región de B-1 a B-30 sea la cadena de insulina B. De acuerdo con la presente invención, el precursor de insulina recombinante humana fácilmente se puede fabricar con buena reproducibilidad, ya que la disolución, sulfonación, concentración, desalación, y purificación se simplifican notablemente, al mismo tiempo que se aumenta el rendimiento de la reacción de redoblamiento.

Description

UN PROCESO PARA PREPARAR PROINSULINA HUMANA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un proceso para preparar proinsulina humana, más específicamente, con un proceso para preparar proinsulina humana que se presenta como la siguiente fórmula química (I) : (B-l) (B-7) (B-19) (B-30) en donde, R es un residuo de aminoácido o un péptido que es químicamente o enzimáticamente degradable y, X es un enlace de un grupo amino de A-l en cadena' de insulina A y un grupo carboxilo de B-30 en cadena de insulina B que se puede separar de la cadena A o de la cadena B enzimáticamente o químicamente, a condición de que una región de A-l hasta A-21 sea la cadena de insulina A y una región de B-l a B-30 sea la cadena de insulina B. En la fórmula química (I) , existen 3 enlaces disulfuro (entre A-6 y A-ll, entre A-7 y B-7, y entre A-20 y B-19) formados de 6 residuos de cisteína que están presentes en la cadena A y en la cadena B . Descripción de la técnica anterior En general, el precursor de la insulina humana ("proinsulina") se ha preparado en el curso de la fabricación de insulina madura ("insulina") mediante la tecnología de ADN recombinante la cual comprende un paso de insertar un gen estructural en un ADN de plásmido de E. Coli . Como se muestra en la Figura 1, una proteína de fusión que contiene la proinsulina se expresa en forma de un cuerpo de inclusión en E. Coli , y los cuerpos de inclusión obtenidos por centrifugación después de la lisis de las células se lavan con detergente no iónico o iónico, o con desnaturalizante a una concentración baja. Este tratamiento acompañado por centrifugación se repite para dar como resultado un aumento de pureza en la proteína deseada (véase: Mukhopadhyay, A. y colaboradores, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 56, 61-108, 1997) . Con el fin de minimizar la interacción hidrofóbica intermolecular y la formación de enlaces disulfuro incorrectos, los cuerpos de inclusión lavados se disuelven en un desnaturalizante tal como urea o solución de guanidina -HCl que contiene una sustancia de reducción tal como ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol, o en NaOH (véase: Fischer y colaboradores, Biotechnology _ Bioengineering, 41, 3-13, 1993). Los cuerpos de inclusión disueltos se centrifugan a alta velocidad, y el sobrenadante se diluye con agua fría para recuperar los cuerpos de inclusión como un precipitado (véase: EP 0 055 945 A2) . Los cuerpos de inclusión así obtenidos contienen una proteína de fusión de proinsulina y una heteroproteína tal como ß-galactosidasa, la cual está enlazada por un enlace cruzado de residuo de metionina. La proteína de fusión se trata con bromuro cianógeno (CNBr) , y la sustitución de seis (6) grupos -SH presentes en la proinsulina con grupos -SS03" sigue para producir el sulfonato de proinsulina S. Este paso de sulfonación conduce a aumentar la estabilidad del precursor de insulina y la eficiencia para una reacción de redoblamiento posterior (véase: EP 0 055 945 A2) . El sulfonato de proinsulina S se vuelve a doblar para producir una conformación original usando sustancias de reducción tales como 2-mercaptoetanol , DDT, etcétera, o un sistema de reducción-oxidación tal como glutationa (véase: Fischer y colaboradores, Biotechnology _ Bioengineering, 41, 3-13, 1993) . La proinsulina original así obtenida se convierte en insulina biológicamente activa removiendo X (o la cadena C) que enlaza la cadena A y la cadena B a través del tratamiento de tripsina y carboxipeptidasa B (véase: Kemmler . , y colaboradores, J.B.C., 246, 6786-6790, 1971). Finalmente, la insulina se purifica a través de una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, etcétera. (Véase: Kroeff, E.P., y colaboradores, J. Chromatogr., 461, 45-61, 1989) y se cristaliza mediante la técnica de cristalización Zn (véase: Mirsky, y colaboradores, J. Clinical Investigation, 42, 1869-1872, 1963; Brader M.L., TIBS, 16, 341-345, 1991). El proceso convencional para preparar proinsulina o insulina, sin embargo, se demuestra que es menos satisfactorio en los sentidos de que: acompaña pasos complicados de disolución y sulfonación, purificación, concentración y desalación; y, emplea una reacción de redoblamiento ineficiente, el cual da como resultado un rendimiento disminuido de la proteína deseada. De conformidad con lo anterior, hay fuertes razones para explorar y desarrollar un proceso mejorado para preparar proinsulina o insulina de una manera simple y eficiente, al mismo tiempo que se preserva su actividad biológica. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han hecho un esfuerzo para resolver los problemas de los procesos convencionales para preparar proinsulina recombinante humana expresada en forma de un cuerpo de inclusión, y con éxito establecen un proceso para preparar proinsulina humana cuyos pasos de disolución y sulfonación, purificación, concentración y desalación son notablemente simplificados, al mismo tiempo que aumentan la eficiencia de la reacción de redoblamiento. El objeto principal de la presente invención, por lo tanto, es proporcionar un proceso simple para preparar proinsulina recombinante humana con una buena reproducibilidad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El anterior y otros objetos y características de la presente invención serán aparentes de las siguientes descripciones dadas junto con los dibujos acompañantes, en los cuales : La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un proceso convencional para preparar insulina humana a partir de un precursor de insulina humana fusionado el cual se expresa en E. Coli recombinante. La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un proceso para preparar insulina humana a partir de un precursor de insulina humana fusionado el cual se expresa en E. Coli recombinante, de acuerdo con la presente invención. La Figura 3 representa un sistema de redoblamiento empleado en el proceso para preparar proinsulina humana de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con el proceso para preparar proinsulina humana de la presente invención, el precursor de insulina humana expresado en forma del cuerpo de inclusión, se trata con tetrationato de sodio (Na2S404) y sulfito de sodio (Na2S03) durante un paso de disolución de un cuerpo de inclusión en urea o solución de guanidina -HCl, lo cual da como resultado la sustitución de grupos -SH en residuos de cisteína del precursor de insulina con grupos -SS03", para producir sulfonato de proinsulina S representado como la siguiente fórmula química (II) , el cual se convierte en la proinsulina representada como la fórmula química (I) haciendo reaccionar el sulfonato de proinsulina S con 2-mercaptoetanol en un medio acuoso.

(B-l) (B-7) (B-19) (B-30) HN-G (A-l) En donde, R y X son iguales a como se describieron anteriormente . El proceso para preparar proinsulina humana de la invención se describe en mayor detalle acompañado por las Figuras 2 y 3. En el proceso para preparar proinsulina humana, todos los pasos preferiblemente se llevan a cabo a baja temperatura de aproximadamente 4°C, aunque se pueden realizar a temperatura ambiente para la conveniencia del practicante. Paso 1 : Purificación de los cuerpos de inclusión Con el fin de preparar una insulina humana recombinante, los presentes inventores usaron una proteína de fusión de una ß-galactosidasa y proinsulina que se expresa en E. Coli (véase: la publicación de patente coreana número 94-1855) . Las células de E. Coli que expresan la proteína de fusión en forma de un cuerpo de inclusión se suspenden en una solución reguladora para lisis en una proporción de 1:5 a 10 (peso/volumen) , y se lisa bajo una presión de aproximadamente 630 kg/cm2. Los cuerpos de inclusión se centrifugan y se lavan usando Tritón X-100 y agua destilada, y se centrifugan para obtener cuerpos de inclusión purificados. Paso 2 : Disolución y sulfonación Los cuerpos de inclusión purificados se disuelven en 0.02 a 0.1M de solución reguladora Tris (pH 8 a 10) que contiene un desnaturalizante de 6 a 8M de urea o guanidina -HCl en una proporción de 1:10 a 20 (peso/volumen) , más preferiblemente de 1:5 a 10 (peso/volumen) , al mismo tiempo que se añade de 0.1 a 0.6M, más preferiblemente de 0.2 a 0.5M de sulfito de sodio (Na2S03) y de 0.01 a 0.1M, más preferiblemente 0.05 a 0.1M de tetrationato de sodio (Na2S404) . Entonces, la solución mezclada que contiene los cuerpos de inclusión se agita para inducir la sulfonación del precursor de insulina, lo cual da como resultado la sustitución de grupos -SH del precursor de insulina con grupos -SS03". En este paso, el pH y la temperatura se mantienen en los rangos de pH 7.0-9.5 y 4-8°C, respectivamente. Finalmente, la proteína de fusión de proinsulina sulfonada se obtiene sustituyendo grupos -SH en residuos de cisteína de la proinsulina con grupos -SS03". Paso 3 : Tratamiento con bromuro cianógeno Después de la reacción de sulfonación, la mezcla de la reacción se centrifuga a 12,000 rpm durante 30 minutos para remover precipitados . Se añade agua fría al sobrenadante en una proporción de 5 a 20:1 (volumen/volumen) , y el pH se ajusta a 5 a 6 para dar un precipitado. La proteína precipitada se disuelve en 70 por ciento (volumen/volumen) de ácido fórmico para alcanzar una concentración de 10-30 miligramos/mililitros, y subsecuentemente se trata con bromuro cianógeno de manera que la proporción molar del bromuro cianógeno a la proteína es 100:1. Esto da como resultado la separación del sulfonato de proinsulina S de la proteína de fusión. Y luego, el secado se lleva a cabo bajo una presión reducida.

Paso 4 : Cromatografía de intercambio de iones El sulfonato de Proinsulina S se disuelve en 20 mM de regulador Tris (pH 8.0) que contiene 1 mM EDTA y 7 M de urea para alcanzar una concentración de 30 miligramos/mililitro y cargar en una resina de DEAE-Sephacel equilibrada con el mismo regulador. Luego, se hace elución empleando un gradiente de concentración de 0-1 M de NaCl, para dar el sulfonato de proinsulina S en el rango de concentración de 0.3-0.5 M NaCl. Paso 5 : Redoblamiento (conversión de sulfonato de proinsulina S en proinsulina) El sulfonato de proinsulina S purificado se diluye con 50 mM de regulador de glicina (pH 10.6) que contiene 1 M de urea a una concentración de 1-10 miligramo/mililitro, sin desalación ni pretratamiento. Luego, gas nitrógeno se purga para remover oxígeno y la cámara se sella bien. En otra cámara, se añade 2-mercaptoetanol a 50 mM de regulador de glicina (pH 10.6) que contiene 1 M de urea en una proporción equivalente de 1 a 3 contra grupos -SS03" de sulfonato de proinsulina S. Y luego, la solución de proteína y la solución de regulador que contiene 2-mercaptoetanol se mezclan rápidamente en una proporción de 1:1 (volumen/volumen) conectando las dos cámaras a una celda de mezclado que tiene un volumen de 0.1 mililitro hasta 10 litros, y la mezcla de la reacción de redoblamiento se introduce en un recipiente al mismo tiempo que se agita lentamente y se hace reaccionar durante 15 a 20 horas a 4-5 °C (véase: Figura 3) . Llevando a cabo el paso de redoblamiento, cuando menos 80 por ciento del sulfonato de proinsulina S se puede convertir en la proinsulina nativa. Paso 6 : Cromatografía por adsorción Para purificar y concentrar la proinsulina redoblada, la mezcla de la reacción de repliegue que contiene la proinsulina redoblada se pone en contacto con una resina de metacrilato polar de HP-2MG, al mismo tiempo que se ajusta la mezcla de la reacción en un rango de pH de 3 a 4, de manera que 8 gramos de las proteínas mezcladas que contienen la proinsulina redoblada se pueden poner en contacto con 1 litro de resina. En relación con esto, la concentración de proteína de la mezcla de carga se controla en un rango de 0.1 a 5 miligramos/mililitro, dependiendo de la condición de la reacción de redoble de la proinsulina. Después de la adsorción, la resina se lava con regulador de ácido acético (pH 3 a 4) , y la proinsulina redoblada se eluye usando un regulador de ácido acético acuoso (pH 3 a 4) que contiene de 15 a 50 por ciento (volumen/volumen) , preferiblemente de 30 a 50 por ciento (volumen/volumen) de acetona. Luego, la proinsulina humana redoblada se recupera en forma de polvo a partir del eluyente para uso posterior mediante la evaporación y la congelación-secado de fracciones activas acumuladas, o se recupera en una forma de precipitado mediante la adición de cloruro de zinc a ?? I las' .fracciones activas acumuladas en una concentración final de I 0.004 a 4 por ciento (peso/volumen), preferiblemente 0.004 a 0.04 por ciento (peso/volumen) después de ajustar el pH del i eluyente a 5 a 7, preferiblemente 5 a 6 con NapH, y centrifugación. El proceso para preparar un precursor de insulina humana de la invención tiene las siguientes ventajas sobre los procesos convencionales: primero, la disolución y sulfonación I se llevan a cabo simultáneamente, lo cual da como resultado la simplificación de pasos para la producción en masa; en segundo lugar, la desnaturalización tal como la gelación que se presenta por polimerización intermolecular en una muestra de I alta concentración se puede evitar con éxito; en tercer lugar, el problema de la disminución en solubilidad de una muestra causada por enlaces disulfuro intermoleculares incorrectos durante la disolución se puede resolver fundamentalmente. Aunque este problema se puede superar usando sustancias reductoras tales como 2-mercaptoetanol o DTT, la sulfonación mediante sulfito y tetrationato es más estable y da mejor solubilidad que el tratamiento con sustancias reductoras; en cuarto lugar, grupos -SH de residuos de cisteína se sustituyen con grupos -SS03" antes del tratamiento con bromuro cianógeno, lo cual evita la desnaturalización irreversible de los residuos de cisteina la cual se puede presentar en el paso de disolución y en los pasos siguientes, por ejemplo, la desnaturalización de la cisteína a ácido cisteico (véase: Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,451,396); en quinto lugar, el tratamiento de bromuro cianógeno y la evaporación se siguen por cromatografía por intercambio de iones o cromatografía por adsorción sin ningún pretratamiento tal como desalación, y por lo tanto es ventajoso en un proceso a escala industrial continuo. La presente invención se caracteriza además por la reacción de redoblamiento eficiente que es uno de los pasos más cruciales para la fabricación a escala industrial de insulina. Particularmente, el aumento en el rendimiento y la buena reproducibilidad durante el escalamiento se obtiene mediante la reacción continua que emplea una celda de mezclado. También, la proinsulina nativa se puede purificar, concentrar y desalar simultáneamente a partir de una mezcla de la reacción usando una resina de adsorción para uso industrial después de la reacción de redoblamiento. En los procesos convencionales para preparar el precursor de insulina humana los cuales esencialmente incluyen la reacción de redoblamiento, los residuos de cisteína del polipéptido representado como la fórmula química (I) descrito anteriormente se sulfonan para producir un sulfonato de proinsulina S, el cual se hace reaccionar con de 1 a 5 equivalentes de 2-mercaptoetanol por grupo -SS03~ bajo una condición neutra o alcalina de pH 7 a 11.5 (véase: la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,430,266) . Esta reacción tipo lote da como resultado un rendimiento de redoblamiento de aproximadamente 60 por ciento, aunque se puede aumentar a un nivel de 80 por ciento a través del sistema de reciclado, empleando los pasos complicados de ajustar la condición del pH a 4 a 6 después de la reacción de redoblamiento para obtener sustancias intermediarias que muestran redoblamiento incorrecto en una forma de agregado, sulfonando de nuevo y redoblando (ver: Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,801,684). Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, hasta el 80 por ciento del sulfonato de proinsulina S se puede convertir en proinsulina nativa a través de solamente un paso de reacción de redoblamiento, el cual da como resultado una simplificación notable del paso y aumenta el rendimiento. Muchos estudios de la reacción de redoblamiento han revelado que: una causa principal de la disminución del rendimiento de redoblamiento de proteínas es la formación de agregados mediante enlaces no covalentes entre residuos hidrofóbicos expuestos a sustancias intermediarias durante la reacción de redoblamiento; y, la formación de agregados está muy influenciada por diversos factores tales como la concentración de proteína, el volumen de la reacción, la temperatura, pH, etcétera, mientras que la concentración de proteína afecta en gran medida la productividad. De este modo, si la reacción de redoblamiento de la proteína se lleva a cabo a baja concentración para obtener un alto rendimiento, no se puede realizar la fabricación a escala industrial. Por lo tanto, se han propuesto en la técnica una variedad de métodos alternativos para redoblar una proteína recombinante. Por ejemplo, un método para añadir el inhibidor de agregación tal como la arginina, detergente tal como polietilenglicol o desnaturalizante, y un método para aumentar escalonadamente la concentración de proteína durante la reacción de repliegue se han sugerido sucesivamente. Los mencionados métodos, sin embargo, han revelado una desventaja de que la mezcla homogénea de reactivo tal como el sulfonato de proinsulina S y 2-mercaptoetanol no se realiza rápidamente, lo cual conduce a la agregación a disminuir el rendimiento de redoblamiento, ya que un volumen de reacción grande se requiere para la reacción de redoblamiento de insulina a escala industrial. Bajo las circunstancias, con el fin de reducir el tiempo requerido para el equilibrio durante la mezcla de sulfonato de proinsulina S y de 2-mercaptoetanol, los presentes inventores han llevado a cabo una reacción de redoblamiento mezclándolos continuamente en una celda de mezcla de un volumen pequeño, la cual finalmente proporciona proinsulina en un alto rendimiento, aún cuando se emplea un sulfonato de proinsulina S muy concentrado. Con el fin de purificar la proinsulina redoblada después de la reacción de redoblamiento, generalmente se emplea cromatografía de filtración en gel tal como Sefadex G-50 en cromatografía de intercambio de iones, las cuales esencialmente requieren un paso de cambiar de solución reguladora y un paso de desalar para remover las sales restantes (ver: la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,430,266) . Los métodos de desalación convencionales incluyen filtración en gel, diálisis, ultrafiltración, etcétera. Entre ellos, la filtración en gel emplea gel de polidextrano tal como Sefadex G-25 para separar sustancias que dependen del peso molecular o de la estructura de la sustancia, basándose en la diferencia en tiempo de retención para las sustancias para pasar a través del gel. Por otro lado, una membrana de diálisis, en vez de gel, se usa para la técnica de diálisis, y un cartucho tal como fibra hueca y cásete, y una membrana de disco se usan para ultrafiltración. Sin embargo, los métodos mencionados han revelado las siguientes varias desventajas: esto es, al llevar a cabo la filtración en gel, la capacidad de la muestra depende del volumen de gel empacado en una columna en vez de la cantidad o concentración de la muestra (capacidad: de 10 a 25 por ciento del volumen del gel) . De este modo, si se emplea una muestra diluida en la filtración en gel, el tamaño de la columna se vuelve más grande. También, la muestra eluida se diluye, lo cual da problemas en los pasos posteriores. Por otro lado, la técnica de diálisis tiene desventajas de pérdida de muestra causadas por el enlace no específico de la muestra con la membrana de diálisis y la capacidad limitada también. La ultrafiltración también tiene las desventajas del requisito de un equipo específico, la pérdida de muestra causada por enlace no específico, atascamiento y tapamiento, y disminución en la velocidad de flujo, aunque tiene ventajas de alta capacidad y capacidad de concentración eficiente . De acuerdo con la presente invención, un paso de desalación, a diferencia de los procesos convencionales, se realiza empleando cromatografía por adsorción, el cual con éxito resuelve dichos problemas, es decir, la capacidad limitada, la dilución de la muestra, el enlace no selectivo, etcétera. Prácticamente, la solución de reacción de redoblamiento que contiene proinsulina activa se ajusta a una condición acida de pH 3 a 4, y se carga sobre una resina de metacrilato polar para recuperar casi toda la proinsulina redoblada usando una solución reguladora (pH de 3 a 4) que contiene de 15 a 50 por ciento (volumen/volumen) de acetona. Con relación a esto, la resina de metacrilato polar bajo la marca comercial de HP-2MG la cual está comercialmente disponible de Mitsubishi Chemical Co., preferiblemente se emplea para la adsorción de sustancias orgánicas que muestran polaridad relativamente alta. El paso de adsorción/elución se lleva a cabo en una columna para la mejor eficiencia de desalación, concentración y purificación. Sin embargo, se puede realizar de una manera de lote o columna. En este paso, más del 90 por ciento del rendimiento, y la concentración eficiente de varias a docenas de veces se puede llevar a cabo, dependiendo de la concentración de la muestra de carga. En resumen, la proinsulina redoblada se puede económicamente desalar, concentrar, y purificar en un paso, y el mismo eluyente se puede usar directamente en pasos posteriores . La presente invención se ilustra además en los siguientes ejemplos, que no deberán tomarse como limitantes del alcance de la invención. Ejemplo 1: Purificación de cuerpos de inclusión Células de E. Coli expresan proteina de fusión de proinsulina en una forma de cuerpo de inclusión (ver: la publicación de Patente Coreana número 94-1855) se suspendieron en reguladora Tris 0.1 M (pH 7.9) que contenía 50 mM EDTA, 10 por ciento de sacarosa y 0.1 mM PMSF en una proporción de 1:5 a 10 (peso/volumen) y se lisaron bajo una presión de 630 kg/cm2. El lisado se centrifugó a 5,000 rpm durante 30 minutos a 4°C para obtener precipitado. 300 gramos (peso húmedo) del precipitado que contiene cuerpos de inclusión se lavó con 10 volúmenes de Triton-XlOO al 2 por ciento y agua destilada, y se centrifugó para obtener cuerpos de inclusión purificados. Ejemplo 2: Disolución de cuerpos de inclusión mediante álcali Los cuerpos de inclusión obtenidos en el Ejemplo 1 se suspendieron de manera uniforme en 20 volúmenes de agua destilada, se agitaron durante 3 horas, y se centrifugaron a 12,000 rpm durante 30 minutos para remover el precipitado. El pH del sobrenadante así obtenido se ajustó a 5.5 con 1 M HCl y se centrifugó a 5,000 rpm durante 30 minutos para obtener precipitado. La proteína precipitada se disolvió en 70 por ciento (volumen/volumen) de ácido fórmico para alcanzar una concentración de 10 miligramos/mililitro. Luego, se añadió bromuro cianógeno en una proporción molar de 100:1 con respecto a la cantidad de la proteína, y se agitó durante 12 horas a 25°C. Y después, evaporación bajo una presión reducida se llevó a cabo para el secado completo y la proteína así obtenida se disolvió en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7 M de urea. Se añadieron sulfito de sodio y tetrationato de sodio a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente, y se agitaron durante 6 horas. Y después, se llevó a cabo análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento para determinar la concentración de la proinsulina sulfonada (véase: Tabla 1) . Ejemplo 3: Disolución de cuerpos de inclusión mediante guanidina -HCl y sustancias reductoras Los cuerpos de inclusión obtenidos en el Ejemplo 1 se suspendieron en 10 volúmenes de varias soluciones reguladoras que contenían un desnaturalizante como los siguientes: primero, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 6-7 M de guanidina -HCl y 1 mM EDTA, en segundo lugar, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 6-7 M de guanidina. HCl y 1 mM EDTA, y se añadió 1 mM de 2-mercaptoetanol ; en tercer lugar, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 6-7 M de guanidina -HCl y 1 mM EDTA, y se añadieron sulfito de sodio y tetrationato de sodio a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente. Y después, cada solución se agitó durante 12 horas a 4°C, y se centrifugó a 12,000 rpm durante 30 minutos para remover el precipitado. Luego, se añadieron aproximadamente 10 volúmenes de agua fría al sobrenadante así obtenido y se centrifugó a 5,000 rpm durante 30 minutos para obtener precipitado. La proteína precipitada se disolvió en ácido fórmico al 70 por ciento (volumen/volumen) para alcanzar una concentración de 10 miligramos/mililitro. Luego, se añadió bromuro cianógeno en una proporción molar de 100:1 con respecto a la cantidad de la proteína, y se agitó durante 12 horas a 25°C. Y luego, se llevó a cabo evaporación bajo una presión reducida para el secado completo y la proteína así obtenida se disolvió en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7 M de urea. Se añadieron sulfito de sodio y tetrationato de sodio a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente, y se agitó durante 6 horas a 25 °C. Y luego, se llevó a cabo análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento para determinar la concentración de la proinsulina sulfonada (véase: Tabla 1) . E emplo 4: Disolución de cuerpos de inclusión mediante urea y sustancia reductora Los cuerpos de inclusión obtenidos en el Ejemplo 1 se suspendieron en 10 volúmenes de varias soluciones reguladoras que contenían un desnaturalizante como los siguientes: primero, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7-8 M de urea y 1 mM EDTA; en segundo lugar, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7-8 M urea y 1 mM EDTA, y se añadió 1 mM 2-mercaptoetanol; en tercer lugar, se disolvieron en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7-8 M de urea y 1 mM EDTA, y se añadieron sulfito de sodio y tetrationato de sodio a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente. Y luego, cada solución se agitó durante 12 horas a 4°C, y se centrifugó a 12,000 rpm durante 30 minutos para obtener precipitado. Después, cerca de 10 volúmenes de agua fría se adicionaron al sobrenadante así obtenido y se centrifugó a 5,000 rpm durante 30 minutos para obtener el precipitado. La proteína precipitada se disolvió en ácido fórmico al 70 por ciento (volumen/volumen) para alcanzar una concentración de 10 miligramos/mililitro. Luego, se añadió bromuro cianógeno en una proporción molar de 100:1 con respecto a la cantidad de proteína, y se agitó durante 12 horas a 25 °C.

Y luego, se llevó a cabo la evaporación bajo una presión reducida para el secado completo y la proteína así obtenida se disolvió en 20 mM de regulador Tris (pH 9.5) que contenía 7 M de urea. El sulfito de sodio y tetrationato de sodio se añadieron a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente, y se agitó durante 6 horas a 25 °C. Y luego, se llevó a cabo análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento para determinar la concentración de la proinsulina sulfonada (ver: Tabla 1) . Tabla 1 : Efecto de varios métodos de disolución en los Ejemplos 2 a 4 sobre sulfonación * *: Cada muestra empleó 30 gramos (en peso húmedo) de cuerpos de inclusión lavados con Tritón X-100 y agua destilada fría, y la misma cantidad de cuerpos de inclusión tratados con CNBr solamente, se empleó como control.

Como se puede ver en la Tabla 1, la adición de sulfito de sodio y tetrationato de sodio después de la disolución por urea o guanidina -HCl dio como resultado un rendimiento aumentado de proinsulina sulfonada el cual es 1.5 a 2 veces mayor que el control. Por otro lado, cuando la disolución se llevó a cabo solamente por guanidina -HCl sin ninguna sustancia reductora, se presentó gelificacion en el curso de añadir ácido fórmico al 70 por ciento (volumen/volumen) . Por lo tanto, la cantidad de proteína después de la disolución y el rendimiento de la sulfonación no se pudo determinar. Este resultado puede ser causado por interacción hidrofóbica intermolecular o polimerización por formación de enlace disulfuro. También, la adición de 2-mercaptoetanol dio como resultado una disminución considerable en rendimiento, lo cual también puede ser causado por las mismas razones descritas anteriormente. Se demostró claramente que : la interacción intermolecular se puede evitar a través de la sustitución de grupos -SS03" en la proteína de fusión de proinsulina sulfonada para dar carga negativa a la molécula entera; y, la disolución por álcali influye la estabilidad de las proteínas. Por otro lado, la adición de sulfito y tetrationato después de la disolución por urea o guanidina -HCl, no tiene diferencia notable en la producción de proinsulina sulfonada. Por lo tanto, el uso de urea para la disolución a escala industrial daría como resultado una reducción notable en costo. Además, el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de la muestra la cual se obtuvo a través de los pasos de disolución y sulfonación, tratamiento de bromuro cianógeno y disolución en regulador Tris 20 mM que contenía 7M de urea, ha revelado que: la adición de sulfito y tetrationato después del tratamiento de bromuro cianógeno no aumentó el rendimiento de la sulfonación. Ejemplo 5: Disolución de cuerpos de inclusión por urea y sulfonación Basado en los resultados en el Ejemplo 2 a 4 descritos anteriormente, los cuerpos de inclusión se disolvieron en una solución de urea y se llevó a cabo la sulfonación. Esto es, 110 gramos (en peso húmedo) de los cuerpos de inclusión purificados se disolvieron en 10 volúmenes de 20 mM regulador Tris (pH 9.5) que contenía 8 M de urea y lmM EDTA. Luego, se añadieron sulfito de sodio y tetrationato de sodio a una concentración final de 0.3 M y 0.1 M, respectivamente, se agitó durante 12 horas a 4°C, y se centrifugó a 12,000 rpm durante 30 minutos para remover el precipitado. Y luego, se añadieron aproximadamente 10 volúmenes de agua fría al sobrenadante así obtenido, y se ajustó el pH de la solución a aproximadamente 5.5 con solución de 2 M HCl, y se centrifugó a 5,000 rpm durante 30 minutos para dar un precipitado de 250 gramos en peso húmedo. El ensayo cuantitativo de proteína reveló que aproximadamente se obtuvieron finalmente 40 gramos de proteína. Ejemplo 6: Tratamiento con bromuro cianógeno La proteína precipitada se disolvió en 2 L de ácido fórmico al 70 por ciento (volumen/volumen) . Luego, se añadió bromuro cianógeno (CNBr) en una proporción molar de 100:1 con respecto a la cantidad de la proteína, y se agitó durante 12 horas a 25 °C. Y luego, se llevó a cabo la evaporación bajo una presión reducida para el secado completo. La proteína así obtenida se disolvió en 20 mM regulador Tris (pH 8.0) que contiene 7 M de urea, y se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Ejemplo 7: Cromatografía de intercambio de aniones DEAE-Sefacel se empacó en una columna (2.5 x 30 centímetros) a una velocidad de flujo de 1.5 de volumen de columna por hora, y se equilibro con 20 mM de regulador Tris (pH 8.0) que contenía 7 M de urea. Luego, la muestra obtenida en el Ejemplo 6 se cargó en la columna a una proporción de 20 miligramos por 1 mililitro de la resina, y la columna se lavó con un volumen de columna del regulador de equilibrio. La proteína se eluyó mediante un gradiente de concentración usando el regulador de equilibrio que contenía de 0 a 1M de NaCl . Luego, los eluyentes se recolectaron a 0.35-0.45 M de NaCl se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, lo cual reveló que la pureza fue de 80 por ciento o más y la tasa de recuperación fue del 91 por ciento. Ejemplo 8 : Redoblamiento de sulfonato de proinsulina S 1 gramo de sulfonato de proinsulina S, el cual se obtuvo sulfonando una proinsulina recombinante activa purificada mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, se disolvió en 500 mililitros de 50 mM de regulador de glicina (pH 10.6) . Luego, se purgó gas nitrógeno para remover oxígeno y la cámara se selló bien. En otra cámara, 104 µl de 2-mercaptoetanol se añadió a 500 mililitros de 50 mM de regulador de glicina (pH 10.6), el gas nitrógeno también se purgó para remover oxígeno y la cámara se selló • bien. Y luego, las dos soluciones rápidamente se introdujeron en la célula de mezclado que tenía un volumen de 1 ml a una velocidad de flujo de 50 ml/hora al mismo tiempo que se agitaba. La solución de la reacción de redoblamiento así mezclada se introdujo a una velocidad de flujo de 100 ml/hora en un recipiente purgado con gas nitrógeno, se agitó lentamente, y se hizo reaccionar durante 18 horas a 4°C. Después de que se completó la reacción, la solución se acidificó para dar pH 2.9 + 0.1 usando 2 M de HCl. El análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento reveló que el rendimiento del redoblamiento fue del 55 por ciento. Ejemplo 9: Efecto de la concentración de proteína en el redoblamiento El efecto de la concentración de proteína en el rendimiento del redoblamiento (es decir, se investigó la conversión de sulfonato de proinsulina S en proinsulina) , a través de una serie de reacciones llevadas a cabo análogamente como en el Ejemplo 8 excepto por la concentración de proteína (ver: Tabla 2) . Tabla 2 : Efecto de la concentración de proteína en el rendimiento del redoblamiento Ejemplo 10: Efecto de la proporción -SH:-SS03" sobre el redoblamiento El efecto de la proporción -SH:-SS03~ en el rendimiento del redoblamiento se investigó a través de una serie de reacciones realizadas análogamente que en el Ejemplo 8 excepto por la proporción de -SH:-SS03~ (ver: Tabla 3) . Tabla 3: Efecto de la proporción -SH:-SS03" en el rendimiento del redoblamiento Ejemplo 11: Efecto de la concentración de urea en el redoblamiento El efecto de la concentración de urea en el rendimiento de redoblamiento se investigó a través de una serie de investigaciones realizadas análogamente como en el Ejemplo 8 excepto por la concentración de urea (ver: Tabla 4) . Tabla 4 : Efecto de la concentración de urea en el rendimiento de redoblamiento E emplo 12 : Redoblamiento de sulfonato de proinsulina S purificada por cromatografía de intercambio de iones El eluyente que contenía 10 gramos de sulfonato de proinsulina S obtenida en el Ejemplo 7 se diluyó con 50 mM de regulador de glicina (pH 10.6) que contenía 1 M de urea para lograr un volumen final de 5 litros. Luego, el gas nitrógeno se purgó para remover oxígeno y la cámara se selló bien. En otra cámara, 781 µl de 2-mercaptoetanol se añadió a 5L,de 50 mM de regulador de glicina que contenía 1 M de urea, se purgó gas nitrógeno para remover oxígeno y la cámara se selló bien. Y luego, las dos soluciones se mezclaron rápidamente, introduciendo en una celda de mezclado que tenía un volumen de 1 mililitro a una velocidad de flujo de 50 mililitros/hora al mismo tiempo que se agitaba. La mezcla de la reacción de redoblamiento se introdujo a una velocidad de flujo de 1 litro/hora en un recipiente sin aire con gas nitrógeno, se agitó lentamente, y se hizo reaccionar durante 18 horas a 4°C. Después de que se completó la reacción, la solución se acidificó para dar pH 2.9 ± 0.1 usando 2 M HCl. El análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento reveló que el rendimiento de redoblamiento fue del 81 por ciento. Ejemplo 13 : Purificación de proinsulina recombinante humana mediante cromatografía por adsorción Resina HP-2MG (Mitsubishi Chemical Co., Japón), una resina de metacrilato polar, se hinchó en una proporción de 1 gramo de resina por 5 mililitros de acetona durante 6 horas a temperatura ambiente. Luego, la resina se lavó suficientemente con 0.1 N de NaOH, agua destilada, 0.1 N de HCl, agua destilada y 20 mM de ácido acético (pH 3.2 ± 0.2) en orden, y se empacó en una columna. Y luego, la columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de un regulador de equilibrio (20 mM de ácido acético, pH 3.2 ± 0.2) a una velocidad de flujo de 1 volumen de columna por hora. Luego, la solución de la reacción que contenía la proinsulina redoblada obtenida en el Ejemplo 12 se cargó en la columna en una proporción de 8 gramos de la proteína por un litro de resina, y la columna se lavó con 1 volumen de columna de 20 mM de regulador de ácido acético (pH 3.2 ± 0.2) . Y luego, la proinsulina redoblada se eluyó con el mismo regulador que contenía 30 por ciento de acetona. Como resultado, 92 por ciento o más de la proinsulina redoblada se recuperó, al mismo tiempo que quedó libre de impurezas tal como glicina y urea. También, la cromatografía líquida de alto rendimiento y un ensayo de proteína cuantitativo revelaron que la proteína se concentró en aproximadamente 10 veces con una pureza aumentada de aproximadamente 1.3 veces. Luego, dicho eluyente que contenía la proinsulina activa se evaporó para remover la acetona y se secó por congelación, o el pH del eluyente se ajustó a 5.4 con 1 M de NaOH y se añadió cloruro de zinc a una concentración final de 0.04 por ciento (peso/volumen) para recuperar la proinsulina redoblada. Como claramente se ilustra y demostró anteriormente, la presente invención proporciona un proceso para preparar proinsulina humana cuyos pasos de disolución y sulfonación, concentración, desalación y purificación se simplifican notablemente, al mismo tiempo que aumentan el rendimiento de la reacción de repliegue. De acuerdo con la presente invención, el precursor de insulina recombinante humana se puede fabricar con una buena reproducibilidad.

Claims (7)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES 1. Un proceso para preparar proinsulina humana que comprende los pasos de: (i) suspender en una solución reguladora células de E. Coli que expresan proteínas de fusión de proinsulina en forma de un cuerpo de inclusión y lisar las células para obtener el cuerpo de inclusión; (ii) suspender el cuerpo de inclusión obtenido en el paso (i) en una solución reguladora que contiene un desnaturalizante, al mismo tiempo que se sulfonan las proteínas de fusión de proinsulina con sulfato de sodio y tetrationato de sodio, para obtener una proteína de fusión de sulfonato de proinsulina S representado como la siguiente fórmula (II) ; (iii) centrifugar la proteína de fusión del sulfonato de proinsulina S obtenida en el paso (ii) para producir un precipitado, disolver el precipitado en ácido fórmico, luego disociar el sulfonato de proinsulina S de la proteína de fusión tratándolo con bromuro cianógeno y secar bajo una presión reducida; (iv) disolver el sulfonato de proinsulina S seco obtenido en el paso (iii) en un regulador y purificar el sulfonato de proinsulina S en una cromatografía de intercambio de aniones; (v) diluir el sulfonato de proinsulina S purificado obtenido en el paso (iv) en una primera solución reguladora, purgar el gas nitrógeno para remover oxígeno para obtener una primera mezcla, mezclar la primera mezcla con una segunda solución reguladora que contiene 2-mercaptoetanol en una celda de mezcla, y agitar en un recipiente para obtener una mezcla de reacción de redoblamiento que contiene proinsulina representada como la siguiente fórmula (I) ; y, (vi) aplicar la mezcla de la reacción de redoblamiento obtenida en el paso (v) a una resina de cromatografía por adsorción y eluir mediante solución acuosa, para producir proinsulina humana redoblada,
2. (B-l) (B-7) (B-19) (B-30)
3. CB-1) (B-7) (B-19) (B-30) en donde, R es un residuo de amino ácido o un péptido que es enzimáticamente o químicamente degradable; y, X es un enlace de un grupo amino de A-l en cadena de insulina A y un grupo carboxilo de B-30 en cadena de insulina B que se puede separar de la cadena A o de la cadena B enzimáticamente o químicamente, a condición de que una región de A-l hasta A-21 sea la cadena de insulina A y una región de B-l a B-30 sea la cadena de insulina B. 2. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el desnaturalizante es urea o guanidina -HCl. 3. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la concentración de desnaturalizante varía de 6 a 8 M.
4. 4. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el cuerpo de inclusión se suspende en 0.02 hasta 0.1 M de regulador Tris en solución (pH '8 a 10) que contiene el desnaturalizante .
5. 5. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde las concentraciones de sulfito de sodio y tetrationato de sodio varían de 0.1 a 0.6 M y desde 0.01 a 0.1 M, respectivamente.
6. 6. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el cuerpo de inclusión se suspende en la solución reguladora que contiene desnaturalizante en una proporción de 10 a 20 (peso/volumen) . 7. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el cuerpo de inclusión se suspende en la solución reguladora que contiene el desnaturalizante a una temperatura de reacción de 4 a 8°C. 8., El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el sulfonato - proinsulina S se disuelve en regulador Tris (pH 7 a 9) que contiene 1 mM de EDTA y 7 M de urea y se purifica en cromatografía por intercambio de aniones equilibrada con el mismo regulador. 9. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde el sulfonato - proinsulina S se diluye con una solución reguladora de glicina (pH 9 a 11) que contiene 1 M de urea en una concentración de 0.1 a 10 miligramos/mililitro. 10. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde se añade 2-mercaptoetanol a una solución reguladora que contiene 1 M de urea en una proporción equivalente de 1 a 3 con respecto a los grupos -SS03" de sulfonato de proinsulina S. 11. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la solución reguladora que contiene sulfonato de proinsulina S diluida y la solución reguladora que contiene 2-mercaptoetanol se mezclan en una proporción de 1:1 (volumen/volumen) . 12. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 10 u 11, en donde la solución reguladora empleada es 50 mM de solución de regulador de glicina (pH 10.6) . 13. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, en donde la mezcla se lleva a cabo en una celda de mezclado que tiene un volumen de 0.1 mililitro a 10 litros. 14. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la cromatografía por adsorción emplea una resina de metacrilato polar. 15. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, en donde la mezcla de reacción de redoblamiento se adsorbe a la resina de metacrilato polar en un valor de pH de 3 a 4. 16. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, en donde la resina de metacrilato polar se lava con regulador de ácido acético (pH 3 a 4) antes de que se haga la elución de la proinsulina humana redoblada. 17. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la solución acuosa es solución reguladora de ácido acético (pH de 3 a 4) que contiene de 15 a 50 por ciento (volumen/volumen) de acetona. 18. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la proinsulina humana redoblada eluida mediante una solución acuosa se recupera del eluyente que contiene la proinsulina redoblada mediante la adición de cloruro de zinc. 19. El proceso para preparar proinsulina humana de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, en donde el cloruro de zinc se añade en el eluyente que contiene la proinsulina redoblada a una concentración final de 0.004 a 4 por ciento (peso/volumen) a un valor de pH de 5 a
7. 7.